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氯化亚锡存在下某些有机生物分子的表面增强拉曼散射光 谱研究 摘要 表面增强拉曼散射( s e r s ) 光谱已经发展成为一种高灵敏度的 重要分析手段，在表面科学、分析科学和生物科学等领域中得到了广 泛应用。但氧化和碳化是该方法在分析检测有机生物分子中难以避 免的干扰现象。文献多采用真空、惰性气氛、低温和低激光功率等物 理方法减小上述干扰，但这些措施难以在例行分析中实现。目前对这 一难题尚缺少简便而有效的化学解决方法。 本文以三种重要的生物分子吡哆醇( p n ) 、半胱氨酸( c y s ) 和 肌肽( c a r ) 为例，针对表面增强拉曼散射光谱方法难以避免的氧化 和碳化问题，提出了一种新的利用氯化亚锡消除氧化和碳化现象的化 学方法，并探讨了其作用机理。该方法操作简单，有效，己应用到金、 银、铜三种粗糙基底上多种有机生物分子的s e r s 研究。 本文的主要内容如下： 1 研究氯化亚锡的电化学性质和s e r s 光谱，探讨氯化亚锡消 除氧化和碳化现象的机理。发现亚锡离子的强还原性，强吸附性，与 生物有机分子的多种作用方式( 包括配位和诱导吸附) 起着关键作 用。以吡啶为探针分子的实验结果表明，氯化亚锡能有效地解决碳化 问题，而电势的改变可以调控氯化亚锡与吡啶的作用。负电势下，强 化学吸附在粗糙金电极上的氯化亚锡对吡啶阳离子进行诱导吸附，避 免了其遭受“第一层效应”的强电磁场破坏，这是抑制吡啶碳化的重 要原因。 2 利用氯化亚锡成功地解决了s e r s 光谱方法测定p n 时存在 的严重氧化和碳化问题，获得高质量的p n 的s e r s 光谱。p n 与 化学吸附在粗糙金表面的亚锡进行强配位而被固定在强电磁场区，同 时也免受了“第一层效应”的强电磁场的破坏。区别于常见的被测分 子的物理吸附、化学吸附和诱导吸附，该信号增强程度非常显著，在 众多生物分子的s e r s 光谱报道中是少见的。我们认为这是由于除 了电磁场( e m ) 增强效应外，化学( c e ) 增强效应在获得p n 的表 面增强拉曼信号时起了重要作用。氯化亚锡的独特作用还可以拓展到 其他两种钱币金属( 即银、铜) 的粗糙基底上。 3 在p n c y s 混合溶液中，引入氯化亚锡不仅可以消除碳化和 氧化现象，还可以选择性测定p n 或c y s 分子。在粗糙金基底上， 只能测到来自混合溶液中p n 的信号，c y s 几乎不干扰p n 的光谱， 因为亚锡与金基底和p n 作用强，而与c y s 作用弱。在粗糙铜基底 上，电势向负方向变化的过程中先出现c y s 的信号，然后p n 与 c y s 的信号同时存在，这是由于亚锡与铜基底的作用相对要弱。 4 利用氯化亚锡与肌肽的配位作用克服了c a r 在s e r s 光谱中 的氧化和碳化现象，实现了c a r 的s e r s 光谱分析。利用s e r s 光 谱初步探讨了亚锡与多种不同类型的分子的相互作用。 关键词：表面增强拉曼光谱，氧化，碳化，氯化亚锡，吡哆醇， 有机生物分子 s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n gs p e c t r o s c o p i cs t u d i e so f s e v e r a lo r g a n i c n o - m o l e c u l e si nt h ep r e s e n c eo fs n c l 2 a b s t r a c t s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) s p e c t r o s c o p yh a s b e c o m ea nu l t r a s e n s i t i v ea n a l y t i c a lt o o li nt h ef i e l d so fs u r f a c es c i e n c e ， a n a l y t i c a ls c i e n c ea n db i o l o g y o x i d a t i o na n dd e c o m p o s i t i o na r ei n h e r e n t p r o b l e m sf r e q u e n t l ye n c o u n t e r e di nt h es e r sm e a s u r e m e n t s ，e s p e c i a l l y f o rt h er e a c t i v e o r g a n i c b i o m o l e c u l e s 。s e v e r a lp h y s i c a lw a y s f o r r e d u c i n gt h ei n t e r f e r e n c eh a v eb e e nr e p o r t e di nt h el i t e r a t u r e ，l i k ev a c u u m ， i n e r ta t m o s p h e r e ，l o wt e m p e r a t u r e ，l o wl a s e rp o w e r ，a n ds oo n h o w e v e r , t h e s ec o n d i t i o n sc a n n o tb em e tc o n v e n i e n t l yf o rr o u t i n ea n a l y s i so fs e r s 。 a p p a r e n t l y , d e v e l o p m e n to fn e wc h e m i c a lm e t h o d sm o r eo p e r a b l ea r e r e q u i r e df o rt h ee f f e c t i v ee l i m i n a t i o no fo x i d a t i o na n dd e c o m p o s i t i o no f a n a l y t e s i nt h i st h e s i s ，w eh a v ea d v a n c e dan e wc o n v e n i e n tc h e m i c a lw a yt o i m p r o v e t h es e r s a n a l y s i s o fs o m e o r g a n i c b i o m o l e c u l e s ，l i k e p y r i d o x i n e ( p ，c y s t i n e ( c y s ) a n dc a m o s i n e ( c a r ) ，b yi n t r o d u c i n gs n c l 2 i n t ot h e s y s t e ma n dd i s c l o s e d i t s p o s s i b l e f u n c t i o nm e c h a n i s m t h e m e t h o dh a sb e e na p p l i e dt os e r ss t u d i e so fa b o v em o l e c u l e so nt h e s u b s t r a t e so fc o i nm e t a l s ：g o l d ，c o p p e ra n ds i l v e r t h em a i nc o n t e n t so ft h i s _ c l e s i sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： i t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ra n ds e r ss p e c t r ao fs n c l 2h a v e b e e ns t u d i e dt or e v e a li t se f f e c to ni m p r o v i n gt h es e r sm e a s u e r m n e t so f r e a c t i v eb i o m o l e c u l e s t h eg o o dr e d u c t i v e ，a d s o r p t i v ea n dc o o r d i n a t i v e p r o p e r t i e s o fs n ( i i ) a c c o u n tf o rt h er e p r e s s i o no ft h eo x i d a t i o na n d d e c o m p o s i t i o no fb i o m e c u l e s f i r s t l y , p y r i d i n ew a se m p l o y e da sap r o b e m o l e c u l et oc o n f i r mt h ee f f e c to fs n c l 2o nr e d u c i n gt h eo x i d a t i o na n d p h o t o d e g r a d a t i o n w ef o u n dt h a tt h es t r o n g l ya d s o r b e ds n c l 2c h a n g e d t h e a d s o r p t i o nm o d eo fp y r i d i n ea n de l i m i n a t e dt h e f i r s tl a y e r e f f e c to n p y r i d i n e ，w h i c h i st h ec r i t i c a l p o i n t t oa v o i dt h eo x i d a t i o na n d p h o t o d e g r a d a t i o no fp y r i d i n em o l e c u l e t h en e g a t i v es h i f to fp o t e n t i a li s b e n e f i tf o rt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns n c l 2a n dp y r i d i n e 2 t h es e r ss t u d yo fp ni ss e r i o u s l yr e s t r i c t e db yi t so x i d a t i o na n d d e c o m p o s i t i o n f o r t u n a t e l y , t h e i n t r o d u c t i o no fs n c l 2s u c c e s s f u l l y r e s o l v e st h ea b o v ep r o b l e m sa n dr e s u l t si nh i g h q u a l i t ys e r ss p e c t r ao f p n i nt h i sc a s e ，s n ( i i ) s t r o n g l yc o o r d i n a t e sw i t hp na n dp r e s e n t s p e r f e c te n h a n c e dr a m a ns i g n a l sf o rp n , w h i c hi sa nu n u s u a lr e s u l ti n s e r ss t u d yf o rb i o m o l e c u l e s c h e m i c a le n h a n c e m e n tp l a y st h ek e yr o l e h e r eb e s i d e se l e c t r o m a g n e t i ce n h a n c e m e n t t h ea t t r a c t i v ef i n d i n g p r o v i d e sa n o t h e rn o v e lw a yt oo b t a i nt h es e r ss i g n a l so fm o l e c u l e so n r o u g h e ds u b s t r a t e sb yc o o r d i n a t i o n t h ea p p l i c a t i o no fs n ( i i ) c a nb ea l s o e x t e n d e dt ot h es u b s t r a t e so f a ga n dc u 3 t h ep r e s e n c eo fs n c l 2i nt h em i x e ds o l u t i o no fp n + c y sc a nn o t o n l ya v o i dt h es a m p l ed e c o m p o s i t i o nb u ta l s ob eo fh e l pf o rt h es e l e c t i v e d e t e r m i n a t i o no fp no rc y sm o l e c u l e s o nt h er o u g h e n e da ue l e c t r o d e ， c y s d o e sn o ti n t e r f e r et h es i g n a l so fp nf o rs n ( i i ) s t r o n g l yi n t e r a c t sw i t h t h ea us u b s t r a t ea n dp ns i m u l t a n e o u s l y h o w e v e r , o nt h er o u g h e n e dc u e l e c t r o d e ，t h es i g n a l s o fc y s e m e r g e f i r s ta st h e p o t e n t i a l s h i f t s n e g a t i v e l y a n d t h e np ns t a r t s c o a d s o r b i n gt h r o u g hs n ( i i ) t h i s p h e n o m e n o ni sd u et ot h er e l a t i v e l yw e a ka f f i n i t yo fs n ( i i ) f o rt h e r o u g h e n e dc us u b s t r a t e 4 i t sc o o r d i n a t i o nw i t hs n ( i i ) c a r la l s or e d u c et h eo x i d a t i o na n d d e c o m p o s i t i o no fc a rs ot h a tw ea r ea b l et or e s o l v et h es e r sa n a l y s i so f c a r m o r et y p e so fm o l e c u l e sh a v e b e e ni n v e s t i g a t e db ys e r st e c h n i q u e t ou n d e r s t a n dt h e i ri n t e r a c t i o nw i t hs n ( i i ) k e y w o r d s ： s e r s ， o x i d a t i o n ，d e c o m p o s i t i o n ，s n c l 2 ，p n ， o r g a n i c b i o m o l e c u l e v 浙江师范大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其他 机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均 已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果 由本人承担。 作者签名：桷幺力茸日期：7 ) 姑年6 月f b 学位论文使用授权声明 本人完全了解浙江师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关机关或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查 阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等手段保存、汇编学位论文。同意浙江 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播论文的全部或部分内容。同 时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据 库，并通过网络向社会公众提供信息服务，同时本人保留在其他媒体发表论文 的权利。 保密的学位论文在解密后遵守此协议。 作者虢柏厶姘新签囊8 年6 月j 日 第一章绪论 1 1s e r s 技术的优越性和局限性 1 1 1s e r s 在生物科学领域应用的优越性 拉曼光谱作为表征分子振动能级的光谱，在物理学、化学、生物学以及材料 科学等领域一直扮演着重要的角色【l 】。拉曼光谱与共焦显微技术结合，不仅可以 实现对样品的表面微区光谱探测，还可以实现对样品的三维可视化研究。与普通 拉曼光谱相比，表面增强拉曼散射( s e r s ) 光谱显著提高了检测灵敏度，甚至 可以实现单分子检测。s e r s 技术已广泛应用于有机生物样品的痕量分析、界 面吸附状态研究和分子在界面的取向及构型构象研究等。 在生物科学领域，研究的对象往往是微量的，甚至是单细胞或单分子水平， s e r s 的超高灵敏度、高信息含量，简便快捷等特点对检测生物分子具有不可比 拟的优越性。s e r s 光谱技术已应用于活体细胞分析，试图在分子水平揭示生命 活动的规律、疾病的发生与发展、药物与机体的相互作用等1 2 - 4 。s e r s 技术不 仅可以作为分子的指纹光谱进行物质识别，还可以根据光谱的表面选律判断分子 的吸附取向。另外，被测分子与基底之间的能量转移可实现荧光猝灭，从而可以 避免生物样品自发荧光或杂质荧光的干扰，得到荧光物质的s e r s 光谱。在电 化学领域，s e r s 光谱与传统的电化学技术结合可以在分子水平上认识电极溶 液界面所发生的物理化学过程。如有机和生物分子在电极表面的吸附、电化学反 应的中间产物及产物检测、电极反应机理等。另外，控制电极的电势可以调变被 测物与电极表面的相互作用程度，得到更丰富的s e r s 光谱信息。 1 1 2s e r s 光谱在生物科学领域方面的应用简介 1 9 7 4 年，f l e i s c h m a n n 等【5 1 首次在粗糙银电极上获得了单层吸附的吡啶分子 的表面增强拉曼散射光谱。自此，研究者们开始对表面增强拉曼散射光谱产生 了浓厚的兴趣。而将s e r s 技术用于生物研究的先驱者们有k o g g l i n 和 s e q u a r i s 6 】( 最早研究核酸碱基和d n a ) 、n a b i e v 7 】( 最早研究氨基酸、膜蛋白 和核酸) 、c o t t o n 8 】( 最早研究色蛋白等) 。后来大量研究工作证实，该技术能够 解决生物化学、生物物理和分子生物学中的许多问题，如核酸、蛋白质等组分 的分析与鉴别、分子的特殊基团( 如氨基酸中的氨基、羧基、芳环等) 与界面 的相互作用、生物分子与金属表面的键合方式、d n a ( r n a ) 和卟啉等在银溶 胶上的吸附状态等。s t e w a r t 等【9 】检测了1 9 种l 氨基酸分子在银溶胶表面吸附 的s e r s 谱图，给出了氨基酸分子与银表面的作用方式。y u 等【1 0 】用s e r s 研究 了细胞色素c 在金溶胶表面的吸附取向。s t a n i 芒o v h 小组【l l 】用s e r s 研究了抗病 毒和抗帕金森病的药剂三环癸胺与组氨酸的相互作用。s e n g u p t a 等【1 2 】报道了 s e r s 作为生物气溶胶中各种低成分含量的氨基酸和糖类的分析工具。s e r s 技 术还可以成为微量维生素1 3 1 和d n a 1 4 1 的检测手段。2 0 0 8 年，p o r t e r 3 1 综述了以 s e r s 为基础的技术是一系列不同种类的免疫测定方法中的高灵敏度的分析检 测手段。同年，s m i t h t l 5 】阐述了利用s e r s 和s e r s s 技术在溶液环境中对极低 浓度的分析物种进行原位检测的分子识别时体现出独特的性能。而利用s e r s 进行单分子检测获得了很大的发展，如k n e i p p 小组【1 6 1 和n c i 小组【1 7 】的工作。 1 2s e r s 应用中的局限性：氧化和碳化现象 1 2 1s e r s 分析中的氧化和碳化现象 氧化和光降解现象是生物有机分子在s e r s 分析中亟待解决的严峻课题。 生物分子多具有活性，易在纳米结构的增强基底上遭到氧化。p i e c z o n k a 小组【1 8 】 和b a k e r 小组【1 9 】在报道中提到了s e r s 研究中粗糙基底本身和目标分子被氧化 的现象。肖等人【2 0 】利用p t 和a u 粗糙电极研究氨基酸分子的解离情况，发现 即使在开路电势下也会出现氨基酸小分子在活性基底上解离的现象。一些含有 易氧化官能团的分子，如羟基【2 2 】或者巯基分子【2 3 1 是报道中较常见的在活性基底 上被氧化而被破坏的物种。m a r c o s 以及他的合作者【2 4 】用银溶胶检测了一系列一 元羧酸和醛的s e r s 谱图，发现普遍有氧化产物的信号。被测有机生物分子的 氧化分解无疑会影响对被测物的光谱解析。 另外，s e r s 测定中有机生物分子在激光照射下容易发生光降解反应并生 成碳化产物一无定形碳。这些碳物种往往形成网状结构覆盖在基底表面，使 s e r s 谱图中出现高基线和强而宽的特征峰，且碳物种特征峰会随着电势改变 2 而发生移动，类似于分子在正常s e r s 光谱中出现的“b l i n k 现象【l 引。容易被 研究者误认为是被测物的光谱信息。o t t o 在题为“w h a ti so b s e r v e di n s i n g l e m o l e c u l es e r s ，a n dw h y ? ”的文章中【2 4 1 ，报道了文献中在银纳米粒子上获 得的酪氨酸s e r s 谱图存在碳化物种。这说明得到酪氨酸拉曼谱图实际上是已 经发生降解后的信号，与吡啶的光降解产物一样，都是碳化物种。血色素【2 5 1 、 维生素【2 6 】、虫漆酶口7 1 、d n a 2 8 】等生物分子的光降解现象也都已见报道。文中特 别强调了s e r s 技术在检测微量分子时，碳物种光污染的严重性。事实上，碳 化现象在许多分子的s e r s 分析中都是普遍存在的。碳化现象严重一些的生物 分子，如虫漆酶，甚至己成为一些工作者研究光降解反应的碳物种来源【2 9 】。即 使一些看来很稳定的分子，如吡啶【3 0 1 ，苯甲酸 3 1 1 ，邻菲罗琳【3 2 1 ，罗丹明【3 3 】，孔 雀石绿【3 4 】等等都难以逃脱碳化的危险。在金属溶胶的s e r s 光谱的研究中， s a n c h e z c o r t e z 和g a r c i a - r 锄o s 【3 5 j 罗列了许多分子的碳化现象的干扰。以追踪 一些已发表的报道为依据，d o m k e 【3 6 】在2 0 0 7 年的一篇综述中指出仍有些研究工 作没有意识到碳化现象，混淆了碳化物种与目标产物的特征峰。而事实上，类 似的相关评论文章还有很多。d o r n k e 还系统地阐述了表面和针尖增强在单分子 检测中存在的普遍的碳化现象及其危害，详细分析了碳化现象产生的根源，并 给出了通过谱图的变化检验碳化存在的方法。 在电化学研究工作中，p e t t i n g e r 等人【3 7 1 和t a y l o r 等人【3 8 】早e 经i i ent 实 验环境中无处不在的有机杂质始终困扰着s e r s 检测。即使在不加任何待测物 种的空白溶液中，都可在粗糙基底表面出现碳物种的光污染产物，对应于谱图 中的高背景和碳特征峰 3 8 , 3 9 。 所有这些报道都说明了检测和解释s e r s 光谱是充满挑战性的，而且其结 果往往存在争论，因此鉴别所测得的s e r s 谱图是否为来自分子的正确信息是 至关重要的。 碳化反应发生时，光谱信号出现大的波动，甚至整个谱图都可能波动起伏， 振动模式的频率，峰宽和强度不确定地变化。碳化的另外一个特点就是得到的光 谱受位置影响。许多研究工作者正是利用这一特点，采用换点取谱的办法，以尽 量避免局部区域在连续激光照射时出现的碳化现象。 另外，d o m k e 例举了几个有效的鉴别碳化现象的方法。第一，常规拉曼是 3 确定s e r s 信息可信度最好的参照。虽然s e r s 光谱存在选择性原则，光谱会 受吸附取向的影响，但是在s e r s 谱图体现出的分子特征峰都应该明确来自被 测分子本身固有的振动模式。另外，即使受s e r s “选律 影响，出现在表面 增强拉曼光谱的振动峰与常规拉曼的谱峰相比，也不会存在根本性的变化。因 为分子在电极表面的空间取向有垂直、水平和介于两者之间的一个任意角度。 如果是垂直取向，特征峰与常规拉曼中的峰位置相差小于5c m ；当水平时达 到最大值，为1 0c m 1 ；而在这之间的角度，频率的变化也是处于5 1 0o m 。1 之 间。而对于大的有机物分子来说，一般认为它们的s e r s 光谱不会存在大的峰 位移，这是由于一个小的电子轨道重叠不能对大分子的电子结构造成明显的改 变。物理吸附时尤其如此。第二，由于瞬时的和非破坏性的过程引起的光谱随 着时间的变化，信号的质量和清晰度是可以维持的，这明显区别于强度和谱峰 单一性恶化的情况，后者反映的是目标分子发生了永久( 4 l 学) 变化，如碳化 反应。第三，通过加合多个连续采集的单个光谱可以区分单分子和碳波动拉曼 光谱信号。碳物种波动光谱叠加的结果会在1 3 5 0 和1 5 8 0c m d 附近出现典型的 宽峰；而单分子光谱叠加的结果是非常接近于分子的常规拉曼谱图。 总结大量研究碳化现象的报道，可以获得碳物种在谱图中对应产生的特征 信号：1 2 0 0 1 6 0 0c m 1 的高背景【4 0 】；1 3 4 0 、1 6 0 0c m 。1 分别归属于石墨的“杂 乱 ( d ) 峰和e 2 2 峰【3 8 】。 1 2 2s e r s 测定中氧化和碳化现象的根源与对策 公认的关于氧化碳化产生的原因来自两方面：一方面是活性增强基底的诱 导作用。这主要是由于基底表面存在氧化物，包括粗糙过程残留的和粗糙后带 入的。前者如金粗糙电极表面往往残留着粗糙环节中产生的高价金氧化物1 4 3 1 ， 这些氧化物有的深入到纳米空穴中难以除去：后者如银基底不稳定，很容易形 成表面氧化物 3 6 j 。表面氧化物的存在，表现为粗糙基底的开路电势较高，从而 导致活性分子的氧化分解和进一步光降解。如氨基酸可解离吸附产生氰根离子 2 0 】，而氰根离子可光解产生碳化物种口4 1 。虽然粗糙过程在较负电势下结束，但 无法维持这个电势，开路电势往往会因为表面水和氧物种的吸附与生成等原因 很快显著回升。常用的银、铜、铂等粗糙基底就属于这种情况。溶艄氧造成的 4 氧化环境也是氧化和光降解的另一个重要诱因，它的存在加剧了光谱的异常波 动【1 8 2 9 1 。虽然人们证实了在操作过程除氧( 真空或者惰性气氛) 将有助于降低 待测物在强电磁场中降解的速率，但是在常规s e r s 实验的操作条件下，空气 或者溶液环境中的氧是无处不在的，吸附物种很难排除被氧攻击的可能。另一 方面，激发光在粗糙基底上的纳米空穴中产生巨大的电磁场，从而导致位于该 s e r s 活性点的被测物种发生光降解。甚至还有这样的结果：在全谱采集过程 中，由于激光诱导分子发生化学转变，导致在高波段和低波段两个区域对应的 是分子两种不同的化学状态【3 6 1 。 文献中减少氧化和碳化现象的措施主要有： 一、减小激光功率和降低温度。拉曼测试中一般都会关注激光引起的局部加 热。激光功率低，局部加热影响小。实验检测和理论计算的结果显示，激光确实 会导致局部温度少量升高。w e i s s 和h a r a n 计算得出1 0 0wc m 2 的照射，纳米 颗粒的温度将会有一个小于o 1k 值的增加值【4 2 】。h a r r i s 等人( 3 0 】研究了真空状 态下，一系列芳香类分子在粗糙银表面的共振光降解现象。证实了这些分子的光 分解速率与激光功率密切相关，而这些分子距离电极表面的远近不同实质上对应 于不等的能量传递。减小功率可以降低激光效应，特别是对那些可能发生共振或 者光化学反应分子。但降低功率会削弱检测信号。需寻找一个最佳状态，即适当 地减小功率以获得对物种的最小破坏但同时又能够有较好的增强信号。但是越来 越多的报道证实了对于极易光解的物种，即使是小的功率，也无法避免在测定过 程中的碳化。 降低温度是直接减小激光诱导分子降解的方法。降低样品的温度有利于得到 高质量的s e r s 信号。p a n g 4 4 等a ；i ! e4 0k 下的s e r s 研究表明，样品暴露在 激光下所引起的负面影响可以大大降低。低温可抑制激光引起的样品碳化反应， 增加分析物种的吸附，抑制分析物种的扩散，从而减小s e r s 信号的光谱波动 ( 碳物种引起) 。h i n d e 等人f 4 5 l 发现使用液氮可以比在室温条件下得到更好的信 噪比。然而，控制温度需要引入更多的设备，增加操作的复杂性。另一方面，降 低体系温度偏离了目标分子的真实存在环境。 二、除氧。在惰性气体氛围中操作，可以改善信噪比，减小光谱的波动和外 来的影响。k u d e l s k i 和p e t t i n g e r 【4 q 以及e t c h e g o i n 2 8 】等人都报道了对于活性物种 5 体系，如果在氮气环境下进行测试，光谱的波动会下降；而在氧气充足的环境中 却会升高。2 0 0 6 年，k u d e l s 心【2 9 1 研究了0 2 在诱导光谱强波动现象中的作用，提 出了不同于e t c h e g o i n 设想的b r u r s t e i n 机理【2 5 ，2 翻的模型。然而除氧方法并不具 有普适性。虽然能够观察到除氧溶液中光谱的波动显著下降，但是当加负电势后， 高背景峰和碳化特征峰又重新出现【2 9 1 。 三、阴离子的影响。k u d e l s l ( i 比较了c 1 和c 1 0 4 。，发现了卤离子有利于改 善银电极表面的光谱【4 7 1 。i l i e s c u 等人m 】也提到了c 1 。利于增强信号和降低碳化 引起高的背景峰，而o h 却会使光谱更加恶化。但卤离子的影响显然很有限， 在许多含卤离子的体系中，依然普遍存在碳化现象。 以上措施或者牺牲了s e r s 信号，或者增加了仪器设备和操作困难，且难以 从根本上解决碳化现象。因此，寻求一种简便而有效的化学方法就成为了必然和 有益的。 1 3 本论文的主要研究内容和目的 我们小组在研究p n 、c y s 、c a r 等分子在粗糙金电极表面的s e r s 光谱过 程中，发现存在严重的氧化和碳化现象。无论是降低功率，调节p h 值，还是 改变支持电解质都无法缓解这些问题。为了从根本上解决p n 的碳化和氧化问 题，又不过多地增加操作的复杂性，本研究组尝试从化学角度入手，寻找一种 分子，使其具备以下三个方面性质：一、强还原性，能除去s e r s 潘眭基底上 高价态金属氧化物种和溶液中溶解的氧，从而排除氧化环境对光降解的诱导作 用；二、强化学吸附性，能直接在金属基底上吸附，并能代替被测定物种承受 住强电磁场的“第一层效应”；三、强配位能力，该物种吸附在粗糙基底上的 同时，还能通过配位、氢键、静电引力等作用方式固定目标分子，得到其增强 信号，但又削弱强电磁场对直接吸附的目标分子的破坏作用。我们发现亚锡离 子是符合上述条件的理想物种。它不仅同时具备以上三种性质，而且只在谱图 的低波段引入非常少的拉曼信号，基本不干扰测定。亚锡离子的存在下，可以 消除有机生物分子的氧化碳化信号，并得到p n 、c a r 和其它一些有机生物分 子在粗糙金电极上的增强信号。亚锡离子的作用还可以拓展到其他两种常用的 增强基底a g 和c u 上。此外，通过调控电势还可以调变基底与亚锡，亚锡与 6 目标分子的相互作用。与文献中已有的改善氧化和碳化的方法相比，我们引入 氯化亚锡的方法操作简便可行，是一种全新的化学方法。 吡哆醇( 维生素b 6 ) 是参与代谢的重要物种，s e r s 光谱的研究报道非常 少；半胱氨酸是研究较多的自组装分子，s e r s 光谱的研究报道已较多：肌肽 是一种重要的抗氧化剂，易光解，相关的s e r s 光谱报道也非常少。这三种物 质都存在严重的氧化碳化现象，本文引入氯化亚锡研究它们的s e r s 光谱，并 拓展到金、银、铜三种基底上，验证了我们小组提出的氯化亚锡方法的简易性 和有效性。 主要内容如下： 1 研究氯化亚锡的电化学性质和s e r s 光谱，以吡啶为探针探讨氯化亚锡 消除碳化氧化的机理： 2 研究氯化亚锡存在下，p n 在粗糙金电极上的s e r s 光谱； 3 研究氯化亚锡存在下，c y s + p n 混合液在粗糙金、铜电极上的选择 性测定； 4 研究氯化亚锡存在下，肌肽等多种分子在粗糙金电极上的s e r s 光谱， 探讨氯化亚锡与它们的作用方式。 7 2 1 试剂和仪器 2 1 1 试剂 第二章实验 弟一早头短 维生素b 6 ( s i g m a 公司提供，纯度大于9 8 ) 、半胱氨酸( s i g m a 公司提供， 纯度为9 9 5 ) 、肌肽( 富士莱医药化工有限公司提供，纯度为9 9 1 0 1 ) 。 甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸均为生物试剂。 二水合氯化亚锡、氯化锡、吡啶，邻菲罗琳、乙二胺四乙酸、苯酚、苯甲 酸、葡萄糖、盐酸，氢氧化钠，氯化钠，高氯酸均为分析纯品。 为防止亚锡水解和氧化，s n c l 2 溶液用6m ( m = m o l l ) h c l 底液配制，配 制过程中通氮除氧气。在全文中，除没有特殊说明的，均在电极表面或被测溶 液中滴加使用的均为这样配制的6mh c l + 0 1ms n c l 2 溶液。 第三、四章所用的氯化锡溶液为0 1ms n c h + 6mh c l ，与亚锡溶液进行 更好的比较。 实验中所用溶液均由分析纯试剂和超纯水( m i l l i p o r em i l l i qs y s t e m ，比电 阻1 8 2m qc m ) 新鲜配制。 实验在室温下进行。 2 1 2 电极 ( 1 ) 工作电极( w e ) 金，银，铜电极：本文所用三种电极均为直径2m m 的圆盘电极。每次实 验前依次用3 群、6 8 或1 2 0 0 目砂纸将电极打磨至镜面光亮，再用0 0 5h ma 1 2 0 3 粉抛光至镜面光亮，最后在超声波中清洗数次，实验中电极工作面水平放置( 图 2 1 ) 。 ( 2 ) 辅助电极( c e ) 本文所用辅助电极为铂环电极( 用于光谱电解池) 。 ( 3 ) 参比电极( r e ) ： 本文所示电势均为相对于饱和硫酸亚汞参比电极( s m s e ) 的电势，为了避 8 免离子扩散以及m 降给实验带来的影响，参比电极与鲁金毛细管相连，并使 鲁金毛细管与工作电极之间靠近并保持固定的距离。 2 13 电解池 文中第三到六章拉曼光谱实验在自行设计的拉曼原位池中进行。其具体构 造见图2 - 1 。拉曼原位池由聚四氟乙烯加工而成，带有石英窗片。 c e q u a r t zw i n d o w 囤2 - 1 电化学显擞共焦拉曼原位光谱池 f i g u r e 2 - 1 t h e m i c r o - r a m a ns p e c t r o e l e e t r o e h e m l s l wc e l lw e ，c e ，a n d r er e p w s e m w o r k i n g , c o u n t e r , a n dr e f e r e a c ee l e c t r o d e ，r e s p e c t i v e l y 2 1 4 电化学工作站 电化学实验在c h i6 6 0 a 电化学工作站( 上海辰华) 上进行，通过微机接 口采集和分析数据。 2 2 实验方法 2 21s e r s 活性电极的制备方法 粗糙金电极采用我们小组首次提出的利用金电极在2mh c l 中阳极溶解 时的歧化反应( a u 一a u 3 + + a u o ) 方法，这种方法能产生很好的s e r s 活性， 对吸附在金电极表面的探针吸附子如c r 和吡啶有强而稳定的增强作用h ”。 银电极的粗糙方法是按照传统的o r c 法，在o 1mk c i 溶液中进行电势 阶跃，获得米黄色粗糙基底表面【4 9 1 。 铜电极的粗糙方法是在0 4mh 2 s 0 4 + 0 2mc u s 0 4 溶液中恒电势( 0v ) 5 0s ，获得棕色粗糙基底表面【5 0 1 。 2 2 2 拉曼光谱实验仪器和方法 拉曼光谱实验采用英国r e n i s h a w 公司的r m l 0 0 0 显微共焦激光拉曼光谱 仪。激光波长为7 8 5 ，6 3 2 8 ，5 1 4n n l ，分别用于铜，金，银三种增强基底。狭 缝、光栅、c c d 区域分别设置为5 01 t m ，1 8 0 0 或1 2 0 0 道m m ，( 士1 0 ) 5 7 6 像 素。显微镬的物镜为5 0 倍长焦镜头。除了特殊说明外，第三到第六章中测定的 s e r s 谱图累积时间均为1 0s 。激光焦点到电极表面的距离可在程序控制条件下 达到微米分辨率。在原位拉曼光谱电化学测试过程中，工作电极与石英窗片间 的液体层厚约2 3n l l l l ，因此可以在不影响电极过程的情况下测得光谱。 1 0 第三章氯化亚锡在粗糙金电极上的行为及其消除吡啶碳化 的s e r s 光谱研究 3 1 前言 锡的电化学性质很早就引起人们的重视。1 9 7 6 年，s t i r r u p 等【5 l 】报道了锡在 盐酸介质中的电化学溶解过程、机理及锡离子的存在形式。h o u s e 等【5 2 1 在1 9 8 4 年系统绘制了s 佣2 呲r 体系的电势p h 图，对锡在不同p h 值和氯离子浓度 下的存在形式和相互转变进行了全面描述。19 8 9 年，a m m a 等【5 3 】对锡的电化学 性质从1 2 个方面进行了详细综述，包含了自1 9 7 0 年以后的重要相关文献。 与其它金属离子相比，亚锡集强吸附性、强还原性和强配位性于一体。亚 锡离子可以在铂、银、金、铜等多种金属表面上强化学吸附。众多的报道已经 证实，亚锡可与多种金属如p t 、p d 、a g 、a u 5 4 5 6 1 等形成配位化学键。亚锡还 可在多种金属基底上欠电势沉积，如c u t 5 7 1 ，a g 5 引，p t 5 9 1 ，这里主要介绍亚锡 离子在金基底上的情况。2 0 0 1 年，m a o 等【5 刀在金( 1 1 0 ) 面上，2 0 0 4 年，f o m i c e l l i 等6 0 1 在金薄膜上，2 0 0 5 年，q i u 掣6 1 】在金电极上，分别研究了亚锡离子的欠电 势沉积行为。他们阐述了二价金属锡离子在金基底上强烈吸附，而欠电势沉积 得到的锡还能与金强烈作用形成金锡合金。但是当表面的亚锡离子转化成四价 锡后将失去吸附能力【6 0 l 。 亚锡离子具有很强的还原性，s n c h 是人们熟悉的还原剂。它能把许多金 属离子还原成低氧化态，甚至还原到金属【6 2 】。例如，在5m 盐酸溶液中s n 2 + 能 把m o ( v i ) 还原成m o ( v ) ，在浓盐酸溶液中则能还原到m o ( i i i ) ，在9m 盐酸溶液中w ( v i ) 被s n ：+ 还原成w ( v ) ( 此反应可以可以定量进行) 以及 h g ( i i ) 、v ( v ) 、c r ( v i ) 、f e ( i i i ) 、p t ( i v ) 、a u ( i i i ) 分别还原到h g 、v ( i v ) 、c r ( i i i ) 、f e ( i i ) 、p t 、a u 。亚锡离子非常容易氧化和水解：二氯化锡 水溶液能吸收空气中的氧，生成氢氧化锡及四氯化锡；o 0 2ms n c h 酸性水溶 液，在p h = 2 1 2 时开始水解，p h 值为2 6 5 时开始沉淀，p h 值为3 3 时，s n 2 + 完全水解成水合一氧化锡沉淀。水解产物在盐酸溶液中溶解得很慢【6 2 1 。 亚锡离子配位化学丰富多彩。1 9 8 3 年，s h i r y a e v 6 3 】综述了二价锡配位化学， 涉及亚锡离子与各种含n 、o 和共轭环官能团的有机分子的配位方式。李志强 6 4 】、尹汉东【6 5 】和谈国霞等【6 6 】研究了锡的配位化学并合成一系列有机锡化合物。 1 9 9 6 年，d j u r d j e v i c 等人【67 】报道7 - - 价锡离子与甘氨酸的配位化学，为亚锡与 蛋白质等生物