金黄色葡萄球菌耐药性研究进展.ppt

葡萄球菌耐药性研究进展及药敏试验的临床应用,安徽省立医院检验科马筱玲,概述,金黄色葡萄球菌在自然界广泛分布金黄色葡萄球菌是医院感染重要的致病菌对环境抵抗力强，容易产生耐药性,金葡菌主要耐药类型和耐药机制,耐青霉素金黄色葡萄球菌：产生内酰胺酶，水解青霉素中有效基团。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：获得Mec基因，编码产生PBP2a，亲和力降低耐万古霉素金黄色葡萄球菌：获得耐药基因，细胞壁增厚对大环内酯类抗生素耐药：泵出机制，靶位改变,MRSA主要研究进展,MRSA临床实验室检测方法SCCmec基因盒研究社区获得性MRSA,MRSA的耐药机制,在甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）中含有5种与内酰胺类抗生素亲和力高的青霉素结合蛋白(PBP)，总称为PBPs，具有羧肽酶或转肽酶作用，主要参与细胞壁粘肽层的合成。使用内酰胺类抗生素时，药物可与PBPs结合，使其功能被抑制，使细胞壁合成受阻，导致细菌因不能抵抗外界的渗透压力而死亡。,MRSA的耐药机制,MSSAmecA基因MRSAmecA能编码合成一种新的青霉素结合蛋白2(PBP2)PBP2能执行PBPs的生理功能，但与内酰胺类抗生素的亲和力低，当有内酰胺类抗生素存在时，正常的PBPs与之结合，功能被抑制，而PBP2不与其结合，则可替代PBPs发挥作用，使细菌能够正常生长，产生耐药性。mecA或PBP2a阴性的甲氧西林/苯唑西林耐药葡萄球菌是罕见的,MRSA检测方法,基因水平：mecA基因PCR扩增法蛋白水平：PBP2a蛋白胶乳凝聚法表型水平：琼脂筛选法苯唑西林纸片扩散法头孢西丁纸片扩散法稀释法,耐甲氧西林葡萄球菌的检测,4%NaCl-6ug/ml苯唑西林盐平板筛选法培养条件：35，24-48小时结果：1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株苯唑西林纸片法：1ug/片金葡菌11-12mm凝固酶阴性葡萄球菌17mm头孢西丁纸片：30ug/片金葡菌、路邓21mm（2007CLSI)凝固酶阴性葡萄球菌24mm,葡萄球菌属-2007,头孢西丁纸片扩散法：修改了对金葡菌和路登葡萄球菌的“S”折点缩短金葡菌的孵育时间到18小时增加注释某些菌株可能甲氧西林耐药而头孢西丁敏感,56,检测葡萄球菌中mecA介导的耐药头孢西丁纸片法折点,*报告甲氧西林耐药*报告甲氧西林敏感,57,头孢西丁纸片检测葡萄球菌中mecA介导的耐药的孵育*,*33-35C反射光读结果,58,某些菌株的检测可能甲氧西林耐药和头孢西丁敏感,a甲氧西林耐药机制除了mecA介导的耐药外，其他罕见M100-S17中新的陈述-“这些分离菌头孢西丁纸片扩散法检测可能敏感”。,CLSIM100-S17Table2C(M2-DD,M7-MIC),葡萄球菌属中甲氧西林耐药的检测,59,为什么头孢西丁优于苯唑西林?,头孢西丁存在时mecA基因以更高水平表达,45,敏感性/特异性TestsformecA-mediatedResistantS.aureus,Sensitivity:OXMIC=OXDD=CXDD=PBP2a=mecA*99%98%98%100%Specificity:OXMIC=OXDD=CXDD=PBP2a=mecA100%99%100%100%,courtesyofSwensonandTenover,*mecA=goldstandard,47,Sensitivity/SpecificityTestsformecA-mediatedResistantCoNS,Sensitivity:OXMIC=OXDD=CXDD=PBP2a=mecA*99%99%98%100%Specificity:OXMIC=OXDDCXDD=PBP2amecA*61%67%96%94%*,*mecA=goldstandard*allerrorsS.warneri,courtesyofSwensonandTenover,48,头孢西丁检测MRS,头孢西丁纸片法是.首选用于检测mecA介导的耐药作为苯唑西林的“替代物”(reportoxacillinNOTcefoxitin)对S.lugdunensis只用头孢西丁(不用oxacillindisk)金葡菌：与苯唑西林纸片扩散法相当凝固酶阴性葡萄球菌：较苯唑西林纸片扩散法好,MRSASCCmec基因盒研究,MRSA呈多重耐药,MRSA耐药特征及机制,PBP2a仅与内酰胺类抗生素亲和力降低，为何对其他非内酰胺类抗生素呈交叉耐药？,mec基因的结构,mec基因盒的J区有吸引和整合外来基因的功能，mec基因与其整合的基因以基因复合体的形式存在，这个基因复合体叫做“葡萄球菌染色体mec基因盒”（staphylocossalcassettechromosomemec,SCCmec）SCCmec不是MRSA菌株所固有的，而是一个外来的可移动的插入片段。,mec基因的结构,SCCmec基因盒包括两种基因复合体基因复合体染色体盒重组基因复合体(ccr),MRSA基因分型及其意义,mec复合体组成：mecA、调节基因（mec1）和抑制基因(mec)mecA是耐药性表达的结构基础mecI编码的抑制因子(mecI蛋白)mecR1基因在诱导剂(如内酰胺类抗生素)的作用下编码产生诱导因子(mecR1蛋白)，能够去除mecI蛋白对mecA的阻遏作用，使mecA转录产生PBP2,MRSA基因分型及其意义,在MRSA的mec基因复合体中mecR1和mecI可同时存在，也可仅有mecR1存在，而mecI缺失。根据mec基因复合体结构，可分为A和B型A型：IS431mecAmecR1mecIB型：IS431mecAmecR1IS1272,A型及B型mec基因复合体,MRSA基因分型及其意义,在mec基因复合体中，IS431的存在有吸引其他耐药基因的功能,使之整合到SCCmec中，因此MRSA不但对内酰胺类抗生素耐药，对其他抗生素也存在抗药性,I431插入子是染色体内多重耐药基因存放的位点。,MRSA基因分型及其意义,染色体盒重组基因复合体(ccr)，有两种点特异性重组基因组成，ccrA和ccrB，负责SCCmec基因盒的移动，ccrA和ccrB可分为1、2、3型。,ccr1型,ccr2型,ccr3型,MRSA基因分型及其意义,根据mec和ccr基因复合体结构，可将SCCmec基因盒分为四型（见图）。,型SCCmec复合体,型：由B型mec基因复合体和ccr1型基因复合体组成。多见于早期分离的MRSA菌株，代表株为NCTC10442，是1961年首次从英国分离出的MRSA菌株。在型中除mec基因外没有其他耐药基因。,型SCCmec复合体,B型mec基因复合体,ccr1型,型：由A型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。是目前医院感染MRSA中常见的基因型，代表株为315，是1982年从日本分离的MRSA菌株。在型SCCmec中含有完整的pUB110质粒和Tn554转座子，pUB110与细菌对氨基糖苷类抗生素、卡那霉素、妥布霉素耐药有关，Tn554编码红霉素、壮观霉素抗药性。,型SCCmec复合体,型：由A型mec基因复合体和ccr3型基因复合体组成。也是医院感染MRSA常见的基因型，代表株85/2082，在型SCCmec中除mecA以外，还含有完整的pT181质粒、Tn554转座子和Tn554。Tn554是编码抗镉的基因，pT181质粒编码四环素耐药、Tn554编码红霉素、壮观霉素抗药性。,型SCCmec复合体,型：由B型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。是新出现的社区感染MRSA常见基因型，MW2和CA05为IVa型代表菌株，8/6-3P为IVb型代表菌株在IVa和IVb型SCCmec中除mecA外，不含有其他耐药基因。,型SCCmec复合体,研究结论,本地区MRSA流行株以SCCmec型为主，表现为对抗生素多重耐药。发现2株SCCmecIV型的MRSA，仅对内酰胺类抗生素耐药，而对多种非内酰胺类抗生素敏感。MRSA的耐药表型与基因型有明显的相关性，但仅使用SCCmec基因分型不能完全解释MRSA的耐药表型。,社区获得性MRSA（CO-MRSA),自从CAMRSA于1982年首先在美国密西西比州被报道以来，CAMRSA在MRSA感染中所占的比例呈逐年上升的趋势。Fridkin等报道200l2002年间CA-MRSA已占MRSA感染的82OCAMRSA可以通过皮肤直接接触传播，也可通过共同运动器械、餐具等间接传播。CA一MRSA感染不仅发生在社区家庭成员之间，还可发生于学校、幼儿园和监狱等人口集中的社区中。2005年，Kazakova等报道了在职业运动员之间传播的CAMRSA,社区获得性MRSA（CO-MRSA),多为SCCmecIV型与典型的医院感染MRSA（H-MRSA）比较，主要表现为对内酰胺类耐药，而对多种非内酰胺类抗生素的敏感性可能增加，甚至对头孢类抗生素也表现为敏感毒力更强，可产生杀白细胞毒素。较多的研究认为，CO-MRSA并非其源于H-MRSA，是近年来出现的一种新的耐药模式，在美国、澳大利亚和欧洲引起广泛重视,CAMRSA和HAMRSA的区别,感染人群：CAMRSA感染者以平素身体健康的青少年为主；H-MRSA感染频繁住院治疗、外科手术后、血液透析、长期护理等全身免疫功能低下的人群。耐药表型：CAMRSA除mecA基因外，不含有其他耐药基因，所以除对一内酰胺类抗生素耐药外，对非一内酰胺类抗生素多显示敏感；HAMRSA由于含有多个耐药基因，除对一内酰胺类抗生素耐药外，对氨基糖甙类、大环内酯类抗生素和喹喏酮类抗生素也耐药。,CAMRSA和HAMRSA的区别,基因型：CAMRSA携带型SCCmee基因盒，而HAMRSA的SCCmee类型主要为型和型。毒力：CA-MRSA菌株基因序列分析中含有杀白细胞毒素(PVL)基因。可产生杀白细胞毒素，致病力更强。在CAMRSA中还有葡萄球菌肠毒素基因，可产生超抗原肠毒素B和肠毒素C，可使患者发生超敏反应，从而使免疫功能低下的患者出现中毒性休克综合征；H-MRSA毒素基因容易丢失。,CO-MRSA诊断依据,菌株来源：一般是从门诊患者或住院48h以内的患者体内分离的金黄色葡萄球菌菌株，并且这些患者在就医之前一年内没有如下情况：曾住院、长期特殊护理、外科手术、血液透析和无留置导管或人工医疗装置等。MRSA检测耐药表型检测：CAMRSA耐药表型检测主要特点为除对一内酰胺类抗生素耐药外，对非一内酰胺类抗生素多为敏感。SCCmee基因分型：有型SCCmec基因盒毒素检测：含有PVL基因,CO-MRSA治疗,传统的治疗社区金黄色葡萄球菌感染的方法可能失败CAMRSA是与HAMRSA不同的一组细菌，虽然HAMRSA感染是使用糖肽类抗生素的适应症，但不能机械地应用于CA-MRSA感染。正确认识CAMRSA和HAMRSA，从而减少糖肽类抗生素的应用，对延缓VRSA的产生有重要的意义环丙沙星对CAMRSA有极高的敏感性，单用克林霉素治疗，也取得很好的疗效。由于CAMRSA除对一内酰胺类抗生素耐药外，对多种一内酰胺类抗生素有较高的敏感性，多重耐药菌株的发生率很低。所以治疗CAMRSA感染首先要根据临床药敏试验结果,耐万古霉素金黄色葡萄球菌研究进展,概述,耐万古霉素金黄色葡萄球菌的出现使细菌感染再次成为非常棘手的临床问题2003年，2004年美国CDC制定和修订了“VRSA/VISA检测和控制指南”，2005年CLSI药敏试验执行标准中增加了耐万古霉素金黄色葡萄球菌检测方法，要求各实验室开展对万古霉素耐药菌的监测。2006年CLSI修改了万古霉素药敏判断标准,分类,万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）：MIC32(16)mg/l，目前全世界仅发现5例万古霉素中介金黄色葡萄球菌（VISA）：MIC为816(48)mg/l，于1997年由日本学者首先分离代表株为Mu50，MIC=8mg/l万古霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌（h-VRSA）：原代纯培养物对万古霉素的MIC4mg/l，但在万古霉素敏感的原代中，存在有部分对较高浓度万古霉素耐药的亚群，这些耐药亚群的MIC8mg/l，代表株为Mu3,200624-816,200548-1632,万古霉素对金葡菌的MIC(g/ml),注意:2005年同现行的FDA标准一致纸片扩散法的标准没有改变对凝固酶阴性的葡萄球菌的标准没有改变,异质性耐药与耐药的关系,异质性耐药与耐药的比较,耐药机制,1、耐药质粒传递,1992年，Noble成功地将粪肠球菌耐药质粒传递给金葡菌，在实验室内构建成“VRSA”。美国于2002、2004年共分离出3株VRSA，均检测出与万古霉素耐药肠球菌（VRE）一致的VanA基因。经这种机制获得的耐药，一般呈高水平，MIC值可以达到1024mg/l,Vancomycin-ResistantS.aureus(VRSA)fromUSA,June2002:VRSA(vancomycinMIC128g/ml)从美国密希根州一例40岁糖尿病肾衰患者的透析管末端分离，该菌同时也含有mecA基因(MRSA).在患者的足部溃疡中同时分离出VRSA和VRE.faecalis.在E.faecalis和VRSA中均检出VanA基因.Sept.2002:VRSA(VancoMIC32g/ml)从美国宾夕法利亚州一名慢性足部溃疡和可疑骨髓炎的患者体内分离，细菌对苯唑西林(MRSA)和万古霉素均耐药，检出mecA和VanA基因.,1、耐药质粒传递,2003年Weigel等报道了美国Michigan州分离的VRSA基因分析结果，证实其耐药基因来源于共同分离的粪肠球菌，它为VanA基因组所编码，存在于一个57.9-Kb的多药耐药质粒中，该质粒含有完整的10.8-Kb的Tn1546转座子，Tn1546编码9个多肽，这9个多肽协同作用最终形成D-丙氨酰-D-乳酸，取代了细菌肽聚糖前体中的UDP-胞壁酸五肽的D-丙氨酰-D-丙氨酸，取消了肽聚糖前体与万古霉素之间原有的氢键结合，并使原来的空间构象发生改变，使万古霉素失去作用位点，导致金葡菌对万古霉素高水平耐药。,细胞壁增厚,VISA和hVRSA有一个共同的特征，就是细胞壁增厚Cui发现：当VISA对万古霉素恢复敏感后（MIC4mg/l），它们细胞壁的厚度降低且与VSSA无区别。再用万古霉素对这些恢复敏感性的菌株进行选择，细菌对万古霉素的耐药性又回复至原先水平，同时出现细胞壁的增厚。表明细胞壁增厚是VISA和hetero-VRSA的共同特征，与细菌对万古霉素的MIC水平存在明显的相关性(r=0.908)。,3、细胞壁增厚,“亲和诱捕”，增厚细胞壁的上有大量D-丙氨酰-D-丙氨酸残基，它们可与万古霉素结合，导致大部分药物分子结合在细胞壁肽聚糖外层上，而不能接触肽聚糖合成活性部位。“阻塞现象”，万古霉素与D-丙氨酰-D-丙氨酸残基结合，阻塞了肽聚糖层的网眼，破坏其网格状结构，阻止药物向细胞内渗透及结合靶位点。两种机制可单独存在，也可同时起作用。有研究表明，Mu50中，D-丙氨酰-D-丙氨酸残基的含量约是VSSA的2.4倍，细胞壁厚度是VSSA的1.5倍，结合的万古霉素分子是VSSA的3.6倍。,VISA和VRSA的检测,VRSA(asof12/05),1ReferencebrothmicrodilutionMIC,73,万古霉素(VA)耐药金葡菌(VISA/VRSA)筛选流程,金黄色葡萄球菌,MIC+VA筛选平板（含5ug/ml万古霉素的BHIA）,纸片扩散法+MIC+VA筛选平板（含6ug/ml万古霉素的BHIA）,VAMIC2ug/mlVA筛选平板不生长,VAMIC2ug/mlVA筛选平板生长(少),VAMIC4ug/mlVA筛选平板生长,VA抑菌圈14mmVA筛选平板生长,VA抑菌圈14mmVA筛选平板不生长,VA抑菌圈14mmVA筛选平板生长,报告VSSA,可能是VISA/VRSA,可能是VISA/VRSA,报告VSSA,纯分,重新鉴定,非自动化系统重新进行MIC药敏试验,保存菌种,通知：感染控制、临床医师、地方卫生机构，报告VISA/VRSA,送参考实验室进一步确认,CLSI为什么要修改S.aureus的万古霉素折点?,检测逐渐增多的的万古霉素耐药资料显示当病人感染S.aureusvancomycinMICs4g/ml时用万古霉素治疗失败CDC建议临床实验室把vancomycinMICs4g/ml的金黄色葡萄球菌作为潜在的VISAorVRSA来研究SomeVISAtest4g/mlbysomemethods,图1.不同菌株菌谱分析图,注：ATCC29213（）10827()10827-4R（）10827-8R（）10827-16R（）10827-32R（）,表1.不同方法药敏试验结果,表2.不同菌株的培养特性结果,表3.不同菌株的生化特性结果,图2.扫描电镜摄片结果,注：A:ATCC29213,B:10827,C:10827-4R,D:10827-8R,E:10827-16R,F:10827-32R,图5.金黄色葡萄球菌nuc基因PCR扩增电泳图,注：M：DNAmarker1：ATCC292132：108273：10827-4R4：10827-8R5：10827-16R6：10827-32R7：阴性对照8：空白对照,小结,耐甲氧西林葡萄球菌的检测方法及判断标准有新的改变，希望大家执行新的标准SCCmec基因盒结构与葡萄球菌多重耐药有一定的相关性，可以开展各地区基因盒分布调查研究CO-MRSA已成为全球关注的热点，各实验室应掌握CO-MRSA检测方法，密切监测CO-MRSA在国内的流行开展VISAVRSA监测，关注耐药性与临床治疗的相关性,葡萄球菌药敏试验及临床应用,临床医师对细菌药敏试验的抱怨,我们想用的药在检测报告中不包括按照药敏试验结果用药临床效果不好,微生物检验人员应与临床医师交流的问题,我们是怎样做药敏试验的你们希望我们实验室怎么做药敏试验报告如何解读,药敏试验方法,必须使用可接受的体外药敏试验方法根据CLSI所公布的最新判断标准进行结果判断举例：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法判断标准,药敏试验的作用,了解分离菌对被检测药物的耐药表型根据标志性抗生素推测其他抗生素的敏感性根据耐药表型推测可能的耐药机理,药敏试验抗生素,试验性抗生素通过试验性抗生素检测了解细菌对抗生素的药敏谱检测耐药表型,药敏试验抗生素,标志性抗生素容易受耐药机理的影响，且能最敏感地表达一种或几种耐药机理的抗生素，它的结果可推演至其他抗生素的敏感性。,标志性抗生素的应用,根据敏感，判读敏感：所有菌素对四环素敏感，表示对多西环素、米诺环素敏感根据耐药，判断耐药：葡萄球菌属细菌对头孢西丁耐药，表示对所有-内酰胺类，包括酶抑制剂复合药和碳青霉烯类均耐药