生物染色技术.doc

生 物 染 色一、为什么要对生物样品进行染色？ 由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等清元素组成，这些元素对光线的折射率比较低，而且它们的原子序数较低，散射电子的能力也较弱，。因此，必须进行染色来增强样品反差。任何能够选择性地增加某些部位质量的物质，均可作为染色剂。显微技术中主要是利用生物染色剂，使细胞或组织的某些成分或某些部位着上色，产生不同的折射率，因而提高反差，使这些部位能够看得清，易于与部位相区别。电镜样品则用重金属盐类进行染色，是由原子序数较大的离子组成，具有较强的电子散射能力，如铀、铅、锇、钨等重金属盐类。经重金属化合物浸染后，不同的结构成分将吸附不同数量的重金属原子。结合重金属多的区域，具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现致密的黑色；结合重金属少的区域，电子散射能力较弱，电镜观察时颜色较浅；没有结合重金属的区域，是电子透明区域。二、生物染色剂显微技术中所用的染色剂，又称生物染料，结构千变万化。1生物染色剂的结构作为染色剂必须具备两个条件：一是具有颜色；二是要与被染组织间有亲和力。染料的颜色和它与组织间的亲和力是由染料本身的分子结构决定的，所以显微技术所用的染色剂不论结构怎样变化，都含有两类基本基团：发色基团；助色基团。产生颜色的发色基团和与组织间产生亲和力的助色基团共同决定了染色剂的染色性质。发色基团的作用是使染料产生颜色，因为它们能够吸收一定波长的光线。如：硝基(-NO2)、偶氮基(-N=N-)、乙烯基（=C=C=）、羰基（=C=O）、亚硝基（N=O）等形成了发色基团；有的染料只有一个发色基团，但有的染料不只一个发色基团，它的颜色就比较深。助色团的作用是使染料与组织产生亲和力，使染料能够牢固地结合在组织上。产生亲和力的原因是由于这些基团的存在，染料在溶液中能够电离，使染料带有正负电荷，因而能与组织中带有相反电荷的部分相结合。如：酸性基团：羟基（OH）、磺酸基（SO3H）、羧基（COOH）等碱性基团：氨基（NH2）、甲氨基（NHCH3）、二甲氨基（N(CH3)2）等没有助色基团的有色物质不能算做染料。如硝基是一种发色基团，当苯环中的3个氢原子被3个硝基取代后就成为三硝基苯的黄色化合物。三硝基苯不是染料，仅有一个发色基团，它不溶解于水，也不能电离，不能与酸或碱形成盐类。如果三硝基苯分子中，用羟基再置换一个氢原子，就成为三硝基苯酚，即苦味酸，它即是一种黄色染料，有电离作用，与强碱能形成盐，这里的羟基便是助色基团。由此可知，苦味酸的颜色是由发色基团(硝基)所致，而它的染色性能则是由助色基团(羟基)形成的，如用氨基代替硝基，就形成无色化合物，不是染料。由此可见，作为染料，必须有发色基团和助色基团相互配合，缺一不可。三、生物染色剂的分类1按照来源的不同，分为人工染料和天然染料生物染色剂都是有机化合物。人工染料：从苯胺或煤焦油中提炼出来的；或者是人工合成的。如：龙胆紫、伊红、固绿等天然染料：从动植物体中提炼出来的。如：洋红：从胭脂虫的雌虫身体提取出来的；番红：从番红花中提取出来的；苏木精：从豆科植物苏木中提取出来的（用乙醚）。2酸性染料和碱性染料我们把助色基团中具有酸性或碱性基团的染料分别称为酸性或碱性染色剂。高中生物学课本在描述染色质时指出：染色质(体)容易被碱性染料染成深色。实验中对染色质(体)进行染色，须使用龙胆紫溶液或醋酸洋红溶液等碱性染色剂，这些染色剂是以龙胆紫或洋红溶解于醋酸溶液中制得，配制后的龙胆紫溶液pH值约小于7(呈酸性)。那么为什么把龙胆紫溶液称为碱性染色剂呢?实际上酸性染色剂、碱性染色剂的界定并非由染料溶液的pH值决定的，而是根据染料物质中助色基团电离后所带的电荷来决定。一般来说，助色基团带正电荷的染色剂为碱性染色剂，反之则为酸性染色剂。如伊红Y含有一个(-COOH)助色基团，在水中电离时放出氢离子，本身带负电荷。配制成伊红Y染料时，与强碱NaOH作用生成盐(-COONa)，此物质的Na+反而在溶液中呈碱性，所以不能认为酸性染料在溶液中就是酸性。 酸性染色剂由于助色基团电离后带有负电荷，所以能够与组织或细胞中带有正电荷的结构相结合，如细胞质中的多数蛋白质、纤维素等。上述伊红就是酸性染料，它是红墨水的主要成分，因此能与纸张中的纤维牢固结合。再如固绿也是酸性染料，所以常用来染细胞质。碱性染色剂的助色基团电离后带有正电荷，所以能够与组织或细胞中带有负电荷的结构相结合，如细胞核中的染色质、木质部等。如苏木精、龙胆紫、番红、醋酸洋红等都是碱性染色剂。地衣红地衣红待遇带有三个甲基，电离后本身带正电荷，所以能够与核酸中的磷酸基团相结合。3溶液pH值对染料性质的影响洋红的等电点pI在40745之间，在pHpI的冰醋酸溶液中染料分子带正电荷，表现出碱性染料的特征，所以用来染细胞核和核酸。4媒染剂和促染剂媒染剂：一些既能与染色剂结合，又能与组织细胞结合的化学物质，如铁盐、铝盐、明矾等。媒染剂的作用主要有两个方面：促进媒染剂与组织细胞相结合；生成有色沉淀，增强染色效果，如使用醋酸洋红就需要加铁。促染剂：本身不参加染色反应，但能够促进染料同组织细胞结合的化学物质，如硼砂、石炭酸等。比如核酸染料吡罗红配制中就可以加少量的石炭酸。四、中学常用的生物染色剂1洋红：用非洲同翅目昆虫胭脂虫雌虫提取出来的。在溶液pH=pI 40745时不溶，只有低于或高于pI时才溶。所以经常用45%的冰醋酸、氨水做溶剂，或者在溶液中加入镁盐、锂盐、硼砂等物质。洋红单独使用时与组织无亲和力，常要加入铵矾、FeCl3、Fe(OH)2等作媒染剂。铁离子最常用。实际使用时可以将醋酸洋红滴在载玻片的标本上，用解剖针在醋酸洋红中搅一搅就足够了。醋酸洋红的配制：用45%冰醋酸做溶剂，配成洋红的饱和溶液，酒精灯加热至沸腾，煮20分钟，冷却后滤纸过滤，棕色瓶保存。醋酸洋红的使用技巧：染色过程中可以微微加热，目的是促使细胞膨胀，增强着色。染色时间一般1520分钟。染后用自来水滴稍洗一下。2龙胆紫：是混有甲基紫的结晶紫晶体。含有三个二甲氨基，故是碱性染料：着色力很强，常用于染细胞核、纺锤丝、纤毛、纤维蛋白、神经胶质、中心体等。细菌革兰氏染色中也要用到它，着色后不能被酒精脱色的为革兰氏阳性细菌。龙胆紫溶液的配制：用2%冰醋酸做溶剂，配成025%的溶液，棕色瓶保存。市售的浓度多在1%，故要稀释，最好用2%冰醋酸稀释。龙胆紫溶液的使用：染色1020分钟。过染时可以用95%酒精褪色，要一滴一滴褪。每褪一次，立即用水冲掉，观察效果，如不够再重复上面步骤，切勿褪过头。3吡罗红-甲基绿：是吡罗红与甲基绿的混合染料。吡罗红又称哌洛宁，和甲基绿都是核酸的染料。但二者与核酸的亲和力，受核酸聚合程度影响。RNA因为细胞中RNA酶的作用会很快发生解聚作用。甲基绿与聚合程度高的DNA结合力较强，而吡罗红则与聚合程度低高的RNA结合力较强。但这并不是绝对的，与染料的浓度有关，一般甲基绿与吡罗红的浓度比要严格控制在12：10或3：7。改变浓度吡罗红和甲基绿都会使DNA、RNA全部着色。吡罗红-甲基绿溶液的配制：清除甲基绿中混杂的甲基紫：将35g甲基绿溶解于100ml蒸馏水中，装入分液漏斗中，再加入一倍左右的氯仿，充分摇动，然后提取1015分钟，使甲基紫溶解于氯仿中，放掉下层的氯仿。一般要重复45次，直至下层的氯仿无色。分别配制吡罗红溶液和甲基绿溶液：配方1配制01M醋酸盐缓冲液：01M醋酸40ml + 01M醋酸钠60ml01M醋酸：06ml醋酸+100ml蒸馏水01M醋酸钠：136g醋酸钠 + 100ml蒸馏水配制质量分数为2%的甲基绿水溶液配制质量分数为5%的吡罗红水溶液用前临时取：2%甲基绿水溶液6ml + 5%吡罗红水溶液 + 01M醋酸盐缓冲液16ml + 蒸馏水16ml。冰箱保存可用一段时间。配方2甲液：石炭酸025g + 蒸馏水100ml + 甲基绿1g乙液：石炭酸025g + 蒸馏水100ml + 吡罗红1g用前临时取：3份甲液 + 7份乙液注意：甲基绿也要事先清除甲基紫。吡罗红-甲基绿溶液的使用：被染材料最好先用卡洛诺氏固定液固定1015分钟。染色时间为2030分钟，或者略多一点时间。结果是DNA呈绿色，RNA呈红色。4詹纳斯绿：超活体染料，即只能进行体外活体染色的染料，因为有毒害作用。是可以专一对线粒体进行染色的染料。其在氧化状态下呈蓝绿色，而在还原状态下呈无色。生活是线粒体由于细胞色素氧化酶的活动，可以使詹纳斯绿变为氧化状态，故呈蓝绿色。而远离线粒体的部位则是还原状态，故无色。当然这是相对的，浓度过高或染色时间过长，这些部位也会有色。詹纳斯绿的配制：配制生理盐水：人和哺乳动物是09g氯化钠 + 蒸馏水100ml，一般两爬类为085g氯化钠 + 蒸馏水100ml用生理盐水做溶剂配制质量分数为002%的詹纳斯溶