（运动人体科学专业论文）不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究.pdf

摘要1 研究目的研究肝源性磷脂补充在一次性力竭运动造成的骨骼肌细胞膜损伤的修复中的作用，并与大豆磷脂补充对比研究，以发现其不同之处，探讨磷脂补充在骨骼肌细胞膜损伤修复及运动疲劳恢复中的作用。2 研究方法以雄性昆明种小鼠为研究对象，分组进行为期两周的补剂补充，之后进行一次性力竭游泳运动。运动后即刻处死，分离双腿两侧股四头肌，提取肌细胞膜，分别测定其丙二醛( m a l o n d i a l d c h y d e ，m d a ) 和超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 含量、n a + - k + 一a t p 酶( n a + k + a t pa s e ) 活性，并测定计算细胞膜的荧光偏振度( p o l a r i z a t i o n ，p ) 、微粘度r i 、膜脂流动性( l i p i dm e m b r a n ef l u i d i t y , l f u ) 等表明细胞膜流动性的指标，以揭示磷脂补充对运动造成的细胞膜损伤的修复作用以及磷脂补充对防止肌细胞膜过度损伤方面所发挥的作用。3 研究结果( 1 ) 运动对照组相较于安静对照组来说，m d a 含量显著上升，s o d 含量显著下降，n a + - k + - a t p 酶活性显著减弱，细胞膜流动性显著降低。( 2 ) 各磷脂补充组与运动对照组相比，在清除自由基、增强n a + 一k + 一a t p 酶活性、改善肌膜流动性方面都有显著性效果。( 3 ) 各磷脂补充组小鼠运动平均力竭时间均长于运动对照组。( 4 ) 相同浓度、不同类型的磷脂补充对同一指标的改善情况存在一定差异，肝源性磷脂补充在多项指标测量中均优于大豆磷脂补充。( 5 ) 补充磷脂并不会明显导致的小鼠体重增长过快或日摄食量的显著增加。( 6 ) 肝磷脂运动+ 限食组各项指标与自由摄食组相比较，未出现显著性差异。4 研究结论( 1 ) 磷脂可有效清除运动导致的骨骼肌细胞膜自由基堆积，增强自主转运酶活性，改善细胞膜流动性。( 2 ) 肝源性磷脂与大豆磷脂相比，对运动损伤显示出更好的修复效果。( 3 ) 磷脂降低运动损伤的程度，并不单纯伴随机体体重的增加，因而可以作为一种安全有效的方法广泛地应用于运动员营养中。关键词：磷脂；骨骼肌细胞膜；抗氧化；细胞膜流动性a b s t r a c t1p u r p o s ei n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no fl i v e rp h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n ta f t e re c c e n t r i ct r a i n i n g ，a n dt oc o m p a r et h er e s u l tw i t hs o y b e a np h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n t ，a n a l y z et h ed i f f e r e n c e s ，a n de v a l u a t et h ef u n c t i o no fp h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n t si nr e p a i r a t i o nt h ei n j u r yo fm e m b r a n ea n dt h er e c o v e r ye x e r c i s e i n d u c ef a t i g u e 2e x p e r i m e n t a lm e t h o d sm a l ek u n m i n gr a t s ，s e p r a t e di n t o5t e a m s ，k e p tt a k i n gs u p p l e m e n t sf o rt w ow e e k s ，t h e nt a k ee c c e n t r i cs w i m m i n gt r a i n i n g s e p e r a t et h es h a r eq u a d r i c e p si m m e d i a t e l ya f t e rt h er a t sk i l l e d ，m a k et h ee e l lm e m b r a n e ，m e a s u r et h em a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) & s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) c o n t e n t s 、n a + - l ( + a t pa s ea c t i v i t y , a n dc a l c u l a t et h ep o l a r i z a t i o n ( p ) 、t i n yv i s c o s i t yq 、l i p i dm e m b r a n ef l u i d i t y ( l f u ) t oa n n o u n c et h er e n o v a t i o ne f f e c to fp h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n to ni n j u r yd u et oe c c e n t r i ct r a i n i n g ，a n dt or e s e a r c ht h ef u n c t i o no fp h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n ti np r e v e n t i n gm u s c l ec e l lm e m b r a n ef r o mi n j u r i n ge f f e c tb r o u g h ti n t op l a yb ya s p e c te x c e s s i v e l y 3r e s u l t s( 1 ) m d ac o n t e n t sa r en o t a b l ec o m i n gf o re cc o m p a r e dw i t hn o t a b l ec o m i n gd o w n ，n a + - k 一a t p a s ea c t i v i t yi sn o t a b l eb ef l u i d i t yi sn o t a b l ed e c r e a s e d s c ，s o dc o n t e n t sa r ew e a k e n e d ，m e m b r a n e( 2 ) p h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n t sg r o u p sh a v en o t a b l ee f f e c t si nt h er e s p e c to fe l i m i n a t i n gaf r e er a d i c a l ，s t r e n g t h e n i n gn a + 一k + 一a t p a s ea c t i v i t y , i m p r o v i n gm u s c l em e m b r a n ef l u i d i t y ( 3 ) e v e r yp h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n t sg r o u pt a k e sl o n g e rt i m et ob ee x h a u s t e di ns w i m m i n gt h a ne ct e a m ( 4 ) t h e r ea r eal i t t l ed i f f e r e n c e si ns u p p l e m e n t so fi d e n t i c a lt h i c k n e s sb u td i f f e r e n tk i n do fp h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n t s ，l i v e rs o u r c ep h o s p h o l i p i di sc o m m o n l yb e t t e rt h a ns o y b e a np h o s p h o l i p i d ( 5 ) p h o s p h o l i p i ds u p p l e m e n t sw i l ln o tl e a dt oo b v i o u s l yw e i g h ti n c r e a s eq u i c k l yo rd a yi n g e s t i o na m o u n t sr a i s e ( 6 ) n o t a b l ed i f f e r e n c ed o e sn o ta p p e a rw h e nl lt e a mi sc o m p a r e dw i t hf r e ei n g e s t i o ng r o u p s 4c o n c l u s i o n s( 1 ) p h o s p h o l i p i dm a yh a v em a n ye f f e c t st oe l i m i n a t et h es k e l e t a lm u s c l ec e l lm e m b r a n ef r e er a d i c a lc o n g e r i e st h a tm o t i o nl e a d st o ，s t r e n g t h e na c t i n go ns e w so w nt r a n s p o r t i n ge n z y m a t i ca c t i v i t y , i m p r o v em e m b r a n ef l u i d i t y ( 2 ) c o m p a r e dw i t hs o y b e a np h o s p h o l i p i d ，l i v e rs o u r c en a t u r ep h o s p h o l i p i dh a sd e m o n s t r a t e dm u c hb e t t e rr e n o v a t i o nt om o t i o ni n j u r e s ( 3 ) t h ed e g r e et h a tp h o s p h o l i p i dl e s s e n i n gm o t i o ni n j u r i e s ，i sn o te x c l u s i v e l ya c c o m p a n i e db yi n c r e a s eo fo r g a n i s mw e i g h t ，s oi tc a nb ea b l et oa p p l i e db r o a d l yi n t oa t h l e t en u t r i t i o na so n ek i n do fs a f e t ym e t h o d k e yw o r d s ：p h o s p h o l i p i d ；s k e l e t a lm u s c l ec e l lm e m b r a n e ；a n t i o x i d a t i o nc a p a b i l i t y ；m e m b r a n ef l u i d i t y 学位论文独创性声明本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。学位论文作者签名：泛丑嘈日期：加辟r 目学位论文版权的使用授权书本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。学位论文作者签名：昊立吁指导教师签名：甥鼻乏争日期：埘斓不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究1 前言1 1 选题依据目前，国内外关于运动性疲劳产生机制的研究一直是运动医学研究的热点。急性运动和力竭运动都可以导致内源性氧自由基生成增多，脂质过氧化反应增强，从而构成了对细胞膜系统的损害，并与运动性疲劳密切相关。细胞膜作为界膜，能保持细胞的完整性，使细胞与外界环境隔离；同时，由于其特殊的结构，又使细胞与环境之间不断交流。细胞膜主要由蛋白质和脂类组成，流动的脂质双分子层构成膜的连续主体，各种球状的蛋白质分子镶嵌在脂类双分子层中。细胞膜的重要生物学特性主要表现在膜的不对称性和膜的流动性两个方面。膜的流动性保证了膜的正常生理功能。运动时，骨骼肌的血流量能增加几十倍。氧耗的急剧增加，使肌肉线粒体呼吸作用增强，通过线粒体呼吸链中的辅酶q 的氧化还原循环，使体内氧自由基大量生成，从而引发骨骼肌细胞膜的脂质过氧化反应；同时，由于运动时体内的血液重新分配，运动中的骨骼肌暂时中止血流供应后血流再灌注，可诱发黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，产生氧自由基，使骨骼肌发生过氧化损伤。此时，大量的氧自由基可以破坏肌细胞膜脂质双层结构，膜流动性降低。同时由于肌细胞膜上的三磷酸腺苷( a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ，a t e )含量非常有限，而n a + - k + - a t p 酶又需消耗大量a t p ，因此细胞膜a t p 含量明显减少，最终导致k + 通道大量开放，k + 大量释放至细胞间隙。这种变化最终导致动作电位降低，促使疲劳的发生，从而导致运动能力的下降n 1 。骨骼肌细胞的正常收缩功能与肌细胞膜特性有着密切的联系。目前关于运动后产生的内源性自由基对细胞膜特性影响的研究，已涉及到肝细胞乜儿射、红细胞h m 酗等，但对骨骼肌细胞膜的研究很少涉及，故而本试验主要通过对骨骼肌细胞膜进行取样测定。与此同时，磷脂作为动植物细胞中细胞膜、核膜及各种细胞器膜的基本成分，对生物膜的流动性、通透性和完整性起着重要的作用。磷脂双层也是结合于膜上的各种酶功能活动的微环境，全身各组织细胞内质网均有合成磷脂的酶系。磷脂中的不饱和脂肪酸能改善细胞膜磷脂和脂肪酸成分，使必需脂肪酸的含量显著增加，从而增加细胞膜的流动性、韧性和变形能力，增强细胞膜的功能哺儿”。不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究但是，目前关于磷脂补充方面的报道研究也不多见，且主要集中在各种病症( 如：心血管眵1 、肝脏阳1 等器官疾病) 发生时细胞膜所表现出来的病变以及如何利用磷脂加强脑的记忆功能n 们等方面，而关于磷脂在运动方面的应用、力竭或大强度运动导致的细胞膜损伤以及如何修复方面的文献仍然较少。故而，探讨补充磷脂与机体抗氧化的关系及对磷脂改善机体营养状况的研究有着重要的理论和实际意义。另外，目前临床医学上用于防治脑、心、肝、肿瘤等疾病所采用的磷脂大多数来源于大豆磷脂、原青花素或蛋黄卵磷脂，纯度较低，因此，如何提取一种纯度更高、利于吸收且效果更好的磷脂来应用于实践，也成为一个亟待解决的问题。1 2 研究目的和内容力竭运动可在很大程度上造成运动肌细胞膜的损伤，而如何更快地修复这种运动造成的膜损伤在很大程度上决定着运动能力的高低。故而，选取合适的补剂便成为现代运动医学一个较为突出的问题。本研究将通过两周的磷脂补充，提取一次性力竭游泳运动后小鼠的运动肌细胞膜，通过测量细胞膜上的脂质过氧化指标m d a 和s o d 、主动转运指标n a + - k + - a t p 酶活性、细胞膜流动性指标等，通过对试验数据的统计分析，探讨不同磷脂f - 补充对骨骼肌细胞膜各项指标的不同作用，观察磷脂补充对运动造成的膜损伤是否有较强的修复作用，以期望为磷脂在运动员的营养补充及恢复方面提供参考。本实验所选用主要磷脂为肝源性磷脂，其提取方法由辽宁师范大学生命科学学院提供，且此方法提取磷脂已成功应用于2 0 0 5 年国家自然科学基金资助项目。该方法提取的肝源性磷脂在抑制肝癌细胞的生长表达、增强小鼠脑记忆能力、修复酒精肝损伤、防治小鼠糖尿病等方面的作用均已得到实验证实嘲，且提取成本低、纯度高。同时，选用目前市面上销售较好的大豆磷脂做为补充对照，用以探讨不同磷脂在对待同一形式的运动损伤方面发挥的作用是否不同。具体的研究内容共分为两大部分：内容一：磷脂的提取和鉴定：提取肝源性磷脂和大豆磷脂，并对其成分进行鉴定，以确保其功效；分别制备肝磷脂与大豆磷脂的脂质体悬浊液，并用电镜测定其分子直径，确保可被动物机体吸收。2不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究内容二：动物实验：小鼠分组，灌胃两周后一次性力竭运动处死，提取股四头肌细胞膜，测定其m d a 和s o d 含量、n a + 一k + 一a t p 酶活性、细胞膜流动性指标等，探讨不同磷脂补充是否会对小鼠的细胞膜损伤修复产生不同程度的影响，以及限制食量能否对肝磷脂的作用效果产生不良影响。1 3 研究假设1 3 1 两种形式的磷脂补充均可对一次性力竭运动造成的骨骼肌细胞膜的损伤产生一定的修复作用。其中，肝源性磷脂会在一定程度上优于大豆磷脂。1 3 2 限食并不会对肝源性磷脂的补充和修复作用产生显著性影响。1 3 3 磷脂补充可能会在一定程度上造成实验小鼠体重的明显增加及摄食的增加，但并不会对小鼠的运动能力产生不良影响。3不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究2文献综述运动对骨骼肌细胞膜抗氧化的影响及磷脂补充运动性疲劳是指机体生理过程不能持续其机能在一特定水平上和或不能维持预定的运动强度而导致机体运动能力下降的现象。运动性疲劳的形成机制之一就是自由基学说。关于自由基的生成，以及如何有效清除体内自由基的堆积，从而提高运动能力，已成为目前国内外普遍关注的热点问题。2 1 自由基的生成与脂质过氧化生物膜是细胞的基本结构，是细胞生命活动的基本场所。s i n g e r 和n i c o l s o n 1 在1 9 7 2 年提出的生物膜液态镶嵌模型：磷脂分子形成的液态脂双层结构是生物膜的基本骨架，它是极性化合物的通透屏障；膜蛋白镶嵌在脂双层分子中。膜磷脂分子不仅构成生物膜的基本成份，也参与生物膜的功能活动的调节。膜脂为酶的活性所必须，脂类为酶的最佳构象和定向提供适宜的非极性环境。脂类分子的极性头部的某些物理特性如静电状态、水化状态等能在膜的极性界面和非极性界面之间为酶的最佳构象提供最适宜的微环境n 2 1 。自由基是指外层轨道上具有未配对电子的原子、原子团或分子。运动中内源性氧自由基生成增加，主要有以下几个途径：1 ) 通过线粒体呼吸链中的辅酶q ( c o q ) 的氧化还原循环，使0 2 一生成增多；2 ) 经黄嘌呤氧化酶产生0 2 一途径被激活。生物膜上具有丰富的多不饱和脂肪酸，其结构特点是分子中含有多个双键，且两个双键之间的亚甲基上的h 原子比较活泼，极易被反应性极强的o h 一抽提，产生脂质自由基和脂质过氧自由基，从而引发脂质过氧化反应，使生物膜结构、功能受到破坏。脂质过氧化实质上就是发生在生物膜上的多不饱和脂肪酸分子上的一系列自由基的连锁反应u 扣。脂质过氧化作用对生物膜的损伤作用是多方面的n 引，如改变膜脂双层特性( 膜流动性、通透性) ，使膜酶活性所需求的微环境发生改变，导致膜功能下降，甚至丧失；其产物不断攻击生物膜上的蛋白质和脂类，而且还攻击细胞内其他的巯基蛋白，甚至d n a 、r n a 等。4不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究脂质过氧化的产物有醛基m d a 、酮基等过氧化物。其中，m d a 对细胞膜有很强的破坏作用，使其流动性和通透性发生变化，细胞内外离子分布发生异常，从而最终导致细胞功能的丧失和细胞的死亡。m d a 值可以有效表示机体内自由基产生以及对机体的影响程度。m d a 含量的高低可反映体内脂质过氧化的程度，间接地反映细胞受损程度。s o d 是机体抗氧化系统中重要的抗氧化酶，是体内自由基的主要清除酶，作用是歧化0 2 一生成h 。0 ：，从而阻断毒性更强的羟自由基产生乜1 。通过清除氧自由基作用减轻脂质过氧化对肌细胞膜造成的损伤，其活性升高表明机体自由基清除加快。s o d 可在一定程度上反映机体自由基清除系统的功能状况n 射。2 2 不同运动形式对骨骼肌细胞膜脂质过氧化的影响运动中机体代谢旺盛，线粒体氧化磷酶化加强，呼吸水平提高，线粒体在电子传递过程中产生的氧自由基升高，又由于运动时a t p 消耗增加，a t p 分解产物次黄嘌呤含量升高，加上运动时黄嘌呤氧化酶活性增加，从而引起脂质过氧化反应增加，m d a 含量增加。另外，同样负荷下，线粒体钙含量升高，反应胞浆c a 2 + 浓度增加，胞浆高c a 2 + 激活磷脂酶a 2 ( p l a 。) ，通过溶酶体和白细胞三烯途径引起m d a 升高h5 1 。目前，关于运动对细胞的影响的实验研究多数停留在心肌细胞、肝脏细胞及细胞线粒体的实验研究上，对骨骼肌细胞膜的研究还只是少数。2 2 1 一次性力竭运动对膜脂质过氧化的影响多数研究发现，大鼠力竭运动后脂质过氧代谢产物m d a 值，运动后即刻明显增加，2 4 小时后达峰值，4 8 小时后开始恢复。张钧等n 力以大鼠力竭运动为模型，观察了运动后心肌线粒体s o d 活性的变化情况i 发现力竭运动后即刻s o d 活性明显下降，而s o m a n 等n 8 1 发现f i s h e r - 3 4 4 大鼠急性运动后心肌线粒体s o d 酶活性增加了1 6 7 。据陶占泉等人n 鲫的研究，力竭游泳后即刻小鼠骨骼肌中的m d a 水平显著升高。j e n k i n s 髓妇报道，力竭运动后尿m d a 升高6 3 ，机体m d a 排泄到肾脏中，m d a 在机体运动过程中不断被肝脏代谢，也证实了脂质过氧化物可以从产生部位扩散至其它部位。所以2 小时急性游泳后即刻肝和肾中高含量的m d a 除了源于运动本身带来的外，也可能是从其它组织特别是从运动器官转移而来。游泳后即刻脑和脾m d a 含量无显著变化，但在运动后1 6 h 和2 4 h 时显著提高h 6 1 ，说明尽管大脑有较强的保护机制和适应能力，不间磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究但不适量的运动也会对大脑及神经系统造成一定损伤。研究结果提示：小鼠力竭运动后后恢复期内，骨骼肌自由基代谢较运动前安静状态下活跃，清除自由基和抵御其氧化损伤的能力相对不足n 7 1 。2 2 2 中等强度耐力运动对膜脂质过氧化的影响1 9 3 5 年有研究报道，运动可增强骨骼肌氧化能力啪1 。此后，大量的研究都证实耐力训练可以促进骨骼肌氧化能力两个重要制约因素线粒体乜和氧化酶活性晗2 1 的发展。有研究表明，耐力训练使体内抗氧化酶活性增加，就可以消除运动时产生过量的自由基，从而减轻了氧自由基损伤呦1 。魏源等研究发现乜钔，经过4周耐力训练的大鼠力竭运动后红肌线粒体m d a 和总c a 2 + 显著低于无训练的大鼠，而s o d 则显著高于后者，说明本研究所采用的训练方案使大鼠在力竭运动时红肌线粒体抗氧化能力提高，脂质过氧化水平降低和维持钙平衡的能力增强，这是训练所引起的适应，这种适应可能是训练增强运动能力的机制之一。同时，另有研究发现h 8 1 ，耐力训练后，小鼠骨骼肌s o d 活性并未下降反而有所增加，同时m d a 含量没有显著增加。表明耐力训练后，机体的自由基代谢达到产生与消除的动态平衡，骨骼肌抗氧化能力增强。2 2 3 间歇性低氧暴露对膜脂质过氧化的影响间歇性低氧暴露中，脉冲性低氧刺激激发组织自氧化，产生大量自由基刺激机体，从而获得抗氧化酶系活性升高的应激反应瞄5 1 ，这是间歇性低氧暴露的重要生理学基础之一。大量实验结果表明，间歇性低氧暴露可以提高心肌、脑组织和骨骼肌对脂质过氧化的消除能力和超氧化物歧化酶的活性，提高机体在缺氧条件下的工作能力。k o v a l c n k o 认为，在人体的组织细胞周围，氧分压是变化的口1 ，这对机体的影响同缺血再灌流的效果类似，实际上是机体对低氧环境的一种适应，是机体以激活抗氧化体系为目的的自我训练过程，这也是间歇性低氧暴露建立的理论依据之一汹1 。2 2 4 间歇性无氧运动对膜脂质过氧化的影响诸多研究证实，剧烈运动可促使体内活性氧产生、脂质过氧化增强及m d a水平升高而导致运动能力下降，产生运动性疲劳瞳引。6不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究据j e n k i n s 等刚的实验研究发现，股四头肌中s o d 活力与v o ：m a x 呈正相关。在大强度间歇运动中，肌组织无氧代谢的加强激活黄嘌磷氧化酶系统，使内源性自由基生成增多，恢复过程中，氧耗量的增加使线粒体电子漏加强也使自由基生成增多，所以在机体处于应激状态的过程中，自由基的增多诱导了体内抗氧化酶及抗氧化物活性相应增强。同时，大量的实验结果还发现踊们，骨骼肌内m d a 水平各运动组仍较对照组明显升高，这可能由于间歇性无氧运动中自由基产生过量，尽管体内的抗氧化防御体系的应激水平已适应性加强，但也无法彻底清除，因而导致肌内氧化损伤加重。2 3n a + - k + - a t p 酶与运动性骨骼肌疲劳n a + - k + - a t p 酶是广泛存在于真核细胞膜上的内在蛋白，是一个依赖于磷脂来维持其活性的酶，在质膜上为不对称分布。n a j - k + - a t p 酶在骨骼肌的肌膜上含量高、活性高，而t 管膜则分布较少啪1 ，该酶活性根据胞内外的离子浓度改变情况而调节，目的是维持肌膜两侧“内高钾外高钠 的离子梯度。所以该酶和动作电位、兴奋收缩一耦联、骨骼肌的兴奋性等关系密切，骨骼肌一系列活动都离不开n a + - k + 一a t p 酶。2 3 1n a + 一k + _ a t p 酶活性下降与骨骼肌疲劳f o w l e s 在2 0 0 2 年研究发现无论是2 1 m m i n 的水平跑台运动，还是l o m m i n 、坡度为8 的耐力跑台运动至疲劳或力竭时，大鼠红肌、白肌细胞膜n a + - k + - a t p 酶活性均降低，红肌和白肌之间比较无差异啪1 ，说明这两种强度运动导致n a + 一k + - a t p 活性下降。同年，f o w l e s 为了验证等长收缩的骨骼肌n a + - k + - a t p 酶活性下降和神经肌肉疲劳( n e u r o m u s c u l a rf a t i g u e ) 具有相关性。把1 4 名志愿者分为训练组、对照组，通过研究训练前后的力量、速度等指标后发现：训练组与对照组相比，股外侧肌n a + 一k + _ a t p 酶活性因为持续等长收缩而下降，同时发现骨骼肌的兴奋性随之下降口。f r a s e r 也发现不论力量型、耐力型运动员还是无训练者，其肌肉n a + - k + - a t p 酶的活性都在疲劳时被抑制，提示这种变化是一种肌肉疲劳的决定因子2 1 。国外以上研究均证实神经肌肉疲劳和n a + 一k + 一a t p 酶的活性下降有关。国内对疲劳时骨骼肌细胞膜上a t p 酶活性只有个别类似研究。马强等在研究中发现，大鼠腓肠肌细胞r p ( 静息电位) 和c a p ( 复合动作电位) 幅值下降，c a 的时程变大隋。9 周游泳训练可以使定量运动大鼠的肌肉匀浆中7不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究n a + - k + - a t p 酶活性明显提高( p o 0 1 ) 1 。田野研究发现大鼠进行2 0 0m i n 下坡跑运动后骨骼肌肌膜n a + 一k + 一a t p 酶活性下降，2 4 h 后基本恢复口利。总之，国内外对肌膜n a + - k + - a t p 酶和疲劳的关系基本可以得出结论：运动疲劳时n a + 一k + - a t p 酶活性的确下降，其活性下降是导致运动性疲劳的重要因素。但是运动疲劳过程n a + - k + - a t p 酶活性和数量的具体调节机制仍然不清楚哺引，这可能是未来研究的热点之一。另外，如何通过营养手段等保护n a + 一k + 一a t p 酶活性，提高骨骼肌的收缩能力也是运动医学界关心的课题。2 3 2 疲劳时n a + - k + - a t p 酶活性下降的原因研究发现，运动疲劳时细胞膜磷脂双分子层组分和流动性改变，影响了膜上的蛋白质分子的构象和基团，会影响n a + 一k + - a t p 酶活性。另一方面，是自由基对该酶的直接作用：在运动强度大于7 0 v 0 。m a x 时自由基产生大量增加，自由基攻击生物膜导致n a + - k + - a t p 酶活性下降。目前一般认为运动中产生的自由基攻击细胞膜，降低膜流动性继而使细胞膜上的n a + - k + - a t p 酶活性下降口5 1 。也有研究认为n a + - k + - a t p 酶失活和n o 有关，n o 可以直接影响肌原纤维的功能，阻断其对c a 2 + 的敏感性，降低缩短速度和减少n a + - k + - a t p 酶活性，具体机制有待进一步深入研究口。综上所述，肌膜上的n a + 一k + - a t p 酶是维持肌纤维结构和功能的重要蛋白质。研究表明通过周期性持续训练可以增加肌纤维细胞膜上酶的数量和活性，产生良性适应。运动过程中有复杂的信号转导机制对n a + - k + - a t p 酶活性进行调节，疲劳时n a + 、k + 调节能力下降，胞内k + 持续丢失，胞外n a + 内流，静息电位绝对值随运动时间延长明显下降，肌肉做功能力下降啼引。近年来的研究资料表明晦引，运动中自由基产生增加，以多种方式的攻击n a + - k + - a t p 酶，是活性下降的重要原因。2 4 磷脂补充对膜抗脂质过氧化能力的影响磷脂是动植物体内细胞膜和细胞器膜的骨架成分，其双分子层结构维持着膜内外物质和信息的传递，并对与膜相关的酶的活性进行调控：磷脂也是脂蛋白装配和分泌所必需的成分，在脂类代谢及其他生命活动中都起着重要作用。广义的磷脂包括甘油磷脂和鞘磷脂两种，甘油磷脂也简称为磷脂。神经系统中的鞘磷脂则是甘油磷脂分子结构中的甘油部分被鞘氨醇取代，其结构8不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究和性质均与甘油磷脂相似。提取的磷脂是混合物，根据其结构通式中一x 基团的不同，分为磷脂酰胆碱( p c ) 、磷脂酰乙醇胺( p e ) 、磷脂酰肌醇( p i ) 、磷脂酰丝氨酸( p s ) 、磷脂酰甘油( p g ) 、磷脂酸( p a ) 等汹1 。磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p c ) 俗称卵磷脂，是真核生物细胞膜的重要组分之一，它不但维持生物膜正常的结构和功能，与细胞的生长、增殖分化及癌变密切相关，其降解产物还参与细胞的信号转导和代谢调控，具有防衰老、降血脂、抗肿瘤、健脑、保肝等多种生理作用h 。因此，p c 作为保健品及药物制剂的研究与应用正越来越受到重视h 0 1 。实验表明：饮食中加入大豆磷脂后，心肌细胞线粒体内膜的呼吸酶、细胞色素氧化酶的活力显著增加，产生能量增多，使人精力、体力增强。补充大豆卵磷脂起到了对心肌细胞膜的修补作用，显示了良好的抗衰老作用。近年来中药研究表明：何首乌的抗衰老、降血脂、防治动脉粥样硬化及保肝作用，主要是其含有4 2 的卵磷脂的作用h 。磷脂被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素。1 9 9 8 年被美国国家科学院食品营养学会列为每日必需营养素( r d a ) 。美国、欧洲、日本等已将磷脂在临床上用于防治脑、心、肝、肿瘤等疾病h 别。磷脂作为重要的天然表面活性剂具有乳化、分散、润湿、速溶、脱膜、分离等作用，被广泛应用于化工、食品、医药、石油、轻工、饲料以及日化等行业中 4 3 - 4 6 o2 5 小结目前国内关于骨骼肌细胞膜的研究仍处于起步阶段，主要集中在对于骨骼肌在运动过程中，如何通过细胞膜的转运机制来吸收某一物质，或者细胞膜的脂质过氧化损伤方面，尚缺乏利用何种手段及方法来修复损伤的实验证据。本文立足于磷脂补充的研究，源自磷脂已被证明的营养作用以及作为药用在临床康复方面的广泛应用。同时，目前作为保健品和药用辅料的天然p c主要来自于大豆和蛋黄磷脂，虽然价格低廉，但纯度较低。肝脏是人体代谢的中心站，肝细胞膜上含有极其丰富的磷脂。它不仅可促进肝细胞脂蛋白的形成，加速脂肪的转运，防止胆固醇在肝中的沉积，同时还可提高肝内脂酰转移酶的活性，防止脂肪肝和肝硬化的产生，并能恢复受损的肝细胞四1 。故而肝源性磷脂的应用应该更能够取得预期的理想效果。9不问磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究3 研究内容一磷脂的提取和鉴定3 1 肝源性总磷脂的提取和鉴定3 1 1 肝源性总磷脂的提取所用样品为新鲜猪肝( 由大连市础明基团提供) ，称重，除去筋膜，切成小块，采用经典的f o l c h 法分离得到猪肝总脂：按质量体积= i ：1 加入双蒸水，组织匀浆器匀浆，制成的匀浆液中加入甲醇、氯仿( 体积比为1 ：4 ：4 ) ，保鲜膜封口，冷藏静置，使其充分萃取分层。1 2 h 后吸取下层溶液( 磷脂的氯仿溶液) ，旋转蒸发仪蒸干，氮气做保护气。按照总脂和丙酮的质量体积比1 ：3 加入丙酮，充分混合，反复多次，直至溶液清亮为止，以去除总脂中的油脂和胆固醇，过滤不溶物，即得到肝源性磷脂。3 1 2 肝磷脂的鉴定利用t l c 薄板层析法检测提取得磷脂中各物质含量：制备a 1 。o 。层析柱，将提取的磷脂溶解于9 5 乙醇中，过滤后上样，控制流速2 5 m l m i n ，从第6 m i n 开始收集，收集4 0 0 m l 洗脱液。利用t l c 硅胶板以展开剂( 氯仿：甲醇：水= 6 5 ：2 5 - 4 ) ，进行薄层层析，并与标准样品进行对比引。图3 - i 为t l c 高效薄板层析分离肝脏总磷脂结果。其中，m 为磷脂标准品，s 为肝脏磷脂。经磷脂标准品鉴定从上到下依次为心磷脂( c l ) 、磷脂酰乙醇胺( p e ) 、磷脂酰肌醇磷脂酰丝氨酸( p i p s ) 、磷脂酰胆碱( p c ) 和鞘磷脂( s m ) 。各成份及其在总磷脂中所占比例如右侧表中所示。l o巧i 同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究c li 一一- p ep i l | | | p s口lp cs m成份含量( )c l8 5 8p e2 5 9 8p i p s4 16p c5 5 5 8s m5 6 9ms图3 一lt l c 高效薄板层析分离肝脏总磷脂及各成分的比较( )3 1 3 肝磷脂悬浊液的制备提取的肝磷脂，加水超声裂解( j y 9 2 一i i 超声波细胞粉碎机，超声功率2 0 0 w ，注意温度变化) ，制成浓度为1 8 m g m l 的肝磷脂悬浊液，其电镜下的观察图片如图所示：图3 2 肝源性磷脂脂质透射电镜照片( 放大5 0 0 0 0 倍)不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究由图3 2 所得图片测定发现，球形肝脏磷脂脂质体直径小于l o o n m ，满足动物的灌胃溶液要求嘞1 。3 2 大豆磷脂的提取和鉴定3 2 1 大豆磷脂的提取直接采用市面所售成品：h a r v a r d - k a n g 大豆磷脂软胶囊( 美国l y ( u s a ) i n t li n c 。提供技术支持，珠海市富海生物科技有限公司生产，国食健字g 2 0 0 5 0 1 8 0 ，磷脂含量为4 9 o g l o o g ) ，用丙酮脱去脂肪及蛋白质成分。3 2 2 大豆磷脂的鉴定利用与3 1 2 中相同的方法对提取所得大豆磷脂进行鉴定，利用成像分析系统对t l c 薄板层析结果进行扫描，并与提取的肝源性磷脂做比较，如图3 - 3 所示。图3 - 3 肝源性磷脂与大豆磷脂主要成分的对比分析图由图示数据可以看出，猪肝脏磷脂中p c 为主要成份，占肝脏总磷脂5 5 8 以上。其次为p e ，占总磷脂的2 8 。大豆磷脂中p c 也为主要成份，1 2不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究占肝脏总磷脂4 7 9 以上。其次为p e ，占总磷脂的2 6 。由两种磷脂成分比较结果可以看出，对应磷脂的主要组分( p c 、p e 、p i ) 所占比例，猪肝磷脂均高于对应大豆磷脂的含量。3 2 3 大豆磷脂悬浊液的制备将提取的大豆磷脂加水超声裂解，制成浓度为1 8 m g m l 的大豆磷脂悬浊液，其电镜下样本观察图片如图3 4 所示：图3 - 4 大豆磷脂脂质透射电镜照片( 放大5 0 0 0 0 倍)由图3 - 4 所示，由电镜观察测定发现，球形肝脏磷脂脂质体直径小于l o o n m ，满足动物的灌胃溶液要求嘲1 。1 3不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究4 研究内容二动物实验：不同磷脂补充对力竭运动小鼠骨骼肌细胞膜损伤修复的影响的研究4 1 实验材料与方法4 1 1 实验对象与分组雄性昆明种小鼠5 0 只，体重1 8 - - 一2 2 9 ，购自大连医科大学，卫生等级为国家二级。动物饲养环境温度为2 3 。0 2 。c ，相对湿度为4 0 - 6 0 ，分笼饲养，国家标准啮齿类动物饲料，自由饮食和摄水，自然昼夜节律变化光照。小鼠在适应实验室环境两天后，随机、筛选分为5 组，每组1 0 只：安静对照组( s i l e n c ec o n t r o l ，s c 组) 、运动对照组( e x e r c i s ec o n t r o l ，e c 组) 、大豆磷脂运动组( s o y b e a np h o s p h o l i p i d & e x e r c i s e ，s e 组) 、肝磷脂运动组( 1 i v e rp h o s p h o l i p i d & e x e r c i s e ，l e 组) 、肝磷脂运动+ 限食组( 当日允许饮食总量控制为安静对照组前一日饮食量，l i v e rp h o s p h o l i p i d l i m i t ，l l 组) 。除s c 组外，其他四组于每日早8 ：o o 与晚8 ：o o 各灌胃一次，各组灌胃剂量为：灌胃药量小鼠体质量= l g k g b w d ，每只鼠每次灌胃体积为2 0 弘l k g b w 。各组灌胃溶液分别采用内容一中制各的1 8 m g m l 的磷脂悬浊液，运动对照组于同一时间灌等量的生理盐水。4 1 2 运动模型采用一次性力竭游泳方案：e c 、s e 、l e 、l l 四组于正式运动前三天，每天进行1 5 2 0 m i n 的适应性游泳训练，饲养两周后，正式进行一次性力竭游泳运动。运动前1 2 小时禁食。泳槽的规格为：1 o 5 0 5 m 3 ，水深4 0 c m ，水温3 0 2 。c 。小鼠在泳槽中做无负重游泳运动。力竭标准：小鼠游泳动作不协调，出现挣扎状，且连续三次没入水面下5秒钟不能浮出水面。4 1 3 测试样本的采集与处理s c 组鼠在喂养1 4 天后处死，其它四组鼠灌胃两周力竭游泳后即刻处死，处死方式均为眼球取血。以下操作均在4 。c 以下进行。骨骼肌样本的采集：小鼠处死后即刻，迅速分离双侧后肢股四头肌，置1 4不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究于冰生理盐水中清洗后，滤干水分，之后用标记好的锡纸包好，放入液氮中保存，备用。肌肉匀浆方法：去除肌肉中的脂肪、血管、神经及结缔组织。剪取2 0 0 m g的肌组织，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，按质量：体积为1 ：9 的比例加入p h 为7 4 的5 0m m o l 的冰t r i s h c l 溶液( 将6 0 5 7 9t r i s b a s e 溶于1 l 双蒸水中，溶解后用浓盐酸调节p h 值至7 4 ) 中进行匀浆。骨骼肌细胞膜的制备方法：匀浆液以2 5 0 0r m i n 离心i 0m i n ，取上清液；再以5 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，取上清液；再以1 4 0 0 0r m i n 离心6 0m i n ，弃上清，取沉淀；再用5 0m m o l 的t r i s h c l ( p h = 7 4 ) 溶液吹打悬浮，再以1 4 0 0 0r m i n 再次离心6 0m i n ，弃上清，取沉淀，最后吹打悬浮于1 2m 15 0m m o l的t r i s h c l ( p h = 7 4 ) 溶液中。离心机为超速冷冻型( 最高转速2 0 0 0 0 r m p ，温度设定为一4 。c ，湘西仪器仪表总厂机械仪器厂生产) 。4 1 4 指标测试与方法4 1 4 1 骨骼肌细胞膜抗氧化指标的测定( 1 ) 膜m d a 的测定：采用改良的硫代巴比妥酸( t b a ) 法，m d a 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，测试严格按照操作步骤进行，仪器为半自动生化仪。( 2 ) 膜s o d 的测定：采用一羟色胺法，s o d 试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，测试严格按照操作步骤进行，仪器为半自动生化仪。4 。1 。4 2 骨骼肌细胞膜n a + 一k + a t p 酶活性的测定采用比色法，a t p 酶试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，测试严格按照操作步骤进行，仪器为半自动生化仪。4 1 4 3 骨骼肌细胞膜流动性的测定以d p h ( 1 ，6 一二苯基一1 ，3 ，5 一已三烯，1 ，6 - d i p h e n y l ，3 ，5 - h e x a t r i e n e ，购自s i g m a 公司) 探针标记骨骼肌细胞膜，通过测定荧光偏振度p 、微粘度r l 、膜脂流动性l f u ，可反应出细胞膜流动性的变化情况。具体步骤如下：( 1 ) 标记溶液的配制：将2 3m gd p h 用5m l 四氢呋喃稀释，再用p b s ( 磷酸缓冲液，8 5 9 n a c l 、2 2 9 n a 。h p 0 4 、0 2 9 n a h ：p 0 4 溶于i l h ：0 中) 稀释至1 0 0 0 倍。( 2 ) 取稀释后的液体2 5m 1 加入1 0 吮l 骨骼肌膜样品，2 5 。c 水浴保温3 0m i n ，用r f 一5 4 0 型荧光分光光度计( 日本s h i m a d z u ) 测定其荧光偏振度p 、不同磷脂补充对小鼠骨骼肌细胞膜损伤的影响研究微粘度n 及