（生态学专业论文）基于近红外光谱分析的培养基中蔗糖含量的无菌检测及应用.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 植物组织培养中，蔗糖作为标准碳源与培养物的生长速度和生长 量密切相关，是影响植物组织培养成功与否的关键因素。植物组织培 养是在无菌，半封闭环境下进行的，而传统的蔗糖测定方法无法在保 持无菌环境下对培养基中的蔗糖进行测定。近红外光谱分析技术是一 种快速、无损的分析检测技术，样品几乎不需要任何前处理的特点使 无损检测培养基中蔗糖含量成为可能。本研究尝试用近红外光谱分析 技术对植物组培培养基中的蔗糖含量进行定量分析，并对其在组培中 的应用进行初步的探讨。 为观察组培玻璃瓶装样对实验产生的影响，实验根据组培培养基 中蔗糖浓度的范围，配备了组培锥形瓶装样，带均质玻璃盖的玻璃培 养皿装样和不带盖的裸露的玻璃培养皿装样三组培养基样品，在相同 状态下采集其光谱。每组样品7 7 个，其中5 7 个样品作为校正集，2 0 个作为验证集。实验首先对三组光谱原始数据进行建模，显示组培瓶 装样对模型的预测精度产生很大的影响；实验结合p l s 对常规的预 处理方法( 平滑，一阶和二阶导数，多元散射校正等) 进行分析比较， 同时采用相关系数法和遗传算法对波长进行筛选优化。基于组培瓶装 样及样品本身易造成的非线性，实验引入p l s + a n n 的建模方法并和 p l s 进行分析比较，对模型进行优化。结果显示，p l s + a n n 的建模 效果要普遍优于p l s ，而经过预处理及优选波长后最终的模型，组培 瓶装样组的预测均方根误差和相对误差分别为2 0 8 3 和6 3 6 7 ，相关 江苏大学硕士学位论文 系数为0 9 8 8 ，逼近裸露组的1 7 3 3 6 和5 6 3 6 ，达到了实验的检验标 准。用此模型对移栽植物后的培养基进行验证，预测均方根误差和相 对平均误差分别2 6 2 3 9 和8 7 6 2 2 ，相关系数为0 9 6 6 ，得到了比较 好的检验效果。 分别利用近红外光谱分析技术和图像处理法对组培过程中培养 基蔗糖含量和组培苗的质量进行无菌动态监测，把组培苗生长的质量 和对培养基中蔗糖的消耗结合起来对组培苗的生长状况进行分析。结 果显示：在接种后初期生长阶段，植物量小的组培苗对蔗糖的平均消 耗速率在1 5 3 0 之间，要明显大于植物量大的组培苗( 4 7 ) ， 暗示着组培中植物量小的组培苗在培养的初期具有更强的异养能力； 从组培苗对吸收的蔗糖的利用效率来看，同种组培苗在不同的时间段 对蔗糖的利用效率是不同的，存在峰和谷的交替，不同种类组培苗在 不同的生长阶段对对蔗糖的利用效率也存在很大的差异，其中，在培 养的前中期，诸葛菜对蔗糖的利用效率要明显大于同属十字花科的油 菜，而缺刻型茅苍术在培养的中后期对蔗糖的利用效率比长披针型茅 苍术更具优势。 关键词：可见近红外光谱，p l s + a n n ，培养基，蔗糖，遗传算法 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t a sa ni m p o r t a n tc a r b o ns o u r c ef o rp l a n tg r o w t h ，s u c r o s eh a sac l o s e dr e l a t i o nt o t h eg r o w t hr a t eo fp l a n t l e t sa n di st h ek e yf a c t o rt ot h es u c c e s so ft h ep l a n tt i s s u e c u l t u r e t h et r a d i t i o n a lw a yc a n tm o n i t o rt h es u c r o s ec o n t e n to fm e d i u m 丽t h n o n d e s t r u c t i o n n e a ri n f r a r e ds p e c t r o s c o p yi saf a s ta n dn o n d e s t r u c t i v ea n a l y t i c a l t e c h n i q u e , w h i c hm a k e st h en o n d e s t r u c t i v ed e t e r m i n a t i o no ft h es u c r o s ec o n t e n to f s u b s t r a t ep o s s i b l e t h ee x p e r i m e n ta t t e m p t e dt om o n i t o rt h es u c r o s ec o n t e n to f s u b s t r a t cu s i n gv i s i b l e n e a ri n f r a r e ds p e c t r o s c o p yt e c h n o l o g y , a n dh a dap r e l i m i n a r y s t u d yo nt h et i s s u ec u l t u r ef o ri t sa p p l i c a t i o n t oo b s e r v et h ei m p a c to fs a m p l ei nb o t t l e st o t h e e x p e r i m e n t ，e x p e r i m e n t c o l l e c t e dt h r e eg r o u p ss a m p l eo ft h eb a r es u b s t r a t es a m p l e si ng l a s sd i s h ，s u b s t r a t e s a m p l e si ng l a s sd i s hc o v e r e db yg l a s sc a pa n ds u b s t r a t es a m p l e si ng l a s sb o t t l e s c o n f i g u r e da c c o r d i n gt ot h es c o p eo fs u c r o s ec o n c e n t r a t i o ni ns u b s t r a t e e v e r yg r o u p c o n t a i n e d7 7s a m p l e s ，5 7o fw h i c hw e r eu s e da sat r a i n i n gs e t ，a n dt h er e m a i n i n g2 0 w e r ea sa p r e d i c t i o ns e t f i r s t ，t h ee x p e r i m e n tb u i l tt h ep l sm o d e l so fs u c r o s ec o n t e n t o ft h r e eg r o u ps a m p l e sw i t ho r i g i n a lw a v e l e n g t h ，a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e s u b s t r a t es a m p l e si ng l a s sb o t t l e sc a u s ea ng r e a ti m p a c to nt h ep r e d i c t i o na c c u r a c yo f m o d e l m u l t i p l ep r e p r o c e s s i n gm e t h o d sw e r eu t i l i z e dt op r o c e s st h en e a r - i n f r a r e d s p e c t r a ld a t ao b t a i n e d ，t h a ti n c l u d es a v i t z k y - g o l a ys m o o t h i n g ，d e r i v a t i o n ，s t a n d a r d n o r m a lv a r i a t et r a n s f o r m a t i o n ， m u l t i p l i c a t i v es c a t t e rc o r r e c t i o na n ds oo nb yp l sa n d t h ep r o c e s s i n gr e s u l t sw e r ea l s ob r i e f l yc o m p a r e d w eh a du s e db o t hc o r r e l a t i o n a r g u m e n ta n da l g o r i t h m ( g 砷t os e l e c ta p p r o p r i a t ew a v d e n 昏ht oi m p r o v et h e p r e d i c t i v ea b i l i t yo fm o d e l f i n a l l y ，c o n s i d e r i n gt h en o i d i n e a ro ft h es p e c t r o s c o p y , a m o d e lo fp l s 谢t l la r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r kw a sc o n s t r u c t e da n dc o m p a r e d 丽t h p l sm o d e l ；t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ep r e d i c t i o nr e s u l to fp l aw i t ha n nw e r g g e n e r a l l ys u p e r i o rt op l s ，a n dc a ne f f e c t i v e l yi n d u c et h ei n f l u e n c eo fs u b s t r a t ei n g l a s sb o t t l ew i t l ls p e c t r a lp r e t r e a t m e n t s t h er m s e pa n dr s d po ft h es u b s t r a t ei n 1 1 1 江苏大学硕士学位论文 g l a s sb o t t l ew e r e2 0 8 3a n d6 3 6 7 ，t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( r ) w a s0 9 8 8 ，w h i c h d o s e dt ot h er e s u l to ft h eb a r es u b s t r a t eg r o u pw i t hs a m et r e a t m e n ta n da st os a m p l e s 丽mp l a n t s ，i ta l s oc a nm a k eas a t i s f a c t i o np r e d i c t i o nr e s u l tt h a tt h er m s e pa n d r s d po ft h em o d e lw e r e2 6 2 3 9a n d8 7 6 2 2 ，t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( r ) w a s 0 9 6 6 ，p r o v i d i n gaf a s t , e a s ya n d n o n d e s t r u c t i v ew a yt od e t e r m i n et h es u c r o s ec o n t e n t o ft h es u b s t r a t e s t e r i l em o n i t o r i n gt e c h n o l o g yo ft h ep l a n t l e t sb ym e t h o d so fn e a ri n f r a r e d s p e c t r o s c o p ya n dm u l t i p l er e f e r e n c eo b j e c t sh a de s t a b l i s h e d a c c o r d i n gt ot h eq u a l i t y o fp l a n t l e t sa n dt h es u c r o s ec o n t e n to fs u b s t r a t ec o n s u m e db yp l a n f l e t s ，w ea n a l y s e d t h eg r o w t ho fd i f f e r e n tt y p e so fp l a n t l e t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，i nt h ee a r l yg r o w t h p h a s ea f t e ri n o c u l a t i o n ，t h ea v e r a g ec o n s u m p t i o nr a t eo fs u c r o s eo fs m a l lp l a n t l e t s w a sb e t w e e n1 5 一3 0 ，w h i c hw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h eb i gp l a n f l e t s ( 4 一7 ) i ts u g g e s t e dt h a tt h es m a l lp l a n f l e t sh a das t r o n g e rh e t e r o t r o p h i cc a p a c i 哆i nt h e e a r l yg r o w t hp h a s ea f t e ri n o c u l a t i o n f r o mt h es u c r o s ec o n t e n ta s s i m i l a t e db yp e r g r a mo fd i f f e r e n tt y p e so fp l a n t l e tw i t hc u l t u r et i m e ，t h es a m et y p e so fp l a n t l e t sw a s d i f f e r e n tb e t w e e nd i f f e r e n tg r o w t hp h a s e ，a n dd i f f e r e n tt y p e so fp l a n t l e t ss h o w e d s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ，t o o b e t w e e nt h ee a r l ya n dm e d i u m t e r mo fg r o w t hp h a s e a f t e r i n o c u l a t i o n ，o r y c h o p h r a g m u sv i o l a c e u sh a sa nh i g h e re f f i c i e n c yi nt h eu s eo fs u c r o s e t h a nr a p ew h i c hi sb e l o n gt ob r a s s i c a c e a et o o t h ee f f i c i e n c yi nt h eu s eo fs u c r o s eo f t h ei n d s e da t r a c t y l o d e sl a n c e aw a sb e t t e rt h a nt h a to ft h el o n gl a n c e o l a t eb e t w e e n t h em e d i u ma n dl a t e t e r mo fg r o w t hp h a s ea f t e ri n o c u l a t i o n k e yw o r d s ：v i s i b l e n e a ri n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ，p a r t i a ll e a s ts q u a r e sa n da r t i f i c i a l n e u r a ln e t w o r k ，s u b s t r a t e ，s u c r o s e ，g e n e t i ca l g o r i t h m 江苏大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密毗 学位论文作者签名：柒艳布 a o j 。年6 月1 1 日 指导教师签名：段汔久 z o o 年f 月f f 日 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：来传暂 日期：厶j 。年月i 日 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1组培中蔗糖的重要性及蔗糖的检测方法 1 1 1组培中蔗糖的影响 糖类化合物是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类有机化合物质，是自然界 分布广泛、数量最多的有机化合物，是食品的主要组成成分之一，也是绿色植物 光合作用的直接产物。 自然界中，叶中富含叶绿素的高等植物可以通过光合作用依靠光能进行自养 生长，即高等植物利用大气中c 0 2 作为碳源进行生长。当一种植物既可从大气 中的c 0 2 得到碳源，也可从有机物质中得到碳源时，我们说这种植物属于兼养 生长。在植物组织培养中，处于半封闭状态，组培容器内c 0 2 浓度很低，加上 组培过程中组培苗的植株体都较小，即使含有叶绿素，光合作用也很弱，特别是 植株体很小时，几乎没有光合能力，不足以维持组培苗自身的健康生长，因此需 要在培养基中加入糖类作为碳源来维持植株体的生长【1 1 。 在植物组织培养中，糖类作为碳源起着举足轻重的作用，不仅为培养物提供 能量，而且是培养物渗透环境的主要调节者。培养基中添加的糖类种类较多，包 括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、脱氧核糖、核糖、甘露糖、甘油、山梨糖、甘 露庚糖、葡庚糖、木糖、阿拉伯糖等近5 0 种，其中蔗糖能支持绝大多数植物离 体培养物的旺盛生长，一直被作为植物组织培养的标准碳源而广泛应用，大多数 合成培养基也均以蔗糖作为唯一碳源。它的用量不仅影响培养物的生长速度和生 长量，也影响其代谢水平、次生代谢物合成、以及细胞行态和发生，是影响植物 组织培养成功与否的关键因素【2 4 】。 不同的培养物有不同的最适蔗糖浓度，不同的植物甚至同种植物在不同的环 境，条件下都具有不同的光合能力，在同等条件下其生长速率，对糖的消耗，生 长中的快慢周期等都会有所不同【5 】，因此在大规模的组培生产中，组培苗是批量 生产，仅靠植株体的外观和培养基的体积消耗来判断组培苗的生长发育，缺少科 学依据，往往会造成组培苗已经度过了最佳生长期或接种移栽期还在依靠培养基 江苏大学硕士学位论文 中剩余的糖分缓慢生长，造成糖的浪费的同时延长了组培苗的接种换代时间；或 者是组培苗对吸收的蔗糖的利用效率较慢，即培养基中的大部分糖含量已经被植 物吸收但植物的生长量并没有随之出现相应的大的变化时，也易造成组培苗对糖 吸收缓慢，生长缓慢的假象，容易组培苗的培养时间，不利于组培苗的接种换代。 因此，如果能对组培过程中培养基中的蔗糖含量进行检测，我们就可以研究培养 物生长过程中培养基糖的消耗情况，根据糖的消耗来观察培养物的快慢生长周 期，方便研究培养物生理性能，判断培养物的最佳接种期，同时还能检测培养基 中剩余蔗糖含量，可能进行糖的回收利用，节约培养成本，为植物组培的大规模 发展提供参考依据。 1 1 2 蔗糖的检验方法 糖浓度的检测技术是食品分析技术中很重要的一部分。在糖类的分析工作 中，由于分析的目的不同，或者是由于被测组分和干扰成分的性质以及它们在分 析物中存在的数量的差异，选择的检测方法也各不相同。蔗糖的检测分析技术 近年来发展很快，主要有传统的化学分析法，色谱法，光谱法，酶的分析法等【q 。 化学法：蔗糖属非还原性双糖，但可水解为一个葡萄糖和一个果糖，称为转 化糖，因此传统的化学测定方法常为间接法，就是通过测定蔗糖水解后还原糖的 含量来计算蔗糖的含量。其中盐酸水解法是测定食品中的糖及其含量较常用的一 种方法；其次还有基于氧化还原反应原理的酶一比色法，是一种利用酶的反应进 行物质定性、定量分析的方法。酶是生物催化剂，它具有高效和专一的催化特性， 而且是在温和的条件下进行，解决了从复杂的组分中检测某一成分而不受或很少 受其他共存成分干扰的问题 7 - s 。 色谱法：色谱法是近几年来迅速发展起来的一种分析技术，它解决了许多常 规化学分析法所不能解决的微量成分分析难题，为分析技术开辟了新的途径。色 谱法包含许多分支，利用色谱法可以对样品中各种糖分进行分离和定量。较早的 方法有纸色谱法和薄层色谱法，目前利用高效液相色谱法和气相色谱法分离和定 量食品中的游离糖己经成为可靠的分析方法，其中高效液相色谱法发展很快，在 可溶性糖的分离与定性定量中，应用最为普遍，已经成为国标新的蔗糖测量方法 【9 】。样品溶液经适当的前处理后，选择适当的分离柱和流动相几乎可作为所有游 2 江苏大学硕士学位论文 离糖的测定，广泛地应用在食品，医药，环境分析等行业 1 0 - 1 4 1 。糖类物质虽属 于非挥发性物质，如能制成具有挥发性的衍生物，也可采用气相色谱法( g c ) 测定，张峻松【1 5 】等就建立了以三甲基氯硅烷，六甲基二硅胺烷为衍生化试剂， 利用毛细管气相色谱定量分析烟草中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的方法。 光谱法：近十多年来，红外光谱定量分析已经实现了单一物质、二元或多元 物质的定量测定。梁奇峰【1 6 】等以k 3 【f e ( c 6 】作内标物质，采用红外光谱内标法 测定板蓝根颗粒中蔗糖的含量，样品测定回收率为9 1 。1 0 3 ，测定相对标准偏 差 5 ，达到了检测的目标。而利用紫外分光光度法对蔗糖进行测定的方法也得 到了很快的发展。肖世远【1 7 】等以间苯二酚为显色剂，在酸性介质中直接与蔗糖 显色，建立了蔗糖的分光光度法，但其线性范围较窄、灵敏度不高，且间苯二酚 有毒，易污染环境；李利军【搏1 9 1 等研究发现在盐酸介质中蔗糖的水解产物受热被 破坏后，其产物在2 8 5 n m 处有较大的紫外吸收，据此，提出了测定蔗糖的紫外 分光光度新方法，并用于甘蔗汁中蔗糖的测定，得出了令人满意的结果。 除上述方法外，对于纯度较高的蔗糖溶液，也可以根据其物理特性采用相对 密度法、析光法、旋光法等物理方法进行测定。 1 2 近红外光谱分析技术简介 1 2 2 近红外光谱分析技术的回顾 近红外光是一种介于可见光( s ) 和中红外光( m i r ) 之间的电磁波，美 国材料检测协会( a s 刚) ，将其定义为波长7 8 5 2 5 2 6 n m 的光谱区。近红外光是 人们发现最早的非可见光区域，距今已有2 0 0 多年的历史。在2 0 世纪5 0 年代中 后期，随着简易型近红外光谱仪器的出现及n o r r i s 等人在近红外光谱漫反射技术 上所做的大量工作，掀起了近红外光谱应用的一个小高潮。近红外光谱技术首先 被应用于农副产品的分析中，但由于技术上的困难，发展比较迟缓。到上世纪 8 0 年代中期，随着计算机技术的发展和化学计量学的深入研究，加上近红外光 谱仪器制造技术的日益完善，才使得近红外光谱分析测量信号达到数字化，并促 进其得到发展。同时，由于近红外光谱吸收弱，可对样品进行简单的预处理或不 做预处理就可以直接进行漫反射分析，避免了预处理时损伤样品，实现无损检测。 3 江苏大学硕士学位论文 同时因不需要化学试剂使分析操作达到绿色化，从而成为9 0 年代最引人注目的 光谱分析技术。由于近红外光谱在光纤中良好的传输性，近年来也被许多发达国 家广泛应用在工业在线分析中。近红外定量分析因其快速、准确己被列人世界谷 物化学科技标准协会和美国谷物化学协会标准，成为世界食品分析标准的检测方 法之_ 1 2 0 - 2 4 1 。 近红外光谱技术的研究及应用在我国起步较晚，但自1 9 9 5 年以来已受到了多 方面的关注，并在仪器的研制、软件开发、基础研究和应用等方面取得了可喜的 成果。比如在石油化工领域中已得到应用并积累了一些实际经验，取得了一定的 经济效益1 2 5 1 。在仪器的研制方面，自1 9 9 5 年以来，陆婉珍院士一直致力于组织近 红外光谱仪的研制，已开发出国产一型近红外光谱仪，其中包括数据计算软件及 近红外光谱法在石油产品分析中的模型，并在部分炼油厂中取得极受欢迎的成果 1 2 6 - 3 0 l 。从上世纪9 0 年代中期，国内许多科研单位及院校所开始积极研发适合国内 需要的n i r 成套分析技术，并著作多本专著，如严衍禄、张录达等人于1 9 8 3 年 成立专门的傅立叶变换近红外漫反射光谱分析研究组，对近红外漫反射光谱分析 的理论基础进行了研究并出版了近红外光谱分析基础和应用p l l ；也有许多学 者发表了多篇有关原理和应用的综述文章，为n i r 技术的普及作了大量工作， 开创了我国研发和应用的崭新局面。近些年来，我国在仪器硬件、化学计量学软 件、分析模型建立以及实际应用等方面都有了长足发展，国内也出现了英贤、聚 光等专业的近红外仪器厂商，分析技术已经应用于药物、粮食、石油、烟草、果 蔬、环境等各个领域并向实际的在线应用发展【3 2 1 。 1 2 2 近红外光谱分析的基本原理 近红外光是电磁波，它具有光的属性，即具有波粒二重性，它的光子能量可 以用光子表示。量子力学理论认为，光子能量为：e p - h v ( 其中h 为普郎克常数， v 为光的频率) 。从光源发出的红外光照射到由一种或多种分子组成的物质上， 如果分子没有产生吸收，则光穿过样品该物质分子为非红外活性分子，否则为红 外活性分子。只有红外活性分子中的键才能与近红外光子发生作用，产生近红外 光谱吸收。红外活性分子在红外光谱区内的吸收产生于分子振动的状态变化或分 子振动状态在不同能级间的跃迁，这些跃迁常用谐振子和非谐振子模型来描述。 4 江苏大学硕士学位论文 能量跃迁包括基频跃迁( 对应于分子振动状态在相邻振动能级之间的跃迁) 、倍 频跃迁( 对应于分子振动状态在相隔一个或几个振动能级之间的跃迁) 和合频跃 迁( 对应于分子两种振动状态的能级同时发生跃迁) ，相应地，基于这些跃迁形 式所产生的吸收谱带就称为基频吸收、倍频吸收和合频吸收。所有近红外光谱的 吸收谱带都是中红外吸收基频的倍频及合频。可以从经典力学与量子力学两种观 点来说明分子的基频、倍频与合频的概念。按照经典力学，最简单的分子由两个 质量分别为m 1 和m 2 的原子组成，可模拟为由弹簧连在一起的两个小球组成的弹 簧振子。由虎克定律知道，这种系统的振动属简谐振动，它的振动频率为： 圪= ( 1 2 万) 纠 式中k 为力常数，其值决定于组成分子的两个原子间键能量的大小，p 为双原子 分子的折合质量。如果组成分子的两个原子的质量分别为m 1 和m 2 ，则 = ( 朋_ + ，呀1 ) 一，若k 燃n n m 为单位( 1 达因= 1 0 - 9 牛) ，1 t 取原子量单位， 则双原子分子机械振动相应的波数频率为： = ( 1 2 ，r c ) q c - k g = 4 13 9 k - t 若分子是极性分子，则分子在机械振动的同时产生电磁场的振动，其波数频率 与机械振动的波数频率相同。若用盯表示分子振动波数频率： o - = o - , = o r e = 4 1 3 x k 1 t 分子的这种振动频率就称为振动的基频，分子也可以按基频的整数倍2 0 ， 3 盯频率发生振动，这种频率称为分子振动的一、二级倍频。若分子中 存在几种频率的振动，则在一定条件下两种频率的振动可以发生藕合，形成频率 相当于两种频率之和的所谓合频振动。 由量子力学可得谐振子的能级公式为： e ，= h c c r ( v + 1 2 ) 式中振子量子数v = 0 ，1 ，2 ，3 ，。e ，为能量级的能量值。谐振子在不同能级 问跃迁的选择定为a v = 1 ，即跃迁只能在相邻能级间发生。每次跃迁吸收光子 的能量e 等于h c o 。 由于近红外谱区在波数4 0 0 0 c m 1 以上( 即波长2 5 0 0 n m ) 以下，这意味着只 5 江苏大学硕士学位论文 有基频振动的频率在2 0 0 0 c m 1 ( 即波长5 0 0 0 n m 以下) 以上的振动才可能在近红 外区形成有适当强度可检测的倍频与合频吸收。根据实际分子基频谱带的分布可 推知只有含氢基团如o h 、c h 、n h 等的伸缩振动才能在近红外区形成适当强 度的倍频、合频吸收谱带。也就是说近红外光谱的信息主要来源于含氢基团 ( o h 、c h 、n h 、s h 等) 伸缩振动的倍频吸收和合频吸收【3 。 不同的基团在近红外区域的吸收位置和吸收强度是不相同的，此外，基团的 数量、相邻基团的性质、氢键的存在也会影响谱峰的位置的强度。因此，根据近 红外谱图和朗伯一比尔定律【3 1 1 就可以确定与化学结构相关的物质的某些性质， 如成分的浓度等，这是近红外光谱分析技术的理论基础。由于大多数有机物都是 由含氢基团如o h 、c h 、n h 、s h 等构成的，基团的吸收频谱表征了这些组 分的化学结构。因此，根据这些基团近红外吸收频谱出现的位置、吸收强度等信 息特征，就可以对这些组分进行定性和定量分析。但由于倍频、合频吸收带要比 基频吸收带宽得多，这使得多组分样品的近红外光谱中不同组分的谱带、同一组 分中不同基团的谱带以及同一基团不同形式的倍频、合频谱带产生严重的重叠， 从而使近红外光谱的图谱解析变得异常困难。因此，利用近红外光谱进行定性或 定量分析时必须借助化学计量学方法。 化学计量学是采用应用数学、统计学和计算机科学等方法来优化化学实验、 化工生产和化学量测过程，并从化学量测的数据中最大限度地提取相关信息的一 种信息处理方法。化学计量学在近红外光谱分析中的应用主要有以下五个方面： ( 1 ) 光谱的预处理，主要是减弱以至于消除各种非目标因素对光谱的影响，净 化谱图信息；( 2 ) 数据压缩及信息提取，目的是用于降低数据维数，提取有用信 息，提高模型稳定性；( 3 ) 定量校正方法，用于建立光谱数据与待测品质之间的 预测模型；( 4 ) 模式识别方法，主要用于样品的分类判别；( 5 ) 模型传递技术， 用于消除不同仪器之间的差异，使模型能在多台仪器上得以使用，以节约建模成 本。图1 - 1 是近红外光谱分析的原理示意图，化学计量学将近红外光谱和样品的 组成或性质数据关联了起来，得到近红外光谱分析模型。 6 江苏大学硕士学位论文 图1 - 1 近红外光谱分析的原理示意图 f i g1 - 1 t h ep r i n c i p l eo fn i ra n a l y s i s 1 2 3 近红外光谱分析技术的特点 近红外光谱分析技术得到越来越多的关注，是因为它主要具有如下的优点： ( 1 ) 样品只需进行简单处理或根本不需要预处理，因此不会破坏样品；( 2 ) 近红外 光谱图提供的信息量大，并可同时对样品的多种成分同时进行分析；( 3 ) 分析速 度快，一般样品可在l m i n 内完成，采用光纤技术后特别适合于在线分析；( 4 ) 测 量过程中不需要有机溶剂，不易产生污染，被称为“绿色”的分析方法；( 5 ) 对 测试人员要求不高，易培训推广；( 6 ) 简单方便，有不同的测样器件可直接测定 液体、固体、半固体和胶状体等样品，检测成本低。 当然，近红外光谱分析技术也有其不足之处：( 1 ) 它不适于对微量成分进行 分析；( 2 ) f l d 于近红外光谱测定的是物质基团倍频和合频等的吸收，信息弱，灵 敏度较低；( 3 ) 由于近红外区谱带复杂，重叠多，因此，近红外光谱分析技术必 须依赖于复杂的校正体系，标准的测量方法以及大量的训练集样本。 1 2 4 近红外光谱定量分析的一般步骤 近红外光谱定量分析过程一般由以下几个阶段组成： ( 1 ) 光谱仪系统参数的合理选择； ( 2 ) 样本的收集。样本其中一部分用于建立模型，称为训练集或校正集，另 7 江苏大学硕士学位论文 一部分用于验证模型，称为预测集或验证集。所用样本尽可能地涵盖可能出现的 所有状态： ( 3 ) 按统一的检测方法对所有样本进行近红外光谱扫描； ( 4 ) 依照国家标准或行业标准测定所有样本中待测组分的含量； ( 5 ) 建立训练集样本的测量值与光谱数据之间的校正模型，并用验证集样本 来检验该模型的预测能力，若模型不能达到预定的要求，则查找问题或改变建模 方法，重新建立模型直到达到实验检测标准为止。 1 3 本研究的对象任务及内容 蔗糖为有机物，是由葡萄糖及果糖各一个分子脱水缩合而成的非还原性的双 糖，其英文名为s u c r o s e ，化学分子式为c 1 2 h 2 2 0 1 1 ，结构式见图1 2 。 图1 - 2 蔗糖的化学结构 f i g1 - 2t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fs u c r o s e 近几年来，国内外学者利用近红外光谱分析技术在蔗糖的检测方面也进行了 多方面的研究，在水果、饮料、糕点等食品中蔗糖的定量检测应用最为广泛 3 3 - 3 4 1 。 河野【3 5 l 等人采用透射方式测量蜜橘的光谱，对糖分进行定标建模；p a u l o a u g u s t o d ac o s t af i l h 0 0 6 1 利用近红外光谱分析法对巧克力中的蔗糖含量进行快速无损检 测；h o l g e r 3 7 1 等利用近红外光谱分析法对混合果汁的蔗糖含量进行定量分析；侯 瑞丽【3 8 1 等利用近红外透射法快速测定蜂蜜中的蔗糖含量；曹干【3 9 l 应用傅立叶变 换近红外光谱透射技术快速定量分析甘蔗蔗汁糖分，利用内部交叉实和自动优化 功能对预测数学模型进行优化，得到蔗汁蔗糖分预测数学模型，在本实验中，主 要以植物组培培养基中的蔗糖为研究对象。 8 江苏大学硕士学位论文 植物组织培养是在无菌，半封闭环境中进行的，即培养基要被封装到锥形玻 璃瓶中保持长期无菌状态。这就造成了对培养基中的蔗糖含量进行检测时必须保 证封装好的样品不能进行任何的前处理，只能隔着组培玻璃瓶对样品经行扫描。 因此，使得近红外光谱采集时有一定的特殊情况。 从样品的光谱采集方式来看：近红外光谱的常规分析技术有反射光谱法和透 射光谱法两大类。一般情况下，均匀透明的液体或固体用透射光谱法，固体样品 ( 颗粒和粉末) 在长波近红外选用漫反射，在短波近红外选用透射的工作方式； 粘稠的液体如牛奶等也可采用漫透射的工作方式，即在样品底部放置陶瓷类等表 面漫反射体，光源通过样品后在该漫反射体上发生漫反射，漫反射光有透过样品 后返回检测器检测，这种方式可以避免近红外光穿过透明或粘稠装样品时光信息 的遗失，增强光谱携带的信息量。培养基凝固后为含有大量水分的固体，透明性 较高，近红外光的透过率较大，适合采用透射光谱法或者漫透射的工作方式，但 培养基封装在组培玻璃瓶中，生产过程中需要在培养基上移栽组培苗，因此，采 用透射的方式时组培苗会对培养基的光谱产生很大的影响，而封装的组培瓶也使 的漫投射的方式不能实现，因此，本实验采取了漫反射的采集方式，通过对组培 瓶底进行培养基的光谱扫描。 从培养基装样条件来看：组培中，培养基凝固后都被封装在组培玻璃瓶中。 组培瓶一般有锥形玻璃瓶和圆柱型玻璃瓶两种。但不管哪种组培瓶，其材质虽然 相同，但组培瓶底厚度一般都不一致，每个组培瓶之间更不能保持完全的一致， 因此，隔着组培瓶底采集光谱时，实验需要验证组培瓶装样对培养基光谱及建模 分析产生的影响。 因此，本实验以装在组培玻璃瓶中的培养基为研究对象，以裸露培养基，覆 盖同一玻璃盖的培养基样品做为参照，分别与培养基中蔗糖的含量建立校j 下模 型，比较组培锥形瓶装样对建模造成的影响，尝试用近红外光谱分析法对培养基 中的蔗糖含量进行定量分析，以期能在不破环组培无菌环境下对培养基中蔗糖含 量进行检测；并用所建模型与图像处理法相结合，对不同种类组培苗的生长进行 无菌动态监测，具体内容如下： ( 1 )样品的配备及光谱的采集，实验首先配备出三组不同装样条件下的具有 一定蔗糖含量梯度的培养基样品，在同一状态下采集其光谱。为验证配 9 江苏大学硕士学位论文 备过程中蔗糖是否水解，采用高效液相色谱法作为参比方法。 实验首先利用偏最小二乘法对三种装样条件下样品的原始光谱进行建 模，观察组培锥形瓶装样对模型预测能力产生的影响。采用不同的预处 理方法结合偏最小二乘法进行比较，以期找到适合本研究的预处理方法， 同时采用遗传算法对波长进行筛选，以期简化模型和提高模型的预测能 力。 引入偏最小二乘与人工神经网络相结合的方法对光谱数据进行新的建 模，与偏最小二乘法相比较，以期找到最佳的建模方法，提高模型的预 测能力。并对移栽植物的样品进行检测，再次验证模型的适用性。 采用近红外光谱分析法和图像处理法相结合，对茅苍术，诸葛菜和油菜 三种植物组培过程中的质量变化和培养基蔗糖的消耗进行动态无菌监 测，观察不同种类组培苗组培过程中质量增长和对培养基中蔗糖消耗之 间的关系。 1 0 ) ) ) 2 3 4 ( k ( 江苏大学硕士学位论文 第二章培养基的配备与光谱的采集 本实验采用的是m s 培养基，包含大量元素，微量元素，铁液，有机成分及生 物生长调节物质，是目前植物组培中使用最为普遍一种培养基。在配置培养基时添 加不同质量的蔗糖组成不同蔗糖浓度的样品，采用高效液相色谱法对培养基配置过 程中蔗糖是否水解进行验证，采集样品光谱时，考虑到培养基样品的透明性和组培 瓶装样的特殊性，比较不同的采样方法，选取合适的采样方式。 2 1 培养基样品的配置 2 1 1 样品的浓度范围 配备1 l 的m s 培养基一般添加琼脂6 5 9 ，蔗糖3 0 9 。即在植物组培中，培 养基常规的浓度为3 0 ，移栽植物后随着植物的生长，培养基中的糖浓度会越 来越低，但植物长到一定程度后会被转接，因此培养基中蔗糖的浓度一般不会降 至o 。考虑样品的正态分布原则和植物组织培养中糖浓度的范围，选取蔗糖浓度 从2 5 0 对培养基进行配备。 2 1 2 样品配备过程 培养基配备过程中要特别注意蔗糖水解的问题。m s 培养基的p h 值在5 8 左右，属于弱酸性溶液，配备时需加热到沸腾来融化琼脂，而蔗糖是一种非还原 性糖，在酸性条件下极易发生水解，转化为一个葡萄糖和一个果糖，因此需等温 度降下后再添加蔗糖，配备过程如下：培养基冒白烟时加入琼脂，不断搅拌，直 到溶液清澈见底，琼脂完全溶解为止。放置，使温度冷却至6 0 度左右，用1 0 0 m l 的量筒量取1 0 0 m l 注入2 0 0 m l 的量杯中，添加所配浓度的蔗糖含量，用玻璃棒 搅拌至蔗糖完全溶解均匀，用5 0 m l 的量筒分别取4 0 m l 注入直径6 0 n ，材质相同 的玻璃培养皿和组培锥形瓶中，注入时速度均匀，避免溶液沾在器皿侧壁和出现 气泡的现象。培养基凝固后就得到两组具有一定糖含量梯度的标准培养基样品， 每组样品数量7 7 个，厚度约为l c m ，为淡黄色半透明固体。 1 1 江苏大学硕士学位论文 2 2 高效液相色谱法测培养基中的蔗糖含量 在样品的配置过程中，虽然已经考虑到高温酸性下蔗糖易水解的特性，在温 度低于6 0 度时再添加蔗糖，但是样品中蔗糖是否水解以及水解程度还需要进一 步验证，本文采用高效液相色谱法作为验证方法，测定培养基中的蔗糖含量。 2 2 1高效液相色谱法原理( h p l c ) 高效液相色谱法( h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是色 谱法的一个分支，是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。高效液相 色谱的分离原理和其他色谱法相同，是利用样品混合物中的溶质在固定相和流动 相之间分配系数的不同，当两相做相对运动时，这些物质在两相中进行连续的反 复的交换和分配而达到分离的过程。 高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验，并引入微处理机技术， 极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现在用微处理机控制的高效液相色 谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪器的操作参数如溶剂梯度洗脱、流动相流 量、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等，又能对获得的色谱图进行收 缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作 者提供了高效率、功能齐全的分析工具，与经典液相色谱法相比，高效液相色谱 法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化嗍。 高效液相色谱技术在我国起步较晚。2 0 世纪7 0 年代初期，中国科学院大连 化学物理研究所率先开展了高效液相色谱的研究，特别是色谱柱填充物的研究， 生产出了高效液相色谱柱，并出版了相关的论文【4 1 4 2 】。