（植物学专业论文）拟南芥mg2转运基因家族中atmgt3基因的功能研究.pdf

摘要 a t m g t 是一个包含1 0 个成员( 彳t m g t i j 们的m 9 2 + 转运蛋白家族 ( l ie ta 1 ，2 0 0 1 ) ，可能在维持细胞内环境m 9 2 + 的离子动态平衡方面 起很重要的作用。拟南芥基因组测序( a g i ) 表明，彳姗刀位于第二 条染色体上，编码一个含有4 2 1 a a 的蛋白质。结构分析表明其具有 a t m g t 家族的一些共同特征，如：含有两个疏水的跨膜区，且第一个 跨膜区上含有保守基序g m n 。到目前为止，a t m g t 家族十个成员中已 有四个成员被鉴定具有镁离子转运功能。本研究克隆a t h l g t 3 基因并 初步鉴定其功能。 1 通过r t - p c r 克隆彳姗豫测序结果显示其序列与a g i 预测的 序列一致。将彳t m g t 3 基因的c d n a 构建至原核表达载体p t r c 9 9 a ，重 组载体转化沙门氏杆菌突变株m m 2 8 1 。m m 2 8 1 功能互补和液体生长曲 线结果表明a t m g t 3 功能互补细菌m 9 2 + 转运突变株，具有m 9 2 + 转运能力。 2 m m 2 8 1 功能互补、液体生长曲线结果表明，a t m g t 3 介导m 9 2 + 的 低亲和性吸收，是一个低亲和性m 9 2 + 转运蛋白；同时，a t m g t 3 可能还 能转运f e 2 + ，但转运f e 2 + 浓度超出了正常的生理浓度。在正常生理条 件下，a t m g t 3 的主要生理功能是作为m 9 2 + 转运蛋白起作用。 3 在正常生理条件下以及缺m 9 2 + 的生理条件下，与野生型材料比 较，突变体植株的s o d 活性升高而叶绿素含量降低，表明a t m g t 3 和 m g z + 含量之间存在相关性。这可以间接的推测a t m g t 3 具有m 9 2 + 转运能 力。 4 表达模式分析表明：a t m g t 3 在拟南芥的根、茎、叶、花、角 果中均有表达，但在花中表达量最高，在根中表达量最少。 5 a t m g t 3 与绿色荧光蛋白( g f p ) 融合，在共聚焦显微镜下显示 这种蛋白定位在细胞质膜上。 6 g u s 染色表明a t m g t 3 主要在花药、根、叶中表达，在花药和 叶中的表达具有时间上的特异性。 7 构建和筛选了t - d n a 插入基因敲除突变体植物和a t m g t 3 过表 达等转基因植物。但进步的分析未发现与野生型明显的表型差异。 关键词：彳姗飓功能互补分析，低亲和m 矿+ 转运蛋白 h a b s t r a c t a t m g t g e n ef a m i l yw a si d e n t i f i e db yl ie ta 1 ( 2 0 0 1 ) ，w h i c h c o n t a i n s1 0 一m e m b e r sd e s i g n a t e da sa t 黼t 卜a t m g t l o a t 艟g tg e n e s e n c o d e sp u t a t i v e m 9 2 + t r a n s p o r t e r s ，w h i c hm i g h t p l a y a n e s s e n t i a lr o l ei nm a i n t a i n i n gm 9 2 + h o m e o s t a s i so ft h ei n t e r n a l e n v i r o n m e n ti nt h ec e l1s a 芒嬲7 7l o c a t e so nt h es e c o n d c h r o m o s o m e ，e n c o d i n ga4 2 1 a ar e s i d u e sp r o t e i n s t r u c t u r a l a n a l y s i sr e v e a l st h i sp r o t e i nh a st h ec o m m o nc h a r a c t e r i s t i c s o ft h ea t m g t s ，e 髟，c o n t a i n i n gt w oh y d r o p h o b i ct r a n s m e m b r a n e ( t m ) d o m a i n s ，a n dag m nc o n s e r v e dm o t i fi nt h ef i r s t t r a n s m e m b r a n ed o m a i n f o rt h eti m eb e i n g ，4 - m e m b e r so fa t m g t w e r ef o u n dt of u n c t i o n a ll yc o m p l e m e n tt h eb a c t e r i a lo ry e a s t m 9 2 + 一d e f i c i e n tm u t a n t s ，s u g g e s t i n gap o t e n t i a lr o l e i nm 9 2 + t r a n s p o r ti na r a b i d o p s i s t h i ss t u d ys h o w ss o m er e s u l t so f a t 硒7 3g e n ec l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o n 1 t h ec d n ac l o n i n gw a so b t a i n e db yr t p c r ，a n dt h e n s e q u e n c e d i ts h o w e dt h ei d e n t i c a ls e q u e n c et ot h a to ft h e p r e d i c t e db ya g i t h e nc d n aw a ss u b cl o n e dt op t r c 9 9 aa n d t r a n s f o r m e dt ot h es a l m o n e l l at y p hi m u r i1 1 1 ym u t a n tm m 2 81w hic h l a c km 9 2 + t r a n s p o r tc a p a b i l i t ya n dc a n n o ts u r v i v ei nt h em e d i u m w i t ht h em 9 2 + c o n c e n t r a t i o nb e l o wl o m m o l l t h er e s u l t ss h o w e d t h a ta t m g t 3c a nf u n c t i o n a l l yc o m p l e m e n tt h eb a c t e r i a lm u t a n t 2 t h er e s u l t so ff u n c t i o n a lc o m p l e m e n t a t i o na n dli q u i d g r o w t hc u r v ea n a l y s i ss h o w e dt h a ta t m g t 3m e d i a t e dl o w a f f i n i t y t r a n s p o r to fm 9 2 + f u r t h e r m o r e ，a t m g t 3m ig h tt r a n s p o r to t h e r d i v a l e n tc a t i o n sl i k ef e 2 + b u t ，t h ec o n c e n t r a t i o nr e q u i r e df o r i i i t r a n s p o r to ff e 2 + i sb e y o n dn o r m a lp h y s i o l o g i c a lr a n g e u n d e r n o r m a lp h y s i o l o g i c a lr a n g e s ，t h em a j o rp h y s i 0 1 0 9 i c a lf u n c t i o n o fa t m g t 3ism 9 2 + t r a n s p o r t 3 u n d e rt h en o r m a la n dl a c k i n g m 9 2 + p h y s i o l o g i c a l r a n g e s ，c o m p a r e dt ot h ew il dt y p e ，s o da c ti v it yb eh i g h e ra n d c h l o r o p h y i ic o n c e n t r a t i o nb el o w e ri nt h em u t a n t ，w ec a nf i n d t h a ta t m g t 3a n dm 9 2 + a r er e l a t e d i ti n d i r e c ti m p r o v e dt h a t a t m g t 3c a nt r a n s p o r tm 9 2 + 4 t h e e x p r e s si o np a t t e r ni n d i c a t e dt h a t ：彳芒彬刀 t r a n s c r i p t sw e r ee x p r e s s e di nr o o t s ，s t e m s ，l e a v e s ，f l o w e r s ， a n ds i l i q u e s ，b u te x i s tm o s ta b u n d a n t l yi nf l o w e r s ，l e a s t a b u n d a n tl yi nr o o t s 5 m e a n w h il e ，t h et r a n s g e n i cp l a n t st r a n s f o r m e dw i t ht h e a t m g t 3 ：g f pf u s i o nc o n s t r u c t sw e r ed e t e c t e dw i t ht h ec o n f o c a l f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a ta t m g t 3 l o c a t e si nt h ep l a s m am e m b r a n e 6 g u se x p r e s s i o no fa t m g t 3m a i n l yi na n t h e r s ，r o o t sa n d l e a v e s ，w h il et h ee x p r e s s i o no fa n t h e r sa n dr o o t sh a v et h e s p e c i f i c i t yo ft i m e s 7 t - d n ai n s e r t i o n a la t m g t 3g e n ek n o c k o u tm u t a n tp l a n t s a n dat m g t 3o v e r e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cp l a n t sw e r es c r e e n e da n d t h e i rp h e n o t y p ew a s a n a l y z e du n f o r t u n a t e l y ，t h e r ei sn o o b v i o u sp h e n o t y p ef o u n d k e yw o r d s ：a t m g t 3 ；f u n c t i o n a lc o m p l e m e n t a t i o na n a l y s i s ： l o w - a f f i n it ym a g n e si u mt r a n s p o r t e r i v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：矛带侄、 卿年口月日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密囱，在一一兰一一年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ 力) 作者签名： 导师签名： 日期：砷年2 月7 日 日期：年 月 日 拟南芥m 9 2 + 转运基因家族中a t m g t 3 基冈的功能研究 第一章引言 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a i a n a ) 隶属于十字花科拟南芥属，二 年生草本，成熟个体高1 5 - - - 4 0 c m 。基生叶有柄呈莲座状，叶片呈倒 卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。总状花序顶生，花瓣4 片，白色，匙形。长角果线形，长l 1 5 c m 。其广泛分布欧、亚、 非、澳和北美洲，与甘蓝、花椰菜、辣根等经济作物同科。 拟南芥在基因组分析方面有很多优势：( 1 ) 植株很小：一般株高 1 5 - - 一4 0 c m ，所占空间很少。取材十分方便，生长条件十分容易控制。 ( 2 ) 生活周期很短：从种子萌发，经生长发育，再形成种子，完成一 个生活周期只需要6 , - 8 周时间，且生长无明显季节性。在一年之内 繁殖许多代，为其生物学和遗传研究提供了充足的时间。( 3 ) 繁殖系 数高：每株可产籽3 0 0 0 粒以上，多者可达万粒，种子十分小，使它 成为理想的诱变实验材料。( 4 ) 典型的自交繁殖植物：自交和远源杂 交可育。( 5 ) 基因组小：只有5 对染色体，5 条染色体测序结果全长 为l 1 0 8 b p ，是高等植物中基因组最小的物种之一。d n a 重组分析和 随机选择基因克隆表明，拟南芥叶绿体基因组有非常低的重复序列， 仅有1 0 - 1 4 是高度重复或回文重复序列；核基因组中的单拷贝比 例更高。由于它具有植株小，生育周期短，种子量大等特点以及开 花植物的全部特征：自交亲和、远缘杂交可育、基因组小、重复序列 少、可被农杆菌转化等特点，故作为植物遗传学、发育生物学和分 子生物学研究的模式显花植物，被称为植物“果蝇 。 m g z + 是高等植物细胞中最丰富的二价阳离子之一，其在植物生长 发育中起着非常重要的作用。m 9 2 + 是构成叶绿素的主要组成成分和酶 的活化剂，参与脂肪代谢，促进磷素的转运以及某些维生素的合成； 参与维持细胞膜的稳定豫1 ；m 9 2 + 对植物液泡离子通道以及叶绿体r n a 的稳定性都有重要的调控作用口1 。在植物生长发育所必需的金属离子 中，m 9 2 + 的化学特性也是独一无二的。植物缺镁时表现出叶片失绿、 坏死等症状。但迄今为止对m 9 2 + 的转运及其动态平衡的调节机制却知 硕士学位论文 之甚少。随着分子生物学技术的发展和应用，已经从植物中克隆到 多种镁离子转运蛋白基因，并对这些镁离子转运蛋白的结构、生化 功能、生理功能等进行了研究。 1 1m 9 2 + 的特性 镁易与氧形成共价键，而不易与氮和硫形成共价键n 1 。在溶液中 和生物环境下，m 9 2 + 与水分子或别的分子结合的键角都接近9 0 。，成 规则的几何形状。其键角的灵活性不如其他的阳离子。m 矿+ 不仅具有 以上几何特性，也具独特的化学性质。m 9 2 + 具有最高的电荷密度、最 大的水合半径和最小的离子半径。其水合半径是其离子半径的4 0 0 倍，而c a 2 + 和n a + 的相应半径比是2 5 倍，k + 的相应半径比最小，仅为 4 倍。因此m 9 2 + 与水分子的亲和力比c a 2 + ，n a + 和k + 大得多，并且经常 会与其他分子相互作用来维持其水合半径的稳定喳1 。由于m 9 2 + 具有独 特的几何性质和化学性质，有人猜测其转运系统也具有独特性。细 菌中的研究结果支持了这一假说嘲。 1 2m 9 2 + 的重要生理作用 1 2 1m 9 2 + 对液泡离子通道的影响 1 9 9 5 年m a r s c h n e r 用挪威云衫研究证实液泡是调节胞质和叶绿 体中m 9 2 + 动态平衡的主要细胞器h 1 。m 9 2 + 进入细胞后，大部分游离m 9 2 + 进入液泡，通过液泡的调节来达到离子的动态平衡阳一1 。当植物中m 9 2 + 过剩或短缺时，液泡可起容量缓冲库的作用。保卫细胞液泡膜中存 在两种类型的离子通道，它们是c e + 离子一通透性的阳离子一选择性的 慢速液泡通道( s v ) 和快速液泡通道( f v ) 口一引。这两种通道受到钙离 子、钙调蛋白、蛋白激酶和磷酸酶等许多因子的调节。钙离子浓度 低时，缺乏m 9 2 + 不能激活s v 通道；缺乏钙离子，m 9 2 + 不能单独激活 s v 通道。因此在s v 通道中钙离子和m 9 2 + 之间存在协作作用。液泡内 m 9 2 + 浓度的增加，可抑制f v 电子流。无论在正负电势下，液泡m 9 2 + 对f v 通道都是负调节西】。 1 2 2m 9 2 + 对光合作用的影响 m 矿+ 对光合作用的影响主要体现在类囊体酸化过程和光合作用 中一些酶的调节。以前的研究表明m 9 2 + 在类囊体酸化过程中主要参与 拟南芥m 孑+ 转运基因家族中a t m g t 3 基因的功能研究 维持类囊体膜两侧的电荷平衡j 2 “引。m 9 2 + 的变化可调节基质中的酶。 黑暗中细胞的淀粉需求下降，m 9 2 + 可激活光合作用中的酶，防止淀粉 降解产物再合成淀粉。光作用下，m 9 2 + 浓度的增加可激活1 、6 - _ 磷 酸果糖，1 、7 一二磷酸景天庚酮酶；引起核酮糖一1 、5 一二磷酸酶接受 c 0 2 。m 9 2 + 也激活核酮糖一1 、5 一二磷酸酶碳酸酶等，驱动这些酶的羧化 导致t c o ：的固定n 引。基质p h 值高，可激活c 0 2 吸收酶，但高p h 值的维 持受胞液中m 9 2 + 浓度影响。 m 矿与叶绿体膜表面的负电荷结合，降低了k + 穿过叶绿体膜的电 导系数。m 9 2 + 通过抑$ 1 j k + 转入到基质，引起h + 转出的受抑，这阻止了 基质的碱性化，导致了光合作用的抑制。m 9 2 + 是胞液中主要的游离二 价阳离子；并且是叶绿体膜主要的生理阳离子，胞液中m 9 2 + 浓度增加， 可引起渗透压消失，细胞表面失水，从而抑制了光合作用n 引。 1 2 3m 矿对高等植物叶绿体r n a 稳定性的调控 关于质体r n a 降解激发的分子机制目前了解很少，迄今为止， 只有几个m r n a 顺势调控元件在高等植物中在基因水平上被描述。 m a r t i n 畸1 等人的研究表明除了一些蛋白外，二价的m 9 2 + ( 作为一个非 蛋白因子) 对叶绿体r n a 的化学稳定性有重要的调控作用，自由m 9 2 + 的浓度在叶绿体发育期间一定范围内的提高可充分的授予基因专一 的m r n a 稳定性的调控。处于最高稳定状态的是编码p s i i 中d 1 反应 中心蛋白的m r n a 。 用滴定实验分析m 9 2 + 对不同r n a 的稳定性影响，结果表明 1 6 s r r n h 在低m 9 2 + 浓度( 2 5 5 m m o l l ) 下就可保持稳定。而 p s b h m r n h 、r b c l m r n h 则显示出一个内部调节特征，在补充5 l o m m o l lm 9 2 + 时就可变得稳定3 。 对于m 9 2 + 为何诱导叶绿体r n a 稳定，一个推测是m r n a 上的切割 位点被m 9 2 + 保护。分析了在有或无m 9 2 + 存在的情况下p s b h m r n h 的降 解产物，结果发现，在m 9 2 + 不存在时，多出一些降解片段，它们是 m 9 2 + 存在时所没有的，推测在m 9 2 + 存在时，一些切割位点可得到保护， 另外的一些位点活性也有所降低。另外一个推测是m 9 2 + 影响蛋白与 m r n a 的u t r 区域的结合。m a r ti n 3 证明了c s p 4 1 ( 一种内切核酸酶) 硕士学位论文 的结合亲和性随m 9 2 + 的增加而降低。 1 3m r 转运的研究现状 目前整个生物界已发现了五大m 9 2 + 转运基因家族：c o r a 家族、 m 9 2 + h + 交换体、离子通道、p 型磷酸酶和m g t e 家族n 司( 见表1 - 1 ) 。 主要的m 9 2 + 转运基因家族是细菌中的c o r a 基因家族n 。其中 c o _ r a 在s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 中以单基因座存在，编码一个3 7 k d 膜蛋白。通过蛋白拓扑分析，发现其有独特结构：n 端有一个大的 亲水性区域，c 端有2 个疏水的、螺旋性很强的跨膜区( d o m a i n ) ，是 m 9 2 + 跨越双层膜的重要d o m a i n 。但c o r a 仅含2 个跨膜片段单体，不 足以构成一个离子通道，因此c o r a 蛋白可能以一个寡聚体的形式参 与m 9 2 + 转运。c o r a 序列上存在保守基序g m n ，是c o r a 具有m 9 2 + 转运 能力所必需的。如果g m n 有一个氨基酸突变，其m 9 2 + 转运功能将丧失 【1 8 】 o a l r i 和a l r 2 是在酵母中发现的两个抗铝毒性的蛋白，其结构与 c o r a 有一定的同源性。而且它们是酵母在低m 9 2 + 浓度条件下生长所 必须的，这暗示a l r 具有m 9 2 + 转运的功能n 引。另一个酵母蛋白m r s 2 ， 其结构也与c o r a 有一定的同源性，可能在线粒体内膜上有转运m 9 2 + 的功能瞳引。酵母的a l r i 、a l r 2 、m r s 2 与细菌中的m 9 2 + 转运蛋白c o r a 有结构上的相似性：都有一个高电荷的n 端d o m a i n ，c 端有两个疏水 表l - 1 五大m 9 2 + 转运基因家族 4 拟南芥m 9 2 + 转运基因家族中a t m g t 3 基冈的功能研究 d o m a i n ；在靠近第一个疏水区域的末端有一保守的g m n 基序。对c o r a 在这一区域的突变分析证明了g m n 保守基序是转运功能所必须的。 在5 ：t y p h i m u r i u m 中发现了另外两个具m 9 2 + 转运活性的基因： 始纠和m g t b 两个基因都编码大的复合跨膜蛋白，属于p 一型a t p a s e 家族雎。虽然c o r a 和m g t a m g t b 系统都可以转运其它的二价金属离 子如：n i 2 + 和c 0 2 “忉，但是从陆值及离子浓度分析来看，这些基因的 生理功能是作为m 9 2 + 的转运系统n 引。 1 4 植物细胞中m 9 2 + 的动态平衡 植物细胞内各种离子( 包括m 9 2 + ) 和营养物都必须达到良性的动 态平衡，这样才能保证细胞内环境的稳定。m 9 2 + 在植物的正常生长发 育中扮演重要角色，对植物体内的离子平衡有重要作用。为了适应 土壤中不断变化的m 9 2 + 含量及应付其它形式的胁迫，植物必须在整体 水平和细胞水平上严格控制m 酽+ 的转运，以达到动态平衡。m 9 2 + 动态 不平衡将会强烈影响胞液和叶绿体中关键酶的活性，从而影响植物 光合速率、碳水化合物的运输、矿物质和水分的运输以及蛋白质的 合成。如果m 9 2 + 对膜转运的正确调节受到干扰，会导致植物出现生长 缓慢和缺m 9 2 + 的症状恤3 。m 9 2 + 通过影响液泡离子通道和光合作用，来 达到自身平衡和植物内环境的稳定哺1 。植物最佳生长时要求的m 9 2 + 浓度是植物有关生长部位干重的0 1 5 - - 一0 3 5 。在叶子受干旱胁迫 时，其中高含量的m 9 2 + ( 占叶子干重的1 5 ) 严重损害光合作用。高 水位条件下，在含不同m 矿+ 的培养条件下，植物生长时的光合效率虽 然一致，但在脱水条件下植物光合作用在m 9 2 + 含量高时受到严重抑制 h s 。植物中过量的m 9 2 + 可能抑制植物光合作用和生长，特别是在脱水 期。另一方面，植物叶片缺乏m 9 2 + 同样会降低光合速率。细胞中结合 到叶绿体的总m 9 2 + 比例依赖m 9 2 + 的供应，在正常植物叶片约为6 ， 在缺m 9 2 + 的植物叶片中供应高达25 35 汹1 ，这会导致出现生 长缓慢和缺m 9 2 + 的症状。叶片萎黄病是m 9 2 + 缺乏的主要视觉症状。同 时，植物中缺乏m f + 也会削弱碳水化合物的运输，这可能受依赖m 9 2 + 的质子融的抑制，导致了贮藏组织中淀粉含量的降低乜引。缺乏 m 9 2 + ，叶片高度感光，根生长削弱，因而影响矿物质和水分的运输。另 硕士学位论文 外作为核糖体亚基集装的架桥元素，m 矿+ 在蛋白质合成中是必须的， 当游离的m 矿+ 不足或存在过量的k + 时，核糖体亚基分离，蛋白质合成 停止汹1 。m 9 2 + 缺乏也会干扰m 孑+ 对膜转运的正确调节。植物缺乏m 9 2 + 受某些生态因子如土壤酸化( 高h + ) 的影响，还受与根质外体的负电 荷结合的其它阳离子的影响，特别是a 1 3 + 、m n 2 + 、c a 2 + 、n a + ，由于阳 离子的竞争引起的m 9 2 + 缺乏是一种普遍存在的现象汹1 。 1 5 植物中的m 9 2 + 转运蛋白 如前所述，整个生物界中已发现有五大m 9 2 + 转运基因家族。到目 前为止，在高等植物中已鉴定出二类具m 9 2 + 转运活性的转运蛋白： m 9 2 + h + 交换体是一类质子依赖性转运蛋白；另一类是c o r a - li k e 镁离 子转运蛋白。 1 5 1m g h + 交换体 1 9 9 9 年s h a u l 在模式植物拟南芥中克隆到一个在液泡膜上编码 转运蛋白的基因- a t 幽t i x oa t m h x 是第一个从多细胞有机体中克隆到 的m 9 2 + 转运蛋白，也是在植物中首个被发现的m 9 2 + h + 交换蛋白。其位 于液泡膜上，作为一种m 矿+ ( z n 2 + ) h + 交换蛋白发挥作用乜7 l 。n o r t h e r n 杂交分析显示，a t a g v xm r n a 在拟南芥的各个组织中均有表达。在所 有成熟植物器官中，a t a g t x 的m r n a 主要存在于木质部导管中。s h a u l 的研究表明当植物中m 9 2 + 和z n 2 + 数 量过剩或短缺时，a t m h x 可起容量 缓冲作用。由于a t m h x 位于液泡膜 上，其虽然不改变细胞中离子的总 量，但能影响m 矿+ 和z n 2 + 在植物各器 官间的分配矧。 1 5 2c o r a - ii k e 镁离子转运蛋白 c o r a 家族是五大m 9 2 + 转运基因 家族最大的一个n 引，其广泛存在于 细菌、真菌、酵母、哺乳动物和 图1 - 1 ：a t m g t 家族成员的系统进化树 高等植物中，其蛋白具有独特的拓扑结构。2 0 0 2 年l i 等在拟南芥中 鉴定出一个与细菌c o r a 同源、蛋白结构相类的a t m g t 家族嘲1 。此家 拟南芥m 9 2 + 转运基因家族中a t m g t 3 基因的功能研究 族有l o 个成员，成员的氨基酸序列多样，氨基酸的同源相似性范围 从1 5 到8 9 。在家族的系统发育中，a t m 6 t 1 和a t m g t 2 , a t m g t 5 和彳芒肥陨彳嬲限a t m g t 8 和a t m g t 9 各自成簇，亲缘关系较近。 而d t m g t i o 在系统发育中另外分支，与其它成员亲缘关系较远呦1 ( 见 图i - i ) 。 目前a t m g t 基因家族已有的研究表明，a t m g t 家族存在二种m 9 2 + 转运蛋白：高亲和性m 矿+ 转运蛋白和低亲和性m 9 2 + 转运蛋白。 1 5 2 1 高亲和性m 9 2 + 转运蛋白 高亲和性m 9 2 + 的转运是在低浓度范围内进行的，其主要依靠转运 体来完成。拟南芥a t m g t 家族中的a t m g t l 、a t m g t 2 和a t m g t i o 这三 个蛋白的氨基酸序列上都含有2 个疏水的跨膜区，并且第一个跨膜 区上都有保守基序g m n ( 图卜2 ) ，已鉴定属于高亲和性m 9 2 + 转运蛋白。 a t m g t l 功能互补细菌m r 转运突变体，定位于细胞质膜上，不仅能 转运m 9 2 + ，还能转运别的二价阳离子如：f e 2 + 、m n 2 + 、c u 2 + 、c 0 2 + 等。但 转运这些阳离子的浓度都超出了植物正常生长的生理浓度，因此该 基因的功能主要是进行m 9 2 + 转运。a t m g t 2 定位于线粒体内膜上，在 线粒体内膜上转运m 9 2 + ，参与呼吸作用啪30 a t m g t i o 功能互补酵母m 9 2 + 转运突变体，定位于质膜上嘲】。 知t 翻瞄瑚n 删越c l 嗣魁磁删：卫弱缮i 臻| 墨蠕雕嘲黜略m 搿蜀宙黝帕晴懈e 鳍咽瑚锵：拍瓣嬲吼瑚晴” ，- 锄黼x 一l 翻巴勰托时w c 豇啪站蕊k 口限范i 瑙：e 鞠踊墨比! c 强n ：汛： 胤s ： o 酩钾：盟自l _ ”n f 竹：嵋0 ：s t w 一 暑p 醵h 如戤期期蝴l 扣艄勰z 竞咻j 锩：瞳融昧嘎圪正孔n 0 托盘凹5 w s ：w 瞳嗡鸷- 瓣蛰薯 t ：馕3 i f 讯一 螂嘟 i = - 一吡l 职m 噼嗍0 啪泔暇i 瞩i 州静氮砒爵肿i 忾腰曩伪懿l 册瞳阿嘲稍粥删悲i 嗡w l 懈搠b 删 i t 躲rz 融删椒l l 椰吖v i c 贽咀l 住泪m 疆住翼i 】c 瀚衙弘田豫上 n 镩w i 静册c i 册e ：0 册：罾搿r 予嚣一瓯w 姒 1 鹫竹曩强烈：鼬_ 鲥 强铷壕l t 钍甜：o 喇饼i 麓：镰湘嘞泓她妣朋m 址咖m 期曙：d h 黜聊l ：i ，弘口v ：羁 - 址翳髓m 蕊：啦地盥 伽骶l 娠l s 纵n 潮骰腻蝴r 酣撕m l 潮哪l 腿脚卞髑珊口miz ：瓶m 勰默ll 獭巴舭口砒埘耽工懿啉埘m 册m m 帆黜湖l 渊讹卅吼懈心工 眦糯z ? ：搿勰瓣辣r 3 州：嚣。s i 懈 船晰，- 嚣d ：懈i 幽朋躲夥豫臻：l 豫崩：菇仡枷就滩蹦乱z 耽燃l 啪嚣 m g 坩 糍愀p ：口聃0 搏一- d l 阳州锄! ：c i v ”埘一 l t 晦l 蹰w 强屯l u 即烈静棵1 l ? 竹盯i r e ，期虹嫩怒扎：湖m 。? i 坫r a ：u p 啊z j 篁柏毗鹭扎y 嚣舡一加了弼s 开 【c r v l p 孵 肛焉订t 田翻引棚耵r 瓣懈讥认盯i 职歌玎l 髓娴瑚。l i 口量苫：跚s 舒| c i 悍胜x l 托t 聊泔m ：般昏一w p i w w 0 ：燃r v l m j i 暾日：- 酬v n 忱匮“嘲阳盯弧懈i 髓t ；i 豫豫粥拼q 喁甄f 。l 硼曙“【豫i c v 蚤n s 1 m 磁嘲z p 即猎瑾i - 麓”埘诌柙c i 竹。 髓禹订i - - 昏n u 臣【跏嘲j 啊t 椰0 t 。玎| l g t i d d 他硎r h i 讧翔职聊0 【o 镰：一诗孵v c l 一澍_ j f 袁v 瓤；：，既吖n 煳硼靠m 翟0 0 r f a 1 矾玎 峨订ol 瑟娃n l 叠出嘲乜：；c i 践i 羽山岱 珏瞳笛埘随蕊娃啦啦晦谢剞计阳f v g l j 加碍- 瞄t 让i 卜一赫轴t m z l t 6 ：壤吼 图l - 2 ：a t m g t 家族的跨膜区分析 1 5 2 2 低亲和性m g “转运蛋白 低亲和性m 9 2 + 转运是在外界m 矿浓度为m m 级进行转运，且在生 理浓度范围内不会达到饱和。现已从a t m g t 基因家族中鉴定出第一 个低亲和性m 9 2 + 转运蛋白- a t m g t 7 呦1 。通过m m 2 8 1 功能互补发现 硕士学位论文 a t m g t 7 转运m 9 2 + 的能力受到p h 值的影响瞳0 1 。本研究的对象a t m g t 3 亦属于低亲和性m 9 2 + 转运蛋白。 1 5 3 m 9 2 + 转运基因家族的生理功能 多个转运蛋白基因与m 9 2 + 转运有关，它们可能在植物细胞不同的 膜上起作用。除了质膜外，细胞中还有很多其它细胞器膜，如线粒 体膜、叶绿体膜、液泡膜、高尔基体膜等。已知a t m g t i 、a t m g t 7 和 a t m g t l o 定位在质膜上，a t m g t 2 定位在线粒体内膜上，a t 姗x 在液 泡膜上介导m 9 2 + 的转运；其它的m 9 2 + 转运蛋白基因也有可能在其它细 胞器膜上发挥。然而，即使某些基因定位在相同的膜上，它们也可 能在植物的不同组织中，或者相同组织的不同发育时期起到m 9 2 + 转运 功能。以上还只是m 矿+ 转运机制的初步研究。m 9 2 + 转运基因家族的转 运机制，以及在植物体内的生物学功能，尚需更进一步的研究。 1 6 本文的研究目的及意义 本研究以a t m g t 3 基因为研究对象，目的在于鉴定a t m g t 3 蛋白 的转运特性，进而分析a t m g t 3 的蛋白结构与转运以及转运亲和性的 高低之间的关系，探讨a t m g t 3 在植物的生长发育过程中的生理功能， 为进一步的揭示m 9 2 + 转运机制打下基础。 植物中m 9 2 + 的动态平衡对于植物的生长发育有着重要的作用， 其对液泡离子通道以及光和作用都有重要的影响，并且调控叶绿体 r n a 的稳定性。但目前而言，对介导这种m 9 2 + 的动态平衡的分子机制 了解甚少。m f + 通过哪种转运蛋白进入根共质体，从木质部装载，在 韧皮部卸载，转运出液泡，通过别的组织膜进入或转出；植物在缺 镁胁迫下如何引发内部的调控机制去适应这种逆境，目前都尚未清 楚。m 9 2 + 具有独特的化学特性，而且对植物的生长发育具有重要的作 用，但是至今，对其转运机制的研究还只是冰山一角。因此通过对 模式植物拟南芥中的m 9 2 + 转运基因家族成员a t m g t 3 的研究来探索植 物中m 9 2 + 的转运机制，具有重要的理论和实践意义。 拟南芥m 矿+ 转运基因家族中a t m g t 3 基因的功能研究 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 主要实验仪器 p c r 仪( e p p e n d o r f 、m jp t c - 1 0 0 、b i o m e t r at 1 ) 、移液器 ( e p p e n d o r f ) 、冷冻离心机( e p p e n d o r f ) 、微型离心机( e p p e n d o r f ) 、 凝胶成像系统( k o d a kg e ll o g i c l 0 0 ) 、生化培养箱d t y 一2 5 0 ( 北京 德天佑科技有限公司) 、制冰机( s a n y os i m - f 1 2 4 ) 、全温振荡器( 东 联电子技术开发有限公司) 、d y y - i i 型电泳仪( 北京六一仪器厂) 、 超净工作台( a i rt e c h ) 、细胞电穿孔仪( b t xe c m 6 3 0 ) 电子天平 ( m e t t l e rt o l e d oa b 2 0 4 - n ) 、p h 计( m e t t l e rt o l e d o3 2 0 一s ) 、全 自动高温灭菌锅( h i r “枷a ) 、恒温循环器( 北京博医康技术公司) 、 超低温冰箱( t h e r m of o r m ) 。 2 1 2 缓冲液和培养基 5 0 xt a e ： 2 4 2 9t r i s 碱 5 7 1 m l 冰乙酸 l o o m l0 5 me d t a ( p h 8 0 ) 加去离子水至1 0 0 0 m l d n ae x t r a c ti o nb u f f e r ： 0 2 mt r is h c i ( p h 9 0 ) 2 5 i n me d t a 1 s d s o 8 ml i c i l b 培养基： 胰化蛋白胨l o g 氯化钠l o g 酵母提取物5 9 加去离子水至总体积为1 0 0 0m l ，调p h 值至7 0 。 9 硕士学位论文 o 5x m s ：参考植物生理学实验指导妇 取a 、b _ c 、d 储液 加1 蔗糖 用k o h 调p h5 7 加1 b a c t oa g a r 并灭菌 农杆菌渗透培养基： o 5 m s 5 0 9 蔗糖 l o l l6 - b a p ( 终浓度l oug m e ) l m lg a m b o r g sv i t a m i n s ( 终浓度1 ) 2 5 0 儿l 7 7s i l w e t 1 0 0 0x g a m b o r g sv i t a m i n s ： 肌醇l o o m g m l 烟酸1 o m g m l 盐酸吡哆醛( b 6 ) 1 o m g m l 盐酸硫胺素( b 1 ) 1 0 o m g m l 2 1 3 菌株和质粒 t y p h i m u r i u m 突变株m m 2 8 1 m m 2 8 1 ：一种沙门氏杆菌突变株，丧失c o r a 、m g t a 、m g t bm 9 2 + 转运系统，因此不能转运m 9 2 + ，只能生长在m 9 2 + 浓度在l o m m 以上的 n - m i n i m a lm e d i u m 上，远高于植物细胞对环境中可利用的m 9 2 + 浓度 因此可利用此突变系统通过功能互补来进行m 9 2 + 转运基因的功能研 究。 大肠杆菌ec o l id h 5 a 、p t r c 9 9 a 、p m d l - g f p 、p b l l 2 1 、p b i1 0 1 1 均为本实验室保存；p m d l 8 - tv e c t o r 购自t a k a r a 公司。 本实验所用载体特征介绍如下： p m d l 8 一tv e c t o r ：该载体是线状d n a ，大小为2 7 k b ，是一种高 效克隆p c r 产物( t ac l o n i n g ) 的专用载体。它由p u c l 8 载体改建 而成，在多克隆位点处的x b a i 和, c a l l 识别位点之间插入胡y 识 别位点，用& o 詹v 进行酶切反应后，再在两侧的3 端添加“t 而 拟南芥m 9 2 + 转运基因家族中a t m g t 3 基因的功能研究 成。可插入p c r 产物，插入位点两侧有常用限制性内切酶位点和t 7 、 s p 6r n a 聚合酶转录起始位点，可对插入序列进行正反向测序，此载 体具有a m p 抗性基因。 p t r c 9 9 a - 原核生物表达载体，大小为4 1 7 6 b p ，含有t r c 启动子， 1 1 个多克隆位点，原核表达时需要1 - s m mi p t g 诱导，具有筛选标记 a m p 抗性基因。 p m d l - g f p ：双元载体，具有3 5 sc a m v 启动子，x b ai 和b a m l l l 两个酶切克隆位点，酶切位点后紧跟g f p 的融合基因，能应用于农 杆菌转化植物进行亚细胞定位，具有筛选标记k a n 抗性基因。 p b l l 2 1 ：有3 5 s 启动子，含有x b ai 、b a m h i 和s m ai 三个克隆 位点，酶切位点后具有g u s 融合基因，”应用于农杆菌转化植物进行 过表达分析，具有筛选标记k a n 抗性基因。 p b i l 0 1 ：此载体多克隆位点有6 种常见的内切酶序列：胁口r i i i 、 p s ti 、s a li 、x b ai 、b a m l - i i 、s m ai ，在多克隆位点后面有一段 g u s 序列。此载体在多克隆位点前不含启动子序列，并含有k a n 抗性 基因，可以作为载体用于分析启动子等。 2 1 4 酶类和试剂盒 r t a qd n a 聚合酶( a m b i o g e n 公司) 、r n a 提取试剂盒( a m b i o g e n ) 、 质粒提取试剂盒( a m b i