（分析化学专业论文）固定化酶微流控芯片用于蛋白质组学的研究.pdf

内容摘要基于整体浇铸或氧等离子体表面处理技术，设计制作了集不锈钢管、微通道于一体的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 微流控芯片。在此基础上，发展了多种化学稳定、寿命长、活性高的p d m s 微流控芯片固定化酶新技术。将这些新技术用于微酶反应器的制备，实现了与m a l d it o fm s 和e s im s 的联用。因微酶反应器中使用了不锈钢包埋电极及可取代毛细管喷头，因此克服了商用涂层毛细管喷头芯片与e s im s 在线联用时寿命短的缺点。几种新的固定化酶技术总结如下：1 利用紫外光照射p d m s 表面产生的自由基反应，将丙烯酸共价键结合在p d m s 表面。然后，利用激活试剂1 一乙基3 ( 3 二甲氨丙基) 碳二亚胺( e d c ) 及n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 的活化作用，将酶固定在已修饰的p d m s 微流控芯片通道中。2 利用自由基反应和聚二烯丙基二甲基氯化铵( p d d a ) 在丙烯酸表面的自组装作用，将酶固定在p d m s 微流控芯片通道中。3 发展了适合于固定化酶的铝溶胶一凝胶技术，利用铝溶胶凝胶技术将胰蛋白酶固定在p d m s 微流控芯片通道中。4 发展了适合于固定化酶的钛溶胶一凝胶技术，利用钛溶胶- 凝胶技术将胰蛋白酶固定在p d m s 微流控芯片通道中。以牛血清白蛋白b s a 、细胞色素c 、酪蛋白为底物，利用毛细管电泳、m a l d it o fm s 和e s im s 对实验室制作的微流控芯片酶反应器的性能进行了测定。结果表明，固定化胰蛋白酶的活性极高。表面修饰固定化酶在5 2 0s 以内可将o 5 m g m lb s a 酶解，而溶胶凝胶固定化酶技术在2 秒内可将o 5 m g m lb s a 酶解。与溶液相酶解( 需6 - 2 4h )相比，酶解速度明显提高。这些结果证明，实验室制备的微反应器理想地适合于高通量的蛋白质肽谱分析。关键词：聚二甲基硅氧烷，微流控芯片，固定化酶，基体辅助激光解吸质谱，电喷雾质谱，肽谱分析a b s t r a c tt h ed e s i g na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs e v e r a lk i n d so fp o l y ( d i m e t h y ls i l o x a n e )( p d m s ) m i c r o f i u i d i cse n z y m a t i c r e a c t o r sa l o n gw i t ht h e i ra n a l y t i c a lu t i l i t yc o u p l e dt om a l d it o fa n de s im sw e r er e p o r t e d m i c r o f l u i d i c si n t e g r a t e dw i t hm i c r o c h a n n e la n ds t a i n l e s ss t e e lt u b i n g ( s s t ) w a sf a b r i c a t e du s i n gp d m sc a s t i n go ro x y g e np l a s m at e c h n i q u e s ，a n dw a su s e df o rt h ep r e p a r a t i o no fe n z y m a t i c - r e a c t o r a ni n n o v a t i v ef e a t u r eo ft h em i c r o f l u i d i c se n z y m a t i c - r e a c t o r si st h ef e a s i b i l i t yo fp e r f o r m i n go n - l i n ep r o t e i na n a l y s isb ye m b e d d e ds s te l e c t r o d ea n dr e p l a c e a b l et i ps e v e r a ln e wm e t h o d so fi m m o b i l i z i n ge n z y m ep r e s e n t e di nt h i st h e s i sc a nb es l u m m a r j z e da sf o l 】o w s- t r y p s i nw a si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fp d m sb a s e do nu l t r a v i o l e tg r a f tp o l y m e r i z a t i o na sw e l ta sw a t e r s o l u t i o nc a r b o d i i m i d ec h e m i s t r y 一t r y p s i nw a si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fp d m sb a s e do nu l t r a v i o l e tg r a f tp o l y m e “z a t i o na n ds e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r st e c h n i q u et r y p s i nw a se n c a p s u l a t e di nt i t a n i as o l g e lt r y p s i nw a se n c a p s u l a t e di na l u m i n as o l - g e lt h em i c r o e n z y m a t i c r e a c t o r sf a b r i c a t e db yt h em e t h o d sm e n t i o n e da b o v ep r o v i d ee x c e l l e n te x t e n to fd i g e s t i o no fs e v e r a lm o d e lp r o t e i n si nv e r ys h o r tr e s i d e n c et i m eo f2 - 2 0s ，w h i c hp r o v et h el a b - m a d ed e v i c e sa r ei d e a l l ys u i t a b l ef o rh i g h - t h r o u g h p u tp e p t i d em a p p i n g k e y w o r d s ：p d m s ，m i c r o f l u i d i c s ，e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n ，m a l d it o fm s ，e s im s ，p e p t i d em a p p i n g第一章微流控芯片与蛋白质组学1 引言“生物学提出问题、技术提供工具，二者应该享有幸福的婚姻，。几种生物体基因组( 也包括人类基因组) 排序的完成为后基因时代即蛋白质组学的发展开辟了道路。人们希望能对感兴趣的蛋白质进行测定、鉴定和定量，也希望能够表征其后修饰作用、测定其三维结构，最终确定其功能。事实上，人们不仅盼望获得一种蛋白质的相关信息，而且也希望获得生物样品中所有蛋白质的相关信息。回答由蛋白质组学所提出的上述问题，必须发展新技术、新方法。蛋白质组学的最基本任务是生物样品中蛋白质的检测和鉴定，完成这一任务的传统方法是将蛋白质在二维凝胶电泳中进行分离，然后转移凝胶上的斑点、酶解蛋白质，最后进行质谱检测和数据库的搜索。虽然二维凝胶电泳技术，不能解决低丰度、疏水性、极碱性或极大分子量蛋白的检测问题【扪，但在蛋白质分离和鉴定中仍起着重要作用 3 1 。y a t e s 等1 4 发展了一种多维蛋白质鉴定技术，即首先对蛋白质进行酶解，大约每个蛋白质产生5 1 5 个肽段，一些不易处理的疏水性蛋白质通过酶解至少可产生几个亲水性肽段；然后，这些肽段混合物通过2 - dl l a n o -液相色谱进行分离，最后利用e s i - m s m s 进行检测。利用该项技术，经过一至两天实验、数天至数星期数据库搜索工作后，可鉴定出上千种蛋白质。类似地，a e b e r s o l d 等1 5 l 发展了一种同位素亲和标记( i c a t )方法，即利用含生物素的试剂对蛋白质中的半胱氨酸残基进行标记：蛋白质混合物被酶解后，只有含半胱氨酸的肽段被捕获并得到质谱分析。这种方法极大降低了肽段混合物的复杂性。而且，来自不同样品的蛋白质可通过两种不同的i c a t 试剂进行标记，因此两种不同样品能够混合在一起同时分析，获得一种相对的定量结果。遗憾的是，由于该方法所固有的低序列覆盖率的特点，因而不能对后修饰作用( p t m )进行鉴定。近年来，新工具如微流控芯片已经引起了人们的关注 6 , 7 1 。微流控芯片是一种可在微结构通道中驱动流体的分析工具。微流控分析系统的目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到方寸大小的芯片上。从分析角度出发，蛋白质组学是颇具挑战性的领域。首先，在蛋白质世界中，不存在如p c r 一样的扩增技术，因此对灵敏度和动力学范围的要求显得十分突出。目前，在细胞水平上分析任何蛋白质组所需要的动力学范围为l0 6 1 0 9 。其次，蛋白质世界是千变万化的。蛋白质的尺寸可由几十个氨基酸( 例如毒素) 到几个兆道尔顿( 例如h u m a nt i t i n ，2 69 2 6 个氨基酸) ；蛋白质的等电点p i 可小到3 、大到1 1 ( 随着分析技术的发展，人们推测等电点范围可能会进一步变大) ；某些蛋白质的强疏水性使其很难从水溶液或凝胶中得到回收 s l 。第三，蛋白质混合物的分析极其复杂。如果说人类有3 00 0 0 5 00 0 0 个基因，并且每个基因给出5 1 0 个不同的蛋白质，那么分析生物学家必须处理15 00 0 0 5 0 0 00 0 0 个不同的蛋白质，这远远超出了现有的分析能力。最后，在蛋白质组分析中，所能获得的样品量非常有限。微分析系统所特有的性质分析时间短、比表面积大使其有希望成为蛋白质组研究的重要工具。一方面，扩散距离( 例如，一个目标分子向一个固定探针扩散) 与d t 的平方根成正比，所以当扩散距离由毫米缩小到微米数量级时，所需时间降低了1 0 6 倍。另一方面，微流控系统具有大的比表面积。例如，9 6 孔板的比表面积是5 0 0e m ，而1c m长5 0 5 0p , m 微通道的比表面积是8 1 0 4m 一。2 微流控芯片的加工2 1 玻璃、硅微流控芯片加工技术微细加工技术是微流控分析系统发展的前提条件。大多数微加工技术依赖于光刻和蚀刻技术，工艺己相当成熟，广泛应用于硅、玻璃基片上微细结构的加工。光刻和蚀刻技术由薄膜沉积、光刻和蚀刻三道工序组成。光刻前先要在基片表面覆盖一层薄膜，薄膜的厚度为数埃到几十微米，这一工艺过程叫薄膜沉积。在薄膜表面用甩胶机均匀地覆盖上一层光胶。将掩膜上微流控芯片设计图案通过曝光成象的原理转移到光胶层上的工艺过程称为光刻。蚀刻是将光胶层上的平面二维图形转移到薄膜上并进而在基片上加工成一定深度微细结构的工艺。这种加工技术具有微结构分辨率高、重现性好、可批量生产的优点。缺点是灵活性差、加工费用昂贵，芯片微结构的变化只能以更换掩膜为代价。此外，化学蚀刻过程中需要使用危险化学试剂如氢氟酸，必须配备有安全、清洁的加工空间。用光刻和蚀刻方法在硅或玻璃材料上加工微通道、微泵、微阀、微储液池、微电极、微检测元件、窗口和连接器等功能元器件，根据分析功能和应用场合，通过键合将这些功能元器件部分或全部集成在一起，就组装成了微流控芯片。最简单的电渗驱动的微流控芯片也要将刻有通道并加工好储液孔的基片和盖片键合后才能使用。键合的方法有热键合、阳极键合和低温键合等。硅片与硅片之间的热键合( f u s i o nb o n d i n g ) 也称为硅熔键合。将硅片于硫酸溶液中洗净，用盐酸除去硅片表面的有机物和金属污染物后，将硅片浸泡在约1 0 0o c 的氢氧化铵溶液中，使拟键合表面通过水化反应增加羟基。通过范得华力的作用，可使处理后的硅片紧密地贴合在一起。将贴合在一起的硅片放在高温炉中加热到8 0 0 - 1 0 0 0 。c 退火，界面上发生化学反应形成硅氧键，使两块硅片牢固地键合在一起1 9 。通过热键合可以将多晶硅薄膜与单晶硅片键合在一起，也可以将表面有二氧化硅保护层的硅片键合在一起 1 0 】。硅片的洁净度和平整度是键合能否成功的关键。玻璃和石英材质的微流控芯片一般使用热键合方法封合。将加工好的基片和相同材质的盖片洗净烘干对齐紧贴后平放在高温炉中，在基片和盖片下方各放一块抛过光的石墨板，在上面的石墨板上再压一块不锈钢块，于高温炉中加热键合。玻璃芯片键合时，高温炉升温速度为1 0 。c m i n ，在6 2 0 。c 时保温3 5h ，再以1 0 。c m i n 的速度降温。石英芯片键合温度高达1 0 0 0 。c 以上。芯片如一次封接后有干涉条纹可多次热键合。普通化学实验室中，通过将洗干净的基片和盖片在超纯水环境中直接贴合后再键合，由于避免了空气中微粒对键合的影响，大大提高了芯片的键合质量和成品率 12 1 。h a r r i s o n 研究组利用高压水洗器严格地清洗基片和盖片后，使键合温度大大降低”】。热键合的缺点在于不能用于装有温度敏感剂、电极和波导管的芯片，也不能用于不同热膨胀系数材料的封接【1 4 】。阳极键合( a n o d i cb o n d i n g ) 常被用于含钠玻璃片和硅片的键合。在玻璃片和硅片上施加高压，玻璃片接负极，硅片接正极，当温度升高时，玻璃片中的钠离子从玻璃硅界面向阴极移动，在界面玻璃一侧产生负电荷，硅片一侧正电荷与玻璃一侧负电荷通过静电引力密合在一起，促进了玻璃片和硅片间的化学键合。最近，几篇文献报道了几种低温键合方法。将1 h f 滴入二玻璃片之间的缝隙中，在室温下加压4k p a 压力，2h 即可键合成功，温度升高到6 0 。c ，1h 即可完成 ”】；于两片玻璃之间滴入硅酸钠稀溶液形成中间层，在室温下放置过夜，或9 0 。c 下放置1h 也能进行键合 14 1 ；在两片清洁的玻璃片之间使用1g m 厚的环氧胶，于lm p a 的压力和9 0 。c 条件下固化，或在1 0 0 2 0 0 。c 温度下加高压15h ，使之直接键合，压力最高5 0m p a is 1 。2 2 聚合物微流控芯片加工技术在高分子聚合物基片上加工微通道的技术有模塑法、热压法、l i g a 技术、激光烧蚀法等。模塑法是最流行的一种聚合物微加工技术。用光刻和蚀刻的方法先制出通道部分突起的阳模( 复杂的微结构可通过多次重复薄膜沉积一光刻蚀刻三道工序完成) ，然后在阳模上浇注液态高分子材料。将固化后的高分子材料与阳模剥离后就得到具有微通道的基片。与盖片封接后，制得高分子聚合物微流控芯片。适合于浇注的高分子材料应具有低黏度、低固化温度，在重力作用下可充满模具上微通道和凹槽等处的性质。可用于浇注的高分子材料有两类：固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。固化型聚合物有p d m s 、环氧树脂和聚脲等，在与固化剂混合后、经固化变硬可得到微流控芯片；溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等，通过缓慢挥发去溶剂而得到芯片。总之，模塑加工法，不需要危险的化学药品或复杂的加工设备，非常适合于在研究实验室内加工。热压法( h o te m b o s s i n g ) 是一种快速复制微流控芯片的技术。适合于热压法加工的有聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 、聚碳酸酯( p c ) 等聚合物材料。在热压装置中将聚合物基片加热到软化温度( p m m a1 0 6。c ，p c i5 0 。c ) ，通过在阳模上施加一定的压力，并保持3 0 6 0s ，可在聚合物基片上压制出与阳模凹凸互补的微通道。然后在加压条件下，将阳模和刻有通道的基片一起冷却后脱模，可得到所需的微结构。l i g a 技术是微细加工的一种新方法，它由x 光深层光刻、微电铸和微复制三个环节组成。这项技术可用于加工微电机、微泵、微阀等三维器件。近来，l i g a 技术已用于高深宽比的聚合物芯片的制作。激光烧蚀法( l a s e ra b l a t i o n ) 是另一种微细加工新技术。它可直接根据计算机c a d 的数据在金属、塑料、陶瓷等材料上加工复杂的微结构，是一种非接触型加工工具。在加工微模17 1 和微通道中已得到应用1 18 1 。根据烧蚀对象可选择激光的脉冲强度和脉冲数。聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、醋酸纤维素、聚苯二甲酸乙二醇酯和聚四氟乙烯等高分子材料，在紫外激光作用下可降解成易挥发的小分子1 1 9 ，因此适合用作激光烧蚀加工材料。在激光作用下，加工微通道时溅射出的微粒与大气中的氧可能发生化学反应，生成含羟基、羧基和酚基等官能团的有机物【2 ”。当基片以一定的速度相对激光束移动时，这些微粒又在其后产生的通道表面沉积，使高分子聚合物微流控芯片中产生了显著的电渗流。由于激光能量大，有一定的危险，需在标准激光实验室中进行操作。高分子聚合物材料的玻璃化温度大多在1 2 0 1 8 0 。c 之间，因此高聚物芯片热封合温度较低。即使装有温度敏感剂，或用温度敏感剂对通道进行化学改性的基片也可热封合。将刻有微通道的聚甲基丙烯酸甲酯基片与盖片用两片载玻片夹紧，放置于10 8 。c 烘箱内保温lom i n ，可使它们封合在一起1 2 t l 。由于这一温度已接近聚甲基丙烯酸甲酯的玻璃态温度，因此芯片中的微通道可能变形【2 引。在聚甲基丙烯酸甲酯盖片上涂上一层低玻璃态温度的聚合物，可克服这一缺点。例如，聚甲基丙烯酸丁酯的玻璃态温度是4 5 。c ，聚甲基丙烯酸丁酯和聚甲基丙烯酸甲酯混合物的玻璃态温度比聚甲基丙烯酸甲酯低，二者的比例决定混合物的玻璃态温度。在聚甲基丙烯酸甲酯盏片上涂上这种复合物聚合体的薄膜，能大大降低芯片的热封合温度【2 2 1 。使用热或光催化黏合剂也可进行封合，但操作时要特别小心，以免黏合剂堵塞微通道 2 3 】。硅橡胶之间的黏附力大，加工有微通道的硅橡胶基片与打好孔洞的硅橡胶盖片只要简单的复合就可得到密闭通道的微流控芯片【24 1 。但这种封合不能承受较高的压力，可轻易剥开。将硅橡胶芯片和盖片表面用氧等离子体处理，可使硅橡胶之间产生永久性封合。通过改变硅橡胶预聚物和交联剂的最佳配比，使基片的预聚物组成比最佳配比略高，盖片中略低，基片和盖片复合之后，在交界处由于分子扩散使预聚物和交联剂的配比最佳，也可提高封接的牢固度口”。2 3 微流体的驱动在微流控分析系统中流体的驱动方式主要有两类。第一类为压力驱动，即采用外部设施如注射泵或气动泵驱动流体。压力驱动的优点在于不管微通道内壁所荷电荷或表面化学性质如何，均可将流速控制到每分钟几十纳升的水平。缺点是压力驱动可诱导样品塞扩散，且微流控分析系统与毛细管的联用还存在一定的技术难度。最近g y r o s 和t e c a n 两公司发展了一种利用离心力驱动流体的方法，即c d 上设计有放射状的微通道结构，旋转c d 就可驱动样品流过微通道。该设备已用于m a l d i 样品的制备及分析方法的优化1 26 1 。第二类为电渗驱动。这种驱动方式所产生的扁平流动轮廓与样品塞性质相一致，有利于分析物的分离，且易于与外部设备联用【27 1 。缺点是，必须对微通道内壁的表面电荷和化学性质以及样品的离子强度进行控制当涉及实际样品时，操作起来比较困难。此外，对于开管通道可能会出现如下问题：6储液池中液面的微小差别可导致因压力而产生的液体流动。直径为5 0“m 、长度为1c m 的微通道，如果液面差为1m m 可产生大约l0p a 的压力降。由h a g e n - p o i s e u i l l e 定律可计算出因压力降所诱导的流速：q 2 ( 兀r 4 8 r 1 ) ( a p l ) = 16n l m i n这里r 代表微通道的直径，l 为微通道的长度，”为流体黏度( 水的黏度为8 ，9x1 0 p a s ) 。计算所得流速与电渗流产生的流速( 通常为5 0 2 0 0n l m i n ) 同属一个数量级，因此由液面差所诱导的流速不能忽视。总之，在流体驱动方面虽已取得很大的进展，但为了获重现性好的结果仍有许多工作要做( 对于凝胶基质的微分离通道，不存在该问题1 【28 1 。3 酶法分析在蛋白质组学研究中，微流控芯片系统中的酶法分析起着两种不同的作用：( 1 ) 蛋白质鉴定平台的建立需将水解酶整合在微芯片中；( 2 )广义的蛋白质组学不仅需要鉴定样品中的所有蛋白质。而且要表征它们的活性，因此高通量地测定酶活性是必要的。3 1 蛋白质的酶解将蛋白质酶解过程整合于微流控芯片中的主要技术障碍在于蛋白酶的固定。几种固定化酶方法己被报道，例如，w a n g 等 2 9 】将涂有胰蛋白酶的商用微颗粒装入一微通道中，反应床体积为1 6g l ；两种底物蜂毒肽和细胞色素c 以不同流速被泵过酶解床。酶解3 斗l 的样品，至少需要6r a i n 的反应时间。酶解产物然后被注入分离通道中，并通过质谱仪进行分析。j i a n g 等 3 0 1 利用吸附作用将胰蛋白酶固定在p v d f 聚合物膜内，该聚合物膜被进一步整合在p d m s 微流控芯片中。作者仔细研究了蛋白质残留时间、浓度和温度等参数对酶解效率的影响。在优化的条件下，该酶反应器子3 6s 内可将细胞色素c 完全酶解。为了固定更多的胰蛋白酶以获得更快的酶解速度，几个研究小组开始探索更好的固定化酶程序。k i m 等【3 1 l 发展了一种基于硅溶胶凝胶化学的胰蛋白酶包埋方法。他们将溶胶成功地注入微通道中，随后固化在微通道内部。t o y o a k a 小组发展了一种四甲基硅氧烷水溶胶，并将其用于c e 毛细管 3 2j 和p m m a 芯片 3 3 1 中胰蛋白酶的包埋。这种包埋酶能够酶解流过凝胶的模型肽或滞留时间为1h 的蛋白质。l i f 的检测结果表明包埋胰蛋白酶的活性很高，是自由酶的2 0 倍。p e t e r s o n 等【3 4于玻璃微通道中制备了聚合物m o n o l i t h s ，胰蛋白酶被共价键结合在m o n o l i t h s 的表面。固定化胰蛋白酶的活性取决于m o n o l i t h s 的孔径大小、表面化学性质以及固定用的胰蛋白酶的浓度。k 。和v 。的变化范围分别为7 - 2 8 5m m 和1 9m m m i n 。1 4 + 2g m 的m y o g l o b i n 溶液以o 5“l m i n 的流速连续通过反应床( 相应的残留时间为1 1s ) ，可获得完全酶解。进一步的研究表明，该设备可用于八种不同蛋白质的肽谱分析( 每个样品的酶解时间小于1m i n ) “。3 2 酶活性的测定酶活性与蛋白质组学密切相关。人们可能需要由样品或蛋自质中测定酶活性，自由酶或固定化酶活性的测定再一次促进了微型分析工具的发展。表征酶活性最简单的方法是将酶与底物混合，然后底物被转化成有色或有荧光的产物。d u f f y 等1 36 】利用离心力驱动c d 芯片上的碱性磷酸( 酯) 酶、不同抑制剂以及p - 硝基酚磷酸盐。p 硝基酚磷酸盐被转换成黄色的p - 硝基酚，通过微通道中吸光度的变化进行检测。t a n a k a 等【37 】基于激光聚焦于微结构顶部吸光片上可使合成底物转化成有色产物，提出了一种温度活性测定方法。为了提高分析通量，c o h e n 等【3 8 】提出了一种在c e 微芯片上测定蛋白激酶a 活性的方法。通过电驱动，酶和荧光底物混合，经孕育后底物和产物分离，再通过l i f 检测、定量，1 2m i n 内可完成酶活性测定。x u e 等3 9 1 发展了一种测定多元激酶活性的方法。几种激酶与其底物以电驱动方式在芯片上混合，并于相同c e通道中得到分离，基于产物和底物迁移速度的不同可完成酶活性的测定( 不包括孕育时间，lm i n 内可同时完成4 种酶的测定) 。最近，s c h i l l i n g 等1 4 0 提出了一种于溶液相中测定细胞溶解物酶活性的新方法。细胞在芯片上溶解后，溶解物与含酶底物的参比溶液一起流过相同的微通道，在两种流体的交界面处底物转变为具有荧光的产物，然后利用l i f 方法对酶活性进行测定。此外，也可对微通道中固定化酶的活性进行测定。p a r k 等4 1 1 将硝化纤维膜用丙酮溶解后点在玻璃板上，并沉积酶溶液于其上。随后将这种沉积有酶的玻璃板与p d m s 微流控系统组装在一起，利用电驱动方式将底物流过固定化的p 一牛乳糖( 孕育时间为lh ) ，得到有荧光的两种酶解产物。产物经c e 分离后，利用l i f 检测体系进行检测。b a n u等【42 j 发展了另外一种固定化酶方法。将固定有碱性磷酸( 酯) 酶或黄嘌呤氧化酶的多孔玻璃填入锥形微反应室中，底物被连续引入微反应室；利用吸光度的变化测定经积累后的产物。由于微反应器具有高的比表面积，所以分析通量可达到每小时6 15 个样品。4 微流控芯片与质谱的联用4 1 微流控芯片与e s im s 的联用质谱可对分析物按m z 的不同进行分离、并提供直接的、高通量的、精确的分析物结构信息，因此在蛋白质组学研究中己成为一种重要分析工具。总的来说，有以下几种原因促进了质谱微芯片系统的发展：( i ) 微流控系统中所采用的流速( 每分钟几十纳升到每分钟几微升) 能很好地与纳电喷雾或电喷雾中所采用的流速匹配：( 2 ) 微加工技术允许在同一芯片上加工出许多电喷雾喷头，因此可大大提高分析通量；( 3 ) 除微喷头以外的其它功能如样品的制备、分离或柱后标记也可整合在同一芯片上。近年来，纳喷雾理论发展迅速 4 3 1 ，材料的种类( 玻璃、硅、p d m s 、p e t 、聚酰亚胺等) 、微通道的尺寸( 由几微米到几百微米) 、出口形状、表面化学等参数均会对电喷雾过程产生影响。因此研究这些参数如何影响电喷雾过程是至关重要的。首先，出口壁的疏水性必须高，以便液体不会润湿出口外壁而导致大液滴的形成。许多研究小组将一个纳喷雾毛细管黏附在微通道出口处【4 4 。5 9 】，实现了微型工具与e s im s 的联用。但这种操作难于自动化，并且附加了一定的死体积。电喷雾也可直接由芯片边缘微通道出口处产生 6 0 l ，但缺点是在微通道出口处难于将泰勒锥限定为微小体积。泰勒锥可在出口的平端面上铺展，甚至沿着芯片平端面移动( 即使使用疏水性的材料p e t 也不例外) 。另外一种可调节的参数是微通道的出口形状。几个研究小组认为v 型喷嘴更有利于限定泰勒锥的形状 2 8 1 。而其他研究小组如k i m 6 1 6 3 1 、l i c k l i d e r 【6 4 】分别在p d m s 微芯片、混合硅聚对二甲苯微结构上加工喷嘴：k a m e o k a等 65 j 提出了一种将薄三角形聚合物尖整合进微流控芯片中的方法；s j o d a h l 等【6 6 1 和s c h u l t z 等【6 7 】发展了毛细管微加工喷嘴。不同方寸和形状的微通道本身也可能影响电喷雾过程的产生。第三个重要参数是施加高电压的方式。在纳喷雾针和毛细管中，通常利用( 1 ) 在溶液中插入铂电极、( 2 ) 液体连接、( 3 ) 或在毛细管出口处涂导电层的方式施加电压。以上方法都有缺点，例如通过样品溶液施加高压时，电喷雾对样品导电能力比较敏感；而导电涂层( 通常为金涂层) 相当不稳定( 特别当放电时) ，实际使用寿命在数小时内。微加工纳喷雾的显著优点是可加工出一体化的微电极。例如，r o h n e r 等 6 8 1 介绍了一种可直接与喷雾微通道接触的碳糊电极；o o b r y 等【6 9 l 报道了一种一体化的微电极芯片( 将5 0u m 的涂金铜电极置于1 2 0g m 宽的等离子蚀刻的聚酰亚胺微通道底部，电极可尽可能安装于接近微通道出1 3 处的位置) 。为了挖掘质谱微芯片的平行检测潜力，一些研究利用微加工技术将e s i 喷头高密度地加工在同一平面上。l i u 等【5 2 1 设计了一种将样品池、电极、9 6 个电喷雾毛细管喷头集于一体的环氧树脂微板。该方法具有重现性好、分析时间短的特点。h e n i o n 小组【6 7 】在硅片上蚀刻出8 - 15u m 宽的微通道，直接用作微喷雾喷头。该装置分析性能好、可直接喷雾肽或蛋白质的水溶液。最近，z h a n g 等 7 0 l 利用了e s i ；枣, 片系统能直接喷雾水溶液以及具有高通量分析的能力，将其用于蛋白质- 配体复合物的研究【7 “。4 2 微流控芯片与m a l d im s 的联用就目前发展情况而言，m a l d i 离子源具有e s i 不可取代的优点：( 1 ) 对样品要求低、耐盐能力强，( 2 ) 灵敏度高，( 3 ) 谱图中单电荷、1 0双电荷分子离子峰很强，便于峰信号重组。但不可否认，因存在不少限制因素，芯片与m a l d i 的联用至今仍处于萌芽状念。最早将二者结合起来的设计基于一种简单的思路：利用微加工技术制作含1o o 个微孔阵列的芯片，用于容纳供m a l d im s 分析的d n a 样品【7 。显然，这只是将芯片当作m a l d i 的点样板，并不是真正优势互补意义上的联用。近来报道的两项工作似可真正反映微流控芯片与m a l d im s 联用的潜力。n i l s s o n 提出了一整套有望代替蛋白质组学传统分析技术平台( 即二维凝胶电泳一离线质谱检测) 的微全分析系统，引进微流控芯片作为蛋白酶解反应器，可在3 5h 内分析1 0 0 个蛋白样品 7 2 , 7 3 】。l e b r i l l a 等 7 4 1 提出的联用方式为：寡糖和肽的混合物在电驱动下流过开管快速电泳芯片的敞开通道，同时得到分离；溶剂蒸发后，预先加入缓冲液中的基质与溶质共结晶；而后将芯片转移进特殊设计的f t m s的m a l d i 源，由激光扫描芯片通道使待测分子离子化而检测。5 蛋白质组学技术平台上述研究的最终目的是要发展能够处理实际蛋白质组样品的微型技术平台。最近两年已有几篇相关报道。s l e n t z 等 7 5 1 将胰蛋白酶酶解、含组氨酸的胰蛋白酶酶解肽段的i m a c ( i m m o b i l i z e dm e t a la f f i n i t yc a p t u r e ) 、c e c 集成在同一p d m s 芯片上。遗憾的是，这种装置只能用于荧光检测，与质谱的联用仍存在一定的困难。l i 等7 6 1 报道了一种玻璃微系统，该系统由一个2 5 “l 的样品注射端口( 包埋有带功能基团的微颗粒) 、一条用于c e 分离的微通道和一个用于与e s im s 联用的纳喷雾喷头。该体系用于人类前列腺癌l n c a p 细胞中蛋白质的鉴定，以每小时测定1 2 个样品的速度共鉴定出7 2 种蛋白质，这是第一次、真正意义上将集成化微型平台用于蛋白质组学研究。6 本论文的工作基于整体浇铸或氧等离子体技术，设计制作了集不锈钢管、微通道于一体的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 微流控芯片。在此基础上，发展了多种化学稳定、寿命长、活性高的p d m s 微流控芯片固定化酶新技术，实现了与m a l d it o fm s 和e s im s 的鉴定联用，为最终实现微量蛋白质及单细胞蛋白质组分析奠定了基础。参考文献1f i e l d s ，s p r o cn a t l a c a ds c iu s a2 0 0 1 ，9 8 ，1 0 0 5 1 1 0 0 5 4 2g y g i ，s p ，；c o r t h a l s ，g l ；z h a n g ，v ；r o c h o n ，y ；a e b e r s o l d ，r p r o cn a t l a c a d s c iu 删2 0 0 0 ，9 7 ，9 3 9 0 9 3 9 5 3r a b i l l o u d ，t p r o t e o m i c s2 0 0 2 ，2 ，3 1 0 4f l o r e n s ，l ；w a s h b u r n ，m p ；r a i n e ，j d ；a n t h o n y ，r m ；g r a i n g e r ，m ；h a y n e s ，j d ；m o c h ，j k ；m u s t e r ，n ；s a c c i ，j b ；t a b b ，d l ；w i t n e y ，a a ；w o l t e r s ，d ；w u ，y m ；g a r d n e r ，m j ；h o l d e r ，a a ；s i n d e n ，r e ，；y a t e s ，j r ；c a r u c c i ，d j n a t u r e2 0 0 2 ，4 l9 ，5 2 0 5 2 6 5g y g i ，s p ；r i s t ，b ；g e r b e r ，s a ；t u r e c e k ，f ；g e l b ，m h ；a e b e r s o l d ，r n a t b i o t e e h n 0 1 1 9 9 9 ，17 ，9 9 4 9 9 9 6l a u r e l l ，t ；m a r k o v a r g a ，g p r o t e o m i c s2 0 0 2 ，2 ，3 4 5 3 51 7l a u r e l l ，t ；n i l s s o n ，j ；m a r k o v a r g a ，gt r e n d s a n a l c h e m 2 0 02 ，2 0 ，2 2 5 2 3 1 8h e r b e r t ，b e l e c t r o p h o r e s i s1 9 9 9 ，2 0 ，6 6 0 6 6 3 ，9m a l u f ，n a ni n t r o d u c t i o nt om i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m se n g i n e e r i n g a r t e c hh o u s e ，b o s t o n ，2 0 0 0 10f i s t e r ，j c ；j a e o b s o n ，s c ，；d a v i s ，l m ；r a m s e y ，j m a n a l ，c h e m 1 9 9 8 ，7 0 ，4 3 1 11s u m p s o n ，p c ；w o o l l e y ，a t ；m a t h i e s ，r a ，b i o m e d m i c r o d e v 1 9 9 8 ，1 ，7 1 2 殷学锋，沈宏，方肇伦分析船学，2 0 0 3 ，3 1 ( 1 ) ，1 1 6 13c h i e m ，n ；l o c k y e a r s h u l t z ，l ；a n d e r s s o n ，p ；s k i n n e r ，c ；h a r r i s o n ，d j s e n s a c t u a t o r sb 2 0 0 0 ，6 3 ，1 4 7 1 4w a n g ，h y ；f o o t e ，r s ；j a c o b s o n ，sc ；s e h n e i b e l ，j h ；r a m s e y ，j m s e n s a c t u a t o r sb 1 9 9 7 ，4 5 ，1 9 9 15n a k a n i s h i ，h ：n i s h i m o t o ，t ；n a k a m u r a ，n ；n a g a m i e h i ，s i e e e 1 9 9 7 ，2 9 9 1 6s a y a h ，a ；s o l i g n a c ，d ；c u e n i ，t ；g i j s ，m a m s e n sa c t u a t o ，sa2 0 0 0 ，8 4 ，1 0 3 1 7h e y l ，p ；o l s c h e w s k i ，t ；w i j n a e n d t s ，r w m i c r o e l e c t r o n i ce n g i n e e r i n g 2 0 0 1 ，5 7 - 5 8 ，7 7 5 1 8r o b e r t s ，ma ；r o s s l e r ，j s ；b e r c i e r ，p ；g i r a u l t ，h a n a l c h e m 1 9 9 7 ，6 9 ，2 0 3 5 1 9s r i n v a s a n ，r ；b r a r e n ，b c h e m r e v 1 9 9 8 ，8 9 ，13 0 3 2 0n i i n o ，h ；y a b e ，a s u s c i 1 9 9 3 ，6 9 ，1 2 1m a r t y n o v a ，l ；l o c a s c i o ，l ，e ；g a i t a n ，m ；k r a m e r ，g w ；c h r i s t e n s e u ，r g ；m a c c r e h a n ，w a a n a l ，c h e m 19 9 7 ，6 9 ，4 7 8 3 2 2s o p e r ，s a ；f o r d ，s m ；q i ，s ；m c c a r l e y ，r l ；k e l l y ，k ；m u r p h y ，m c a n a l c h e m 2 0 0 0 ，7 2 ，6 4 3 a 2 3m c c r e e d y ，t t r e n d sa n a l c h e m 2 0 0 0 ，19 ，39 6 2 4e f f e n h a u e r ，c s ；b r u i n ，gj ，m ；p a u l u s ，a ；e h r a t ，m a n a l c h e m 1 9 9 7 ，6 9 ，3 4 5 1 2 5u n g e r ，m a ；c h o u ，h p ；t h o r s e n ，t ；s c h e r e r ，a ；q u a k e ，s t s c i e n c e 2 0 0 0 ，2 8 8 ：113 2 6f e l t o n ，m j a n a l c h e m ，2 0 0 3 ，7 5 ，3 0 2 a 一3 0 6 a 2 7b o u s s e ，l ；c o h e n ，c ；n i k i f o r o v ，t ；c h o w ，a ；k o p f - s i l l ，a r ；d u b r o w ，r ；p a r c e ，j w a n n u r e v b i o p h y s b i o m o l e c s t r u t 2 0 0 0 ，2 9 ，15 5 - 1 8 1 2 8l i o n ，n ；r o h n e r ，t c ；d a y o n ，l ；a r n a u d ，i l ；d a m o c ，e ；y o u h n o v s k i ，n ；w u ，z y ；r o u s s e l ，c ；j o s s e r a n d ，j ；j e n s e n ，h ；r o s s i e r ，j ；p r z y b y l s k ，m ；g i r a u l t ，h e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 3 ，2 4 ，3 5 3 3 ，3 5 6 2 2 9w a n g ，c ；o l e s c h u k ，r ；o u c h e n ，f ；l i ，j j ；t h i b a u l t ，p ；h a r r i s o n ，dj 。r a p i dc o m m u n 。m a s ss p e c t r o m 2 0 0 0 ，1 4 ，1 3 7 7 1 3 8 3 3 0j i a n g ，y ；l e e ，c s ，c h r o m a t o g r a2 0 0 1 ，9 2 4 ，3 15 - 3 3 2 3 1k i m ，y d ；p a r k ，c b ；c l a r k ，d s b i o t e e h n 0 1 b i o e n g 2 0 0 1 ，7 3 ，3 3 1 3 3 7 i43 2s a k a i k a t o2 9 4 3 2 9 4 9 3 3s a k a i k a t o3 8 8 3 9 3 ，k ；k a t o ，m ；t o y o o k a ，t a n a l c h e m 2 0 0 2 7 4k ；k a t o ，m ；t o y o o k a ，t a n a l c h e m 2 0 0 3 ，7 5 ，3 4p e t e r s o n ，d s ；r o h r ，t ；s v e c ，f ；f r 6 c h e t ，j m ja n a l c h e m2 0 0 2 ，7 4 ，4 0 8 l 一4 0 8 8 3 5p e t e r s o n ，d s ；r o h r ，t ；s v e c ，f ；f r d c h e t ，j m j ，p r o t e o m er e s 2 0 0 2 ，1 ，5 6 3 - 5 6 8 3 6d u f f y ，d c ，；g i l l i s ，h l ，；l i n ，j ；s h e p p a r d ，n f ；k e l l o g g ，g j a n a lc h e m 1 9 9 9 ，7 1 ，4 6 6 9 ，4 6 7 8 3 7t a n a k a ，y ；s l y a d n e v ，m n ；h i b a r a ，a ；t o k e s h i ，m ；k i t a m o r i ，t ；，c h r o m a t o g r , a2 0 0