（作物遗传育种专业论文）大豆转leafy和Hs1ltpro1gt基因的初步研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：充木生日期：矽07 j 7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：_ 济 日期： 沙7 一7 - 7 指导教师亲笔签名。阀以地日期：伽叼f 7 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 在植物转基因的这一领域内，大豆是较难转化的作物之一，这是由于大豆组织培养 再生困难，可重复性差，基因型之间差异大，遗传转化体系是完全根据大豆的基因型所 建立的本试验通过大豆子叶节器官发生途径的再生系统，从福建地域生态型的1 0 个 不同大豆基因型中筛选到再生频率高的一个基因型，并对影响再生频率和农杆菌介导的 遗传转化系统的主要因素进行了优化，建立了一个适于农杆菌转化的大豆子叶节高效爱 体系统，并在此基础上进行了l e a f y 和胁，胪7 基因的初步遗传转化研究主要研究结 果如下： 1 大豆基因型和基本培养基的筛选 选择福建地域生态型的1 0 个不同基因型大豆品种分别在m s 和b 5 基本培养基中， 进行出苗培养和丛芽培养，结果表明，在激素浓度相同的情况下，出苗率和再生频率在 m s 和b 5 这两种培养基之间的差异不大，但在基因型之间差异较大，特别是上杭六月 泡的出苗率和再生频率均高于其它基因型，分别是达到4 3 5 和7 0 。 2 子叶节不定芽诱导分化的激素浓度的筛选 ( 1 ) 本试验在子叶节不定芽诱导分化阶段设计了b a 和i b a 浓度梯度交互配比的方 案，筛选到对于上杭六月泡这个基因型大豆b a 和i b a 的最适配比浓度，分别为1 4 m g l 和0 2m g l 再生频率为7 8 9 5 。 ( 2 ) 研究表明大豆生根阶段施加i b a 可以显著提高生根率，生根基本培养基为 1 2 m s ，蔗糖浓度为2 ，筛选得到在i b a 浓度为2m e , l 、b a 浓度为0 2m g l 时，生 根率较高，为7 5 5 6 3 影响农杆菌遗传转化效率的因素第选 ( 1 ) 由于在l e a f y 和乒坛j p ”基因真核表达载体中所携带的选择标记基因皆为_ 尸厂 ，本研究以k a n 为选择荆将大豆子叶节接入不同k a n 浓度水平的培养基进行筛 选，结果表明，k a n 筛选浓度为1 5 0 m g l ( 2 ) 本研究以不同浓度的t i m e n t i n 为杀菌剩。结果表明，浓度在0 - 3 0 0 m g l 之问 对大豆子叶节的生长以及不定芽的化化无较大的影响，在外植体与衣杆菌共培养后，在 液体培养基和固定培养基中，浓度分别为7 5 m g l 和2 5 0 m g l 的t i m e n t i n 浸泡 3 0 m i n ，可完全抑制农杆菌的生长 ( 3 ) 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化中，用g u s 瞬时表达率来衡量侵染和共培 养的最适时间研究表明侵柒时间为1 5 r a i n ，共培养时间为8 0 h ，g u s 的瞬时表达率最 高，为2 3 5 因此，本研究以1 5 m i n 的侵染时间和8 0h 的共培养时间为最佳配比时 间 4 阳性植株p c r 检测 利用p c r 法分别对转l e a f y 和胁，胪7 基因的转化苗进行检测，分别获得阳性的 转基因植株为2 株和3 株，转化频率分别为o 7 6 和1 1 1 3 福建农林大学2 0 0 7 届项士学位论文 5 阳性植株的s o u t h e r n 杂交检测 以l e a f y 和胁，胪7 基因片段为探针，对转基因阳性植株进行s o u t h e r n 杂交，结 果表明转化体中均含有整合的外源基因 关键词：大豆子叶节再生衣杆菌介导l f y 胁p “7 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h ef i e l do fp l a n tg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n s o y b e a ni s o n eo ft h e c r o p sw h o s e t r a n s f o r m a t o ni sd i f f i c u l t i ti sb e c a u s et h a tt i s s u er e g e n e r a t i o no fs o y b e a n ，r e p e t i t i o no f e x p e r i m e n ti s n o ti d e a l ，a n dt h er e s u l t sa m o n gg e n o t y p e sa r e v e r y d i f f e r e n t ，a n dt h e t r a n s f o r m a t i o ns y s t e me n t i r e l yd e p e n d so nt h es o y b e a ng e n o t y p e i nt h i se x p e r i m e n t ，t h ec o t y l d o n a r yn o d er e g e n e r a t i o ns y s t e mw a su s e d ，a n d o n eg e n o t y p e w i t hh i g hr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yw a ss c r e e n e df r o m10d i f f e r e n tf u j i a n g e o e c o l o g i c a l s o y b e a ng e n o t y p e s ，a n d t h e m a j o r f a c t o r s i n f l u e n c i n gt h er e g e n e r a t i o ns y s t e ma n d t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mf o ra g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dm e t h o dw e r eo p t i m i z e d w ee s t a b l i s h e da h i g h e f f c i e n c ys o y b e a nc o t y l e d o n a r yn o d er e c e p t o rs y s t e m l f ya n dh s l p r 9 | w e r ei n t r o d u c e d i n t os o y b e a n ，a n dg a i n e dt h ep o s i t i v ep l a n t sd e t e r m i n e db yp c ra n ds o u t h e r nb l o t t h e 而a i n r e s u l t sw e r es h o w e da sf o i l o w s ： 1 ，s c r e e n i n go f t h es o y b e a ng e n o t y p e sa n db a s i cc u l t u r em e d i u m s 1 0v a r i e t i e sf r o mf u j i a nw e r es c r e e n e do nm sa n db 5r e s p e c t i v e l y t h er e g e n e r a t i o n f r e q u e n c ei ss a m eb e t w e e nt w od i f f e r e n t r e g e n c t i o no fs h a n g l y pw a sh i g h e rw i t h7 0 2 s c r e e n i n go f t h eh o r m o n ec o n c e n t r a t i o n c u l t u r em e d i u m a m o n gt h ev a r i e t i e s ，t h e s oi tw a su s e da st h er e c e p t o rm a t e r i a l ( 1 ) t h ec o n c e n t r a t i o no fb aa n di b aw a sd e s i g n e da sa na l t e r n a t i o nc h a n g i n ga tt h e d i f f e r e n t i a t i o ns t a g eo ft h ea d v e n t i t i o u ss h o o tf r o m c o t y l e d o n a r yn o d e t h es u i t a b l e p r o p o r t i o nb e t w e e nb aa n di b aw a ss c r e e n e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fb aw a s 1 4 m g l ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fi b aw a so 2 m g q _ t h ed i f f e r e n t i a t i o nf r e q u e n c ei s 7 8 9 5 ( 2 ) t h ef r e q u e n c eo fr o o tr e g e n e r a t i o nw a sr e m a r k a b l yi n c r e a d e db yt h ea d d i t i o no fi b aa tt h e r o o tr e g e n e r a t i o ns t a g e t h eb a s i cm e d i u mf o rr o o tr e g e n e r a t i o nw a si 2 m s ，a n dt h e c o n c e n t r a t i o no fs u g a rw a s2 w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fi b aw a s2 m g l t h e c o n c e n t r a t i o no fb aw a so 2 m g l ，t h er o o tr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c i e sf o rs h a n g h l y pw a s 7 5 5 6 3 s c r e , ? n i n g o f t h e f a c t m s i n f l u e n c i n g t h e i r a n s f o m a a l i o n e f l i e n c y o f a g r o b a t _ e r i u m - m e d i a t e d m e t h o d ( 1 ) t h es e l e c t i o ng e n e so fl e a f y a n dh s l ”9 ii nt h ew e r eb o t hn p tl 。a n dt h es e l e c t i v e r e g e a n tw a sk a n t h es h o o t sw e r et r a n s f e r r e dt ot h es c r e e n i n gm e d i u mb e f o r et h er o o t r e g e n e r a t i o n t h es u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no fk a ni s15 0m g l ( 2 ) t i m e n t i nw a su s e da sa n t i b i o t i c w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft i m e n t i nb e t w e e n0a n d2 5 0 m g l ，i td i d n ti n f l u e n c et h ed i f f e r e n t i a t i o nf r e q u e n c eo ft h ea d v e n t i t i o u ss h o o tf r o m c o t y l e d o n a r yn o d e w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft i m e n t i ni nt h el i q u i dm e d i u mw a s7 5 m g la n di nt h es o l i dm e d i u mw a s2 0 0 m g l ，t h eg r o w t ho fa g r o b a c t i u mw a ss u p p r e s s e d 5 福建农林大学2 0 盯届两士学位论文 s ot h es u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no f t i m e n t i ni nt h es o l i dm e d i u mw a ss e l e c t e dw i t h2 0 0m l ( 3 ) g u st r a n s i e n te x p r e s s i o nw a su s e dt od e t e r m i n et h es u i t a b l et i m eo fi n f e c t i o na n dc o c u l t u r e w h e ns h a n g h l y pw a si n f e c t e d15m i n ，a n dt h ec o c u l t u r et i m ew a s8 0h o u r s ，t h e g u st r a n s i e n te x p r e s s i o nw a st h eh i g h e s tw i t h2 3 5 s ot h es u i t a b l ep r o p o r t i o nf o r i n f e c t i o na n dc o c u l t u r ew a s15m i na n d8 0 h 4 p c rt e s to f t h ep o s i t i v ep l a n t s f r o mt h i se x p e r i m e n t t h ep o s i t i v ep l a n t sw i t hl e a f yg e n ea n dh si p ”| g e n ew e r et e s t e d b yp c r t h e r ew e r e2p o s i t i v ep l a n t sw i t hl e a f yg e n e a n d3p o s i t i v ep l a n t sw i t hh s p r 。“l g e n e t h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c eo f g e n ew e r eo 7 6 a n d1 11 r e s p e c t i v e l y 5 s o u t h e r nb l o th y d r i d i s a t i o n & t h ep o s i t i v ep l a n t s t h ep o s i t i v ep l a n t sw e r et e s t e db ys o u t h e r nb l o th y d r i d i s a t i o nw i t ht h ep r o b eo fl e a f y g e n ea n dh s l p “一g e n e t h em o r d i f i c a t i o np l a n t st e s t e dp r i m a r i l yi n g r a t e dt h ef o r e i g ng e n e k e yw o r d s ：s o y b e a nc o t y l e d o n a r yn o d ea g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d l f yg e n eh si p r ”| g e n e 6 福建农林大学20 0 7 届硕士学位论文 1 前言 1 1 研究的目的与意义 大豆( g l y c i n em 6 l xl ) 起源于中国，栽培历史最为悠久，是重要的农作物和经济作 物，又是工业原料和牲畜家禽的重要饲料，在对外贸易上还是重要的出1 ：2 物资。在南 方，夏季的大豆生产后期往往遭遇雨季，大豆来不及收获，在植株上就开始发芽有些 品种由于营养生长期过长，使成熟处于高温，籽粒中的蛋白质发生变质，籽粒成褐色并 产生有毒物质。因此，通过育种适当改变大豆的生育期，使南方的大豆生长避开高温和 雨季，对提高南方大豆的产量和品质，有着重要的意义 另外，在大豆的生产上，大豆孢囊线虫病是大豆的一种毁灭性病害。大豆孢囊线虫 是一种土传的定居性内寄生线虫大豆孢囊线虫病是由大豆孢囊线虫侵染大豆根部引起 的，能迅速漫延，使大豆严重减产或绝枚因此对大豆杭线虫品种的筛选和培育是极其 重要的 常规育种技术具有很大的局限性，存在盲种年限长。难以打破性状连锁，多基因重 组机率低，远缘杂交困难等弊端。通过组织培养方式， , j g j 基因工程手段将基因转入农 作物，使基因稳定遗传和表达，可以打破物种问的生殖隔离，实现遗传物质在物种之问 的交流，而且还可以克服常规育种的缺陷。因此，基因工程手段被越来越多的运用到衣 作物的遗传改艮上本研究通过农杆菌介导将改变植物花期的上e h f y 基因和抗线虫 胁，胪7 基因转化大豆子叶节，并通过分子鉴定获得阳性转化植株，为大豆育种提供一 些育种材料。 1 2 文献综述 1 2 1 大豆遗传转化研究 1 2 1 1 大豆遗传转化方法 植物转基因的方法很多，王关林等将其分为农杆菌介导法( 根癌农杆菌t i 质粒和 发根农杆菌r i 质粒介导的基因转化) ，植物病毒栽体介导的基因转化d n a 直接导八 的基因转化( p e g 法，脂质体法，电激法，超声波法，显微注射法，激光微束法基 因枪法等) 和种质系统介导( 花粉管通道法，萌动种胚浸泡法、胚囊和子房注射法) 等大豆的转基因方法主要有农杆菌介导法基因枪法、电激法，p e g 法，显微注射 法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法等其中，以基因枪法和农杆菌介导法两 种方法为大豆常用的转基因方法 ( 1 ) 农杆茵介导法 农杆菌介导法( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 是农杆菌在侵染爱体时，细菌通过受 体原有的病斑或伤1 ：7 进入寄主组织，但细菌本身不进入寄主植物细胞，只是把t j 质粒 的d n a 片段导入植物细胞基因组中农杆菌介导法目前应用的农杆菌主要有根癌农杆 菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 和发根衣杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 两种 7 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 农杆菌转化的方法主要有整体植株接种共感染法和叶盘转化法 用农杆菌介导进行大豆的转基因研究是从野生型菌株开始的，o w e n s 用2 6 个大豆 品种研究了大豆品种对衣杆菌( t i 和r i 质粒) 的敏感性【2 1 ，b y r n e 等用2 1 个大豆品种研 究了大豆品种与农杆菌间的关系1 3 1 k u d i r k a 等研究了大豆基因型农杆菌共培养时间 对农杆菌转化的影响i 4 】o w e n s 等探讨了混合菌株在转化中的作用1 5 1 我国学者王连铮 等利用致瘤农杆菌的1 5 个菌系对2 7 5 9 个大豆品种的致瘤能力进行了研究，筛选出7 个 致瘤能力较强的茵系1 6 】2 0 0 2 年王罡等研究了大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性，认 为不同大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性存在显著差异1 7 】 1 9 8 8 年h i n c h e e 等首次旺子叶为外植体，经衣杆菌侵染后，诱导不定芽再生植株 坶l 。他们从1 0 0 个栽培大豆品种中筛选出3 个对农杆菌较敏感的基因型( m a p l e p r e s t o 、p e k i n g 和d o m a t ) ，用含有p t i t 3 7 s e 和p m o n 9 7 4 9 ( 含j 叮和g 晒基 因) 或p t i t 3 7 一s e 和p m o n 8 9 4 ( 含p r 和g l y p h o s a t e 耐性基因) 的农杆菌与子叶共 培养进行了转化，经在含卡那霉素的筛选培养基上筛选得到含n p t l l 和g u s 基因共转 化的不定芽，以及a p 7 和g l y p h o s a t e 耐性基因共转化的转基因植株，经检测转化率 为6 对两种类型的转基因植株后代进行的遗传学分析表明，外源基因是以单拷贝整 合进大豆基因组此外，以子叶节，子叶下胚轴和未成熟子叶等为外植体用农杆菌介 导法将b t 基因、几丁质酶基因、b a r n a s e 基因玉米转座子爿c 基因导入大豆中 叶盘转化法( 1 e a f d i s ht r a n s f o r m a t i o n ) 是由h o r s c h 等( 1 9 8 5 ) 发展起来的一种转化 方法，其操作方法是首先用打孔器从消毒叶片上取得叶圆片，亦称之叶盘1 9 1 。目前，大 豆农杆菌转化多采用的是改良叶盘法，外植体主要是子叶、下胚轴和子叶节等 ( 2 ) 基因枪法 基因枪法( p a r t i c l eg u n ) 又称微弹轰击法( m i c r o p r o i e e t i l eb o m b a r d m e n t p a r t i c l e b o m b a r d m e n t 及b i o l i s t i c s ) 最早是由美国c o m e l l 大学的s a n f o r d 等研制出引爆的基因 枪k l e i n l l 0 】等首次在洋葱上对细胞进行试验，在受体细胞中观察到了病毒r n a 的复 制。他们还用这种技术将c z t ( c h l o r a m p h e r i e o l ka c e t y lt r a n d f e r a s e ) 基因导入洋葱表皮细 胞，从被轰击的表皮组织的提取液中检测到很高的c a t 活性。1 9 8 8 年，m c c a b e 等用外 源d n a 包被的钨粉粒对大豆茎尖分生组织进行轰击，结果约有2 组织通过器官发生 途径获得再生植株，并且在t o 、t i 代植株中检测到了外源基因的表达】s a t o 等对基 因枪轰击大豆组织的不同部位( 未成熟胚的芽尖和长期增殖悬浮培养物) 进行了研究， g u s 染色和组织切片结果表明，轰击芽尖组织时g u s 基因主要在细胞表层l 一2 层表 达：轰击悬浮培养物g u s 基因在表一层表达，即轰击的部位不同，被击入细胞的深度 也不同1 1 2 1 m o o r e 等对大豆子叶大小轰击压力基因型等对基因枪转化的影响进行 研究，认为g u s 基因的表达是在表层或近表层，大豆未成熟子叶以4 5 c m 最好，轰击 压力对o u s 基因表达无影响，但在大豆基因型上存在显著差异ij 3 1 9 9 9 年，胡张华等 在研究影响基因枪遗传转化因子时发现，c a c l 2 ，浓度，氦气压力和爱体状态等对大豆 暑 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 转化频率有重要影响，在基因枪轰击前2 4 h ，用5 g y 辐射处理愈伤组织，转化效率获得 了提高h a d i 等用1 2 个质粒s i m m o n d s 等用两个质粒分别研究了多个质粒混合轰 击共转化的效果，经h y g r o m y c i n 抗性筛选和s o u t h e r n 杂交检测，证明得到了共转化的 克隆争再生植株1 5 , 6 1 2 0 0 2 年王萍等在研究影响基因枪转化效率时发现，未成熟子叶 被轰击后在高渗培养基中停留的天数是影响大豆转化率的主要因素之一1 7 1 。目前，外 源目的基因的转化有b t 基因1 9 1 和牛酪蛋白基因1 2 0 2 1 1 的成功报道，所用外植体为未 成熟子叶或由未成熟子叶诱导产生的胚性悬浮培养物( 细胞团) ( 3 ) 电激法 激法( e l e c l r o p r a t i o n ) 是利用高压脉冲作用，在原生质体膜上，电激穿孔，形成 可逆的瞬间通道，从而促进外源d n a 的摄取李宝健等人于1 9 8 5 年首次将其应用于 植物细胞的基因转化，并用此法获得了水稻转基因植株f 2 2 l 。用电激法对大豆的遗传转 化有下列报道，c h r i s t o u 等用3 个大豆品种研究电激条件，得到了抗卡那霉素的愈伤， 并诱导生根；j o n e s 等以野生大豆品种g 1 6 2 6 为材料，得到了抗卡那霉素植株1 ； d h i r 等以c l a r k 6 3 为材料，分别得到抗性芽和抗卡那霉素植株f 2 5 1 。由于原生质体培养技 术复杂，难以掌握，应用不很广泛。 ( 4 ) 显微注射法 显微注射法( m i c r o i n j e c t i o n ) 进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术 方面的研究都比较成熟。特别是在动物细胞或卵细胞的遗传转化核移植及细胞器的移 植方面应用很多近年来，这项技术已发展为以培养细胞或胚性细胞团为受体，例如， 1 9 8 7 年n e u h a u r 等用油菜( b r a s s i c an a p u sl ) 花粉起源的1 2 细胞期的体细胞胚注射含 n p t i i 基因的d n a ，获得转基因植株的频率高达2 7 5 1 。0 1 2 6 1 1 9 8 9 年刘萼妖等用微注 射法将a t r a z i n e 抗性基因向大豆叶绿体中转移，获得转基因抗性再生植株【2 7 1 ( 5 ) 聚乙二醇法 聚乙二醇法( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 介导基因转化是2 0 世纪8 0 年代初d a v e y 等和 k r e n s 等首先建立的p e g 直接转化方法对禾本科作物有重要作用，已经在水稻高梁 和小麦等重要粮食作物都获得了转基因植株大豆的p e g 介导法转基因的研究有卫志 明和南相日两例报道【2 8 , 2 9 1 ( 6 ) 花粉管通道法 花粉管通道法( p o l l e n t u b ep a t h w a y ) 是利用花粉管通道导入外源d n a 的技术， 它是由周光宇等1 9 8 3 年建立并在长期科学研究中发展起来的其主要原理是授粉后使 外源d n a 能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的 卵、合子或早期胚胎细胞l u o 等报道了用花粉管通道法将舍p 3 5 s n p t l i h i s t 3 的质粒 d n a 转入藤坂五号水稻品种中，分子杂交检测证实了外源d n a 已整合到了水稻基因 组中1 3 0 1 谢道昕等从b ta i z a w a i 7 、2 9 和b tk u r s t a k ik d 1 中分离了两个杀虫基因，分别 构建在植物表达载体p b l l 2 1 2 和g a 6 4 3 上，通过花粉管途径，将这两种杀虫基因导入 9 福建农林大学20 0 7 届硕士学位论文 我国棉花品种中，获得转基因植株p ”分子杂交的结果证明杀虫基因已经整合到棉花 的基因组中， 杀虫基因融合的报道基因( g u s ) 在棉花中得到表达谢道昕等以我国生产 上大面积推广的丰产，抗病的优良水稻品种“中花1 1 号”为材料，采用花粉管通道法成 功地获得了转b t 杀虫基因的水稻植株，分子杂交实验证明杀虫基因已整合到水稻基因 组中，与杀虫基因融合的报告基i 蛩( g u s ) 在转基因植株中得到了表达1 3 2 1 1 9 9 3 年曾君祉 等将含有g u s 基因的p b i l 2 1 质粒用花粉管途径转化普通小麦品种j 、山3 号”的小花， 获5 株转基因小麦植株，转化率为4 7 1 3 3 1 。 大豆利用花粉管通道法进行遗传转化仅在中国有几例。】9 9 1 年，雷勃钧等通过花 粉管通道进行了外潺d n a 的导入，转化后代变异包括成熟期，株型，花色：种皮色， 百粒重，蛋白质含量等【3 4 j 刘德璞等使用此种方法获得抗s m v 的大豆转基因植株【3 5 1 。 胡张华等将反义尹p 基因转入浙春3 号大豆品种中，获得再生植株，并得到p c r 检测 结果p 6 1 。徐香玲等将几丁质酶基因转入大豆栽培品种中获得再生植株，斑点分子杂交 证明了几丁质酶基因已转入大豆中1 3 7 j ( 7 ) 超声波辅助农杆菌转化方法 超声波辅助农抒菌转化方法( s o n i c s t i o n - a s s i s t e da g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ) 是近年发展起来的一种遗传转化方法超声波基因转化的基本原理是利用低声强 脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜，使外源d n a 进入细胞。在进行农杆茵转化时用 超声波处理外植体组织，使其产生小的通道，有利于农杆菌进入植物细胞内t r i c k 等 用扫描电镜及光学显微镜观察发现，超声波处理后使外植体表面及近表面产生大量的细 小贯穿通道，农杆菌易于与植物细胞接触，从而促进转化过程1 3 8 1 】9 9 8 年，s a n z a r e m 和m e u r e r 分别以未成熟子叶和子叶节为外植体进行了超声波辅助农杆菌转化法的研 究，结果各异s a n t a r e m 等以未成熟子叶为外植体，在用农杆菌侵染共培养3 d 后，用 超声波处理2 s ，获得了更高的g u s 表达1 3 9 1 ；而m e u r e r 等的结果表明，超声波辅助衣 杆菌转化没有增加稳定的转化 1 2 1 2 大豆组织培养与再生体系的建立 大豆遗传转化的受体主要有胚轴，未成熟子叶、子叶节，胚性悬浮培养物( 细胞 团) ，原生质体和子房等大豆未成熟子叶和胚性悬浮培养物( 细胞团) 主要做为基因 枪法的转化受体，未成熟子叶和胚性悬浮培养物( 细胞团) 的体积较小，作为基因枪轰 击的靶较为经济同时，未成熟子叶在高浓度的生长素诱导下可经体细胞胚胎发生再生 植株，尽管有些大豆品种的体细胞胚胎发生率不是很高，但它克服了子叶节进行遗传转 化时易产生嵌合体的缺点，已将b t 基因牛酪蛋白基因转入j a c k 等少数大豆品种中 大豆胚轴，子叶节和未成熟子叶可以作为衣杆菌介导法主要转化受体，尤其以子叶 节更为常用农杆菌在侵染受体时，常常使受体受到伤害，而当以子叶节为受体时，这 种伤害较小，易于得到转化体，转化率也较高由于子叶节经器官发生再生植株， 专化 体常容易形成嵌合体，又增加了后代筛选的难度目前，用此法已将几丁质酶基因 0 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 b a m a s e 基因、b t 基因玉米转座子a e 基因s m v c p 基因等转人大豆中 原生质体只作为聚乙二醇法的转化受体，由于原生质体的培养较为困难，操作难以 掌握，此方面的研究较少子房可作为花粉管通道法和子房显微注射法的爱体，用花粉 管通道法已将高蛋白基因，抗s m v 基因，反义p e p 基因和几丁质酶基因转入大豆中， 用显微注射法将抗a t r a z i n e 基因转入大豆中 由以上分析可以看出，基因枪轰击大豆未成熟子叶、农杆菌介导大豆子叶节为最常 用的方法，转化的外源基因主要是抗病虫基因和抗除草荆基因等抗性基因 1 2 2 转基因植株的筛选和检测 1 2 2 1 转基因植株的筛选 在有选择压力的条件下，利用抗性基因在转化体内的表达，有利于从大量的非转化 细胞中选择出转化克隆目前使用的选择性试剂主要有抗生素类、除草剂类、氨甲喋 呤氨基酸类 由于植物种类、品种以及外植体类型不同，选用的选择试荆种类和浓度也有差异 通常要通过预备试验以确定最佳的选择试剂种类及浓度选择试剂可以由低浓度到高浓 度逐渐加大，另外选择试剂有时可能对分化产生影响，可适当降低分化阶段的选择压， 甚至除去选择压】。选择压的加入时机，也因转化方法物种外植体类型的差异而 不同过早加入选择压，转化细胞往往来不及恢复生长状态，抗性基因未来得及表达， 而被选择性试剂抑制或杀死【4 2 i 过迟加入选择压，未转化的细胞则可能逃避选择，导 致出现嵌合现象或假转化体【4 3 1 一般来讲，应用农杆菌介导的逸传转化，在外植体与 菌体共培养3 6 h 至5 d 加人选择压；而基因枪，电击穿孔等直接转化法，宜在转化后 5 l5 d 加入选择压i 州 i 2 2 2 转基因植株的检测 分子生物学技术的发展，可以对目的基因进行整和状态转录和翻译水平的检测， 跟踪目的基因在转基因植物中的行为，报告基因由于其表达产物易于检测，已广泛用 于基因调控和转基因技术的研究无论用什么方法检测，都需要在构建质粒时，加上可 识别位点，如报告基因、限制性内切酶的识别位点，引物识别位点等，从而有利于对外 源基因的检测 1 2 2 2 1 报告基因的检测 报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，因而易于进行转化后的 筛选利用酶法分析、通过同位素放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报 告基因的表达，从而有效地检测出重组细胞或组织根据报告基因编码特点，大致分为 两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因 ( 1 ) 抗性基因的酶活性检测 新霉素磷酸转移酶( n p t - i i ) 氯霉素乙酰转移酶( c a t ) ，p p t 乙酰转移酶( p a t ) 是常 用的3 种抗性酶，因其易于检测，编码基因常用作报告基因 1 i 福建农林大学2 0 0 7 届硕士擘位论文 新霉素转移酶( n p t 1 1 ) 可以催化氨基糖苷类抗生素( 如新霉素、卡那霉素庆大霉 素，g 4 1 8 ) 磷酸化使用该基因转化植物，可以赋予转化细胞抗k a n 庆大霉素， g 4 1 8 的能力，被广泛应用于植物遗传转化中n p t 1 i 基因在多数植物体中都有很强的 表达能力，同时也适用于酶法分析，因此被广泛用作报告基因邵莉【4 5 】等先分析了转 基因矮牵牛n p t 一1 i 酶活性，然后对阳性植株进行s o u t h e r n 杂交，减少了工作量检测 n p t - i i 活性需要的材料少，易进行早期检测1 4 6 1 氯霉素转移酶( c a t ) 能使氯霉素丧失抗菌素活性c a t 基因的表这能力不如n p t i i 强，敌应用并不广泛但是。由于植物细胞内非特异性活性本底很低，不易造成对 基因产物分析的干扰，因此适合于对基因产物进行定性和定量分析c a t 作为报告基 因已在番茄、烟草等作物上得到应用【4 7 l 。 p p t 乙酰转移霉( p a n 是由b a r 基因编码的，可使上游游离的氨基乙酰化，乙酰化 的p p t 对g s 不再有控制作用，从而失去对植物的毒害。抗除草剂基因作为目的基因在 植物中得到了广泛的应用由于b a r 基因具有明显的筛选作用，且检测方法灵敏，可用 作报告基因。j u n c a o 4 s j 在水稻上通过检测p a t 活性，对转基因植株进行筛选，取得了 理想的效果。 ( 2 ) 胭脂碱和章鱼碱的测定 胭脂碱( n o p a l i n e ) 和章鱼碱( o c t o p i n e ) f f 成酶基因广泛存在于土壤农杆菌t i 质柱的t d n a 上，类似于真核基因的启动子和加尾信号i ”1 。在经改造的质粒非致癌t d n a 上 常保留胭脂碱合成酶( n o s ) 或章鱼碱合成酶( o s c ) 基因n o s 和o c s 的催化产物容易发 生明显的颜色反应，故在植物转化中常用作筛选标记梁小友 5 0 l 等利用纸电泳菲醌染 色检测转基因番茄，在4 株转化番茄中有3 株具有明显的荧光斑点，间接证明目的基因 插入植物染色体组中。n o s 、o c s 基因作为报告基因被广泛应用于转化体的检测中 4 9 5 1 、5 2 1 ( 3 ) 荧光素酶活性检测 检测转化细胞中荧光素酶活性是一个简单快速筛选转基因植物的有效方法荧光素 酶基因是一个灵敏的报告基因，检测的灵敏度比c a t 高1 0 0 倍，而且没有背景荧光 素酶基因的最大特点是不损害植物，即在整体植物或离体器官内，基因产物都可测定 但荧光素酶基因产物易在过氧化物酶体中积累，在植物体内产生光的部位不一定能反映 荧光素酶基因的特定表达部位。 ( 4 ) g u s 酶活性检测 b 葡萄糖苷酶( p g l u c u r o n i d a s e ，g u s ) 能催化裂解一系列的p 葡萄糖苷，产生具有发 色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对g u s 活性进行定量和空 间定位分析，检测方法简单灵敏g u s 基因广泛地用作转基因植物，细菌和真菌的报 告基因，特别是在研究外源基因瞬时表达转化实验中g u s 基因的最大优点是它能研 究外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的有一些植物在 1 2 福建农林大学2 0 0 7 届硕士学位论文 胚胎状态时，能产生内源g u s 活性，检测时要注意设定严格的阴性对照s o r y u ”在 转基因r 0 代的幼叶，花粉胚珠中检测到g u s 活性，同样在r l 代的幼根，子叶花 粉胚珠中也检测到g u s 活性因此，g u s 基因能从r 0 代遗传至r l 代，随着组织 的成熟衰老，g u s 表达逐渐停止这种现象也在- 甜g x 5 4 】烟草1 5 5 , 5 6 1 ，水稻中存在 因此在检测g u s 活性时，要注意植物的发育时期和取材部分 1 2 2 2 2p c r 检测转化植株 p c r 是在体外快速特异地扩增目的基因d n a 片段的有效方法能在几小时内使 p g 水平的起始物达到n g 乃至p g 水平，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后 很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序这项技术可用于转化 后外源基因的鉴定和植物基因组的分析。武长剑等【5 8 】用p c r 技术检测出转基因水稻中 b t 基因和抗除草荆基因的存在应用p c r 法检测易出现假阳性，可用p c r s o u t h e r n 杂交进一步验证f 5 8 5 9 有时n o r t h e r n 杂交的信号弱，可用r t p c r ，将r n a 反转录成 c d n a ，再与探针杂交，从而检测外源基因的表达【5 9 1 利用r a p d p c r 技术，可以检 测出对照植株与转化植株带型差异，还可用该技术检测不同代植株问基因组的稳定性及 后代的分离。 与s o u t h e r n 分析相比，p c r 检测d n a 用量少，操作简单，成本低，不需同位素即 可完成。另外，p c r 还能检测目的基因的完整性i 鲫但p c r 检测也存在缺点，d n a 插入植物基因组后易发生重排，即使载体上的抗性基因能表达，目的基因也未必完整地 存在于转化体中，从而造成检测结果的误差 1 2 2 2 3 点杂交和s o u t h e r n 杂交 点杂交是将提取d n a 或r n a 不经酶切，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与捩针 进行杂交的技术利用点杂交，可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因罗云波 等l6 1 】用d n a ，r n a 的点杂交技术对转基因植株进行鉴定，取得与田网表现一致的结 果。但点杂交的特异性差，阳性植株还需进一步作s o u t h e r n 杂交验证 s o u t h e m 杂交是将经酶切d n a 转移到杂交膜上与探针杂交的技术利用s o u t h e r n 杂交，可以确定外源基因在植物中的组织结构1 6 2 1 外源d n a 整和的位置及拷贝数 | 6 3 , 6 4 , 6 5 l 、转基因植株f 1 世代外源基因的稳定性【矧 s o u t h e r n 杂交可清除操作过程中的污染( 如d n a 分离及植物d