【精品论文】苏氨酸母液中氨基酸的分离纯化研究[专业：化学工艺].pdf

江南大学 硕士学位论文 苏氨酸母液中氨基酸的分离纯化研究 姓名：付勇 申请学位级别：硕士 专业：化学工艺 指导教师：彭奇均 20070601 知识水坝论文 摘要 论文题名：苏氨酸母液中氨基酸的分离纯化研究 论文作者：付勇 导师姓名：彭奇均 作者专业：化学工艺 摘要 苏氨酸的生产主要以发酵法为主，要得到苏氨酸纯品必须经过一系列物理和化学处 理，当经过预处理的发酵液等电点结晶后，会产生苏氨酸母液，母液里包括苏氨酸、杂 质氨基酸( 谷氨酸、少量的中性氨基酸) 、蛋白质、残糖、无机盐等，如果将其直接排 放到环境中或卖给饲料添加剂厂，不仅降低母液的使用价值，同时造成极大的污染。因 此重新利用苏氨酸母液有一定经济价值，既可使苏氨酸母液的价值得到增值，同时减少 母液排放对环境的污染。本论文以苏氨酸母液为主要原料，对母液成分含量、氨基酸的 分析方法建立、母液脱色、及母液中氨基酸的分离等进行了系统的研究，旨在为苏氨酸 母液提供新的、且有效的处理方法，也为应用于工业生产提供一定的技术基础。 1 、为了确定分离对象，对苏氨酸母液成份的质量百分含量进行了较为详细的分析，可 知苏氨酸母液中固含量2 0 2 4 ( 苏氨酸7 8 、谷氨酸6 9 、糖1 4 、无机盐2 2 8 和 其它物质1 6 6 等) 和水分7 9 7 6 。 2 、苏氨酸和谷氨酸分析方法的建立。采用茚三酮比色法对苏氨酸和谷氨酸的分析，通 过最大波长扫描，确定1 = 5 7 0 n m 作为氨基酸的研究波长，并且探索茚三酮比色法显色 反应的影响因素，确定加热时间为3 0 分种，p h 为6 0 ，显色水浴温度为1 0 0 ，静放时 间为6 m i n 为最佳显色条件。在这一条件下，建立苏氨酸和谷氨酸的分析方法，其中苏 氨酸线性浓度范围为6 0 1 3 0 m g l ，标准曲线为y - - o 0 2 5 0 x 1 3 7 8 0 ，相关系数为 r 2 = 0 9 9 5 8 ，而谷氨酸线性浓度范围为4 0 9 0 m g l ，g a ：y - - 0 0 2 5 8 x 0 5 2 0 1 相关系数为 r 2 = 0 9 9 8 8 ，因此可得两种氨基酸标准加和曲线y = o 0 2 5 4 x 0 9 4 9 1 ，测得母液中总氨基酸 量1 8 2 3 9 l 。虽然与h p l c 分析法相比有些偏差，但用茚三酮比色法分析简便、经济。 同时研究了不同稀释倍数的母液与吸光度的关系，得知结果相对偏差小于3 ，说明茚 三酮比色法具有较高的准确性。 3 、分别探索了活性炭和7 1 7 碱性树脂对苏氨酸母液进行脱色工艺条件的研究。活性炭脱 色条件：1 2 9 5 0 m l 、温度为5 0 、起始p h 值6 0 和脱色时间为3 0 m i n ，脱色率达9 1 ，氨 基酸损失率为1 0 ；而7 1 7 树脂脱色条件：温度为2 5 ，流速为0 1 6 7 b v m i n 条件下脱色 吸附，采用0 2 n 的氯化钠和1 o n 的盐酸梯度洗脱可以有效分离母液中的氨基酸和色素， 脱色率达9 0 ，氨基酸损失率为1 6 。 4 、研究了离子交换法和色谱法分离苏氨酸和谷氨酸，由于苏氨酸母液里含有2 2 8 的 无机盐，对d 0 0 1 阳离子交换树脂吸附苏氨酸影响较大。因此采用色谱法分离纯化苏氨 酸。通过环氧型树脂分离苏氨酸和谷氨酸的分离度达到2 7 ，但苏氨酸的色谱峰拖尾较 为严重。通过分析柱分离苏氨酸和谷氨酸的色谱工艺条件研究，可知温度对分离影响不 大，但流速对苏氨酸和谷氨酸的分离影响较大，当流速由1 0m l m i n 增加到3 0 m l m i n ， 分离度由2 7 增至3 5 ，苏氨酸的色谱峰峰宽得到改善。同时研究了葡萄糖、氯化铵和氯 知识水坝论文 江南大学硕士学位论文 化钠在色谱柱上的保留情况，得知苏氨酸与这些杂质分离，达到纯化目的。 关键词s 苏氨酸母液；苏氨酸：谷氮酸；脱色；分离；离子色谱 i i t i t l e ：s t u d yo ns e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f a m i n oa c i d si nw a s t et h r c o n i n em o t h e rl i q u o r a u t h o r ：z h e n gj i e m e n t o r ：p e n gq i - j u n m a j o r ：c h e m i c a le n g i n e e r i n ga n dt e c h n o l o g y a b s t r a c t t h r e o r t i u ei s m a i n l yp r o d u c t c db yf e r m e n t a t i o n i no r d e rt oo b t a i np u r et h r e o n i n e ，a s e r i e so fp h y s i c a la n dc h e m i c a ls e p a r a t i o np r o c e s s e sm u s tb ea p p l i e d a f t e rt h ef e r m e n t a t i o n b r o t ho ft h r c o n i n ep a s st h et e c h n o l o g yo fc r y s t a lu n i t ，t h r e o n i n em o t h e rl i q u o ri sp r o d u c t e d l a r g e l yi nw h i c hm a n yi m p u r i t i e sa r ei n t e r m i n g l e d e g ，t h r e o n i n e ，o t h e ra m i n oa c i d s ，r e s i d u a l s u g a r s ，p r o t e i n s ，p i g m e n t s ，c o l l o i d s , i n o r g a n i cs a l t sa n dr e s i d u a lr a wm a t e r i a l s f f t h e mm o t h e r l i q u o ri sd i r e c t l yp u to u ti n t oe n v i r o n m e n to rs e l l e df o rf e e d s t u f fa d d i t i v ef a c t o r y , n o to n l yt h e v a l u eo ft h e mf a l l ，b u ta l s ot h e ym a k el a r g ep o l l u t i o n s oi ti sv e r yi m p o r t a n to fr e n e w l y m a k i n gu s eo f t h e m i nt h i sp a p e r , t h r e o n l n em o t h e rl i q u o rw a su s e da st h em a i nm a t e r i a l s t h ec o n t e n to f m o t h e rl i q u o rc o m p o n e n t s ，b u i l d i n ga n a l y t i cm e t h o d so fa m i n oa c i d s ，d e c o l o r i n ga n dt h e s e p a r a t i o no fa m i n oa c i d si nm o t h e rl i q u o rw c l es t u d i e ds y s t e m a t a c i a l l yi no r d e rt og a i nt h e n e wa n dm o r ee f f e c t i v e l yr e a c t i v ew a y s ，w h i c hc o u l d s u p p l yt h et e c h n i c a lf o u n d a t i o nf o rt h e i n d u s t r yi ns o m ed e g r e e 1 i no r d e rt oc o n f i r ms e p a r a t i o no b j e c t s ，t h ec o m p o n e u so fm o t h e rl i q u o rw e r ed e t a i l e d l y a n a l y s e d t h er e s u l t ss h o wt h e yi n c l u d e2 0 2 4 s o l i dm a t t e r ( 7 8 t h r e o n i n e ，6 9 g l u t a m i c a c i d , 1 4 r e s i d u a ls u g a r s ，2 2 8 i n o r g a n i cs a l t sa n d1 6 6 p r o t e i n se t c ) a n d7 9 7 6 w a t e r 2 t h em e t h o do f q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f t h r c o n i n ea n dg i u t a m i ca c i dw e r ei n v e s t i g a t e d b yc l o r i m e t r yi nt h ep r i n c i p l eo f c o l o r r e a c t i o nb e t 、e e na m i n oa c i d sa n dn l n l a y d r i n , a n dm a i n l y d i s c u s st h ee f f e c tf a c t o r s , r e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dp o i n t sf o ra t t e n t i o no ft h i sc o l o 疗e a c t i o n t h eb e s tc o n d i t i o n so f c l o r i m c t r yw e r eh e a tt i m e3 5 m i n u t e ，p h 6 o ，t e m p e r a t u r e l 0 0 c ，l a y i n g 6 m i n u t sc o m p a r e dw i t l 】t h eh p l cd e t e c t i o nm e t h o d i tw a ss i m p l ea n de c o n o m i c a lb yw h i c h t h ec o n c e n t r a t i o no f t o t a l n n l n oa c i do f t h r c o n l n em o t h e rl i q u o rc a nb em p i d l ya n da c c u r a t e l y d e t e c t e d 3 t h ed e c o l o r i n gc o n d i t i o n so f t h r e o n i n em o t h e rl i q u o ra r es t u d i e db ya c t i v ec a r b o na n d7 1 7 r e s i n t h eb e s td e c o l o r i n gc o n d i t i o n so fa c t i v ec a r b o ni n c l u d e1 2 9p e r5 0 m lm o t h e rl i q u o r , 5 0 c ，p h 6 0a n dd e c o l o r i n g3 0 r a i n i nt h ec o n d i t i o n , t h ed e c o l o r i n gr a t ei s9 1 a n dt h el o s s o f a m i n oa c i di s1 0 t h e n7 1 7r e s i n ：e m p e r a t u r c 2 5 v e l o c i t yo f f l o wo 1 6 7 b v m i n g r a d s w a s h i n go fo 2 ns o d i u mc h l o r i d ea n dh y d r o c h l o r i ca c i dc a ns e p a r a t ea m i n oa c i d sa n d p i g m e n t si ne f f e c t i nt h ec o n d i t i o n , t h ed e c o i o r i n gr a t ei s9 0 ，a n dt h cl o s so f a m i n oa c i di s 1 2 4 t h es e p a r a t i o no f t h r e o n i n ea n dg l u m a t i ca c i dw a ss t u d i e db yi o ne x c h a n g ea n dc h r o m a t o g - 江南大学硕士学位论文 r a p b yt e c h n o l o g y i n o r g a n i cs a l t si nt h r e o n i n em o t h e rl i q u o rr e s i nh a v eg r e a te f f e c t 0 1 1 a d s o r p t i o no ft h r e o n i n eb yd 0 0 1r e s i n s ow es e l e c tc h r o m a t o g r a p h ys e p a r a t i o n s e p a r a t i o n d e g r e eo f t h r e o n i n ea n dg l u m a t i ca c i di s2 7 ，b u tc h r o m a t o g r n p h yp e a ko f t h r e o n i n ew a s ab i g w i d t h t h es t u d yo fc h r o m a t o g r n p h yt e c h n o l o g yc o n d i t i o ns h o w e dt e m p e r a t u r ep l a yas m a l l r o l eo ns e p a r a t i o no f a m i n oa c i d ；v e l o c i t yo f f l o wh a v eg r e a te f f e c t0 1 1s e p a r a t i o n , a n ds ot h r e - o n i n ec h r o m a t o g m p b yp e a kw i d t hi sb e t t e ri m p r o v e d a tt h es a m et i m e ，t h er e t e n t i o no f g l u c o s en h 4 c ia n dn a c iw a ss t u d i e do nc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n t h er e s u l t ss h o wt h r e o n i n e a n dt h e s em a t t e r sw e r e s e p a r a t e d ，a n dr e a c ht h ea i mo f p u r i f i c a t i o n k e y w o r d s ：t h r e o n i n em o t h e rl i q u o r ；t h r e o n i n e ；o l u m a t i ea c i d ；d e e o l o r i n g ；s e p a r a t i o n ；i o n c h r o m a t o g r a p h y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获 得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 签名； 日期：年月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日期：年 月日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 苏氨酸简介 1 1 1 苏氨酸性质1 1 司 苏氨酸为人体所需的八种必需氨基酸之一，其英文名是l t h r e o n i n e ，化学名称 是a 氨基b - 羟基丁酸，分子式为c 4 壬1 9 n 0 2 ，结构式为n h 2 - c h ( c o o h ) - c h o h - c h 3 ，分 子量为1 1 9 1 2 ，分子中包含一个羟基和一个羧基，是中性氨基酸、脂肪族氨基酸和支链 氨基酸，其离解常数分别为：p k c o o h = 2 1 5 ，p k n | 1 2 = 9 1 2 ，等电点p i = 5 6 4 。 苏氨酸最早由r o s e 在1 9 3 5 年发现于纤维蛋白水解物之中，易溶于水，在2 0 c 时 l o o m l 水的溶解度为9 9 ，不溶于无水乙醇、醚和三氯甲烷，外观无色至黄色晶体、极 弱的特别气味，代谢能量为1 4 5 9 5 k j k g ，有d 、l 、d 别和l 别四种立体异构，具有生 物学活性的只有l 型。苏氨酸的主要商品有d - 苏氨酸、l 苏氨酸、d l 苏氨酸及其钠盐 和d l - 苏氨酸等。 1 1 2 苏氨酸的用途 工业生产的苏氨酸应符合下列要求： 项目指标 含量( 干燥后) 比旋光度【a 】( 于基，4 9 l o o m l 水) 干燥失重( 1 0 5 ，3 h ) s 炽灼残渣5 重金属( 以p b 计) s 砷( 以a s 计) s 铅曼 9 8 5 1 0 1 5 _ 2 6 5 。2 9 o o o 2 o 1 0 0 0 2 o 0 0 0 1 5 o 0 0 i 苏氨酸主要用于医药、饲料添加剂、食品强化剂、化学试剂等方面，特别是饲料添 加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限 制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。 1 1 2 1 在医药中的应用1 3 1 苏氨酸是氨基酸输液的主要成分之一。氨基酸输液常用于手术前后、创伤、烧伤、 骨折、营养不良、慢性消耗性疾病等的辅助治疗，是临床用量很大的品种。我国现在全 国老龄人口已有1 3 亿，医疗保健水平的不断提高，使得近年来氨基酸大输液的消费量 呈快速增长趋势。 1 1 2 2 在饲料添加剂中的应用p 。7 1 苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸一起列为四大饲料添加剂，主要用于末成年仔猪 和家禽等。苏氨酸是畜禽饲料中的重要组成物质，在畜禽饲料中添加苏氨酸，能提高饲 料蛋白质的生物学价值，平衡各种氨基酸，促进蛋白质沉积，降低动物氨的排泄，减轻 环境污染，改善饲养条件。 1 1 2 3 在食品中的应用1 5 1 苏氨酸是重要的食品强化剂之一，添加于食品中，可提高蛋白质的营养价值，使食 1 坚堕查堂堡主兰篁堡兰 品营养成分更加充足合理。苏氨酸与葡萄糖共热易产生焦香和巧克力香味，有增香作用。 它一般与其他氨基酸合并用于强化谷物，有时也用于糕点、乳儿食品、牛奶中。人体每 日对l - 苏氨酸的最低必需量为：成年男子6 5 m g k g ，成年女子3 5 m g k g ，幼儿6 0 m g k g ， 尤其对儿童的健康成长和智力发展更为有益。预计今后随着食品添加剂向多品种，多功 能化、营养强化的方向发展，苏氨酸在食品工业中的应用也将日趋广泛。 1 2 苏氨酸母液概述 1 2 1 苏氨酸生产方法介绍 苏氨酸的生产方法有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法等，但以发酵法为主。( 1 ) 发酵法吲：是在通气条件下以乳糖发酵短杆菌作为菌株在种子培养基中的代谢作用而生 物合成的，近年来，随着微生物发酵工业和化学工业的发展，用生物技术和化工技术相 结合来制备与提取苏氨酸，在苏氨酸生产上发挥着越来越重要的作用。( 2 ) 蛋白质水解 法i 州：主要是苏氨酸以l 型存在于血粉、角蹄、玉米麸质粉、棉籽饼丝胶等天然蛋白 质中，可将蛋白质经水洗、搅碎、干燥、酸解得水解液，经浓缩得浓缩液，上柱，接收 液作柱层析，收集苏氨酸部分。该方法的最主要问题是苏氨酸在这些蛋白质中含量较低， 此法制备l 苏氨酸满足不了市场的需要。( 3 ) 化学合成法【蚺1 2 】：是由甘氨酸与硫酸铜络 合后，在碱催化下与乙醛迸行羟醛缩合、经铵型离子交换树脂脱铜，浓缩，醇析制得苏 氨酸，但该法需对外消旋体进行拆分才能得到光学纯产物，其工业生产价值不高。后二 种生产方法虽然有些研究，但仍停留在实验室阶段而没有达到工业化程度。 1 2 2 国内外苏氨酸的生产情况及发展趋势0 3 - 1 6 】 目前，国外的苏氨酸生产企业主要有日本味之素公司、德国德固赛公司、美国a d m 公司、日本协合发酵工业公司、日本田边制药等，这几大公司生产苏氨酸都以发酵法为 主，其产量占全球份额的9 0 左右。其中，日本味之素公司是世界上最大的苏氨酸生产 企业，其苏氨酸产量为5 万吨，占据全球市场6 0 以上的份额。德国德固赛公司也是苏 氨酸的生产大户，且是世界上惟一能够同时生产三大氨基酸产品( 苏氨酸、蛋氨酸、赖 氨酸) 的企业，苏氨酸产量为3 万吨。日本协合发酵工业公司和美国a d m 公司分别拥 有l 万吨和5 0 0 0 吨的苏氨酸生产规模。此外，韩国希杰公司、三星印尼公司等也生产 苏氨酸。由于市场持续热销，各公司都有意扩大苏氨酸的产能，以满足市场需求。最近 几年，全球苏氨酸市场以每年2 0 多的增长率高速增长，亚洲、北美等地区的需求快速 增长，需求的旺盛拉动了生产。1 9 9 3 年，全世界苏氨酸产量为4 0 0 0 吨，1 9 9 6 年为5 0 0 0 吨，1 9 9 9 年猛增至2 5 万吨，2 0 0 2 年达4 万盹，2 0 0 5 年达6 万吨，目前约为i o 万吨， 比1 0 年前增长了2 0 倍左右。据联合国粮农组织估计，目前全世界苏氨酸的需求量约为 3 7 0 万吨。 2 0 世纪9 0 年代以前，我国尚未生产苏氨酸，9 0 年代以后才开始生产。多年来发展 速度缓慢，全国产量很少。2 0 世纪末，全国苏氨酸年产量仅为7 0 8 0 吨，近年来达到 2 0 0 吨左右，产品主要供应医药市场，国内苏氨酸生产厂家也大多是制药厂，主要有上 2 箜二皇堑丝 海第二制药厂、西北第二合成药厂、湖：i l a 峰化工制药厂、江西鹰潭市生物化学制品厂、 武汉化工学院等。此外，苏氨酸用于化学及生化试剂，食品添加剂等方面。近几年，我 国市场对苏氨酸的需求逐年稳步增长，特别是在后两方面。随着近年来市场对食品的需 求数量和产品质量都在不断提高，苏氨酸作为重要的饲料添加剂，越来越受到重视，被 大量添加剂到配合饲料中。市场需求逐年上升，年需求量已达上万吨。可是多年来国内 饲料用苏氨酸的生产基本处于空白状况，每年都需从国外大量进口。市场的巨大需求使 我国不少企业纷纷投入力量研制开发苏氨酸，国内氨基酸生产巨头吉林大成集团公司通 过引进和自主研发相结合，在国内率先开发成功微生物法生产苏氨酸，建成年生产能力 达l 万吨的生产线。 未来的苏氨酸市场仍有多个增长点，发展空间广阔。首先，在饲料添加剂方面的用 量将持续大量增加。近l o 多年来，我国饲料工业产量平均年增幅达到2 位数。现在全 国饲料年产量已超过亿吨，成为世界第二大饲料生产国。预计到2 0 1 0 年，我国各种饲 料添加剂的产量将达3 0 0 万吨，市场对苏氨酸的需求量将达到6 万8 万吨。其次是医 药及其他领域。氨基酸大输液一直是临床用量很大的品种，苏氨酸是其主要成分之一。 近年来多种氨基酸饮料正在欧美、日韩等发达国家流行，今后将向我国等发展中国家扩 展。氨基酸在化妆品特别是中高档化妆品中的用量也在增多。此外，多种氨基酸片剂及 e l 服液等保健产品现己在我国市场上崭露头角，“瑞年”、“万基”、“金日”等品牌的多 种氨基酸保健品市场销售状况良好，各种营养食品对氨基酸的需求也在增加。 1 2 3 苏氨酸母液的产生及利用情况 发酵法生产苏氨酸工艺图： 发酵液经过等电点结晶得到苏氨酸产品，同时结晶后的料液为苏氨酸母液，而苏氨酸生 产公司处理母液通常采用以下两种方法； 母液里包括苏氨酸、杂质氨基酸、蛋白质、残糖、无机盐等物质，如将其卖给饲料添加 剂厂降低了母液的价值，而直接排放到环境中造成极大的污染，因此重新利用苏氨酸母 液有待于进一步研究。 江南大学硕士学位论文 1 3 苏氨酸母液中氨基酸的分析鉴定 据文献记载，1 9 5 8 年s p a c k m a n 等人首次报道了氨基酸分析方法，经过近5 0 年的 发展，氨基酸分析方法得到不断的改进和完善，由最初的阳离子交换色谱分离一柱后茚 三酮衍生化方法发展为多种分析方法并存，互相取长补短，这些方法可以归纳为： 1 3 1 柱后衍生高效阳离子交换色谱法( h 酏) ”1 9 】 高效阳离子交换色谱一柱后茚三酮衍生光度检测分离测定法 这是一种经典的氨基酸分析方法，此方法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而 在阳离子交换柱中分离，分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可见光度检测器检测，检 出限一般在1 0 0 p m o l 以上，现在的自动氨基酸分析仪就是这种原理来分析氨基酸的。 高效阳离子交换色谱一柱后荧光胺邻苯二甲醛衍生光度检测分离测定法 此方法是利用荧光胺，邻苯二甲醛与氨基酸反应产生荧光，再采用荧光检测，但荧光 胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的灵敏度大约提高了3 个数量级。在柱后衍生荧 光检测中，邻苯二甲醛( o p a ) 比荧光胺更常用，检出限一般可达5 l o p m o l 。 柱后衍生高效阳离子交换色谱法缺点：色谱仪器较复杂，需要通过泵和反应器以保 证洗脱液与柱后衍生试剂均匀混合。 3 2 柱前衍生反相高效液相色谱法( r h p l c ) r p h p l c 要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离，并能被灵敏检测的衍生 物。柱前衍生的关键在于衍生试剂的选择，选择衍生试剂的标准是能与各氨基酸定量反 应，每种氨基酸只生成一种化合物且产物有一定的稳定性，不产生或易于排除干扰物。 一些比较常用的柱前衍生试剂主要有相邻苯二甲醛( o p a ) 吲、萘2 。3 二甲醛( n d a ) 【2 ”，9 - 芴甲基氯甲酸酯( f m o c ) 1 2 2 、异硫氰酸苯酯( p i t c ) 【2 3 j 、丹酰氯( d a n s y l c i ) 【州、4 , 4 二甲胺基偶氮苯- 4 一磺酰氯( d a b s - c i ) 【2 5 】、6 - 氨基奎啉- n 羟基琥珀酰亚胺碳酸 盐( a q c ) 【2 6 1 和2 , 4 二硝基氟苯( d n f b ) 【2 刀等，检测方法主要有u v ，荧光。 此方法的缺点：随着衍生试剂的不同，碰到的问题不同，如o p a 衍生法不能检测 伸氨基酸及衍生物不够稳定、f m o c c i 衍生法需要将反应过程中剩余的衍生试剂萃取 出以中止衍生反应，同时避免衍生物的分解。 1 3 3 商效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法 2 s , 2 9 此方法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子 中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位，可在贵金属( 金、铂) 电极表面发生氧 化反应，从而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测。 1 3 4 其它分析技术 其它的分析技术包括毛细管电泳技术( c e ) 3 0 l 、气相色谱( g c ) 1 3 1 1 、高效液相色 谱，质谱( h p l c m s ) 1 3 2 1 、和液相色谱大气压离子化质谱( l c a p i m s ) 1 3 3 ，这些分析 方法都是针对特殊情况需要研发的。 4 第一章绪论 1 4 氨基酸的分离纯化文献综述 由于国内外关于苏氨酸母液的提取文献报导较少，因此有必要参照其它氨基酸发酵 液或母液的提取方法，特别是中性氨基酸的提取，因此想简要介绍一下国内外氨基酸的 分离进展。 氨基酸的分离提纯通常采用离子交换法、色谱法、沉淀剂分离法、膜分离法和溶剂 萃取法等方法f 3 4 - 3 6 1 。 1 4 离子交换法 离子交换法是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异对氨基酸混合物进行 分组或实现单一成分的分离，其在工业中有成功应用的实例，例如，味精厂采用强酸性 阳离子交换树脂对谷氨酸阳离子进行选择性吸附，以使发酵液中妨碍谷氨酸结晶的残糖 及糖的聚合物、蛋白质、色素等非高子性杂质得以分离。k i s a y l e e 等人3 7 1 发现芳香族氨 基酸( 苯丙氨酸和酪氨酸) 在浓度较高时会发生非离子性吸附，吸附量偏离化学计量数 较远，高于脂肪族氨基酸，无法使用钠盐再生。2 5 ( 质量分数) 的乙醇溶液可以有效 地抑制非离子性吸附。t a o z u y i 等人1 3 嗣对氨基酸阳离子与氢离子的交换平衡进行了详细 的研究，给出了1 0 种氨基酸阳离子在低p h 下的热力学平衡方程。李鑫等人【3 明用离子 交换法分离高盐体系中的苯丙氨酸，研究了苯丙氨酸在不同的氯化钠时树脂吸附量的影 响，同时对苯丙氨酸的上柱液浓度、流速及洗杂和洗脱工艺进行了优化研究。s h a o l i n g c h e n g 等人( 4 0 l 用强酸性阳离子交换吸附四种中性氨基酸( 苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸和 甘氨酸) ，得到d 0 0 1 树脂对四种氨基酸吸附量是不同的，氨基酸的不同侧链对其在树脂 上的吸附量有一定影响，通过对热力学参数的分析，证实了氨基酸在树脂上的吸附是疏 水和静电的共同作用结果。 1 4 2 色谱法 色谱法可以分离多元组分组成的混合物，它利用物质的两相中分配系数的微小差异 进行分离，当两相作相对移动时，使被分离物质在两相之间进行反复多次分配，这样原 来微小的分配差异产生较大的效果，使各组分分离，以达到分离的目的。 色谱法用于混合氨基酸分离纯化的研究有一些文献报告，如符若文等人【4 l j 研究了用 n a 2 h p 0 4 - n a o h 缓冲液和氨水作为洗脱液两步洗脱法、采用两性纤维分离谷氨酸和丙氨 酸的混合物，分离度达到2 6 9 ；刘菊湘等人 4 2 1 用一系列不同交换容量的铵型强酸性阳离 子交换树脂为色谱填料，研究了丙氨酸和缬氨酸及缬氨酸和亮氨酸在色谱上的分离，得 知树脂的交换容量较低时采用氯化铵作流动相对中性氨基酸有更好的分离性能；徐宇平 等人 4 3 1 研究了不同阳离子交换树脂种类、温度和洗脱剂等因素对谷氨酸和丙氨酸的色谱 分离，确定用0 0 1 型树脂在洗脱剂为氨水、温度为5 0 c 的条件下，两种氨基酸分离度达 1 5 1 7 。 1 4 3 膜分离法 膜分离技术用于发酵液中氨基酸的分离和精制，可以先用微滤或超滤将发酵液中的 菌体截留并回收利用，透过液经纳滤或反渗透浓缩后，再通过等电点结晶获得高纯氨基 垩堕查兰堡主兰垡笙兰 酸产品，这样不仅可提高氨基酸的质量和收率，而且可节约菌种培养费和分离能耗。 h u a n g 等人1 4 4 将微滤、反渗透和等电点结晶技术相结合，从发酵液中回收谷氨酸。 首先采用膜孔径o 2 l 肿的乙酸纤维素微滤膜澄清发酵液，即去除大小约1 u m 的细菌， 将发酵液浓缩7 倍后。改用渗滤操作洗出截留液中残留的l 谷氨酸，再将渗滤透过液经 反渗透浓缩后得到的截留液，通过真空蒸发进一步浓缩，最后利用等电点结晶技术得到 l - 谷氨酸。g u u e l l 等人【4 5 l 通过调节p h 值利用纳滤膜的带电性质，可以分离相对分子质 量相近而等电点不同的氨基酸。如天门冬氨酸、异亮氨酸、鸟氨酸的相对分子质量分别 是1 3 3 、1 3 1 、1 3 2 ，当p n 值为5 0 时，膜对天门冬氨酸的截留率为4 0 ，对异亮氨酸 和鸟氨酸的截留率均小于1 0 。改变p h 值时，膜对上述种氨基酸的截留率有比较明显 的差异。尽管不是很大，仍可以实现它们之间的分离。王晓琳等人m 1 开展了苯丙氨酸和 天门冬氨酸水溶液的纳滤分离实验，并对分离和浓缩过程进行了模拟计算，采用纳滤膜， 研究不同p h 值下氨基酸的膜分离透过特性，取得较好的分离效果。但膜分离存在易受 污染、寿命低的问题。 1 4 4 沉淀剂分离法 沉淀法法是氨基酸与有机化合物或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，达到 与其它氨基酸分离的目的。周锡梁等人【4 2 l 从胱氨酸母液中提取氨基酸，分别以苯甲醛、 邻二甲苯_ 4 一磺酸和苯三酸为沉淀剂分离精氨酸、亮氨酸和苏氨酸。苯甲醛与精氨酸在 碱性和低温条件下，可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸，将沉淀用盐酸水解除去苯 甲醛，即可得精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻二甲苯_ 4 磺酸反应，生成亮氨酸的磺酸盐， 后者与氨水反应，得到亮氨酸；苯三酸与苏氨酸作用，生成苏氨酸的沉淀物，再经硫化 氢的处理就可得苏氨酸。特殊沉淀法操作简单、选择性强，从胱氨酸母液中分离提取多 种氨基酸，不仅可以大大降低排放液的含氮量，而且还有附加的经济效益，但是特殊沉 淀法的沉淀剂回收较困难，排放废液中参杂有沉淀剂，加重了污染，残留在氨基酸产品 中的沉淀剂还会影响纯度。 1 4 5 萃取法 溶剂萃取法提取氨基酸是近年研究和发展起来的氨基酸分离提取新方法，用溶剂萃 取法对混合氨基酸的萃取已有些的报道。徐占林等人【4 ”用含二( 2 乙基己基) 磷酸乳状液 膜对谷氨酸的萃取研究，以乳状液膜为载体，在酸性条件下可以实现谷氨酸的萃取回收， 内相h + 浓度的大小是最终萃取结果的决定因素，载体是液膜法萃取氨基酸的必备条件。 曹汉瑾等人【驰j 用二( 2 一乙基己基) 磷酸一煤油溶剂萃取苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷 氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸和组氨酸的规律及其温度效应进行了研究。发现其萃 取分配比和氨基酸的结构有关，它取决于氨基酸中基团的极性、所含的碳原子数和氨基 酸的空问结构。萃取反应为放热反应，温度升高对萃取不利。中性氨基酸在溶剂中的分 配比较商，而酸性氨基酸基本上不被萃取。翁连进等人嗍开发了一种新的萃取能力更强 的反胶团二异辛基磷酸铵表面活性剂，这种反胶团在盐浓度高达4 5 m o l l 的胱氨酸母 液中仍具有令人满意大萃取率。 萃取法分离氨基酸的研究方兴未艾，但大多仍处于实验室研究阶段，未见工业报道， 6 笙二兰丝笙 萃取法分离氨基酸必需要解决的几个问题是萃取过程的乳化问题、萃取剂毒性问题、萃 取平衡和传质速率问题。 1 5 苏氨酸母液中苏氨酸和谷氨酸分离方法的研究 苏氨酸母液的重新利用主要是提取母液中高价值的氨基酸，而经过分析得知母液中 氨基酸主要是质量百份比为7 8 的谷氨酸和7 苏氨酸。而氨基酸是一类两性的物质， 在水溶液中具有两性电离的特性。苏氨酸分子中含有一个酸性羧基( - c o o h ) 和一个碱 性氨基( n h 2 ) ，属二性电解质，与酸或碱性作用都能生成盐，它在不同p h 值溶液中 能以3 种不同离子状态存在，见图1 1 ；而谷氨酸分子中含有二个酸性羧基( - c o o h ) 和一个碱性氨基( - n h 2 ) ，也属二性电解质，与酸或碱性作用都能生成盐，它在不同 p h 值溶液中能以4 种不同离子状态存在，见图1 1 。 k l k 2 咿f 卜t 一洲；专邺一p r ；专邺一r c h 一啪 o hn 时 w + 、洲n 时w + 、 o h n h 2 阳离子( t h r + )两性离子( t h r + _ )一价阴离子( t h r - ) q 丛吐趔= e i趟2 区 耳去耳 n 也 旷、自h 2 阳离子( g a + ) 两性离子( g a + - )一价阴离子( “1 = 价阴离子( g a l 幽世必必 图1 1 苏氨酸和谷氨酸电离离子结构形式 表1 1 苏氨酸和谷氨酸的p k 、p i 值 苏氨酸在不同的p h 值条件下可离解成n 一、皿士、n 矿3 种离子状态，利用l - 苏氨酸 各级离解常数，可求出不同p h 值下各种离子所占的百分比见图1 2 。 宅 - 彘 虹 着 砷 衄柚 件 t 蠢 o 图1 2 苏氨酸和谷氨酸离解曲线 7 皇a；兰a 8隶缸墨一衄巾t雌 垩堕查兰堡圭兰垡堡茎 由图1 2 可知，当p h 值在o 0 9 1 范围内，主要以t h r + 离子状态存在；当p h 值在0 9 1 6 1 6 范围内，主要以t h r + 和t i c 离子状态存在，但随着p h 增加，t h r + 离子浓度逐渐减少 而n l r 离子浓度逐渐增加；当p h 值在6 1 6 7 2 4 范围内，主要以t h r ：离子状态存在；当 p h 值在7 2 4 1 1 8 范围内，主要以n 矿和t h r 离子状态存在，但随着p h 增加，t 舻离子浓 度逐渐减少而t h r 离子浓度逐渐增加；当p h 值在1 1 8 1 4 0 范围内，主要以t h r 离子状态 存在。苏氨酸的等电点为6 1 6 t 5 0 l ，苏氨酸随着p h 值变化过程各种离子变化曲线见图1 2 。 谷氨酸在不同的p h 值条件下可离解成g a + 、g a + 、g a 和g d 4 种离子状态，利用谷氨酸 各级离解常数( 见表1 1 ) ，可计算出不同p h 值下各种离子所占的百分比见图1 2 。当p h 值在o 2 1 9 范围内，g a 主要以g ”和g a i 士离子状态存在，随着p h 增加，g a + 离子浓度 逐渐减少而g a + 离子浓度逐渐增加，当p h 值为2 1 9 时，g a + 和g a 士各占g a 的5 0 ；当p h 值在2 1 9 4 2 5 范围内，g a 以g a + 、g a 士和g a 离子状态存在，随着p h 增加，g a + 离子浓 度逐渐减少，g a 离子浓度逐渐增加，而g a 士在p h 值为2 1 9 3 2 2 范围内离子浓度逐渐增 加，在p h 值为3 2 2 4 2 5 范围内离子浓度逐渐减少，当p h 值为3 2 2 时，g a + 占g a 的 8 4 2 4 ，当p h 值为4 2 5 时，g a 和g a 各占g a 的5 0 ；当p h 值在4 2 5 6 0 范围内，g a 主要以g a 士和g a 离子状态存在，随着p h 增加，g a 士离子浓度逐渐减少而g a 。离子浓度逐 渐增加；当p h 值在6 o 1 3 0 范围内，g a 主要以g a 。和g a 。离子状态存在，随着p h 增加， g a 离子浓度逐渐减少而g a 2 。离子浓度逐渐增加，当p h 值为9 6 7 时，g a - 和g a 2 。各占g a 的5 0 。谷氨酸的等电点为3 2 2 ，谷氨酸随着p h 值变化过程各种离子变化曲线见图1 2 。 针对苏氨酸和谷氨酸的离子特性，可以选择离子交换技术分离苏氨酸和谷氨酸，因 为苏氨酸的等电点为6 1 6 ，当p h 值在低于等电点时溶液中才有反离子存在，即一价苏氨 酸阳离子，说明在进行阳离子交换时溶液的p h 值必须低于等电点时，才有苏氨酸离子被 吸附。因此在较低的p h 值范围内，有利于提高l 苏氨酸的吸附率，但p h 不能调得过低， 因为发酵液里面还有谷氨酸，谷氨酸电离情况随着p h 的变化如图1 2 ，当p h 3 2 2 时，谷 氨酸溶液中才有一价谷氨酸阳离子出现。因此可以选择母液p h 为4 5 进行阳离子交换树 脂吸附苏氨酸的实验，但母液中含无机盐( 主要是氯化铵和氯化钠) ，要考察铵离子和 钠离子对苏氨酸在阳离子交换树脂上竞争吸附的影响。如果影响较大，可以采用色谱法 来分离苏氨酸和谷氨酸。通过前面查阅的文献可知离子交换色谱已成功分离混合氨酸 1 4 1 删，但流动相使用了n a 2 h p 0 4 、n a o h 和氨水等无机物进入氨基酸溶液中，使分离得 到氨基酸含有大量的无机物，另外没有考察氨基酸的回收率和柱效等指标。因此研究色 谱法分离苏氨酸和谷氨酸，关键是要寻找到不可逆吸附少和柱效高的色谱固定相。 1 6 本课题的立题依据与意义 宁波生物工程有限公司日产苏氨酸废液2 吨，目前尚无有效的治理技术，该废液对 当地的水环境造成了严重的污染。该厂欲开发母液中氨基酸回收及处理新工艺，与本课 题组进行合作。另外近年来国内外苏氨酸工业发展很快，苏氨酸产量到目前为止己达到 1 0 万吨，但是苏氨酸高浓度废水的污染已成为苏氨酸工业发展面临的主要问题。苏