（营养与食品卫生学专业论文）β甘露聚糖酶的生产及其酶法制备魔芋葡甘露低聚糖的研究.pdf

摘要 摘要 葡甘露低聚糖作为功能性低聚糖除了具有促进双歧杆菌的生长繁殖以外，还是唯一 一种能与肠道中外源病菌结合的功能性低聚糖。它将有望成为抗生素的“替代品 。本 论文研究了发酵培养基组成和发酵条件对黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e re 5 6 固态发酵产1 3 甘 露聚糖酶的影响，大幅度提高了发酵酶活性，同时对魔芋葡甘露聚糖酶法水解工艺条件 以及魔芋葡甘露低聚糖的精制工艺条件进行了研究，为指导酶的工业化生产和应用奠定 了基础。 首先以一株实验室保藏的p 甘露聚糖酶高产菌株黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e ，e 5 6 作为 出发菌株，对其三角瓶固态发酵产酶条件进行了研究。通过单因素试验考察了培养基初始 p h 、有机氮源与有机碳源比、魔芋胶添加量、料水比对菌株e 5 6 三角瓶固态发酵产酶 的影响，获得黑曲霉e 5 6 最优化发酵培养基组成为：2 5 0m l 三角瓶中装基料1 0g ( 麸 皮7 5g + 豆饼粉2 5g ) ，魔芋胶0 4g ，k - h 2 p 0 40 0 2 4g ，c a c l 20 0 1 2 5g ，m g s 0 4o 0 1 2 5 g ，( n h 4 ) 2 8 0 4 0 1 2 5g ，料水比为1 ：1 5 ，自然p h 。最佳培养条件为：3 2 。c 静置培养8 4h ， 期间于2 4h 翻曲1 次。黑曲霉e 5 6 菌株三角瓶固态发酵产1 3 甘露聚糖酶活性最高达 4 2 6 2 6u g 干曲。 以三角瓶优化发酵培养基及发酵条件为基础，对a s p e r g i l l u sn i g e re 5 6 曲盘发酵工 艺条件进行了研究，获得了曲盘发酵适宜条件为：3 2 静置培养7 2h ，期间发酵4 4h 后补加相当于基料1 5 的水，于2 4h 、4 4h 各翻曲一次，自然p h 。在该条件下曲盘发 酵产1 3 甘露聚糖酶最高酶活性可达3 3 2 4 5u g 干曲。 采用a s p e r g i l l u sn i g e re 5 6 菌株所产p 甘露聚糖酶粗酶液( 平均酶活性1 2 0 0 0 i7 m i ，) ，研究了酶法水解魔芋葡甘露聚糖的工艺条件。单因素试验结果表明：酶解作 用与酶的添加量、酶解时间、温度、p h 值、魔芋胶浓度均有关，通过正交试验进一步 确定了酶法水解魔芋胶制备葡甘露低聚糖的工艺条件。其最佳工艺条件为：魔芋胶浓度 2 4 0g l ( 用去离子水配制) 、酶解温度5 0 、加酶量1 2 0u g 魔芋胶、酶解时间8h 。测 得酶解液平均聚合度( d p ) 值在1 8 1 9 之间。 魔芋胶酶解产物中添加2 酵母种子液，于2 8 。c 、2 4 h 进行发酵，去除了2 4 8 的 单糖成分，得到魔芋葡甘露低聚糖粗糖液；采用正交试验法，用粉末活性炭对粗糖液进 行脱色处理，比较粉末活性炭用量、脱色时间和脱色温度对脱色效果的影响。结果表明： 粉末活性炭用量o 6 ，脱色时间2h ，脱色温度5 0 ，脱色率达到6 5 6 8 ，总糖收率 为9 0 1 8 ；糖液经颗粒活性炭柱处理后魔芋腥味消失；选择离子交换树脂吸附糖液中 的盐离子，当离子交换树脂的用量为糖液体积的一倍时，脱盐率为9 7 7 3 ，且去除糖 液中离子的同时进一步去除了色素，脱色率为9 0 9 8 ，总糖收率达8 8 。 关键词：p 甘露聚糖酶；魔芋胶；葡甘露低聚糖；精制 a b s t r a c t a b s t r a c t m a n n a n - o l i g o s a c c h a r i d e sa so n eo ft h ef u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e sn o to n l yp r o m o t et h e g r o w t ho f b i f l d o b a c t e r i u m ，b u ta l s oi st h eo n l yo l i g o s a c c h a r i d e st h a tc a np r o t e c te x o t i c b a c t e r i u mf r o ms e t t i n gd o w ni n t oo u rb o d ya c c o r d i n gt or e c e n ti n v e s t i g a t i o n a n di ti s h o p e f u lt ob et h er e p l a c e m e n to fa n t i b i o t i c s t h i st h e s i sg o ts o m em a i nc o n c l u s i o n sb yd o i n g r e s e a r c h e so fp r o d u c t i o no f1 3 - m a r m a n a s e ，t h e s t u d yo nh y d r o l y t i cc o n d i t i o n so fk o n ja k g l u c o m a n n a nb yu s i n g1 3 - m a n n a n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e re 一5 6a n dt h es t u d yo nr e f i n i n g t e c h n o l o g yo fk o n ja ko l i g o s a c c h a r i d e sp r e p a r e db ye n z y m a t i ch y d r o l y z i n g s i n g l ef a c t o rm e t h o dw a se m p l o y e dt oe v a l u a t et h ee f f e c t so fs e v e r a lv a r i a b l e so ns o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o ni nf l a s kw i t ht h es t r a i na s p e r g i l l u sn i g e re 一5 6 t h eo p t i m u mm e d i u m i n g r e d i e n t sf o r 3 - m a n n a n a s ep r o d u c t i o ni nf l a s kw e r ea sf o l l o w s ：t h ep r o p o r t i o no fw h e a tb r a n t os o y b e a nf l o u r7 5g ：2 5g ，i n i t i a lp hn a t u r a l ，t h er a t i oo fw a t e rt od r a wm e d i u m1 5 ：1 ， k o n j a kg u m0 4g ，k h 2 p 0 40 0 2 4g ，c a c l 20 0 1 2 5g ，m g s 0 4o 0 1 2 5g ，( n h 4 ) 2 8 0 4o 1 2 5g t h ec u l t i v a t i o nw a sc a r r i e do u ta t3 2 cf o r8 4 h w i t ht h e s ec o n d i t i o n s ，t h e 3 - m a n n a n a s e a c t i v i t yr e a c h e d4 2 6 2 6u gd r ym e d i u m ；b a s e do nt h ef l a s kf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ， 1 3 - m a r m a n a s ea c t i v i t yr e a c h e d3 3 2 4 5u gd r ym e d i u mw i t hk o j ip l a t ef e r m e n t a t i o na t3 2 cf o r 7 2hb ya d d i n gw a t e ra n dt u r n i n g k o j i t h eh y d r o l y t i cc o n d i t i o n so fk o n j a kg u mf o rp r o d u c i n gg l u c o m a n n a no l i g o s a c c h a r i d e s w e r es t u d i e d 晰mh i 曲a c t i v i t y1 3 - m a n n a n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e re 一5 6 b a s e do ns i n g l e f a c t o rt e s t s ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o n s w e r eo b t a i n e db yo r t h o g o n a lt e s t t h eo p t i m u m h y d r o l y t i cc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：k o n j a kg u ms o l u t i o n2 4 0g l ( w i t hd e i o n i z e dw a t e 0 ， h y d r o l y t i ct e m p e r a t u r e5 0 c ，1 3 - m a n n a n a s ed o s a g e1 2 0u gk o n j a kg u m ，a n dh y d r o l y t i ct i m e8 h w i t ht h e s ec o n d i t i o n s ，t h er a n g eo fa v e r a g ep o l y m e r i z a t i o nd e g r e e ( d p ) i s1 8 - 1 9i n h y d r o l y s a t e s 2 ( v v ) y e a s tw a sa d d e di n t ok o n j a kg u mh y d r o l y s a t e s ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si sa t 2 8 f o r2 4h 谢t 1 12 4 8 m o n o s a c c h a r i d e sr e m o v a lb yt l ca n dh p l cm e t h o d ；t h ee f f e c t so f a c t i v ec a r b o np o w d e r , a d s o r p t i o nt i m ea n dd e c o l o r i z a t i o nt e m p e r a t u r eo nd e c o l o u r i z a t i o no f c r u d em a n n o o l i g o s a c c h a r i d e sl i q u i d sw e r es t u d i e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s 砀er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u md e c o l o r i z a t i o ne f f e c tw a so b t a i n e df r o mt h et r e a t m e n tc o n d i t i o n s o fo 6 a c t i v ec a r b o np o w d e ru n d e rc o n d i t i o n so fd e c o l o r i z a t i o nt e m p e r a t u r e5 0 a n d a d s o r p t i o nt i m e2h 硒ed e c o l o r i z a t i o nr a t er e a c h e d6 5 。58 a n dt h er e c o v e r yr a t eo ft o t a l s u g a rw a su pt o9 0 18 t h ep a r t i c l ea c t i v a t e dc h a r c o a lh a sr e m a r k a b l ed e s m e l ta b i l i t yf o rt h e m a n n o o l i g o s a c c h a r i d e sl i q u i d so fk o n j a k l i k es m e l l ；i o ne x c h a n g er e s i nw a su s e di nk o n j a k o l i g o s a c c h a r i d e sl i q u i d sp u r i f i c a t i o n b yt h et r e a t m e n tw i t h1 ：1v o l u m er a t i ob e t w e e ni o n e x c h a n g er e s i ni n c l u d i n g0 0 1 7n a 、d 2 0 1a n do l i g o s a c c h a r i d e sl i q u i d s ，9 7 7 3 o ft h es a l t y i o n sw a sr e m o v e d ，m e a n w h i l e ，9 0 9 8 o ft h ep i g m e n tm o l e c u l a rw a sr e m o v e da n dt h e r e c o v e r yo ft o t a is u g a rr e a c h e d8 8 k e y w o r d s ：p m a n n a n a s e ；k o n j a kg u m ；g l u c o m a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e s ；p u r i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是各人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 幽 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅扣借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进, f - i - g t 索，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 兰翌壁笙五盆! 墨旦 日 期： 鹾： 差 鱼骤 丕堑 幽倒 【第一章绪论】 第一章绪论 1 1 立题背景 随着我国加入世界贸易组织。( w t o ) ，社会经济高速发展和科学技术的不断进步， 人民生活水平普遍提高，人类的寿命得到延长，社会老龄化己成为一个全球性的问题。 物质的极大丰富，加上日益严重的环境污染也带来了日常生活中的一些常见病，如肥胖、 糖尿病、脑血管病、高血压、龋齿，综合免疫能力下降等病症。这些常见病逐渐成为社 会的主要问题，迫使人们更加关注生活质量和自身健康。对于食品，为了既满足人们对 口味和营养的要求，又能够通过日常饮食就能预防这些疾病，于是出现了功能性食品。 目前，在国内、国际市场上掀起了一股功能性食品的研究、生产热潮。其中尤以日本最 为活跃。 功能性食品( f u n c t i o n a lf o o d ) 系指调节人体生理功能，适宜特定的人群使用，不 以治疗疾病为目的的一类食品。这类食品除了具有一般食品皆具备的营养功能和感官功 能( 色、香、味、形) 外，还具有一般食品所没有或不强调的调节人体生理活动的功能。 由于这类食品强调食品的第三种功能，故称之为功能性食品，而我国则称之为保健食品 ( h e a l t hf o o d ) 。 功能性食品的出现给食品工业注入了全新的内容，而生产功能性食品的关键是功能 性食品基料( 即生理活性物质、功能因子) 的制备。功能性低聚糖因具有独特的生理功 能而成为一种重要的功能性食品基料，引起了全世界的关注【l j 。“中华人民共和国轻工 行业标准功能性低聚糖通用技术规则对功能性低聚糖定义为：功能性低聚糖 ( f u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e s ) 是由2 1 0 个相同或不同的单糖，以糖苷键聚合而成( 可 以是直链也可以是支链) ；具有糖类的特性，可直接作为食品配料，但是不被人体消化 道酶和胃酸降解，不被( 或难被) 小肠吸收；具有促进人体双歧杆菌增殖等生理功能。 目前，己知的功能性低聚糖有1 0 0 0 多种，国际上已研究开发成功的低聚糖有7 0 多种， 主要有低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚麦芽糖、帕拉金糖、乳酮糖、低聚 半乳糖、海藻糖、耦合糖等。日本在功能性低聚糖的研究、开发与应用方面位居前列， 已形成工业化生产规模的低聚糖品种就达十几种，其中以低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、 低聚果糖三个品种为主。继日本之后，在西方如美国、欧洲各国对低聚糖的开发热情也 正不断上升。我国研究低聚糖始于2 0 世纪8 0 年代，进入商品化生产是在9 0 年代。迄今为 止，大豆低聚糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖已有较成熟的商品化生产基地，2 0 0 0 年功能 性低聚糖总产量约3 万吨。但是与发达国家相比，我国对功能性低聚糖的研究近几年虽 然发展较快但还远远不够：国内低聚糖品种与国外相比还较少，如：与人母乳中的双歧 因子有相似作用的乳酮糖；安全性很高、极少摄入量即可增加体内双歧杆菌的低聚木糖； 具有抗肿瘤作用的低聚氨基葡萄糖等都还未大批量商品化供应。另外，低聚糖产品的质 量还有待提高，有些副产物如蔗糖、糊精等含量较高，直接影响下游制剂产品的质量、 生理活性和保健功能。为了满足国际市场的需求，刺激我国制糖业的生产和消费，目前 江南大学硕士学位论文 亟待利用科技手段结合本地区实际开发出优质、新型的功能性低聚糖，提高投入和产出 比率，充分挖掘功能性低聚糖市场潜力。 葡甘露低聚糖( g l u c o m a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e s ) 是一种唯一具有结合外源性病原菌 的新型的功能性低聚糖，它是运用特定酶将天然星科魔芋属( a m o r p h o p h a l l u sk o n j a c ) 植物魔芋球茎中的葡甘露聚糖降解得到的产物。魔芋是一种多年生草本植物，其球茎含 有丰富的葡甘露聚糖( g l u c o m a n n a n ，一种优良的半纤维素) 。中国是世界上最盛产魔 芋的国家，主要分布在四川、云南、贵州、湖北等地，1 9 8 6 年农业部把魔芋认定为我国 重要的特种经济作物之一例。因此，我国在葡甘露低聚糖的开发上具有资源上的相对优 势。多年来，人们将魔芋块茎简单加工后直接制成粉条、豆腐等食品直接食用，而很少 挖掘利用其深层价值。由于功能性低聚糖研究热潮的掀起，国内近年来己经有科研院所 开始了利用魔芋精粉制备葡甘露低聚糖的研究。首先由马延和【3 】等利用碱性枯草芽孢杆 菌所产p 甘露聚糖酶制备魔芋低聚糖，但由于该酶在碱性条件下作用，反应过程中产生 的深色物质，使得分离提纯困难，增加了产品的成本，并影响产品的质量。继马延和之 后，杨文博等【4 j 利用地衣芽孢杆菌n k 2 7 所产的d 甘露聚糖酶制备魔芋低聚糖，但酶解 产物中含有较多的单糖。以魔芋胶为原料，酶法制备魔芋低聚糖的核心技术是应用高活 力的p 。甘露聚糖酶和使用高浓度的魔芋胶溶液。由于生产p 甘露聚糖酶的制造技术未能 取得实质性突破，另外魔芋胶溶于水后分子链伸展，粘度非常大，几乎所有有关魔芋胶 酶解工艺的文献报道均采用1 0 3 0g l 的魔芋胶浓度，导致了酶解产物后处理成本很高、 生产效率极低。目前葡甘露低聚糖产品仅有日本少量生产，在国内仍处于中试阶段【5 j 。 因此，积极开展b 甘露聚糖酶水解魔芋精粉制备葡甘露低聚糖这一课题的研究，不仅具 有重要的学术理论价值，还能为开发新的功能性低聚糖品种做出贡献。 1 2 葡甘露低聚糖 低聚糖( o l i g o s a c c h a r i d e s ) 是由2 1 0 个单糖单位通过糖苷键连接形成的直链或支链 的低度聚合糖【6 j 。 1 2 1 葡甘露低聚糖的组成 葡甘露低聚糖由甘露糖残基通过p 1 ，4 糖苷键组成直链，在直链或支链( 1 3 - 1 ，3 或c 【一1 ，6 糖苷键) 上连接有葡萄糖或半乳糖等单糖残基的低聚糖 j 7 1 。 1 2 2 葡甘露低聚糖的生理功能 1 2 2 1 对有益微生物特别是双歧杆菌的促生长作用 葡甘露低聚糖具有促进双歧杆菌增殖、抑制病原菌的作用。杨文博等【4 j 在p y g 和 g a m 液体培养基中分别加入终浓度( ) 为0 1 、o 3 、o 5 、o 7 、1 0 的植物胶( 魔芋粉、角 豆胶、瓜儿豆胶和田菁胶) 酶水解液，接种青春双歧杆菌7 ，3 4 培养2 4h 后，血球计 数板计数。结果显示，四种植物胶经b 甘露聚糖酶酶解后的低聚糖对青春双歧杆菌的增 长均有较明显的促进作用，菌体增殖数从1 0 7 提高到1 0 8 个m l 。吴拥军等【8 】在g a m 和 p t y g 培养基中按5 分别加入浓度为0 4 、0 6 、0 ：8 的魔芋胶( k g m ) 发酵液，接 2 【第一章绪论】 种耐氧长双歧杆菌5 ，3 7 培养2 4h 后，美蓝染色血球计数板计数。结果显示，加入 0 4 k g m 发酵液的一组活菌数分别达到2x 1 0 9 和5x 1 0 9 ，生长速度快；而未 3 i k g m 发酵 液的对照组仅为4 4x 1 07 和3 4 x 1 07 。另外两组的活菌数也远超过对照组，均比对照增 加了两个数量级，表明魔芋葡甘露低聚糖对双歧杆菌具有很强的增殖作用。秦湘红等p j 在无碳源的g a m 基础培养基中，添加不同量的魔芋粉酶解产物对双歧杆菌具有明显的 促生长作用，其促生长作用与低聚果糖相当，均以2 的浓度增殖效果最明显，与不加 低聚糖的对照组相比，活菌数可以提高几倍到十几倍。m i r e l m a n 等【lo 】报道葡甘露低聚糖 截取肠道病原菌的效果见表1 1 。 表1 1葡甘露低聚糖截取病原茵的效果 t a b 1 - 1t h ee f f e c to fg l u c o m a n n a n o l i g o s a c c h a r i d e so nt r a p p i n gp a t h o g e n i cb a c t e r i a 1 2 2 2 对实验性高脂血症防治，降血脂及护肝作用 杨艳燕等【l l 】给实验性高脂血症小鼠灌喂一定剂量的魔芋低聚糖，发现魔芋低聚糖 能有效地抑制血清甘油三酯( t g ) 和总胆固醇( t c ) 水平升高，同时能提高高密度脂 蛋白胆固醇( 皿l c ) 水平，证实魔芋低聚糖确有一定对抗小鼠实验性高脂血症形成的 作用。陈黎等【1 2 】用高脂溶液造成小鼠高血脂动物模型，同时给予一定剂量的魔芋低聚糖 3 0g ( k g d ) 灌胃，取血样测定多项生化指标，研究了魔芋低聚糖对小鼠血脂的影响，发 现用魔芋低聚糖喂养后的小鼠t g 和t c 水平较高脂组分别降低2 9 和3 2 ，而h d l c 水 平却升高了3 5 ，表明魔芋低聚糖有非常明显的降脂作用。而且，灌喂低聚糖组小鼠的 3 江南大学硕士学位论文 血清丙氨酸氨基转移酶( a l t ) 较高脂组无显著差异，表明其对小鼠肝功能无明显损害； 而血清尿素氮( u n ) 水平却明显降低1 6 。推测魔芋低聚糖降低u n 水平可能与低聚糖 能减少肠内氨的生成和吸收，从而减轻肝脏对血氨的解毒负担有关，故魔芋低聚糖可能 有一定的护肝作用。 1 2 2 3 降血糖 杨艳燕等【”】研究魔芋低聚糖对实验性糖尿病小鼠血糖浓度的影响，5 四氧嘧啶水 溶液腹腔注射诱导小鼠糖尿病，再用不同剂量的魔芋低聚糖水溶液灌胃，先后测定小鼠 血糖值及某些血液成分的含量，实验2 周后结果显示，灌服了低、高剂量魔芋低聚糖液 的糖尿病小鼠血糖值分别为1 0 4 1 + 2 2 3m m o l l 、9 8 1 士1 6 7m m o l l ，与未用药的糖尿病 组( 1 7 1 7 - 4 - 3 8 9m m o l l ) 比较明显降低( p 4 0 目、 k g m 7 0 、蛋白质g 6 、脂肪 o 1 、淀粉 o 5 、水分s 1 2 、s 0 2 s o 3 、灰分 3 o ) ： 【第三章魔芋葡甘露聚糖酶水解工艺条件研究】 购自成都百仕隆生物科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯。 3 2 3 实验方法 3 2 3 1b 甘露聚耱酶活力测定 见2 2 7 3 2 3 2 魔芋胶总糖和游离还原糖含量测定 1 ) 魔芋胶总糖含量测定本总糖是指k g m ( 不含淀粉) 提取液被酸完全水解后所有 还原性单糖之总。称取0 1 0 0g 魔芋胶，加入0 0 1m o l l 甲酸一氢氧化钠缓冲液( p h3 2 ) 4 0m l ，于室温溶胀4h 并定容至5 0m l ，4 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，上清液即为k g m 提 取液。吸取4m l 提取液于2 5m l 具塞试管中，加入0 5m l6m o l lh 2 s 0 4 ，混匀，于沸 水浴中密闭水解1 5h ，n a o h 中和并定容至1 0m l 。取滤液o 5m l 用d n s 法测定还原 糖量，总糖按公式( 3 1 ) 计算： 魔芋胶总糖含量= 蔫鬻1 。 ( 公式3 - 1 ) 2 ) 魔芋胶游离还原糖含量测定游离还原糖是指样品水解前的还原糖。称取0 2 5 0g 魔芋胶，置2 5 0m l 具塞三角瓶中，加去离子水7 0m l 室温溶胀2h 并定容至1 0 0m l ， 4 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，取上清液2 5m l 用d n s 法测定还原糖量，游离还原糖含量按 公式( 3 - 2 ) 计算： 魔芋胶游离还原糖含量= 鲎熹券1 0 0 ( 公式3 2 ) 魇手胶量( g ) 3 ) 魔芋胶葡甘露聚糖含量计算k g m 是指样品中魔芋胶总糖含量与游离还原糖含 量之差乘以0 9 ( 换算系数) ，按公式( 3 3 ) 计算： 魔芋胶葡甘露聚糖含量= 堑堕塑鬯弓耋；蒌茎誓掣。9 l 。( 公式3 3 ) 3 2 3 3 魔芋胶水解率测定 p 甘露聚糖酶水解魔芋胶一定时间，取样、灭酶、离心，取上清液适当稀释后用 d n s 法测定还原糖( 以甘露糖计) 量。魔芋胶水解率按公式( 3 4 ) 计算： 魔芋胶水解率= 堕塑堕至 摹翥篓害亲誓鬈产，。 c 公式3 - 4 ， 3 2 3 4 酶解液平均聚合度测定 平均聚合度( d p ) 是指魔芋胶总糖量与酶解液还原糖量之比值。数值越接近1 ，表 示酶解越彻底。当制备魔芋葡甘露低聚糖时，该比值一般控制在1 8 1 9 之间 6 】o 平均零厶度钟= 磊畿 ( 公式3 - 5 ) 1 9 江南大学硕士学位论文 3 3 结果与讨论 3 3 1 魔芋胶总糖和游离还原糖含量 同一批魔芋胶样品重复多次测定，结果见表3 1 。经统计学方法【6 7 】检验，总糖含量 的标准差6 = - 4 - o 4 6 ，变动系数c v = 士0 5 7 ；游离还原糖含量的标准差6 = - 4 - o 0 9 3 9 ，变 动系数c v = 4 - 2 2 ，实验数据可靠。由此可确定该魔芋胶样品的总糖含量以质量分数表 示为8 0 1 9 ，游离还原糖含量为4 3 0 ，k g m 含量为6 8 3 0 。 表3 - 1 魔芋胶总糖和游离还原糖含量测定结果 t a b 3 1d e t e r m i n a t i o no ft h et o t a ls u g a ra n df r e er e d u c i n gs u g a r 3 3 2 魔芋胶酶解条件单因素试验 3 3 2 1 酶解p h 值的选择 在加酶量8 0u 儋魔芋胶、5 0 水解6h 条件下，试验了用去离子水及不同p h 值缓 冲液配制的魔芋胶溶液( 8 0g l ) 对水解率的影响( 表3 2 ) 。表3 2 结果表明，用p h5 5 6 5 缓冲液配制的魔芋胶溶液的水解率较低( 5 0 ) ，以p h3 5 最高。与所用b 甘露聚糖酶的最适作用 p h3 5 相吻合【6 引，也表明离子强度对该酶有一定影响。考虑到缓冲液离子将给酶解液精 制带来困难和增加生产成本，因此在实际应用中以去离子水配制魔芋胶溶液1 3 ，8 j 。以下 试验均采用去离子水配制魔芋胶溶液。 2 0 【第三章魔芋葡甘露聚糖酶水解工艺条件研究】 表3 - 2 魔芋胶溶液p h 值对水解率的影响 t a b 3 - 2e f f e c to f t h ep ho fk o n j a kg u ms o l u t i o no nh y d r o l y t i cr a t e 3 3 2 2 魔芋胶酶解加酶量的确定 在魔芋胶浓度8 0 l 、5 0 c 水解6h 条件下，试验了加酶量对魔芋胶酶解液平均聚 合度( d p ) 的影响( 表3 3 ) 。随着加酶量的增加，酶解液中的还原糖量逐渐增加，平 均聚合度逐渐降低。由于本试验的目的是获取高含量的魔芋葡甘露低聚糖，尽量减少单 糖的量，因此参考李剑芳等人【6 5 】的文献报道，将d p 控制在1 8 1 9 范围内，即加酶量 确定为7 0 8 0u g 魔芋胶。 袁3 3 加酶量对魔芋胶酶解液还原糖量及d p 的影响 t a b 3 - 3e f f e c to f t h ed o s a g eo fe n z y m eo nr e d u c i n gs u g a ra n da v e r a g ed e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o no f h y d r o l y s a t e s 3 3 2 3 魔芋胶酶解时阃的影响 在魔芋胶浓度8 0g l 、5 0 。c 、加酶量分别取4 0u g 、6 0u g 和8 0u g 魔芋胶的条件 下，试验了不同酶水解时间对酶解液d p 的影响( 图3 - 1 ) 。由图3 1 可见，酶解液d p 随酶解时间增加而逐渐降低，且发现加酶量和酶解时间对d p 的影响是关联的，即达到 一定的d p ，加酶量越大，酶解时间越短；加酶量越少，酶解时间越长。为了控制d p 2 1 江南大学硕士学位论文 在1 8 1 9 范围内，在加酶量分别取4 0u g 、6 0u g 和8 0u g 魔芋胶情况下，对应的酶 解时间控制在1 0 1 2h 、7 9h 和5 6h 。 24681 01 21 4 水解时间h 图3 - 1 酶解时间对魔芋胶酶解液平均聚合度的影响 f i g 3 - 1 e f f e c to fh y d r o l y t i ct i m eo nt h ed po fk o n j a kh y d r o l y s a t e s 3 3 2 4 魔芋胶酶解温度的影响 试验了不同酶解温度对d p 的影响( 表3 4 ) 。结果表明，在4 0 6 0 范围内，温度 和加酶量对d p 影响是关联的，即温度越高，加酶量越少。为控制d p 在1 8 1 9 内，可 分别取4 0 c 、加酶量9 0u g 魔芋胶，5 0 c 、加酶量7 0 8 0u g 魔芋胶，6 0 c 、加酶量 6 0u g 魔芋胶。 表3 - 4 酶解温度对魔芋胶酶解液还原糖量及d p 的影响 t a b 3 - 4e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nt h er e d u c i n gs u g a ra n dd po fk o n j a kh y d r o l y s a t e s 5 3 l 9 7 5 2 2 2 1 l 1 山a，堪如磔露 【第三章魔芋葡甘露聚糖酶水解工艺条件研究】 3 3 2 5 魔芋胶浓度的影响 首先在5 0 c 水解6h 条件下，试验了魔芋胶浓度对d p 的影响( 图3 2 ) 。由图3 - 2 可见，魔芋胶浓度越高，d p 也越高，当魔芋胶浓度超过2 0 0g l 时，两种加酶量的d p 均大于1 9 。为达到本研究目的，我们采取了延长酶解时间的措施来解决。在加酶量1 0 0 u g 魔芋胶、酶解温度5 0 。c 下，分别于4 、6 、8 、1 0h 测定( 图3 3 ) 。由图3 3 可见， 为使d p 值在1 8 1 9 范围内，在试验的三个浓度条件下，反应时间需8h 。 山 口 型 d 霹 睁 2 3 2 1 1 7 1 5 8 01 2 01 6 02 0 0 2 4 0 魔芋胶浓度( g l ) 图3 - 2 魔芋胶浓度对酶解液平均聚合度的影响 f i g 3 2 e f f e c to fk o n j a ks o l u t i o nc o n c e n t r a t i o no nt h ed po fh y d r o l y 7 s a t e s 山 。 倒 d 谦 露 * 4 酶解时间i l 图3 - 3 酶解时间对魔芋胶酶解液平均聚合度的影响 f i g 3 - 3 e f f e c to fh y d r o l y t i ct i m eo nt h ed po fk o n j a kh y d r o l y s a t e s 3 3 3 魔芋胶酶解条件正交试验 3 3 3 1 正交试验结果 选择加酶量、魔芋胶浓度、酶解时间三个因素，利用正交试验表l 9 ( 3 4 ) 进行三因素 三水平正交试验( 表3 5 ) 。表3 5 结果表明，加酶量的极差r 一0 1 7 为最大，魔芋胶浓 6 5 4 3 2 1 2 9 8 7 6 2 2 2 2 2 2 l 1 1 1 江南大学硕士学位论文。 度的极差r = 0 0 6 为最小。为控制d p 在1 8 1 9 内，同时考虑工艺的简化和成本的最 小化，故最佳魔芋胶酶水解工艺条件为：加酶量为1 2 0u g 魔芋胶、魔芋胶浓度2 4 0g l 及5 0 水解8h 。 袁3 5 正交试验数据及处理结果 t a b 3 - 5d a t aa n dr e s u l t s o fl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a lt e s t 试验 加酶量( u g ) 魔芋胶浓度( g l ) 酶解时间m 平均聚合度d p 1 1 ( 8 0 )1 ( 2 2 0 ) 3 ( 1 0 ) 1 8 8 2 ( 1 0 0 ) 3 ( 1 2 0 ) 1 一 3 l 2 1 ( 6 ) 2 ( 8 ) 2 3 l 1 2 1 9 7 1 7 7 1 9 2 l 。9 0 1 8 5 2 1 1 1 9 0 9 33 31 7 7 k l 5 9 1 5 6 25 9 3 5 7 7 5 3 9 1 9 7 1 9 2 1 8 0 5 6 7 5 7 8 1 8 7 1 8 9 1 9 3 5 5 9 5 5 5 1 9 8 1 8 6 1 8 5 r o 1 7o 0 6 0 1 3 3 3 3 2 最佳酶水解条件验证 选用上述最佳魔芋胶酶水解工艺条件，重复试验三次( 表3 6 ) 。由表3 6 可见，三次 试验结果d p 值均在1 8 1 9 之间，符合本研究的目标。 、，、， o 。 殂 2 2 拍 3 ，l，l 2 3 2 3 4 5 6 7 8 硒 h 娩 b 【第三章魔芋葡甘露聚糖酶水解工艺条件研究】 3 4 本章小结 本章利用第二章中黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) e 5 6 菌株所产的高活力1 3 甘露聚糖酶， 研究了魔芋葡甘露聚糖的酶水解工艺条件。单因素试验表明：酶解作用与酶的添加量、 酶解时间、温度、p h 值、魔芋胶浓度均有关，进一步通过正交试验确定了酶水解魔芋胶 制备葡甘露低聚糖的最佳工艺条件为：魔芋胶浓度2 4 0g l ( 用去离子水配制) 、酶解温 度5 0 、加酶量1 2 0u g 魔芋胶、酶解时间8h 。测得酶解液d p 值在1 8 1 9 之间。彻底解 决了现有魔芋葡甘露低聚糖生产工艺中由于酶活力低、魔芋胶浓度低所导致的生产效率 低、成本高的缺陷。 2 5 江南大学硕士学位论文 第四章魔芋葡甘露低聚糖的精制工艺 4 1 引言 目前，开发功能性低聚糖产品正成为研究热点，葡甘露低聚糖是其中之一。葡甘露 低聚糖( m a n n a no l i g o s a c c h a r i d e s ，m o s ) 是由葡甘露聚糖经过化学降解或酶法降解生成 的聚合度为2 1 0 的低聚糖，由甘露糖残基通过p 1 ，4 糖苷键组成直链，在直链或支链( p 1 ，3 或0 【1 ，6 糖苷键) 上连接有葡萄糖或半乳糖等单糖残基的低聚糖，它除了具有低热量、稳 定、安全无毒等良好的理化特性外，最重要的生理功能是双歧因子作用，它对双歧杆菌 具有较强的促生长作用h ，6 9 1 。 本论文在第三章对魔芋葡甘露聚糖的酶水解工艺条件进行了全面的研究，制备得到 了魔芋葡甘露低聚糖粗制品，但是魔芋葡甘露低聚糖的粗制品中存在一定量的单糖成 分，单糖的存在对甘露低聚糖的“双歧因子”增殖等生理功能产生干扰，严重影响了葡 甘露低聚糖的功效和商业价值；魔芋葡甘露低聚糖的粗制品还存在色泽深、味腥等问题， 严重影响了葡甘露低聚糖产品的外观和应用范围。 本研究以魔芋葡甘露聚糖酶水解液为原料，采用微生物发酵法 7 m 7 2 1 去除其中的单糖 成分，从而消除单糖成分的存在对功能性低聚糖的“双歧因子”等生理功能产生的干扰， 提高了功能性低聚糖的功效；采用活性炭对魔芋葡甘露低聚糖发酵液进行脱色脱昧，考 察了粉末活性炭用量、脱色时间和脱色温度对脱色效果和总糖回收率的影响，从而确定 了适宜的脱色条件；进一步运用大孔离子交换树脂对葡甘露低聚糖产品进行脱盐，再经 过真空浓缩获得魔芋葡甘露低聚糖。总而言之，本研究原料利用率高、工艺简单，设备 投入和运作成本低，适合制备较高含量的葡甘露低聚糖。 4 2 材料和方法 4 2 1 试验材料 4 2 1 1 魔芋胶：购自成都百仕隆生物科技有限公司；高活性酿酒干酵母：购自珠海紫英 生物科技有限公司。 4 2 1 2 活性炭 选取了上海魅宝活性炭有限公司提供的糖用活性炭，粉末、颗粒活性炭型号分别为 m b c o j 0 0 7 、m b c o j 0 0 6 。活性炭的预处理过程按文献 7 3 】介绍的方法进行，即：粉末 或颗粒活性炭_ 1m o l l 盐酸浸泡2h ，去除漂浮物_ 热的去离子水洗至p h5 6 _ 滤 干_ 干燥( 1 2 0 。c ，干燥8h ，颗粒活性炭不需要干燥) 冷却至室温，备用。 4 2 1 3 离子交换树脂 选取江阴苏青水处理工程集团生产的离子交换树脂，它们分别为阳离子交换树脂 0 0 1 7n a 、阴离子交换树脂d 2 0 1 。树脂的预处理及再生【7 4 】过程分别为： 阴离子树脂一1m o l ln a c l 浸泡树脂4h ，去除悬浮物_ 去离子水清洗_ 2m o l l 2 6 【第四章魔芋葡甘露低聚糖的精制工艺】 h c l 浸泡4h 一去离子水漂洗1 2 次，装柱，再用水洗至p h5 6 2m o l l n a o h 冲洗 2 个柱体积，浸泡2h ，再用n a o h 冲洗1 个柱体积_ 去离子水冲洗至p h8 0 左右， 待用。 阴离子树脂再生：从柱中取出树脂，用去离子水漂洗1 2 次，装柱一2m o l l n a o h 冲洗2 个柱体积，浸泡2h ，再用n a o h 冲洗1 个柱体积去离子水冲洗至p h8 0 ， 待用。 阳离子树脂_ 1m o l ln a c i 浸泡树脂4h ，去除悬浮物一去离子水清洗_ 2m o u l n a o h 浸泡4h _ 用去离子水漂洗1 2 次，装柱，再用水洗至p h8 左右_ 2 m o l lh c l 冲洗2 个柱体积，浸泡2h ，继续用h c l 冲洗1 个柱体积一去离子水冲洗至p h5 “， 待用。 阳离子树脂再生：从柱中取出