（分析化学专业论文）层层累积技术结合导电聚合物和纳米材料构建葡萄糖生物传感器.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：握亟蕊：e t 期：趔! ：兰：堡 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文和汇编本学位论文。 0 公开 口保密(年，解密后应遵守此规定) 论文作者签名：毯亟垫：导师签名：量；鲤垫：日期：咝，哆 1 2 生物传感器2 1 3 葡萄糖生物传感器一2 1 3 1 光学葡萄糖生物传感器2 1 3 2 电化学葡萄糖生物传感器3 1 4 导电聚合物4 1 4 1 导电聚合物的概述4 1 4 2 导电聚合物固定酶的特点一5 1 4 3 导电聚合物的分类一5 1 4 4 导电聚合物在生物传感器构建中的应用。6 1 4 5 导电聚合物在生物传感器构建中的应用展望7 1 5 层层累积技术7 1 6 纳米材料：7 1 6 1 纳米材料的性质一8 1 6 2 纳米材料在生物传感器中的应用8 1 7 本论文的研究思路9 第二章基于固定葡萄糖氧化酶到聚苯乙烯磺酸钠聚丙烯胺和金纳米粒子铅纳 米线上构建葡萄糖生物传感器1 1 2 1 实验部分1 l 2 1 1 实验试剂与仪器1 1 2 1 2 制备聚苯乙烯磺酸钠聚丙烯胺铂电极1 2 2 2 6 样品检测17 2 3 结论17 第三章基于层层累积聚吡咯- - 氧化钛纳米复合物和葡萄糖氧化酶辣根过氧化 物酶双酶构建葡萄糖生物传感器1 9 3 1 实验部分1 9 3 1 1 实验试剂和仪器1 9 3 1 2 ( 葡萄糖氧化酶辣根过氧化物酶聚吡咯- - 氧化钛) n 铂传感器制备 19 3 2 结果与讨论2 0 3 2 1 修饰电极的电化学性能。2 0 3 2 2 ( 葡萄糖氧化酶辣根过氧化物酶聚吡咯- - 氧化钛) n 铂传感器的优化 条件2 2 3 2 3 电流响应2 6 3 2 4 抗干扰能力的检测2 7 3 2 5 实际样品检测2 7 3 3 结论2 8 第四章基于层层累积聚苯胺聚邻氨基苯酚普鲁士蓝葡萄糖氧化酶构建葡萄 糖生物传感器。2 9 济南大学硕上学位论文 4 1 实验部分2 9 4 1 1 实验试剂与仪器。2 9 4 1 2 制备普鲁士蓝聚邻氨基苯酚聚苯胺葡萄糖氧化酶铂传感器2 9 4 2 结果和讨论3 0 4 2 1 修饰电极的电化学性能3 0 4 2 2 酶浓度优化3 3 4 2 3 电压优化3 3 4 2 4 温度优化3 4 4 2 5 缓冲液p h 优化。3 5 4 2 6 电流响应3 5 4 2 7 抗干扰能力的检测3 6 4 2 8 稳定性。3 7 4 3 结论3 7 第五章基于壳聚糖多壁碳纳米管和聚吡咯二氧化钛纳米复合物构建葡萄糖生 物传感器3 9 5 1 实验部分3 9 - 5 1 1 实验试剂与仪器3 9 5 1 2 制备葡萄糖氧化酶壳聚糖多壁碳纳米管聚吡咯二氧化钛铂传感器4 0 5 1 3 修饰电极的电化学性能4 0 5 2 结果与讨论4 1 5 2 1 优化实验4 l 5 2 2 电流响应4 2 5 2 3 稳定性4 3 5 2 4 实际样品检测4 3 5 3 结论4 4 i i i 层层累积技术结合导电聚合物和纳米材料构建葡萄糖生物传感器 第六章基于金纳米粒子多壁碳纳米管聚吡咯生物复合物构建电流型葡萄糖生 物传感器4 5 6 1 实验部分4 5 6 1 1 实验试剂与仪器4 5 6 1 2 制备多壁碳纳米管金纳米粒子聚吡咯铂电极4 6 6 1 3 酶电极的制备4 6 。6 2 结果与讨论 4 6 6 2 1 修饰电极的电化学性能4 6 6 2 2 电流响应4 7 6 2 3 抗干扰能力的检测5 0 6 2 4 稳定性5 1 6 2 5 实际样品检测5l 6 3 结论5 2 第七章结论与展望。5 2 7 1 结论5 3 7 2 展望5 3 参考文献5 5 翌| 谢6 3 附录6 5 i v 糖尿病是危害人类健康的严重疾病之一，并且以极快的速度增长。评估糖尿 病的客观指标是人体中血糖的含量，控制血糖浓度，关键在于严格限制糖尿病人 从食物中摄入过多的葡萄糖，因此，建立一种快速、高效、低成本的检测食品中 的葡萄糖的方法十分必要。导电聚合物因其电导率高、比表面积大和比重轻等特 点备受人们关注，而纳米材料具有大的比表面积和特殊的物理性质，二者均在生 物传感器领域有着广泛的应用。本文以导电聚合物和纳米材料作为增大电信号和 固定葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 的基质，通过层层累积技术( l a y e r - b y l a y e r ，l b l ) 和电聚合方法构建了检测葡萄糖的电化学生物传感器。并对这些 传感器进行了一系列性能的研究，如响应速度、检测线性范围、检测限、稳定性、 实际样品检测等。 本研究的内容主要包括以下几个部分： 1 基于聚丙烯胺( p o l y ( a u y l a m i n c ) ，p a a ) 聚苯乙烯磺酸钠( p o l y ( s o d i u r n 4 - s t y r e n e s u l f o n a t e ) ，p s s ) 和金纳米粒子( g o l dn a n o p a r t i c l e s ，g n p s ) 铅纳米线 ( p bn a n o w i r e s ，p 卧j 1 s ) 构建葡萄糖生物传感器。将聚丙烯胺和聚苯乙烯磺酸 钠交替沉积到电极表面后浸在金纳米粒子、铅纳米线、葡萄糖氧化酶复合物溶液 中。用此修饰后的电极为工作电极检测葡萄糖，并对该传感器的各项性能指标进 行了优化。该传感器的响应时间少于5 秒，检测线性范围在0 1 m m o l l 到 6 0 m m o l l ，四周之后其活性仍为原来的9 0 ，并且表现出良好的选择性。 2 构建基于层层累积技术和聚吡咯( p o l y p y r r o l e ，p p y ) - - 氧化钛( t i t a n i u m d i o x i d e ，t i 0 2 ) 纳米复合物双酶系统的葡萄糖生物传感器。聚吡咯- - 氧化钛纳 米复合物能够很好的增强传感器的电流信号，双酶系统可以进一步提高检测葡萄 糖的灵敏度。该传感器的响应时间在6 秒之内，线性范围o 0 4 m m o l l 到 4 2 m m o l l ，检测限为0 3 p , m o l l ，该传感器的重复性好，并能用于实际样品检测。 3 构建基于层层累积技术结合聚苯胺( p o l y a n i l i n e ，p a n i ) 聚邻氨基苯酚 ( p o l y ( o a m i n o p h e n 0 1 ) ，p o a p ) 普鲁士蓝( p r u s s i a nb l u e ，p b ) 的葡萄糖生物传 感器。聚苯胺和聚邻氨基苯酚结合后的导电性优于单一聚合物的导电性。优化了 该传感器的实验电压、温度、酶的负载量、酸度等条件，该传感器响应时间少于 v 层层累积技术结合导电聚合物和纳米材料构建葡萄糖生物传感器 6 秒，检测线性范围为0 2 5 m m o l l 到5 0 m m o l l ，最低检测限为o 0 0 5 m m o l l 。 此外，该传感器还显示出优越的抗干扰能力和稳定性。 4 构建基于壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 多壁碳纳米管( m u l t i w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ，m w c n t s ) 和聚吡咯二氧化钛纳米复合物的葡萄糖生物传感器。将 二氧化钛纳米复合物分散在聚吡咯溶液中，增大了聚吡咯的导电性。壳聚糖多 壁碳纳米管和聚吡咯- - 氧化钛纳米复合物不仅增加了电流响应，而且是葡萄糖 氧化酶良好的载体，可以很好的保留了葡萄糖氧化酶的活性。该传感器响应时间 少于5 秒，检测线性范围在6 2 x 1 0 6 m o l l 到1 o x l o 弓m o l l ，检测限为 3 5 x1 0 石m o l l 。该传感器已经成功运用到实际样品的检测。 5 构建了金纳米粒子多壁碳纳米管聚吡咯生物复合材料修饰电极的电流型 葡萄糖生物传感器。该传感器的线性范围为5 i t m o l l 到1 2 m m o l l 、最低检测限 为0 1 t m o l l 、检测0 0 5 m m o l l 葡萄糖的相对标准偏差( r e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n ，r s d ) 为4 8 ，1 0 天后该传感器的活性为原来的9 5 。该传感器对 葡萄糖的检测有好的灵敏度和选择性，并可用来对实际样品检测，例如果汁和茶 饮料。 关键词：层层累积技术；导电聚合物；纳米材料；葡萄糖生物传感器； v i a n ds p e c i f i cp h y s i c a lp r o p e r t i e s ，m e yw e r eb o t l lw i d e l yu s e do nt h ed e v e l o p m e n to f b i o l o g i c a ls e n s o r s t h i sp a p e rs e l e c t sd i f f e r e n tc o n d u c t i v ep o l y m e r sa n dc a r b o n n a n o t u b e st od e v e l o pd i f f e r e n te l e c t r o c h e m i c a lg l u c o s eb i o s e n s o r t h ep e r f o r m a n c e , o p t i m i z a t i o n , r e a ls a m p l e st e s to ft h ep r o p o s e db i o s e n s o rw a ss t u d i e d t h e p a p e rc o n s i s t st h ef o l l o w i n gp a r t s ： 1 an o v e lg l u c o s eb i o s e n s o rw a sd e v e l o p e d ，b a s e do nt h ei m m o b i l i z a t i o no f g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) 0 1 1ap te l e c t r o d e , w h i c hw a sm o d i f i e dw i t l lp o l y ( a l l y l a m i n e ) ( p a a ) p o l y ( s o d i u m4 - s t y r e n e s u l f o n a t e ) ( p s s ) a n dg o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) d e c o r a t e dp bn a n o w i r e s ( p b n w s ) p a aa n dp s sw e r ea l t e r n a t e l yd e p o s i t e do nt h e c l e a n e dp te l e c t r o d es u r f a c e ( p s s p a m p t ) t h ep s s p a a p te l e c t r o d ew a s a l t e r n a t e l y i m m e r s e di ng n p s p b n w sa n dg o dt oa s s e m b l ed i f f e r e n tl a y e r so f m u l t i l a y e rf i l m s t h ee f f e c to fp ha n dt e m p e r a t u r eo nt h es e n s i t i v i t yo ft h eb i o s e n s o rw a ss t u d i e di n d e t a i l u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h eb i o s e n s o rs h o w e dt h ed e t e c t i o nl i m i to f 0 0 5m m o l l , a n dt h er e s p o n s et i m e 5sw i t hal i n e a rr a n g eo f0 1 - 6 0m m o l l f u r t h e r m o r e ，t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y , l o n g - t e r ms t a b i l i t y ( 9 0 r e m a i n sa f t e r4 w e e k s ) a n d r e l a t i v eg o o da n t i - i n t e r f e r e n c e 2 ag l u c o s eb i o s e n s o rc o m p r i s i n gt h eg l u c o s eo x i d a s e ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h i 冲) s y s t e m sa n dp o l y p y r r o l e ( p p y ) t i t a n i u md i o x i d e ( t i 0 2 ) n a n o - c o m p o s i t e sh a s b e e ns u c c e s s f u l l yd e v e l o p e d t h ep p y t i 0 2n a n o - c o m p o s i t e sc a l li n c r e a s et h ec u r r e n t s i g n a l s ，t h eg o d h r ps y s t e m sc a ni m p r o v et h es e n s i t i v i t yo ft h eg l u c o s eb i o s e n s o r t h e r e s u l t i n gb i o s e n s o re x h i b i t e daf a s tr e s p o n s et i m e ( w i t h i n6s ) a n daw i d e rl i n e a r c a l i b r a t i o nr a n g ef r o m0 0 4t o4 2m m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 3 p m o l l v t i p o l y a n i l i n e ( p a r e ) w a sd e v e l o p e df o rm es p e c i f i cd e t e c t i o no fg l u c o s e p o a pf i l la t p bm o d i f i e dp l a t i n u me l e c t r o d e t h ec o n d u c t i n ga b i l i t yo fp o a p p a n iw a sb e t t e r t h a no n eo ft h e m sc o n d u c t i n ga b i l i t y t h ec o m p o n e n t si nt h en a n o c o m p o s i t ep r o v i d e a d e q u a t ee l e c t r o nt r a n s f e rp a t hb e t w e e ng o da n dt h ee l e c t r o d e e f f e c t so ft h e b i o s e n s o rr e s p o n s eo fp a r a m e t e r ss u c ha sw o r k i n gp o t e n t i a l ，p h ，t e m p e r a t u r e , a n d l o a d e d ，e n z y m ew e r ei n v e s t i g a t e da n dd i s c u s s e d t h er e s u l t i n gb i o s e n s o re x h i b i t e da f a s tr e s p o n s et i m e ( w i t h i n6s ) a n daw i d e rl i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g ef r o m0 2 5t o5 0 m m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 0 0 5m m o l lg l u c o s e ( s n = 3 ) a d d i t i o n a l l y , t h e b i o s e n s o rs h o w sg o o da n t i i n t e r f e r e n ta b i l i t y e x c e l l e n ta n ds t a b i l i t yo fb i o s e n s o ra r e a l s oo b s e r v e d 4 a g l u c o s e b i o s e n s o r c o m p r i s i n gc h i t o s a n ( c s ) m u l t i w a l l c a r b o n n a n o t u b e s ( m w n t s ) ，p p y 仍0 2a n dg o d - i m m o b i l i z e dw a ss u c c e s s f u l l yd e v e l o p e d 。u n i f o r md i s p e r s i o no ft i 0 2i i lp p ym a t r i xi m p r o v e dt h ep p y c o n d u c t i v i t ya n dl e a d e d t 01 1 i g hr a t ec a p a b i l i t yi nc s 瓜删叫p p y t i 0 2 e l e c t r o c h e m i c a lm e a s u r e m e n t sw e r e c o n d u c t e dt or e v e a lt h ee l e c t r o a c t i v i t yo ft h eg o do nt h em o d i f i e dp te l e c t r o d e t h e b i l a y e rc s m w n t sa n dp p 0 2s e r v e d8 1 8ag o o dc a r d e rf o rg o d a sw e l l 弱a c o n d u c t o r , e n h a n c i n gg r e a t l yt h er e s p o n s ec u r r e n t t h eg o d i m m o b i l i z e di nt h i sw a y r e t a i n e di t sb i o e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yf o rt h eo x i d a t i o no fg l u c o s e t h eb i o s e n s o r s h o w e dl i n e a rr e s p o n s et og l u c o s ef r o m6 2 xl0 r 6t o1 0 10 。m o l lw i t had e t e c t i o n l i m i to f3 5x10 6m o l l ( s n = 3 ) 1 1 1 ee f f e c to fp ha n da p p l i e dp o t e n t i a lo ft h e b i o s e n s o rw a ss t u d i e di nd e t a i l t h eb i o s e n s o re x h i b i t e df a s tr e s p o n s et i m e ( 5s ) a n d s t o r a g es t a b i l i t y ( 9 0 o fi n i t i a ls e n s i t i v i t ya f t e ro n em o n t hs t o r a g e ) f i n a l l y , t h e p r o p o s e ds e n s o rw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e da n dc h e c k e di nt h eg l u c o s ed e t e r m i n a t i o ni n v i i i f a b r i c a t eag l u c o s eb i o s e n s o r t h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s e sw e r ec o r r e l a t e dl i n e a r l y w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s eo v e rt h er a n g eo f5i t m o l l - 12m m o l la n dt h e d e t e c t i o nl i m i tw a s0 1 l x r n o l l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) f o rt h e d e t e r m i n a t i o no f0 0 5m m o l lg l u c o s ew a s4 8 i ts t i l lk e p t9 5 a c t i v i t ya f t e r10 d a y s t h i sb i o s e n s o re x h i b i t e dag o o da n t i i n t e r f e r e n t i a lq u a l i t ya n da ne x c e l l e n t s t a b i l i t y i th a sag r e a ti m p r o v e m e n ti ns e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yf o rg l u c o s ea n a l y s i s t h e p r o p o s e db i o s e n s o rw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n et h eg l u c o s ec o n t e n ti n r e a ls a m p l e ss u c ha sj u i c ea n dt e ad 矗1 1 1 【 k e yw o r d s ：l a y e r - b y - l a y e r ；c o n d u c t i n gp o l y m e r s ；n a n o m a t e r i a l s ；g l u c o s e b i o s e n s o r i x 率仅为3 3 3 和2 7 2 。评估糖尿病的客观指标是血液中葡萄糖的含量【l 】。人体 血液中葡萄糖浓度的正常范围为7 5 x 1 0 2 m g l 到1 0 x 1 0 3 m g l ，高于1 3 x 1 0 3 m g l 时为高血糖，低于5 0 x 1 0 2 m g l 时为低血糖。现代医学证明，饮食之后人体的血 糖会升高。如果糖尿病人不进行饮食控制，甚至过度食用含糖食品，就会使血糖 升得过高，并且会对本来就分泌不足的胰岛组织产生不利影响，使胰岛功能更加 减退，胰岛素的分泌更加减少，从而使病情进一步加重。控制血糖浓度的关键是 合理控制糖尿病人从食物中摄取过多的葡萄糖，因此食品中葡萄糖的准确测定具 有重要意义 2 1 。目前，国内外传统检测葡萄糖的方法一般为仪器法、化学法、传 感器法。 仪器法：酶离子色谱法、氧化酶偶联比色法、氧速率法、己糖激酶法( h k 法) 、高效液相色谱法、气相色谱同位素稀释质谱法、微创测定法、分光光度法 【3 1 、电流测定法【4 】、高效液相色谱法【5 1 、极谱法 6 1 及毛细管电泳法【7 1 等。此类方法 的优点是检测的灵敏度高、检测限低；缺点是仪器价格昂贵、检测时间长、样品 前处理复杂。 化学法：菲林滴定法、干湿化学法、邻甲苯胺法等。该类方法的操作简单， 但是其检测的准确度低。 传感器法：化学发光型葡萄糖传感器法、电流型葡萄糖生物传感器法、无创 检测皮下葡萄糖的新型生物传感器法、荧光纳米生物传感器法等。这种检测具有 方便、省时、选择性好等优点。 其中电流型葡萄糖生物传感器分为酶生物传感器和非酶生物传感器。酶生物 传感器是将信息科学、分析化学、物理化学和生物学结合起来研发的一种新型检 测技术，酶的固定化与载体的选择是确保生物传感器高灵敏度、高稳定性的关键 层层累积技术结合导电聚合物和纳米材料构建葡萄糖生物传感器 因素【引。酶生物传感器具有高选择性、高灵敏度等优点。因此，利用葡萄糖氧化 酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 构建葡萄糖生物传感器具有广阔的前景【9 1 。 1 2 生物传感器 生物传感器的研究始于2 0 世纪6 0 年代，它是指用固定化的生物活性组分如： 酶、抗原、抗体、细胞等作为敏感元件的装型1 0 1 。生物传感器一般由分子识别 元件、信号转换器及电子测量仪表组成，其中分子识别元件直接决定了生物传感 器的检测机制【1 1 】。生物传感器的检测原理是：利用信号转换装置，将待测物和传 感器敏感元件之间发生的化学变化转化为相应的电信号，同时利用检测设备和电 子技术处理手段，记录转化信号，检测未知物。 生物传感器内的分子识别元件的生物组分即为该生物传感系统内的生物活 性组分，根据生物活性组分的不同，生物传感器可以分为：酶传感器、组织传感 器、微生物传感器、免疫传感器、场效应晶体管生物传感器、光导纤维生物传感 器等【1 2 1 。根据对生物活性组分固定方法的不同，生物传感器可以分为三种：( 1 ) 是将生物活性组分包埋在基质膜里，然后将这层基质膜固定在传感器件上；( 2 ) 是将生物活性组分吸附在基质膜里，然后将这层基质膜固定在传感器件上；( 3 ) 是将生物活性组分直接键合在基质膜里，然后将这层基质膜固定在传感器件上。 随着科学技术的不断发展，新技术的不断涌现，葡萄糖生物传感器因其具有 高选择性、高灵敏度等优点，受到越来越多研究者的关注，在医学、生物工程、 食品工业、环境污染物检测等领域显示出十分广阔的应用前景【1 3 , 1 4 】。 1 3 葡萄糖生物传感器 葡萄糖生物传感器是生物传感器领域研究较多的类型之一，根据检测原理的 不同可分为光学葡萄糖生物传感器和电化学葡萄糖生物传感器两大类。 1 3 1 光学葡萄糖生物传感器 光学葡萄糖生物传感器是以光电技术为基础，利用化学变化产生的光学变化 来对葡萄糖进行检测。传统的糖尿病检测试纸就是一种光学葡萄糖生物传感器， 其原理是试纸里面的某种物质和血液中的葡萄糖发生反应生成一种有颜色的化 2 可直接被葡萄糖氧化酶催化，通过微分脉冲伏安法和循环伏安法可对电极表面的 电化学性能进行表征【1 7 1 。电化学葡萄糖生物传感器主要分为电位式葡萄糖生物 传感器和电流式葡萄糖生物传感器。 ( 1 ) 电位式葡萄糖传感器是利用化学反应所引起的电位信号的变化来对葡 萄糖进行检测。该传感器所用的电极是p n 电极和气敏电极，其中电极决定着传 感器的灵敏度、响应时间、检测限等许多性能【1 引。电位式葡萄糖传感器的电位 变化信号与被测物浓度对数相关，当被测物浓度变化达到四个数量级时，电位式 葡萄糖传感器的效果较好，但在体液中葡萄糖浓度变化不超过一个数量级，因而 该传感器不适合生物样品的检测。 ( 2 ) 电流式葡萄糖传感器是利用化学反应所引起的电流信号的变化来对葡萄 糖进行检测。该葡萄糖生物传感器使用的是过氧化氢电极和氧电极，它主要通过 相应的氧化还原反应在电极上产生电流，最终获得电流变化与被测物溶液浓度之 间的线性关系，从而检测出被测物的浓度。电流式葡萄糖传感器的酶氧化还原活 性中心与电极接近，能够相对容易地进行直接电子传递，使传感器的响应速度更 快、灵敏度更高，真正实现酶的专一性和高效催化性。因此，电流型葡萄糖传感 器的研究越来越受到研究学者们的重视【1 9 1 。 此外，根据是否利用葡萄糖氧化酶构建葡萄糖生物传感器，可以将葡萄糖生 物传感器分为有酶葡萄糖生物传感器和无酶葡萄糖生物传感器。本文以下所述的 葡萄糖生物传感器即为利用葡萄糖氧化酶构建的葡萄糖生物传感器。该传感器是 将葡萄糖氧化酶固定在电极上作为分子识别元件，其中葡萄糖氧化酶对p d 葡 萄糖具有高度专一的催化氧化作用【1 9 1 ，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生葡萄糖酸 3 层层累积技术结合导电聚含物和纳米材料构建葡萄糖生物传感器 内酯和过氧化氢，见式( 1 1 ) 。实际上葡萄糖氧化酶进行催化作用的过程中，辅 酶起到电子中间体的作用，即辅酶通过它的氧化态和还原态的不断循环而实现葡 萄糖检测。葡萄糖氧化酶的主要来源为黑曲霉菌和灰绿霉菌。葡萄糖氧化酶的结 构包括5 8 0 个氨基酸残基、黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子、n 乙酰氨基葡萄糖残 基、3 个甘露糖残基、1 5 2 个溶剂分子。它的催化特性具有以下特点：( 1 ) 催化 效率高；( 2 ) 催化作用专一性强；( 3 ) 催化反应条件温和( 通常在常温、常压、 近中性的条件下即能进行反应) 。 葡萄糖+ 0 2塑葡萄糖酸内酯+ 2 h 2 0 2 式( 1 1 ) 在葡萄糖生物传感器的构建中，关键技术之一就是将葡萄糖氧化酶固定到传 感器的表面。目前常用的葡萄糖氧化酶的固定方法有： ( 1 ) 包埋法：将葡萄糖氧化酶、导电材料、粘结剂混合均匀，形成导电复 合材料修饰到电极表面，与相应的检测装置连接。包埋法中使用的膜材料较多， 如凝胶膜、溶胶凝胶膜和各种电聚合膜等【2 0 】。 ( 2 ) 交联法：利用葡萄糖氧化酶与试剂的多官能团发生的交联反应，生成 不溶于水的二维交联网状结构的聚集体后修饰到电极表面的方法【2 1 1 。常用的交 联剂是戊二醛。戊二醛是一种最好的蛋白质交联剂，易溶于水、乙醇等，与有活 波氧的化合物和含氮的化合物反应。这种交联法的缺点是p h 、温度和离子强度 需要控制，同时还要研究戊二醛浓度对于传感器性能的影响。 ( 3 ) 吸附法：通过吸附力将葡萄糖氧化酶固定在传感器上，这是一种较为 温和的酶固定方法，能有效地保留酶活性。但是该方法的酶负载量较低，此外， 由于吸附过程一般是可逆的，吸附的酶能轻易脱落，这会对检测结果的准确度产 生影响，造成传感器的操作不便和储存稳定性差，不容易满足实用要求【2 2 1 。 此外，采用电聚合法制备导电聚合物用于葡萄糖氧化酶的固定将是葡萄糖生 物传感器发展的重要方向之一。 1 4 导电聚合物 1 4 1 导电聚合物的概述 2 0 世纪8 0 年代，研究者打破了有机聚合物都是绝缘体的传统观念，开创了研 4 能隙并且其反键轨道上基本没有电子转移口7 1 ，因此其电导率比较低。1 9 8 6 年， f o u l d s 和l o w e 首次将葡萄糖氧化酶包埋固定于聚吡咯( p o l y p y r r o l e ，p p y ) 中， 构建了酶传感器，揭开了导电聚合物构建生物传感器的序幕【2 8 , 2 9 1 。随后，许多学 者相继将不同的酶、抗体、d n a 、甚至细胞和组织等生物活性物质固定于不同 的导电聚合物中，形成各种新型的生物传感器。 1 4 2 导电聚合物固定酶的特点 导电聚合物固定酶具有以下特点：( 1 ) 可以将酶包埋在导电聚合物膜内，导 电聚合物上包埋的酶量易于控制，并且导电聚合物上修饰酶膜厚度均一，与电极 表面的粘附力强；( 2 ) 导电聚合物膜有选择性透过某些物质的功能，采用导电聚 合物固定酶可以提高传感器的抗干扰能力；( 3 ) 方法简单，导电聚合物合成和酶 的固定化可以一步完成；( 4 ) 导电聚合物具有极好的导电性和放大电信号的能力， 导电聚合物固定酶可以提高传感器的灵敏度【3 0 】。 1 4 3 导电聚合物的分类 导电聚合物可分为离子型、结构型和复合型三种【3 1 】：( 1 ) 离子型导电聚合 物，它因加入的盐离子在电场下发生电子迁移而具有导电功能，一般它是把高氯 酸钾等碱金属盐溶于聚环氧乙烷或其衍生物而制得的；( 2 ) 结构型导电聚合物， 是指利用电解聚合法合成并经过一定的掺杂处理而使其具有导电功能的聚合物 f 3 2 】；( 3 ) 复合型导电聚合物，是将各种导电性物质如银、铜等以不同的方法填 充到聚合物基体中而构成的导电聚合物。几乎所有的聚合物都可制成复合型导电 聚合物【3 3 1 。 5 病人的葡萄糖浓度。 ( 2 ) 胆碱传感器 s h i 等【3 5 】用胆碱氧化酶作为聚合材料和聚乙烯亚胺、聚二甲基二烯丙基氯化 铵建立多层膜涂层电极。胆碱氧化酶传感器的特点是用电化学方法进行测量。用 石英晶体微天平监测多层沉积膜。该胆碱氧化酶聚乙烯亚胺膜传感器有高的电 流响应、广泛的动态范围、快的响应时间、简单的制备工艺，因此，此类导电材 料适合构建胆碱传感器。 ( 3 ) 乳酸生物传感器 r a h m a n 等【3 6 1 构建了基于乳酸脱氢酶尼古丁酰胺酶固定在导电聚合物多壁 碳纳米管( m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ，m w c n t s ) 复合物膜的传感器，并用 电化学实验和石英晶体微天平来测定修饰电极的特性。导电聚合物多壁碳纳米 管被组装到电极表面，可以放大信号。实验优化了电压、温度等实验参数，同时 研究了传感器的检测性能，结果表明用导电聚合物多壁碳纳米管复合膜构建的 传感器，灵敏度、稳定性、重现性得到了大大提高。 ( 4 ) 胆固醇生物传感器 t u r k a r s l a n 等【3 7 】将胆固醇氧化酶包埋在聚3 , 4 乙烯二氧吡咯中构建电流型胆 固醇生物传感器。并且研究了该传感器的各项性能指标，得出该传感器的灵敏度 为1 0 i _ t a m m o l l c m 2 ，检出限为0 4 m m o l l ，2 0 天后该生物传感器的活性为原来 活性的9 0 。 ( 5 ) 胆红素生物传感器 r a h m a n a 等【38 】将m n 2 + 络合在抗坏血酸氧化酶和聚乙烯亚胺薄膜上来构建胆 6 步提高导电聚合物的性能，增强导电聚合物生物传感器的稳定性、重复性等，揭 示导电聚合物与生物分子间的电荷传递机理，发展可批量生产生物传感器的技术 4 2 , 4 3 】 o 1 5 层层累积技术 层层累积技术是通过在电极表面交替吸附不同物质而形成完整致密的自组 装复合薄膜的技术，1 9 9 1 年d e c h e r 等人提出了由带相反电荷的聚电解质在液 固界面通过静电作用层层累积( l a y e r - b y - l a y e r ，l b l ) 沉积形成多层膜的新技 术1 。层层累积制备技术简单通用，不需要复杂昂贵的仪器，成膜物质丰富， 产物有序性高。层层累积技术主要借助于静电力的相互作用，将带有相反电荷的 物质和纳米粒子交替吸附，一层一层地自组装起来。在组装过程中，具有正负电 荷对的聚电解质的使用较为广泛，因为这些具有正负电荷对的聚电解质有非常多 的结合位点，可以在很大程度上提高纳米材料层层修饰的效果。通常，层层累积 技术采用的阴离子型聚电解质有：聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及 聚乙烯磺酸盐等；阳离子型聚电解质一般有聚乙烯亚胺、聚二甲基二烯丙基氯化 铵、聚丙烯胺( p o l y ( a l l y l a m i n e ) ，p a a ) 等【删。 总之，层层累积过程的结合力主要包括共价键、配位键、电荷转移、氢键和 静电引力等形式的作用力，作用力的不同导致产物的形貌和结构产生了较明显的 变化【4 5 1 。 1 6 纳米材料 7 小尺寸效应。根据这一特点