核心结合因子α1基因沉默对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响(论文).pdf

生堡医堂苤查! q ! ! 生! 旦! ! 旦筮! ! 鲞箜! 翅盟! ! ! 丛鲤g ! i 塑：! ! ! ! 翌垫：! ! ! ! ：! ! ! ：丝：盟! ：兰 核心结合因子仪一1 基因沉默对高磷诱导的 血管平滑肌细胞钙化的影响 余毅魏培丹 2 5 1 慢性肾脏病 【摘要】目的研究核心结合因子仪1 ( c b f c t - 1 ) 基因沉默对高磷诱导的血管平滑肌细胞 ( v s m c ) 成骨样分化和钙化的影响。方法体外原代培养大鼠v s m c 。针对大鼠c b 缸1 基因设计合 成4 对候选小分子干扰r n a ( s i r n a ) 序列，以l i p o2 0 0 0 为载体，转染体外培养的v s m c ；f a m 荧光标 记s i r n a 优化转染条件。反转录( r t ) 一p c r 检测c b f c t 一1m r n a 表达，筛选有效s i r n a 序列。将有效 s i r n a 序列转染v s m c ，细胞分为4 组：( 1 ) 正常磷组( 1 3m m o l z l ) ；( 2 ) 高磷组( 2 6m m o l l ) ；( 3 ) s i r n a 转染组：高磷十c b f a 一1 一s i r n a ；( 4 ) 阴性转染对照组：高磷+ 阴性对照s i r n a 。r t p c r 和 w e s t e r n 印迹法检测c b 缸一1 、骨桥蛋白( o p n ) 基因和蛋白表达；茜素红染色观察细胞钙盐沉积。结果 在c b f e t 一1 一s i r n a 浓度为1 0 0n m o l l 、l i p o 为8t x l ：f l 转染条件下，转染效率约5 5 ；筛选最佳干扰序列 c b f c l 【一1s i r n a l 9 5 2 ，转染2 4h 沉默效率可达8 1 8 。与高磷组相比，s i r n a 转染组c b f c t 1m r n a 表达 在转染后2 4 和4 8h 均明显低于高磷组( 2 4h ：0 3 3 5 0 0 5 9 比0 7 1 4 0 1 0 6 ，4 8h ：0 5 7 4 0 0 3 6 比 0 7 2 6 0 0 8 6 ，均p 0 0 1 ) ；c b f a 一1 蛋白表达在转染后4 8 和7 2h 均显著低于高磷组( 均p 0 0 1 ) ， 以4 8h 最明显。s i r n a 有效沉默c b f a 一1 基因表达后，s i r n a 转染组o p nm r n a 和蛋白的表达明显低 于高磷组( 均p 0 0 5 ) ，且细胞钙盐沉积亦明显低于高磷组。结论化学合成的c b f o t 1s i r n a 可有 效抑制v s m cc b f c t 一1 基因和蛋白的表达，从而抑制高磷诱导的v s m c 成骨样转分化和细胞钙化。 c b f a 一1 可望成为c k d 血管钙化治疗的靶点。 【关键词】血管中膜； 肾机能不全，慢性；动脉硬化；r n a ，小分子干扰；核心结合因子 d 1 亚基 e f f e c t so fc o r e - b i n d i n gf a c t o ra lg e n es i l e n c e db ys i r n ao nc a l c i f i c a t i o no fv a s c u l a rs m o o t hm u s c l e c e l l si n d u c e db yh i g hp h o s p h a t ey uy i ，w e ip e i d a n d e p a r t m e n to fb l o o dp u r i f i c a t i o n ，f u z h o ug e n e r a l h o s p i t a fo fn a n f i n gc o m m a n d f u z h o u3 5 0 0 2 5 c h i n a c o r r e s p o n d i n ga u t h o r ：y uh ，e m a i l ：y u y i c n 1 2 6 c o r n 【a b s t r a c t 】o b j e c t i v e t oe x p l o r et h ee f f e c t so fc o r e - b i n d i n gf a c t o rc t l ( c b 缸一1 ) g e n es i l e n c e db y s i r n ao no s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o na n dc a l c i f i c a t i o no fv a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l sfv s m c 、i n d u c e db y h i g hp h o s p h a t ei nv i t r o m e t h o d sv s m cw e r ec u l t u r e di nv i t r oa n dp a s s a g e d3t o8t i m e s f o u rp a i r so f c b 缸一1s i r n aw e r e d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t r a n s f e c t i o nw a sp e r f o r m e d w i t hc a t i o n i c 1 i p i dv e c t o r s ( l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ) t r a n s f e c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e db yt h ef a mf l u o r e s c e n tl a b e l i n g s i r n at o s c r e e ne f f e c t i v es i r n as e q u e n c e sb yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t p c r ) a f t e r t r a n s f e c t i o nw i t he f f e c t i v es i r n as e q u e n c e s ，v s m c sw e r ed i v i d e di n t o4g r o u p s ：( 1 ) n o r m a lp h o s p h a t e ( p i 1 3m m o l l ) ；( 2 ) h i g hp h o s p h a t e ( p i2 6m m o l l ) ；( 3 ) s i r n at r a n s f e c t i o n ：h i g hp h o s p h a t e + c b 缸一1 一 s i r n a ；( 4 ) n e g a t i v et r a n s f e c t i o nc o n t r 0 1 ：h i g hp h o s p h a t e + n e g a t i v ec o n t r o ls i r n a c b 缸一1a n do s t e o p o n t i n ( o p n ) m r n aa n dp r o t e i ne x p r e s s i o nw e r ed e t e c t e db yr t p c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g c a l c i u md e p o s i t i o n w a sv i s u a l i z e db ya l i z a r i ns t a i nm e t h o d r e s u l t st h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yw a sa r o u n d5 5 w i t ha c o n c e n t r a t i o no fc b 缸一ls i r n a1 0 0n m o l la n dl i p o8u l w e l l c b f c i 【1s i r n a1 9 5 2w a sc h o s e na st h e e f f e c t i v es e q u e n c ew i t ha s u p p r e s s i o nr a t i ou pt o8 1 8 a t2 4a n d4 8hp o s t t r a n s f e c t i o n t h ee x p r e s s i o no f c b f c 一1m r n aw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri ns i r n at r a n s f e e t i o n g r o u pt h a nt h a t i n h i g hp h o s p h a t eg r o u p ( 0 3 3 5 0 0 5 9v s0 7 1 4 0 1 0 6 ，0 5 7 4 0 0 3 6v s0 7 2 64 - 0 0 8 6 ，a l lp 0 0 1 ) a t4 8a n d7 2hp o s t t r a n s f e c t i o n t h ee x p r e s s i o no fc b f a lp r o t e i ni ns i r n at r a n s f e c t i o ng r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n h i g hp h o s p h a t eg r o u p ( b o t hp 0 0 1 ) w h i l ec b f e 一1g e n ew a ss i l e n c e db ys i r n ai ns i r n at r a n s f e c t i o n g r o u p ，t h em r n aa n dp r o t e i ne x p r e s s i o no fo p ns i g n i f i c a n t l yd e c l i n e d ( a l lp 0 0 5 ) a n dc a l c i u md e p o s i t i o n d o i ：1 0 3 7 6 0 c m a j i s s n 0 3 7 6 - 2 4 9 1 2 0 1 4 0 4 0 0 4 基金项目：福建省科技计划重点项目( 2 0 1 3 y 0 0 6 9 ) 作者单位：3 5 0 0 2 5 南京军区福州总医院血液净化科 通信作者：余毅，e m m l ：y u y i c n 1 2 6 c o r n 万方数据 生堡匡堂盘壹! ! ! ! 生! 旦! ! 旦笠! 堡鲞箜垒翅盟! ! ! 丛塑! i 塑：! ! ! ! 旦! ! ：! ! ! ! ：y ! ! ：丝：盟! ：垒 i nc e l ll a y e r sd e c r e a s e d c o n c l u s i o n s c b 缸一1s i r n ac a ne f f e c t i v e l yi n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fc b f o 一1 m r n aa n dp r o t e i ni nv s m ca n dt h u ss u p p r e s st h et r a n s f o r m a t i o no fv s m ci n t oo s t e o b l a s t 1 i k ec e l l sa n d c a l c i f i c a t i o ni n d u c e db y h i g hp h o s p h a t e c b f e t 一1m a yb e c o m eap o t e n t i a lt h e r a p e u t i ct a r g e ti nv a s c u l a r c a l c i f i c a t i o no fc h r o n i ck i d n e yd i s e a s e 【k e yw o r d s 】t u n i e am e d i a ； r e n a li n s u f f i c i e n c y ，c h r o n i c ； a r t e r i o s c l e r o s i s ；r n a ，s m a l l i n t e r f e r i n g ；c o r e b i n d i n gf a c t o rc t l 血管钙化在慢性肾脏病( c k d ) 患者普遍存在， 并随着肾功能的减退和肾脏病的进展而加重。血管 钙化的发病机制是复杂的，受多因素影响。研究表 明，血管平滑肌细胞( v s m c ) 表达成骨细胞表型是 血管钙化过程的中心环节。核心结合因子d 1 ( c b f e l 一1 ) 是成骨细胞发生和分化的特异性转录因 子，能特异性识别成骨基因启动子中的特异性顺式 作用元件，掌控下游相关骨基质蛋白和骨胶原成分 ( 如骨钙素、骨桥蛋白和骨碱性磷酸酶等) 的产生， 调控成骨细胞发育、分化，调节骨骼的矿化及骨形 成。在动脉粥样硬化斑块和钙化血管中层c b f a 一1 表达明显上调o i - 3 ，c k d5 期患者血管钙化灶上 c b f a l 的表达远高于非钙化灶，并且可能与促进 v s m c 向成骨样细胞转分化有关，提示c b 缸1 是 c k d5 期患者血管钙化的重要调节因子口j 。 本研究以体外培养的大鼠v s m c 为研究对象， 应用c b f a 1 特异的s i r n a 沉默v s m cc b f a 1 基因， 观察c b f a 一1 基因下调对高磷诱导的v s m c 成骨样 分化和钙盐沉积的影响，探讨c b f a 一1 在高磷诱导的 v s m c 钙化中的作用，为c k d 血管钙化的治疗提供 可能的靶点。 材料与方法 1 大鼠v s m c 培养及鉴定：按照前期研究中所 采用的方法对v s m c 进行原代培养及相关鉴定hj ， 实验用第3 8 代细胞。 2 主要试剂：胎牛血清、d m e m 低糖培养基和 无血清培养基( o p t i m e m ) 均为美国g i b c o 公司产 品；l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 购自美国i n v i t r o g e n 公司； c b f e t 1 兔抗大鼠多克隆抗体、骨桥蛋白( o p n ) 兔抗 大鼠多克隆抗体购自美国a b c a m 公司。 3 s i r n a 的设计及合成：根据g e n b a n k 公布的 c b f a 一1 m r n a ( n m 一0 5 3 4 7 0 2 ) 全长序列，依照 s i r n a 设计原则，利用a m b i o ns i r n a 软件设计4 对 c b f o r 一1s i r n a 序列，并自行设计阴性对照序列，经 b l a s t 分析证实具有良好的特异性，由上海吉玛制药 技术有限公司合成。具体序列见表1 。 4 转染条件优化：在检测不同浓度的f a m 一 表1 针对c b f e t 一1 基因设计的s i r n a 序列 编号引物序列( 57 3 ) 上游c c g g g a a u g a u g a g a a c u a t t 下游u a g u u c u c a u c a u u c c c g g 7 丌 上游g c a u u c c u c a u c c c a g u a u t t 下游al _ a c u g g g a u g a g g a a u g c t t 上游c a g g c g u a u u u c a g a u g a u t t 下游a u c a u c u g a a a u a c g c c u g r i 上游c a c g c u a u u a a a u c c a a a u t t 下游a u u u g g a u u u a a u a g c g u g t t 上游u u c u c c g a a c g u g u c a c g u t t 下游a c g u g a c a c g u u c g g a g a a i t r e 游u u c u c c g a a c g u g u c a c g u i t r 下游a c g u g a c a c g u u c g g a g a a 7 r r 注：c b f a 1 ：核心结合因子d 1 ( 下图表同) s i r n a 对转染率的影响时，转染试剂l i p o2 0 0 0 的浓 度为8i l l ，f a m s i r n a 的浓度分别取2 5 、5 0 、i 0 0 、 2 0 0n m o l l ；在检测不同浓度l i p o2 0 0 0 对转染率的 影响时，f a m s i r n a 的浓度取1 0 0n m o l l ，l i p o 2 0 0 0 分别取6 、8 、1 0 l ，每组均设2 个复孑l 。细胞 转染6h 后在荧光显微镜下观察各孔细胞内的荧光 显色，每孑l 取3 个具有代表性的视野，各观察1 0 0 个 细胞，计算阳性细胞率，并根据目测结果筛选f a m s i r n a 的优化转染浓度。 5 有效序列的筛选：将复苏后的细胞以( 3 5 ) 1 0 5 细胞孔接种于6 孔培养板中，细胞随机分 为5 组：阴性转染对照组、c b f a 一1s i r n a l 4 组，转 染后6h ，更换普通培养基。转染后2 4h 常规 t r i z o l 法提取细胞总r n a ，紫外分光光度法测定 r n a 浓度及纯度。用1i x g 总r n a 进行c d n a 的合 成，再行p c r 扩增。r t p c r 检测靶基因c b 缸1 m r n a 表达，其引物序列上游5 g c a c t a t c c a g c c a c c t i c a 37 ，下游5 7 c t t c c a t c a g c g t c a a c a c c 3 ，以b 一肌动蛋白( a c t i n ) 为内参照，引物序列：卜- 游5 g t c c c t g t a t g c c t c t g g t c 37 ，下游5 a g g t c t tt a c g g a t g t c a a c g 3 。反应条件：9 4 预变 性5m i n ，扩增9 4 3 0s ，退火3 0s ，延伸7 2 1 m i n ，退火温度分别为c b 缸一15 5o c ，b a c t i n5 8o c 。 循环次数分别为c b f a 13 0 个循环，b a c t i n2 5 个循 环。取3 lp c r 扩增产物于2 琼脂糖凝胶电泳， 燃 瑚 叭 懈 a a a a 受 n n n n m 生 r r r r 川 孙 5； 虬 虬 虬丌r叭眇 万方数据 主堡匿堂苤查垫! 兰堡! 旦垫旦筮丝鲞筮堡塑盟型丛塑! i 坠：塑! ! 型! ! ：垫! 堡：! ! ：丝，型! ：兰 内参与目的基因条带灰度值由q u a n t i t yo n e 凝胶图 像分析软件进行灰度值扫描。r t p c r 法检测4 对 c b h 1s i r n a 序列对c b f a 1 基因表达的抑制作用， 选取4 对候选序列中抑制效率最高的s i r n a 用于后 续实验。 6 细胞转染与实验分组：将复苏后的细胞随机 分为4 组：a ：正常磷组；b ：高磷组；c ：s i r n a 转染 组；d ：阴性转染对照组。s i r n a 转染组：以经上述 方法筛选优化的有效抑制s i r n a 转染细胞；阴性转 染对照组：具有与s i r n a 转染组相同的转染条件， 但无有效抑制s i r n a 转染。转染4 6h 后，正常磷 组换用正常磷( 1 3m m o l l ) 培养基培养，后3 组均 换用含高磷( 2 6m m o l l ) 培养基培养。4 组培养基 中钙离子浓度均为1 8m m o l l 。分别于转染后2 4 、 4 8h 提取细胞总r n a 和转染后4 8 、7 2h 提取细胞 总蛋白。 7 r t p c r 检测c b 缸1 和o p nm r n a 表达：收 集各组细胞，弃去上清，方法同前。o p n 引物序列： 上游5 c a a g g a g t a t a a g c a g g g c c a3 ，下游5 7 a c t c t r a g g g t c t a g g a c t a g c q t g t37 ，反应条件： 9 4 预变性5m i n ，扩增9 4 3 0s ，退火5 7 3 0s ， 延伸7 2 1m i n ，2 5 个循环。 8 w e s t e m 印迹法检测c b 缸一1 和o p n 蛋白表 达：收集各组细胞，按常规方法提取蛋白质并进行蛋 白定量( b c a 法) ，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝 胶电泳( s d s p a g e ) 分离，转膜、封闭，加人一抗稀 释液，4 孵育过夜。洗膜，加入h r p 标记的二抗 稀释液( 1 ：30 0 0 ) ( b - a c t i n1 ：50 0 0 ，c b 如- 11 ：30 0 0 ， o p n1 ：1 00 0 0 ) ，室温下孵育2h ，化学发光后x 线片 曝光。图像分析软件扫描条带灰度值，计算蛋白表达 相对定量。 9 茜素红染色法观察细胞钙盐沉积：按以上方 法转染和诱导细胞，转染后第6 天固定细胞，1 茜 素红染色5 1 0m i n ，显微镜下观察、拍照。 1 0 统计学处理：用s p s s1 7 0 统计软件分析。 符合正态分布计量资料以元s 表示，采用单因素方 差分析和l s d t 检验，不符合上述要求采用秩和检 验。p 0 0 5 为差异有统计学意义。 结果 1 最佳转染浓度优化结果：荧光显微镜下可见 成功转染的细胞发出f a m 绿色荧光，荧光亮度观察 显示，当f a m - s i r n a 浓度为1 0 0n m o l l ，l i p o2 0 0 0 为8 斗l 孔时，v s m c 转染效率约5 5 ，故后续实验 都按此条件转染( 图1 ) 。 l 2 候选s i r n a 筛选结果：s i r n a 转染v s m c 后，与阴性转染对照组相比，4 对c b f a 一1s i r n a 序列 只有s i r n a l 6 9 8 和s i r n a l 9 5 2 序列为有效序列 ( 图2 ) ，各组c b f a 1 相对表达量分别为：阴性转染 对照组：0 8 7 2 0 0 8 1 ，s i r n a1 4 1 7 ：0 8 3 i 0 0 9 3 ， s i r n a l 6 9 8 ：0 3 0 9 0 0 5 4 ，s i r n a l 9 5 2 ：0 1 5 9 0 0 3 5 ，s i r n a 2 3 8 4 ：0 8 3 34 - 0 0 8 0 。其中s i r n a l 9 5 2 序列有最佳抑制c b f o l 1 基因的作用，与阴性转染对 照组相比，抑制效果最明显( p 0 0 1 ) ，转染2 4h 后 抑制效率达8 1 8 ，故实验选定c b f a 1s i r n a1 9 5 2 作为有效抑制c b f a 1 的s i r n a 。 b 一肌动蛋白4 5 9b p c b f a 一13 2 1b p 、1 概、瓶譬照物：1。他转拈 j 照川：! ( “_ 1 - i l 1 4 l7 ； 3 c b h - 1s i r n a l 6 9 8 ：4 c b f a 一1s i r n a l 9 5 2 ：5 c b f a - ls i r n a 2 3 8 4 图2 反转录p c r 对候选s i r n a 的筛选结果 3 c b f a - 1s i r n a 对v s m cc b f c - 1 和o p n m r n a 表达的影响：转染后2 4h ，高磷组v s m c 中 c b f a 1 和o p nm r n a 表达均高于正常磷组( 均p 0 0 1 ) ，s i r n a 转染组c b 缸一1m r n a 表达低于高磷 组及阴性转染对照组( 均p 0 0 5 ) ；转染后 4 8h ，s i r n a 转染组c b f a 1m r n a 表达仍低于高磷 组及阴性转染对照组( 均p 0 0 5 ) ，但高于正常磷 组( p 0 0 5 ) ；o p nm r n a 表达低于高磷组及阴性 转染对照组( 均p 0 0 5 ) ，但高于正常磷组( p 0 0 5 ) ( 图3 ，表2 ) 。 4 c b f c t - 1s i r n a 对v s m c c b f a 一1 和o p n 蛋白 粒光帷荧糊色绿佴镟蛐微 燃粕僦荧堋础。曼张溉蜡儿f 锡删黼州 耵艟w 1 y m图t 队 万方数据 ! r j 罡匡堂盘圭! ! ! 堡生! 旦垫旦筮! 堡鲞笠兰塑堕堕! 丛型些i 塑：! 型! 翌垫：! ! ! ! ：! ! ：丝：盟! ：兰 4 8h l234 b 一肌动蛋白4 5 9b p m 标准参照物；1 正常磷组；2 高磷组；3 s i r n a 转染组； 4 阴性转染对照组 图3 转染后2 4 、4 8h 各组血管平滑肌细胞c b f a 一1 、o p nm r n a 表达注：o p n ：骨桥蛋白，下图表同 表2 各组血管平滑肌细胞转染后2 4 、4 8hc b f c 一1 、 o p nm r n a 相对表达量( 凡= 3 ，i s ) 注：与转染后同时间高磷组比较，8 p 0 0 1 ，6 p 0 0 5 ；与转染 后同时间正常磷组相比较，。p 0 0 5 表达的影响：转染后4 8h ，高磷组c b 缸一1 和o p n 蛋 白表达较正常磷组均显著高( 均p 0 0 1 ) ，s i r n a 转染组c b 缸1 蛋白表达较高磷组及阴性转染对照 组明显低( 均p 0 0 5 ) 。转染后7 2h ，s i r n a 转 染组c b 缸1 蛋白表达仍低于高磷组及阴性转染 对照组( 均p 0 0 5 ) ，但高于正常磷组( p 0 0 5 ) ； o p n 蛋白表达低于高磷组及阴性转染对照组( 均 p 0 0 5 ) ，但高于正常磷组( p 0 0 5 ) ( 图4 ， 太3 ) c b f a 一1 ( 5 70 0 0 ) 0 p n ( 6 60 0 0 ) b 一肌动蛋自( 4 30 0 0 ) 1 ij 常磷川：! 高膦川：3 - t i 、转染组：4 陛转染州峨组 图4 转染后4 8 、7 9h 各组血管平滑肌细胞c b f c t - 1 、o p n 蛋白表达 5 c b f c 1s i r n a 对v s m c 钙盐沉积的影响：细 胞转染后第6 天，在正常磷组中，v s m c 细胞外未见 钙盐沉积，高磷组和阴性转染对照组中可见大量橘 红色钙盐沉积，而s i r n a 转染组细胞钙盐沉积明显 减轻( 图5 ) 。 表3 转染后4 8 、7 2h 各组血管平滑肌细胞c b f c c 一1 、o p n 蛋白相对表达量( n = 3 ，面s ) 注：与转染后同时间高磷组比较，8 | p 0 0 1 ，6 p 0 0 5 ；与转染 后同时间正常磷组比较，。p 0 0 5 冬篷一 涠擎 孵0 瓣二 图5 彳 组中m 僻平滑肌细胞的钙盐沉积茜素红染色 2 0 0 【i 享i 巾满红包即为钙盐沉积a 正常磷( 13m t - t i ) 组；b 岛 磷( 2 6m m o l l ) 组；c s i r n a 转染组；d 阴性转染对照组 讨 论 血管钙化在c k d 患者普遍存在，和许多不良临 床终点事件密切相关。研究发现c k d 5 期尤其是透 析患者，与无动脉钙化者相比生存率明显下降j 。 c k d 患者血管钙化发生的机制极其复杂，一般认为 多种因素参与了病变过程。本课题组前期研究已发 现，高磷是体外培养的大鼠v s m c 和残肾大鼠血管 钙化的重要影响因素，并且高磷可能通过上调 c b 缸1 表达，参与血管钙化的发生口刁j 。已有大量的 研究证实，v s m c 是参与血管钙化的主要细胞，高磷 条件可成功诱导体外培养的v s m c 钙化。4 8 10 | 。本实 验对大鼠v s m c 钙盐沉积的检测表明，采用高磷 ( 2 6m m o l l ) 条件可成功诱导建立v s m c 钙化模型。 高磷诱导血管钙化的机制尚不完全明确，但高 磷刺激v s m c 表型转化是目前广泛认同的观点。高 磷可诱导v s m c 表达成骨细胞表型，即促进成骨细 胞样基因( 如c b 缸一1 、o p n 及骨钙蛋白) 表达，并抑 万方数据 主堡医堂苤查! q ! 兰生! 旦垫旦箜塑鲞筮兰塑堕型丛盟堡! i 塑：! ! ! ! 型垫：! ! ! ! ：y ! ! ：丝：盟! ：堡 制平滑肌细胞特异性基因( 如s m 仪a c t i n 和s m 2 2 a ) 表达，最终诱导v s m c 钙化。本实验结果显示， c b f a - 1 和o p n 等成骨细胞标志蛋白在高磷培养基 中表达明显增加，表明高磷能够诱导v s m c 向成骨 样细胞转分化，这可能是c k d 发生血管钙化的重要 机制之一。 c b f a - 1 是骨髓间质干细胞成骨化和骨发育所 必需的关键因子，也是成骨细胞形成最早的、最具特 异性的细胞因子1 1 i 。c b 缸一1 在成骨细胞分化与骨 骼形成中的作用已比较清楚；关于c b f a 1 与c k d 血管钙化的关系，近年来已备受关注。n a k a n o k u r i m o t o 等12 。研究发现，k l o t h o 基因缺陷小鼠模型 ( 类似人类慢性肾衰竭血管钙化) ，血管钙化灶处 c b 缸1 表达明显增加；体外研究发现，在高磷 ( 2 5m m o l l ) 条件下培养的v s m c ，细胞钙沉积、 c b f a 一1 、i 型胶原蛋白表达及碱性磷酸酶活性显著 升高，而予s i r n a 沉默c b 缸1 基因后，细胞钙沉积 和碱性磷酸酶活性明显减少，v s m c 钙化受抑，提示 c b 缸一1 在血管钙化发生中起重要作用，其表达上调 与促进v s m c 向成骨样细胞转分化有关。为进一步 阐明c b f a 1 在血管钙化发生中的核心作用，我们以 体外培养的大鼠v s m c 为研究对象，采用r n a i 技 术进行研究。本实验采用脂质体瞬时转染方法转染 大鼠v s m c ，结果显示在合适的条件下，脂质体l i p o 2 0 0 0 可将c b f e 一1s i r n a 成功转染到大鼠v s m c 中， 最高转染效率可达5 5 。4 对候选c b 缸- 1s i r n a 序列中沉默效率最高可达8 1 8 ，c b f a 1s i r n a 转 染高磷培养的v s m c 后，s i r n a 转染组c b 缸- 1 基因 和蛋白的表达低于高磷组及阴性转染对照组，表明 c b f a 1s i r n a 成功抑制了高磷诱导的v s m cc b f a - 1 基因和蛋白的表达；在蛋白水平上，该基因沉默效应 在s i r n a 转染后7 2h 仍然有效，从而证实了应用 s i r n a 沉默v s m cc b f a 1 基因的可行性和有效性。 o p n 是细胞外基质中的一种重要的非胶原性 骨基质糖蛋白，是成骨细胞的表型之一。o p n 和骨 钙素等相关骨基质蛋白编码基因的启动子上存在 c b 缸1 结合位点，c b f a 1 基因能诱导上述基因和蛋 白表达，从而促使细胞向成骨细胞分化。1 3 。1 4j 。本实 验发现c b 缸1 被s i r n a 靶向抑制后，能够逆转高磷 诱导的o p n 表达上调，明显减少细胞钙盐沉积，说 明c b 缸1 表达上调在高磷诱导v s m c 表型转分化 和钙化中是必需的。c b 缸1 调控着下游相关骨基 质蛋白的作用，c b f a 一1 表达受抑，可以阻止v s m c 向成骨样细胞转分化和细胞钙化。本研究通过基因 沉默技术证实了c b f a 一1 在高磷诱导的v s m c 钙化 发生、发展中的关键作用。 本实验应用化学合成的s i r n a 进行瞬时转染， 只能观察细胞短时间内产生的基因沉默效应，下一 步拟制备慢病毒载体介导的c b 缸1 s i r n a 导入高 磷培养的v s m c 和高磷诱导的残肾血管钙化模型， 稳定转染以获得较长时间的靶基因抑制，以便更全面 地观察c b 缸1 靶基因抑制效应对血管钙化的影响。 参考文献 1 y o s h i d ah ，y o k o y a m ak ，y a g i n u m at d i f f e r e n c ei nc o r o n a r y a r t e r yi n t i m aa n dm e d i ac a l c i f i c a t i o ni na u t o p s i e dp a t i e n t sw i t h c h r o n i ck i d n e yd i s e a s efj c l i nn e p h r o l ，2 0 1 l ，7 5 ：1 - 7 2 c h e nn x ，o n e i l lk d ，c h e nx ，e ta 1 a c t i v a t i o no f a r t e r i a l m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e sl e a d st ov a s c u l a rc a l c i f i c a t i o ni nc h r o n i c k i d n e yd i s e a s e j a mjn e p h r o l ，2 0 1 1 ，3 4 ：2 1 1 - 2 1 9 3 y uy t h ee x p r e s s i o no fr u n x 2a n dc o li ii na r t e r i e so fr e m n a n t k i d n e yr a t sa n dp a t i e n t sw i t hc h r o n i cr e n a lf a i l u r e j ja ms o c n e p h r o l ，2 0 1 1 ，2 2 ：6 4 1 a 4 余毅，林开平骨形态发生蛋白- 7 抑制高磷诱导的血管平滑 肌细胞钙化 j 中华肾脏病杂志，2 0 1 1 ，2 7 ：6 9 2 - 6 9 3 5 e d d i n g t o nh ，h o e f i e l dr ，s i n h as ，e ta 1 s e r u mp h o s p h a t ea n d m o r t a l i t yi np a t i e n t sw i t hc h r o n i ck i d n e yd i s e a s e j c l i nja m s o cn e p h r o l ，2 0 1 0 ，5 ：2 2 5 1 2 2 5 7 6 y uy ，c a oc y t h ee f f e c t so fc o r e - b i n d i n gf a c t o ra n dc o l l a g e n t y p e o nh y p e r p h o s p h a t e m i a - i n d u c e dv a s c u l a rc a l c i f i c a t i o ni n r a t sw i t hr e m n a n tk i d n e y s j a mjh y p e r t e n s ，2 0 1 3 ，2 6 ： 2 9 8 7 y uy ，h u a n gt k l o t h oa n dn a + p ic o t r a n s p o r t e ro i lh i g h p h o s p h o r o u si n d u c e dv a s c u l a rc a l c i f i c a t i o na n de a r l yi n t e r v e n t i o n b ys o d i u mt h i o s u l f a t e i nr e m n a n tk i d n e yr a tj ja ms o c n e p h r o l ，2 0 1 2 ，2 3 ：7 9 4 a 81 k e n d r i c kj c h o n c h o lm t h er o l eo fp h o s p h o r u si nt h e d e v e l o p m e n ta n dp r o g r e s s i o no fv a s c u l a rc a l c i f i c a t i o n j a mj k i d n e yd i s ，2 0 1 1 ，5 8 ：8 2 6 8 3 4 9 m a c k e n z i en c ，z h ud ，l a n g l e yl ，e ta 1 m o v a s - 1c e l ll i n e ：a n e wi nv i t r om o d e lo fv a s c u l a rc a l c i f i c a t i o n j i n tjm o lm e d ， 2 0 1 1 ，2 7 ：6 6 3 - 6 6 8 1 0 伍敏，刘必成慢性肾脏病血管钙化机制的研究进展 j 中 华医学杂志，2 0 1 3 ，9 3 ：2 7 5 9 2 7 6 1 1 1 b u r t o nd g ，m a t s u b a r ah ，i k e d ak p a t h o p h y s i o l o g yo fv a s c u l a r c a l c i f i c a t i o n ：p i v o t a lr o l eo fc e l l u l a rs e n e s c e n c ei nv a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l s j e x pg e r o n t o l ，2 0 1 0 ，4 5 ：8 1 9 8 2 4 1 2 n a k a n o k u r i m o t or ，i k e d ak ，u r a o k am ，e ta 1 r e p l i c a t i v e s e n e s c e n c eo fv a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l se n h a n c e st h e c a l c i f i c a t i o nt h r o u g hi n i t i a t i n gt h eo s t e o b l a s t i ct r a n s i t i o n j a m jp h y s i o lh e a r tc i r cp h y s i 0 1 2 0 0 9 2 9 7 ：h 1 6 7 3 一h 1 6 8 4 1 3 e n o m o t oh ，e n o m o t o - 1 w a m o t om ，1 w a m o t om ，e ta 1 c b f a 一1i sa p o s i t i v er e g u l a t o r yf a c t o ri nc h o n d r o c y t em a t u r a t i o n j jb i o l c h e m ，2 0 0 0 ，2 7 5 ：8 6 9 5 - 8 7 0 2 | 1 4 b a ej s ，g u t i e r r e zs ，n a r l ar ，e ta 1 r e c o n s t i t u t i o no fr u n x 2 c b f a l n u l lc e l l si d e n t i f i e sar e q u i r e m e n tf o rb m p 2 s i g n a l i n g t h r o u g ha r u n x 2f u n c t i o n a ld o m a i nd u r i n go s t e o b l a s td i f