（物理化学专业论文）锌指蛋白zfp191的dna结合性质研究.pdf

论文题目 学科专业 学位申请人 指导教师 锌指蛋白z f p l 9 1 的d n a 结合性质研究 物理化学 王皓月 沈鹤柏 摘要 作为真核生物中一类重要的转录因子，锌指蛋白通过结合特定的d n a 序列， 广泛地参与基因的表达调控、信号转导、细胞的生长以及分化和发育等生命过程。 研究锌指蛋白的d n a 结合性质对于探寻其调控的下游靶基因具有重要意义。本论 文探讨了锌指蛋白z f p l9 1 的d n a 结合性质。 锌指蛋白z f p l 9 1 是近年来发现的小鼠c 2 h 2 型锌指蛋白。作为转录因子， z f p l9 1 已经被证明在小鼠的心脏、脑、肝、肾等组织中广泛表达，并且根据其分布 推测其在软骨分化以及细胞的生长发育分化过程中具有重要的生理功能。更重要的 是，z f p l 9 1 基因敲除的小鼠所表现出的胚胎发育上的严重缺陷证明其在胚胎发育过 程中的重要作用。但是锌指蛋白基因z f p l9 1 自19 9 9 年被p r o s t 发现以来，其相关 的实验研究主要集中于z f p l 9 1 基因的结构鉴定、体内分布以及宏观的生理功能探 索，而对于z f p l 9 1 蛋白的性质及在转录调控中所担当的具体角色关注较少。因此， 有必要关注z f p l 9 1 的d n a 结合性质，进而揭示其通过调节下游基因表达来调控发 育的具体方式。 本论文中，我们设计并构建了融合蛋白g s t z f p l 9 1b d 用来模拟z f p l 9 1 的 d n a 结合结构域。并且，用磁性纳米粒子亲和法、d n a 微阵列以及微孔显色法进 一步研究了z f p l 9 1 的d n a 结合结构域与其四核苷酸重复的靶序列之间结合反应的 性质。这些性质包括d n a 结合序列的特异性、结合反应的协同性和结合反应的锌 离子依赖性。实验的结果显示，该融合蛋白能够特异地与酪氨酸羟化酶基因的第一 个内含子( h u m t h 0 1 ) 的微卫星序列( t c a t ) n 结合，并且亲和力随重复数的增加 而加强；t c a t 重复序列上有多个z f p l9 1d n a 结合结构域的结合位点，各位点之间 存在协同效应。此外，z f p l9 1d n a 结合结构域与d n a 的结合反应在理论上具有锌 离子依赖性，在我们的工作中给出了实验证据。本论文的工作为进一步研究z f p l 9 1 在发育阶段调控基因表达中所起的作用提供了线索。 关键词：锌指蛋白z f p l 9 1 ；d n a 结合蛋白；t c a t 模体；微卫星序列；磁性纳米粒 子；d n a 微阵列；微孔显色分析 论文类型：研究报告 s u b j e c t m a j o r c a n d i d a t e d i r e c t e db y s t u d yo nt h ed n a - b i n d i n gp r o p e r t i e so fz i n cf i n g e rp r o t e i n19 1 p h y s i c a lc h e m i s t r y h a o y u ew a n g h e b a is h e n a sa ni m p o r t a n tc l a s so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r si ne u k a r y o t e ，z i n c - f i n g e rp r o t e i n sp l a yv e r y i m p o r t a n tr o l e si n t h er e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o n 。s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，c e l lg r o w t h ， d i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n tb yb i n d i n gt ot h e i rd n a r e c o g n i t i o ns i t e s s t u d i e so nt h ed n a b i n d i n gp r o p e r t i e so fz i n cf i n g e rp r o t e i n sa r ei m p o r t a n tf o rs e a r c h i n gf o rt h ed o w n s t r e a m g e n e sr e g u l a t e db yt h e m h e r ew er e p o r tt h ed n ab i n d i n gp r o p e r t yo fac y s 2 h i s 2t y p e t r a n s c r i p t i o nf a c t o rz i n cf i n g e rp r o t e i n19 1 ( z f p l9 1 ) w h i c hh a sb e e nn e w l yf o u n dt ob e s i g n i f i c a n ti nm i c e b a s e do ns t u d i e sa tp r e s e n t 。i ti sk n o w nt t l a tz i n cf i n g e rp r o t e i n19 1 ( z f p l9 1 ) 。w h i c hi s w i d e l ye x p r e s s e d i nm u l t i p l et i s s u e sa n do r g a n so fm i c e ，w a ss u p p o s e dt ob ed e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e da n dr e l a t e dt oc a r t i l a g ed i f f e r e n t i a t i o na n db a s i cc e l l u l a rp r o c e s s e s i ti sm o r e n o t a b l et h a tt h ep h e n o t y p er e p r e s e n t e di nt h ez f p l9 1g e n ek n o c k o u tm i c ei n d i c a t e sz f p l9 1 s i r r e p l a c e a b l er o l ei ne a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n t h o w e v e r , t h ee x a c tr o l eo fz f p l9 1i n d e v e l o p m e n th a sn o tb e e nk n o w n s o i ti sn e c e s s a r yt oa s c e r t a i ni t sd n a b i n d i n gp r o p e r l i e s a n di n v e s t i g a t eh o wz f p l9 1w o r k si nd e v e l o p m e n t a lr e g u l a t i o nb yr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no f i t sd o w n s t r e a mg e n e s ， i no u rs t u d i e s ，w eh a v ed e s i g n e da n dc o n s t r u c t e daf u s i o np r o t e i ni nw h i c ht h en t e r m i n a lp a r to fz f p l9 1w a ss u b s t i t u t e db yt h eg s ts e q u e n c e 1 1 1 e nt a r g e td n aw a s c h a r a c t e r i z e db yd e t e r m i n i n gt h eb i n d i n gs p e c i f i c i t ya n dd e p e n d e n c eo nz i n cu s i n gm a g n e t i c n a n o p a r t i c l e sb i n d i n ga s s a y , d n am i c r o a r r a y sa n dm i c r o w e l lc o l o d m e t d ca s s a y t h ed a t a s h o w st h a tt h ed n ab i n d i n gd o m a i no fz f p l9 1c a ns p e c i f i c a l l yb i n dt ot h et c a tr e p e a tm o t i f 。 a n dt h e r ei sc o o p e r a t i v ee f f e c ta m o n gt h em u l t i p l eb i n d i n gs i t e so nt h et a r g e td n a f u r t h e r m o r e ，z i n c - d e p e n d e n c yo ft h eb i n d i n gr e a c t i o nw a sa l s og i v e ne x p e r i m e n t a lp r o o fi n o u rw o r k t h i sw o r kp r o v i d e saf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d i e so nt h er o l e o fz f p l9 1i ng e n e r e g u l a t i o na n dd e v e l o p m e n t k e yw o r d s z i n c f i n g e rp r o t e i n 19 1 ：d n ab i n d i n gp r o t e i n ；t c a tr e p e a t s ； m i c r o s a t e l l i t e ；m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ( m n p s ) ；d n am i c r o a r r a y s ；m i c r o w e l lc o l o r i m e t r i c a s s a y 缩略词表 上海师范大学硕士学位论文 a e a p s c 2 h 2 c h i - s q r c h i p d t t e m s a f i s h g o p t m s g s h g s t h u m t h 0 1 f i i p t g k d k d 唧 m n p s n m r p b s q d s d s s d s p a g e s e l e x t f z f p l 9 1 z f p l 9 1b d z n f2 4 缩略词表 n - ( 2 - a m i n o e t h y l ) - 3 一a m i n o - p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e c y s 2 h i s 2 c h i - s q u a r e c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n d l d i t h j o t h r e i t o l e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n y - g l y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e g l u t a t h i o n e g l u t a t h i o n es 乃旨n s f e r a s e t h es h o r tt a n d e mr e p e a ti nt h ef i r s ti n t r o no fh u m a n t y r o s i n eh y d r o x y l a s e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y i s o p r o p y lb d - 1 - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o d a l t o n a p p a r e n td i s s o d a t i o nc o n s t a n t m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e q u a n t u md o t s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t t r a n s c r i p t i o nf a c t o r z i n cf i n g e rp r o t e i n19 1 z i n cf i n g e rp r o t e i n19 1b i n d i n gd o m a i n z i n cf i n g e rp r o t e i n2 4 h o m os a p i e n s 上海师范大学硕士学位论文论文独创性声明 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：王储同日期：哟4 店 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：王俦日导师签名：1 妙胁日期：2 哟4 f 占 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 引言 2 0 0 0 年，人类基因草图的绘制完毕；2 0 0 1 年，国际公共领域人类基因组合作 计划和美国c e l e r a 公司公布人类基因组图谱“基本完成 ；2 0 0 3 年，美、英、日、 法、德、中6 个国家1 6 个研究中心联合宣布人类基因组序列图完成【1 1 。本世纪初， 人类通过步步努力拥有了打开生命科学之门的金钥匙。在准确率达到9 9 9 9 的人 类基因组序列“完成图中，不仅包含了基因序列，而且涵盖了那些辅助调节基因 活性的d n a 片段序列。然而就d n a 序列信息本身而言，并不能提供特定基因功能 的确定信息。这就需要人们将在掌握了基因组静态的碱基序列后，转而对基因组进 行动态的生物学功能的研究。一个以破译、解读以及开发基因组功能信息为主要研 究内容的时代已经开始，即进入了后基因组时代。这个时代的开始预示着人们在这 些巨量的序列信息基础上，从分子层面探索人类自身生命过程和疾病的奥秘都成为 可能。后基因组时代更加注重从整体水平研究基因及其产物在不同时间、空间与条 件下结构与功能关系及活动规律。特别是真核生物的基因结构复杂，功能分化，基 因的开关及活性通常受到多种调节元件精确调节。目前，真核生物的基因调控已经 成为分子生物学中重要的研究方向之一。 转录水平的调控通常会广泛地影响基因表达，是真核细胞生长、扩增以及整体 分化、发育等生命过程的分子基础。例如，在果蝇的发育过程中，母体基因的表达 产物具有转录激活或转录抑制的活性，调控着合子基因的表达，这是果蝇早期发育 的主要调控模式【2 1 。这种现象在哺乳动物中也极为常见。 对转录调控的研究通常可以从两方面入手，其一，可以以鉴定基因的调控元件 为切入点，通过寻找结合在调控序列上的转录因子或转录因子复合物来探明该基因 转录调控的机制；其二是掌握了或者从结构预测出某种蛋白因子具有转录调控的功 能，通过寻找其靶向调节序列，进而找到其调节的下游基因，从而阐明该蛋白因子 在调节基因表达方面的功能和地位。目前，有很多功能并不明确的转录因子新基因 需要用上述的第二种方法来确定它们的功能以及在生理过程中的地位。 小鼠锌指蛋白基因z i n cf i n g e rp r o t e i n1 9 1 ( z f p l 9 1 ) 是由p r o s t 等人于1 9 9 9 年为克隆和鉴定参与软骨分化相关的基因，通过差减杂交策略从软骨细胞系( m c 6 15 ) 第一章文献综述 上海师范大学硕士学位论文 的c d n a 中分离到的新基因【3 】。该基因产物z f p l 9 1 蛋白属于锌指蛋白家族，根据 同源比对、表达谱分析、基因敲除等结果可以推测该蛋白可能是一种在胚胎期的分 化、发育过程中具有重要作用的转录因子。但是目前关于z f p l 9 1 基因在转录调控 中的具体地位和作用还没有明确的结论，这将寄希望于通过确定其d n a 特异性的 结合位点来寻找下游基因。研究z f p l9 1 与d n a 的结合性质对于确定其调控的靶基 因，阐明其作用机制具有重要的意义。 1研究背景 1 1转录因子与真核生物基因表达调控 1 。1 。1 真核生物转录调控 真核生物的基因表达通常采用多级调节，即转录前水平调节、转录水平调节、 转录后水平调节、翻译水平调节、翻译后水平调节，其中转录水平调节是极为重要 的一种方式f 4 】。 真核生物在转录水平上的调控主要通过顺式作用元件( c i s a c t i n ge l e m e n t s ) 和 反式作用因子( t r a n s a c t i n gf a c t o r ) 的相互作用来实现。顺式作用元件是d n a 上 的非编码序列，它们为真核r n a 聚合酶或反式作用因子提供结合位点，影响自身 基因表达活性。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作 用的方式，可将真核基因的这些功能元件分为启动子、增强子及沉默子等。反式作 用因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用( d n a 蛋白质相互 作用) 反式激活或抑制另一基因的转录。也有基因产物可特异识别、结合自身基因 的调节序列，调节自身基因的开启或关闭，通过这种调节方式起作用的调节蛋白称 为顺式作用蛋白。反式作用因子是真核生物主要的转录调节因子，又称转录因子 ( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，t f ) 。 1 1 2 转录因子及其结构特征 转录因子在细胞中的数量很低，大约每3 0 0 0 个核小体中有一个分子。这些蛋 白质识别特定的d n a 序列( 通常8 1 5 个核苷酸) ，与d n a 结合后，可以促进( 正 调控) 或抑制( 负调控) 一个靶基因的转录。在多细胞有机体中，不同的细胞类型 具有不同的反式作用因子群体，引起每一细胞类型表达不同的成套基因。 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 所有转录因子至少包括两个结构域：d n a 结合域( d n a - b i n d i n gd o m a i n ) 和转 录效应域( t r a n s c r i p t i o n e f f e c t i n gd o m a i n ) 。此外，很多转录因子还包含一个介导 蛋白质一蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化结构域。各个结构域的特征如 下： ( 1 )转录效应结构域由3 0 10 0 个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点， 转录效应域可以是酸性结构域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。 ( 2 )介导二聚化的结构域二聚化作用与亮氨酸拉链、螺旋环螺旋结构有 关。 ( 3 ) d n a 结合结构域通常由6 0 10 0 个氨基酸残基组成。通常含有保守的 结构模体，最常见的有螺旋- 转角一螺旋( h e l i x - t u r n h e l i x ) 、锌指结构( z i n cf i n g e r ) 、亮 氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r ) 、螺旋一环一螺旋( h e l i x l o o p - h e l i x ) ( 图1 - 1 ) 【5 】。 7 彦黟 p 1? j 飞 l b 】) lf t k i l c c p e ：i su 图1 1d n a 结合结构域的保守结构模体 a 螺旋转角一螺旋结构；b 锌指结构；c 亮氨酸拉链结构；d 螺旋环螺旋 f i g 1 1t h ec o n s e r v e dm o t i fi nd n ab i n d i n gd o m a i n s a h e l i x t u m - h e l i x ( h t h ) ；b z i n cf i n g e rm o t i f ；c b a s i cl e u c i n ez i p p e r ( b l z i p ) ； d b a s i ch e l i x l o o p h e l i x ( b h l h ) 研究发现d n a 结合结构域和转录效应结构域可以各自独立发生作用【6 ，7 】。基于 转录因子日趋明朗的结构特点，已经能够人为地选择针对特定序列的d n a 结合结 构域与具有特定作用的效应结构域构建人工转录因子。人工的d n a 结合结构域多 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 为c 2 h 2 型锌指结构，多个锌指可以串联成簇。目前人工转录因子已经在基础研究、 药物设计以及基因治疗等领域得到了广泛的应用【8 ，9 】。 1 1 。3 转录因子与d n a 相互作用 反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合实质上是指d n a 与蛋白 质的相互作用。这种结合通常是非共价结合，依靠氢键、静电作用、疏水力和范德 华力结合在一起。绝大多数调节蛋白结合d n a 前需二聚化甚至多聚化。所谓二聚 化或多聚化就是指两个或多个分子单体通过一定的结构域结合成二聚体或多聚体， 这是调节蛋白结合d n a 时常见的形式。除二聚化或多聚化反应，还有一些调节蛋 白不能直接结合d n a ，而是通过蛋白质一蛋白质相互作用间接结合d n a ，调节基 因转录。 1 2 锌指蛋白研究进展 锌指蛋白基因是基因组中一类重要的转录因子基因，它们编码在形态结构和功 能上相似的d n a 结合蛋白家族锌指蛋白家族。 1 2 1 锌指蛋白的发现及分布 19 8 0 年，r g r o e d e r 和d d b r o w n 发现，5 s r n a 基因在r n a 合成酶作用 下的转录起始需要一种称为转录因子i l i a ( t fi l i a ) 的蛋白质参与，其参与途径为 t fl i i a 蛋白质与5 sr n a 基因编码区5 0 b p 的一段序列特异结合来决定转录起始 【1 0 ，11 】。在此之前就已经发现大量t f i i i a 蛋白质可以与5 sr n a 构成7 sr n p 复 合体而存在【14 ，并且已经知道了t f i i i a 中含有锌离子【13 1 。在后续的研究中，a f l u g 和j m i l l e r 发现t f i i i a 蛋白质结合d n a 、r n a 的过程中都需要锌离子，通过 分析表明在7 s r n p 复合体的一个单体中含有7 ”个z n 2 + 离子。同时发现t f i i i a 蛋白质含有大量的c y s 和h i s ，而在许多蛋白质中c y s 和h i s 是z n 2 + 最普遍的，也 是很理想的配体【14 】。g i n s b e r g 等人在1 9 8 4 年纯化出t f i i i a 后，决定了部份蛋 白质的序列，其中序列较清楚的两段分别是f h n i k i 、c h f e n c g 15 1 。进一步的蛋 白质水解实验表明，t f i i i a 蛋白质最终的解离产物为3 k d a ，而且在水解过程中， 不断出现相差3 k d a 的中间产物。这表明t f i i i a 蛋白质可能是由重复排列的3 k d a 的小片段构成。t f i i i a 基因的一个c d n a 克隆证实了这一猜测：在3 3 4 个氨基酸序 列中，a a l 3 2 7 6 构成了9 个线性重复排列的片段，每个片段约3 0 个氨基酸，并含 有2 对c y s 和h i s 【14 1 。由此人们得知了这一重要的独立的结构片段：约3 0 个氨基 上海师范大学硕士学位论文第章文献综述 酸为一个单位，围绕一个z n 2 + ，形成“手指一一样的结构，即“锌指 。因此，锌 指结构最初定义为在结合d n a 的结构域中含有较多的半脱氨酸( c y s ) 和组氨酸( h i s 的区域，借肽链的弯曲使2 个c y s 和2 个h i s 或4 个c y s 与一个锌离子络合成的指 状结构。而t f i i i a 就成为了第一个被确定为锌指蛋白的转录因子。1 9 8 9 年获得了 锌指的第一个n m r 结构【1 6 ，17 】，1 9 9 8 年得到了t f i i i a 与5 sd n a 的x 晶体衍 射结构【1 8 】。 自从19 8 5 年在爪蟾卵母细胞中发现第一个具有锌指结构的基因转录调控因子 t f i i i a 以来【14 】，人们在多种生物中发现了锌指蛋白基因。锌指蛋白在原核生物中 较为少见，但广泛存在子真核生物中，如酵母、果蝇、爪蟾、鼠和人。在线虫的大 约1 9 ，0 0 0 种蛋白质中，约有5 3 5 种属于锌指蛋白。据估计，1 的哺乳动物基因 编码锌指蛋白【19 】。锌指蛋自家族可以说是人体中最大的一个蛋白质家族【2 0 】。 1 2 2 锌指结构域的d n a 识别特异性 含有锌指模体的蛋白会以一种序列特异性的方式与d n a 相互作用。1 9 9 1 年， p a v i e t i c h 等于报道了小鼠转录因子z i 住6 8 的三个锌指与d n a 结合所形成复合物的 晶体结构，首次提供了关于这种相互作用的详细情况【3 3 1 。在这个复合物中，锌指 嵌入d n a 双螺旋的大沟，通过a 螺旋的一1 ，+ 2 ，+ 3 ，+ 6 位氨基酸与d n a 上的碱基特 异性地识别并产生相互作用，每个锌指识别一个连续的三碱基单元。相邻的锌指单 位间不存在蛋白一蛋白相互作用，每一个锌指相对独立地识别d n a 。但是在后来的 研究中发现，g l l 、t t k 以及更高分辨率下z i 伦6 8 ：d n a 复合物的晶体结构反映的 情况却不同 3 4 ，3 5 ，3 6 ，3 7 】。在这些复合物中，一个锌指可以识别连续5 个d n a 碱 基；相邻锌指在结合过程中却具有协同性，它们的识别序列具有一个碱基的重复； 并且相邻锌指间存在蛋白蛋白相互作用。 目前，从一级结构上还很难预测锌指蛋白的结合序列偏好，例如，尽管z i 渤8 ， g l l ，t 丁ks p l 等与c f 2 j 1 的一级结构极为相似，但前者偏向于识别富含g c 的序 列，后者则偏向于识别富含a t 的序列【3 8 】。多数情况下，锌指主要是与b d n a 的 大沟接触，但在t f i i i a 中，第四个锌指z f 4 与小沟接触并横穿整个双链【3 9 】。序列 依赖的d n a 构象，对特异性识别也有影响，尤其是对于亲和力具有较大的贡献。 连接相邻锌指的u n k e r 对于识别特异性虽然贡献不大，但是由于其具有很好的可变 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 性、柔韧性，在使得单独锌指以正确的取向与d n a 的大沟结合以及保持一个完整、 合适的间隔上发挥作用。 1 2 3c 2 h 2 型锌指蛋白 1 2 2 1 c 2 h 2 型锌指蛋白的分布 锌指蛋白家族是最大的转录因子家族之一，其中所包含的锌指模体序列也是多 种多样。目前已在5 6 0 多种锌指蛋白中发现了约4 1 0 0 种不同的锌指模体序列【2 1 】。 根据锌指模体序列特征可以将锌指蛋白分为6 个亚家族：( 1 ) c 2 h 2 型；( 2 ) c ( c 2 ) 2 型；( 3 ) c 4 型；( 4 ) c 6 型；( 5 ) 指环型( r i n gf i n g e r ) ：( 6 ) l i m 型【2 2 】。其中c 2 h 2 型锌 指结构域是真核生物中最普遍的d n a 结合序列，也是人类基因组中编码第二多的 蛋白结构域。这说明c 2 h 2 型转录因子是人类转录因子中一个重要而多样的部分 【2 3 ，2 4 。 c 2 h 2 锌指模体结构是一个广泛存在的保守的基本序列。在c a e n o r h a b d s e l e g a n s 的经测序的全基因组中，有1 3 8 个蛋白( 占总蛋白0 7 ) 含有c 2 h 2 锌指模 体 2 5 ，2 6 。在果绳d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 的经测序的全基因组中，约有2 6 的 部分编码3 5 2 个c 2 h 2 型锌指蛋t 刍 2 6 2 7 。人类基因中大约有2 的基因编码的 是c 2 h 2 型锌指结构 2 3 。2 4 。 1 2 2 2c 2 h 2 型锌指蛋白的结构特征 a 螺旋 _ 图1 2z n p 稳定p p a 样锌指结构示意图 f i g 1 - 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fp p az i n cf i n g e rm o t i fs t a b i l i z e db yz n 2 + c 2 h 2 型锌指蛋白含有最为典型的锌指模体结构，每个锌指有2 个c y s 和2 个 h i s 残基，一般由2 5 3 0 个氨基酸构成，其基本序列为：c x 2 _ 4 c x 3 f x 5 l x 2 h x 3 - 5 h ( 其 中x 为任意氨基酸) 【2 8 。其n 端约11 个氨基酸残基形成两个反向平行的1 3 一折叠 弓一 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 片层，而c 端氨基酸残基形成一个a 螺旋。在b 折叠片层转角附近的两个c y s 和a 螺旋中的两个h i s 与锌离子配位，形成稳定的b 1 3 a 样锌指结构( 图1 2 ) 。而在没 有锌离子的环境中，锌指结构不能形成，肽链处于非折叠状态【2 9 】。通过金属结合 光谱和n m r 实验都证明了上述的锌指结构。不同的锌指蛋白中所含有的锌指模体 的数目相差很大，从1 个到3 7 个不等f 3 0 】。c 2 h 2 型锌指蛋白中的锌指基序以线性 重复的排列方式存在于蛋白质的c 一末端。相邻的锌指之间通常具有保守的七核苷酸 间隔序列t g e k p y k ，被称为c h 连接( h ( 3l i n k e r ) 【2 8 】。连接肽的氨基酸序列对 于锌指结构与d n a 结合也有重要影响。连接肽的柔性状态保证各个锌指能够沿d n a 的大沟排列，同时将相邻的锌指结构以一定距离分隔，使得每个锌指都能成为一个 独立的功能单位【3 1 ，3 2 】。 1 2 1 2 3c 2 h 2 型锌指蛋白的功能 总体来说，c 2 h 2 型锌指蛋白主要参与细胞分化增殖和胚胎发育，并因此与一 些疾病密切相关。例如，在血细胞的分化和发育需要g a t a lh o 、e k l f 4 1 、 z i f 2 6 8 1 4 2 等多种锌指蛋白组成调节网络进行调节；w t l 、h f h z 、h f o g 2 与心脏 的发育及心脏疾病有关 4 3 4 5 】；还有一些锌指蛋白基因在肿瘤中表达异常，也暗示 其在肿瘤的发生和发展过程中有重要作用 4 6 - 4 8 。 1 3 z f p l 9 1 基因研究背景及z f p l 9 1 蛋白的分子生物学特性 1 3 1 z f p l 9 1 基因的获得 1 9 9 9 年，p r o s t 等人在克隆和鉴定参与软骨分化相关基因的过程中，通过差减 杂交技术分离得到了一个小鼠的锌指蛋白基因，最初命名为z f l 2 。依据其c d n a 的开放阅读框，推测z f - 12 基因编码3 6 8 个氨基酸，c 端含有4 个连续c 2 h 2 型锌 指模体，n 端存在s c a n 结构域【3 1 。 1 3 2 z f p l 9 1 基因结构 p r o s t 等人报道了小鼠z f 1 2 的c d n a 序列( g e n b a n k 登录号：a f l 4 9 0 9 3 ) ， 但其3 端的非翻译区( 3 - u t r ) 是不完整的。2 0 0 3 年，厉建中等获得了小鼠锌指 蛋白z f - 1 2 基因组片段，全长180 9 3b p ，并完成了其测序，在g e n b a n k 注册 了其全序列( 登录号：a y 0 5 2 4 9 5 ) 【4 9 】。他们还利用生物信息学软件对全序列的剪 接位点进行了分析，划分出小鼠z f 1 2 基因的内含子和外显子边界。由此得知， 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 小鼠z f 1 2 基因由4 个外显子和3 个内含子组成，与人锌指蛋白z n f l 9 1 基因的 结构相一致，转录本约3 1 4k b ( 不含p o l y a 尾) 目前，文献中对该基因的命名比较混乱。n a t i o n a lc e n t e ro fb i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n ( n c b i ) 数据库将该基因的官方名称定为z i n cf i n g e rp r o t e i n1 9 1 ( z f p l 9 1 ) ，别称为z f 1 2 。该基因位于家鼠的第1 8 号染色体上，其基因结构如 图所示( 图1 3 ) 。 2 k b - - - - _ _ 一 a 叩c 从1 l 从 饥a a a t 王一- l - - j 一 l i1 1 i v e x 伽o f z p - 3 $ 图1 - 3z f - 1 2 基因结构示意图【的l 黑框：编码区；阴影框：非编码区；白色框：锌指蛋白z f p 2 3 5 的第3 外显子； a t g ：转录起始密码子：m t a m ：加尾信号 f i g1 - 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h em o u s e z i n cf i n g e rp r o t e i nz f - 12 g e n e1 4 刚 b o x e sr e p r e s e n te x o n s ，b l a c ka n ds h a d o wr e p r e s e n tc o d i n gr e g i o na n dn o n - c o d i n gr e g i o n ， r e s p e c t i v e l y w h i t eb o xr e p r e s e n t se x o n o fz i n cf i n g e rp r o t e i nz f p 2 3 5 a t ga n da a l 7 a a a i n d i c a t eat r a n s l a a o n a ls t a r tc o ( i o na n dap o l yas i g n a lr e s p e c t i v e l y z f p l 9 1 基因的蛋白产物为z i n c f i n g e r p r o t e i n1 9 1 【m u sm u s c u l u s ，n c b i 登陆 号为n p - 0 6 7 5 3 4 。氨基酸序列如图所示( 图1 - 4 ) 。根据c d n a 序列的推测，z f p l 9 1 蛋白中的四个锌指均含有高度保守的c x 2 c x 3 f x s l x 2 h x 3 h ，并且由序列为 t g e k p y x 的七核苷酸h c 间隔序列连接。 1m s a q s v e e d si l i i p n p d e ee k i l r v k l e ed p d g e e g s s is w n h l p d p e vf r q r f r q f g y 6 1q d s p g p r e a vs q l r e l c r l wi r p e t h t k e qi l e l v v l e q fv a i l p k e l q tw v r e h h p e n g 12 1e e a v a v l e d le s e l d d p g q pv s l r r q k r e vi v e e i t s q e da q g l p s s e l da v e n q l k w a s 18 1w e l h s l r h c dd d a t t e n g a la p k q e m a s a ge s h e g p g t l ni g v p q l f k y ge t c f p k g r f e 2 4 1r k r n p s r k k qh i c d e c g k h fs q g s a l i l h qr i h s g e k p y gc v e c g k a f s rs s i l v q h q r v 3 0 1h t g e k p y k c le c g k a f s q n sg l i n h q r i h tg e k p y e c v q cg k s y s q s s n lf r h q r r h n a e 3 6 1k l l n w k v 图1 4 锌指蛋白z f p l 9 1 的氨基酸序列 f i g 1 - 4t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fz i n cf i n g e rp r o t e i n1 9 1 1 3 3 z f p l 9 1 基因及蛋白分子的同源性分析 根据n c b i 数据库的h o m o l o g e n e 分析，z f p l9 1 的d n a 和蛋白序列与以下基 因有较高的同源性( 表1 1 ) 。 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 表1 - 1z f p l 9 1 基因及蛋白分子的同源性分析 t a b l e1 - 1t h eh o m e o l o g ya n a l y s i so fz f p l9 1 g e n e i d e n t i t y ( ) s p e c i e s s y m b o l p r o t e i nd n a m u sm u s c u l u s z f p l 9 1 v s h o m os a p i e n sz n f 2 4 9 4 68 8 9 v s p a nt r o g l o d y t e sz n f 2 4 9 5 18 9 0 v s c a n i si u p u sf a m i l i a r i sz n f 2 49 5 98 8 3 v s b o st a u r u sz n f 2 49 5 88 8 2 v s r a t t u sn o r v e g i c u s z f d l 9 1 9 7 39 3 2 因此。该基因与人锌指蛋白基因z n f 2 4 的同源性最高。这和人与小鼠间的锌指 转录因子的氨基酸序列及功能性质通常有很高保守性的报道相一致 1 3 ，1 4 。 1 3 4 z f p l 9 1 蛋白表达谱分析 p e o s t 等人在此基因发现之初就用n o r t h e r nb l o t 的方法检测了z f p l9 1 在小鼠 各组织中的转录水平【3 】。结果显示，该基因在心脏、大脑、肝、骨骼肌、肾和睾丸 组织中均可检测到较高的转录水平，而脾和肺中的转录水平较低，说明锌指蛋白 z f 1 2 在小鼠中表达具有广泛性。经小鼠胎胚多组织的n o r t h e mb o l t 分析发现，在 发育过程中小鼠z f 1 2 的m r n a 转录水平从胎胚期第7 天到第1 1 天逐渐增加并达 到最高水平，随后不同的发育阶段保持相对恒定。 更值得注意的是，最近k h a l f a l l a h 等人用免疫组化技术分析了z f p l 9 1 在小鼠早 期胚胎发育过程中的表达情况【5 0 】。他们的结果显示，z f p l 9 1 特异性地表达在发育 过程中的中枢神经系统，特别是一些增殖旺盛的区域。 1 3 5 z f p l 9 1 的功能 由于z