（环境科学专业论文）莠去津对斑马鱼解毒酶系的影响及dna损伤研究.pdf

莠去津对斑马鱼解毒酶系及d n a 损伤的影响研究 津浓度的升高，g s t 活性大体上都呈现先降低后升高的趋势。对于雄鱼而 言，g s t 活性除了1 m l 处理组在染毒第5 d 和2 0 d 受到显著抑制外，其 它处理时间的处理组均显著高于对照组；对于雌鱼而言，除了染毒第5 d 的1 m l 处理组和染毒2 5 d 处理组外，其它处理的g s t 活性均高于对照 组。另外，本试验结果也表明了莠去津对斑马鱼g s t 的诱导效应也存在 性别差异，在经莠去津处理后，雄鱼的g s t 活性高于雌鱼。 3 单细胞凝胶电泳试验结果显示，在设定的五个检测时间( 5 m ，1 0 m ， 1 5 t h ，2 0 m ，2 5 t h d ) ，经不同浓度莠去津处理后，斑马鱼肝细胞d n a 均有 损伤，而且随着浓度的增加和时间的延长，o l i v e 尾矩值均有上升的趋势， 这说明d n a 损伤程度与莠去津的浓度和处理时间具有剂量效应关系和 时间效应关系。 关键词：莠去津斑马鱼细胞色素p 4 5 0谷胱甘肽硫转移酶 彗星试验 2 山东农业火学硕上学位论文 t h et o x i ce f f e c t so f a t r a z i n eo nd e t o x i f i c a t i o ne n z y m e sa n d d n a d a m a g ei nz e b r a f i s h d o n gx i a o l i d i r e c t e db vd r z h ul u s h e n g ( c o l l e g eo fr e s o u r c ea n de n v i r o n m e n t ，s h a n d o n ga g r i c u l t u r eu n i v e r i s t y , t a i a n ，c h i n a ，2 7 1 0 1 8 ) a b s t r a c t i n t r o d u c e d i nt h e19 5 0 s ， a t r a z i n e ( 2 - c h l o r o 一4 一e t h y l a m i n o - 6 一 i s o p r o p y l a m i n o - 1 ，3 ，5 - t r i a z i n e ) h a sb e e no n eo ft h em o s tf r e q u e n t l yu s e d h e r b i c i d e sw o r l d w i d e i nf a c t ，a g r i c u l t u r er u n o i f , i 1 1 r i g a t i o nw a t e r s ，a n d w e t l a n da p p l i c a t i o n sa r et h ec e n t r a ls o u r c e sf r o mw h i c ht h i sc o n t a m i n a n t e n t e r st h ea q u a t i ce n v i r o n m e n t ，l e a d i n gt ot h ed e t e r i o r a t i o no fw a t e rq u a l i t yi n t h ep r o c e s s e s p e c i a l l y ，a t r a z i n ec a nb et r a n s f e r r e dt h r o u g hp h y t o p l a n k t o nt o f i s ha n du l t i m a t e l yt oh u m a n s t h ei s s u eo fc o n t a m i n a t i o no fa t r a z i n eh a s i n c r e a s e di ni m p o r t a n c ei nr e c e n ty e a r s ，d u et oi t sp e r s i s t e n c ew i t h i nt h e e n v i r o n m e n t s o ，i ti se m e r g e n tt oe v a l u a t et h ew a t e re c o l o g i c a ls a f e t yo f a t r a z i n e i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t a k i n ga t r a z i n ea sam o d e lp o l l u t a n t ，e c o t o x i c i t yo ft h e p e s t i c i d e sw a se v a l u a t e db ys t u d y i n gi t st o x i c i t ya n dt r a u m ae f f e c t so nd a n i o r e r i o t h el i v e rm i c r o s o m a lc y t o c h r o m ep 4 5 0e n z y m e sa n dg l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ( g s t ) a c t i v i t yw e r em e a s u r e dr e s p e c t i v e l y f r o mt h eb i o c h e m i s t r y a s p e c t ，t o x i c i t y e f f e c t so ft h ep e s t i c i d e so nd a n i or e r i ow e r ee v a l u a t e d t r a u m ae f f e c t so fa t r a z i n eo nd n aw e r et e s t e db yu s i n gs i n g l ec e l lg e l e l e t r o p h o r e s i st e s t f r o mm o l e c u l el e v e l ，s o m ep r i m a r yd i s c u s s i o n so ft h e p o s s i b l ei n d u c e dm u t a t i o nw e r em a d ei nt h ee x p e r i m e n t s t h er e s u l t sc o u l db e s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 e f f e c to fa t r a z i n eo nc y t o c h r o m ep 4 5 0e n z y m e si nz e b r a f i s hl i v e r ：t h e 3 莠去津对斑马鱼解毒酶系及d n a 损伤的影响研究 l i v e rm i c r o s o m a lc ”o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n t ，n a d p h - p 4 5 0r e d u c t a s ef n c r ) ， a m i n o p y r i n en d e m e t h y l a s e ( a p n d ) ，a n de r y t h r o m y c i nn - d e m e t h y l a s e ( e r n d ) a c t i v i t yw e r em e a s u r e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，w i t h i nt h er a n g eo f t e s ta t r a z i n ec o n c e n t r a t i o n s ，e i t h e rp 4 5 0c o n t e n to rp 4 5 0i s o z y m ea c t i v i t i e s c o u l db ei n d u c e db ya t r a z i n e ；a t r a z i n es i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t e sc ”o c h r o m e p 4 5 0e n z y m e si nz e b r a f i s hl i v e r sa tc o n c e n t r a t i o n sr a n g i n gf r o m0 0 1t o1 m g l m o r e o v e r ，g e n d e r b a s e dd i f f e r e n c e sw e r ea l s o o b s e r v e d o u rd a t a s h o w e dt h a t ，i nc o n t r o lz e b r a f i s h ，c ”o c h r o m ep 4 5 0c o m e ma n dn c ra c t i v i t y i nm a l e sa l e2 4 4 a n d13 9 h i g h e r ，r e s p e c t i v e l y ；f e m a l e sa l em o r e s u s c e p t i b l et oc y p 3 at h a nm a l e sf o l l o w i n ga t r a z i n et r e a t m e n t ，a p n da n d e r n dl e v e l sw e r ef o u n dt ob eh i g h e ri nf e m a l e st h a ni nm a l e s 2 e f f e c to fa t r a z i n eo ng l u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s e ( g s t ) a c t i v i t y i n z e b r a f i s hl i v e r ：o u rp r e s e n tr e s u l t se v i d e n c ed i f f e r e n tt r e n d si ng s ta c t i v i t y b e t w e e nb c i t hm a l e sa n df e m a l e so fz e b r a f i s h c o m p a l e dt ot h ec o n t r o l s ，f o r m a l e s ，t h eg s ta c t i v i t ya ta l la t r a z i n ec o n c e n t r a t i o n s ( 0 01 ，0 1 ，1m g l ) w a s s t i m u l a t e dm a r k e d l yt h r o u g h o u tt h ed u r a t i o no ft h ee n t i r ee x p e r i m e n tw h i l ea s i g n i f i c a n ti n h i b i t i o no ft h ea c t i v i t ya tl m g la t r a z i n ea td a y s5a n d2 0 f o r f e m a l e s ，s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s ew a sf o u n da to 1m g lo nt h ed a y s5a n d15 w h i l eo 01m e g lo nt h ed a y2 0 m o r e o v e r ，g e n d e r - b a s e dd i f f e r e n c e sw e r ea l s o o b s e r v e do ng s ta c t i v i t y 3 e f f e c to fa t r a z i n eo nd n a d a m a g ei nz e b r a f i s hl i v e r ：i nt h es i n g l ec e l l g e le l e t r o p h o r e s i st e s t ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，o l i v et a i lm o m e n t so fd a n i o r e r i ow a se r d a a n c e da f t e rt r e a t m e n tw i t hd i f f e r e n td o s e so fa t r a z i n eo nt h ed a y s 5 ，10 ，15 ，2 0 ，a n d2 5 ，a n dd n af r a g m e n t a t i o ns h o w e dad o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p ，d n ad a m a g ei n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n ga t r a z i n ec o n c e n t r a t i o n s ， a n ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw e r ef o u n dc o m p a l e dt ot h ec o n t r o l s k e y w o r d s ：a t r a z i n e z e b r a f i s h c y t o c h r o m ep 4 5 0 g s tc o m e ta s s a y 4 山东农业人学顾十学位论文 a p n d c d n b d e a d e i d i a d t t e d t a e r n d g s t g s h g s s g m f o n a d p h n c r o d o e c d p 4 5 0 p m s f r o s s c g e t r i s u v 英文缩略表 a m i n o p y r i n en - d e m e t h y l a s e 1 - c h l o r o - 2 ，4 - d i n i t r o b e n z e n e d e s e t h y l a t r a z i n e d e s e t h y l d e i s o p r o p y l d e i s o p r o p y l a t r a z i n e d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n ed i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d e r y t h r o m y c i nn - d e m e t h y l a s e g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e r e d u c e dg l u t a t h i o n e g l u t a t h i o n eo x i d i z e d m i x e d f u n c t i o no x i d a s e n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d eh o s p h a t e n a d p h p 4 5 0r e d u c t a s e o p t i c a ld e n s i t y o r g a n i z a t i o no fe c o n o m ya n dc o o p e r a t i o n d e v e l o p m e n t c y t o c h r o m ep 4 5 0 p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s i n g l ec e l lg e le l e t r o p h o r e s i s t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e i j l t r a - v i o l e t 5 氨基比林n 脱甲基酶 2 ，4 二硝基氯苯 脱乙基莠去津 羟基化莠去津 脱异丙基莠去津 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 红霉素- n 脱甲基酶 谷胱甘肽硫转移酶 还原型谷胱甘肽 氧化型谷胱甘肽 多功能氧化酶 还原型辅酶i i 细胞色素p 4 5 0 还原酶 光密度 联合国经济合作与发展 组织 细胞色素p 4 5 0 苯甲基磺酰氟 活性氧 单细胞凝胶电泳试验 三羟甲基氨基甲烷 紫外 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出 重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责 任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸 质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学 位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录 到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 董巫两 日期：皇篮多、烨 莠去津对斑马鱼解毒酶系及d n a 损伤的影响研究 1 引言 环境激素( e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e ) ，又称“内分泌干扰物质”、“环境荷 尔蒙”，英文名e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s 或e n d o c r i n ed i s r u p t o r s ，是一 类对人类健康和生态环境极其有害的化学物质。环境激素是2 0 世纪9 0 年 代以来才引起世界重视的一种公害。世界卫生组织给环境激素作了严密的 定义：“使内分泌功能发生变化，并因此而对个体及其子孙或者集团( 部分 是亚集团) 产生有害影响的外因性化学物质或者混合物”。环境内分泌干扰 物可以模拟自然激素，抑制激素作用，或者改变免疫系统、神经系统和内 分泌系统正常的调节功能( t h o m a s ，1 9 9 8 ) ，国外己有研究表明多种在环境 中广泛存在的有机化合物具有类雌激素作用，产生对水生生物特别是鱼类 繁殖的影响( j o b l i n g ，1 9 9 8 ) ，例如抑制鱼类卵泡发育、改变鱼体内性激素水 平。 环境激素来源广泛，天然来源主要指植物性雌激素，而目前研究主要 集中在人为释放的环境激素，如农用化学品，而又以杀虫剂和除草剂居多。 1 9 9 9 年世界自然基金会公布了环境中被报告具有生殖和内分泌干扰作 用的化学物质清单，列出了1 2 5 种环境激素，包括2 9 种除草剂、1 5 种 杀菌剂、3 8 种杀虫剂、4 种其它农药、3 9 种工业化合物和污染物( 包括 铅、镉、铝和汞四种金属) 。其中农药有8 6 种，共占1 2 5 种环境激素中的 6 8 8 。因此，农药类环境激素在所有环境激素中占了很大的比例。农药 类环境激素具有使用范围广、可以通过食物链进入人体及在生物体内具有 蓄积作用的特点，所以与其他环境激素相比农药类环境激素对人类的潜在 威胁更大，对农药类环境激素的研究具有重要意义。 。农药类环境激素与其他类环境激素相比，有其特殊性。首先，农药类 环境激素使用普遍，污染范围广。可以说，从目前的情况来看，人类是离 不开农药的，人们不仅在农村，在农田、草场和森林中使用农药，同样在 城市绿地和园艺景观中使用大量农药。农药的广泛使用导致了农药污染的 普遍存在，而这些农药中，有很多是环境激素类物质，也导致了人类长期 暴露在农药类环境激素污染中。其次，农药类环境激素可以直接通过食物 链进入人体。大部分农药在使用过程中都会存在不同程度的残留，残留在 农产品中的农药及其代谢产物，通过人们的食用就可以直接进入人体，这 6 山东农业人学硕士学位论文 是农药类环境激素与其他类环境激素的一个不同之处。再则，农药类环境 激素在生物体内有蓄积作用。许多农药类环境激素，像有机氯农药，是亲 脂性物质，进入生物体后可以在生物体的脂肪中逐渐累积，具有蓄积作用。 由于这种蓄积作用的存在，导致一些在环境中含量较低的农药类环境激素 也可能在生物体内产生慢性毒性危害。根据农药类环境激素的这些特点可 以得出：与其他类环境激素相比，农药类环境激素与人类的关系更为密切， 从某种程度上来讲，对人类的潜在威胁更大，更需要人们的高度重视。 莠去津是世界范围内广泛使用的除草剂之一，近年来又被列为环境激 素的一种。 1 1 莠去津概述 1 1 1 莠去津的结构和理化性质 莠去津( a t r a z i n e ) ，又名阿特拉津，氯乙异丙嗪，化学学名2 一氯4 一 乙基胺6 异丙基胺1 ，3 ，5 三嗪，属于三嗪类除草剂，分子式为c s h l 4 c 1 n 5 ， 分子量2 1 5 7 ，结构式为： ( c h 3 ) 2 ch c 2 h 3 纯品为无色结晶，熔点1 7 3 1 7 5 ，蒸气压4 0 1 0 p a ( 2 0 。c ) ，2 5 时在水中的溶解度为3 3m g l ，正戊烷中为3 6 0 m g l ，二乙醚中为2 0 0 0 m g l ，醋酸乙酯中为2 8 ，0 0 0m g l ，甲醇中为1 8 ，0 0 0m g l ，氯仿中为5 2 ，0 0 0 m g l 。在微酸及微碱介质中较稳定，在较高的温度下能被较强的酸和较 强的碱水解。莠去津原粉为白色粉末，纯度在9 2 以上( 王险峰，2 0 0 0 ) 。 实验室条件下，p h 为5 - 9 时，莠去津可稳定3 0 天而没有浓度变化，在中 性状态下，其半衰期可达1 5 0 1 8 0 天( 严登华等，2 0 0 5 ) 。 莠去津对斑马鱼解毒酶系及d n a 损伤的影响研究 1 1 2 莠去津的应用概况及存在问题 莠去津属选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂。现在生产上常用的多 为莠去津与酰胺类除草剂乙草胺、丁草胺、异丙甲草胺的混配制剂。由于 玉米等某些植物体内含有谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) ，它能够催化谷胱甘肽 ( g s h ) 与莠去津进行反应生成可溶于水的结合体，从而使莠去津迅速失 活，因此该除草剂适用于玉米、高粱、果园和林地等，可防除一年生禾本 科杂草和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用( 中国化工产 品大全，1 9 9 4 ) 。 目前，莠去津仍为国际上出售的主要除草剂之一，在美国被列为最广 泛使用的除草剂之一，每年喷洒4 1 0 4 t ，占其除草剂使用量的6 0 ( 叶常 明，1 9 9 9 ) 。我国从2 0 世纪8 0 年代初开始使用莠去津，近年来使用面积不 断扩大，1 9 9 6 年全年的使用量为1 8 0 0 t ( 有效成分) ，2 0 0 0 年为2 8 3 5 2 t ( s i n t e i n ，1 9 9 6 ) ，每年用量平均以2 0 的速度递增，近年其在中国的年使用 量已达到5 0 0 0 t ( r e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 莠去津的广泛应用，导致了其严重的环境污染。许多莠去津使用历史 较长的国家的地表水和地下水均受到了不同程度的污染。美国环保署报 道，在美国大约2 5 个州的地下水中检测到了莠去津。1 9 8 7 年，在对爱荷 华州的公共水系的调查中发现，离农药销售点1 0 0 0 英尺范围内的1 8 口井 中有1 6 口井中能够检测到包括莠去津在内的农药；在爱荷华州2 8 个销售 点的土壤、地表水和地下水中能够检测到高剂量的农药，在土壤中莠去津 的最大含量为1 1 0 0 i ，t g g ，在地表水中为1 6 p g l ，地下水中为1 5 0 0 p g l ， 均超过美国环保署规定的最大安全浓度3 r d l ( f a w c e t t ，1 9 8 9 ) 。在19 9 1 19 9 2 年美国u n i t e ds t a t e sg e o l o g i c a ls u r v e y ( u s g s ) 调查发现，w e s tl a k e 湖的1 3 个水样中有1 1 个水样的莠去津的浓度超出了饮用水的标准。 h o f f m a n 等( 2 0 0 0 ) 在对美国8 条城市河流中农药含量作比较时，发现莠去 津、西玛津、甲草胺等除草剂被检出率很高。在对加拿大魁北克市y a s m s k a 河河口附近的水域及其5 个直流的研究发现，莠去津的最高浓度一般超过 了加拿大为保护水生生物而制定的水质标准， 鸟类 鱼类 无脊椎动物体。且p 4 5 0 酶 系活性因不同生物的改变而呈现出种群差异。 解毒功能是p 4 5 0 酶系在生物体内具有重要的生理功能。有些通过细 胞色素p 4 5 0 的生物转化作用对生物体是必需的，如胆固醇转化成皮质激 素和性激素。一些疏水的外来物质，经细胞色素p 4 5 0 催化反应后，形成 极性更高的物质而更易被生物体直接排泄或通过与水溶性物质( 如葡糖醛 酸和谷胱甘肽) 结合后排除，这通常是解毒过程。在某些情况下，外来物 质可能被转化为比细胞毒性、致突变性或致癌作用更强的物质，而起毒性 活化作用( p o r t e re ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 影响c y p 4 5 0 活性的因素很多，就性别和性成熟方面来讲，动物肝 脏对外来物的转化随青春期的开始而显示出性别差异。此种差异贯穿于整 个成年期，它在很大程度上是由淄族及多肽类等激素调节的。鱼类中也存 在类似的性别差异。雄鱼c y p 4 5 0 水平和单加氧化酶活力显著高于雌鱼。 尤其是在繁殖期，雌鱼c y p 4 5 0 活力急剧下降，同时伴随着对诱导剂及 抑制剂敏感性的降低( m a r y , 1 9 9 3 ) 。s o l e 等( 2 0 0 0 ) 在对产卵前鲤鱼注射e e 2 后研究发现，受试鱼c y p 4 5 0 单加氧酶系活性，尤其c y p l a ，以及参与 c y p 4 5 0 发挥作用的n a d p h 细胞色素p 4 5 0 还原酶都表现显著抑制。 这种性别差异是由激素调控的。 另外在温度方面，低温可延长达到最大酶活性所需时间，从而影响到 诱导过程。鱼肝中c y p 4 5 0 酶系比哺乳动物的c y p 4 5 0 酶系对温度的适 应性差。在鱼肝中，单加氧化酶活性以一种补偿性的形式受最适温度的调 控。在标准的诱导温度下进行试验，通常适应较低温度的鱼比适应较高温 度的鱼表现出更高的单加氧化酶活性( a n d e r s s o n ，1 9 8 5 ) 。在自然环境的温 度下进行分析，不同鱼种的酶活力却是近似的。 1 3 2c y p 4 5 0 作为生物标志物在毒理学上的应用 c y p 4 5 0 酶系活性是一种便捷的污染物毒性评价机制和早期监测模 莠去津对斑马鱼解毒酶系及d n a 损伤的影响研究 型，它通过研究污染物对生物体的毒性伤害和生物体早期所表现出的药物 对细胞水平生物标记物的诱导状况之间的关系，并以毒性伤害为污染物的 毒性评判标准，来确定污染物与酶之间的量效关系，从而判断污染物在环 境中的毒性及其残留量。c y p 4 5 0 具有免疫特性，可根据某些特异反应， 提供毒物类型和不同作用信息。能提供定性定量数据，从生理角度上为定 性效应提供解释，进而外推至毒物对种群、群落的影响。 国外针对p 4 5 0 酶系的研究已有5 0 多年的历史，它首次出现于文献中 是在1 9 6 2 年。其后在2 0 世纪7 0 年代，p 4 5 0 酶系在致癌物代谢中的重要 作用得到证实，方法和技术的改进使增溶和纯化p 4 5 0 及重组p 4 5 0 酶系活 性成为可能，由此证明了许多细胞色素p 4 5 0 在物理学和酶学性质的不同。 在2 0 世纪8 0 年代，分子生物学技术的应用，对p 4 5 0 的认识有极大的促进。 到了9 0 年代，p 4 5 0 的研究重点在于对p 4 5 0 基因表达机制和p 4 5 0 结构与 功能的关系的研究。近1 0 年来，p 4 5 0 的研究成果已开始涉及农业、环境、 医药及基础研究各领域。现今，p 4 5 0 被开始着重于其作为生物标志物的 研究。 作为生物指标，p 4 5 0 酶在毒理学中的应用日渐广泛，具有极大的潜力。 例如，可用于探讨低剂量环境污染物对机体有关代谢酶系的长期影响及可 能的潜在危害，从而防治慢性中毒：研究外来物的致癌性；研究药物氧化 代谢遗传多态性分子机制，指导临床个体化用药：评价沉积物毒性等，从 而为大环境的调整提供有力证据。 以p 4 5 0 酶系作为毒物毒性的生物学标志物( b i o m a r k e r ) 已广泛应用于 毒理学研究。其中，肝细胞色素p 4 5 0 酶系的诱导已被提出作为评价环境污 染状况的最灵敏的生物学反应之一。 与传统的生态毒理学方法相比，以p 4 5 0 为生物指标评价毒物毒性有如 下优点( 朱琳，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 一般认为，哺乳动物和人的p 4 5 0 酶系对外来物的氧化过程的机理 是一致的，因此，在动物试验中以p 4 5 0 酶系为指标，所测得的毒物毒性， 作用机理更有把握外推到人身上。 ( 2 ) 能对某种化合物可能引起的生态效应提供早期预警信号。 ( 3 ) p 4 5 0 具免疫特异性，可根据某些特异性反应提供毒物类型和不同 1 4 山东农业大学硕士学位论文 作用的信息。 ( 4 ) 极为敏感。 ( 5 ) 相对来说，处理过程较为简单，操作简便，费用较低，能在很短 时间内得出结果。 ( 6 ) 能提供定性、定量数据，从生理角度为定性效应提出解释，并进 而外推至毒物对种群、群落的影响。 如今，c y p 4 5 0 作为生物标志物指示环境污染在毒理学上已受到高度 重视，国际上已有相关报道，且研究较多的是淡水鱼类、海洋鱼类和贝壳 类。鱼类生活于水中，其急、慢性毒性试验操作方便，管理上也比较经济。 利用鱼类动物的p 4 5 0 对环境污染物进行生物监测，与传统的理化分析手 段相比，具有直观、客观、综合和历史可溯源性的特点，能更真实更直接 反映环境污染的客观状况，这种综合性和真实性是任何化学监测无法比拟 的。在鱼类，细胞色素p 4 5 0 主要被作为指示工农业污水对水环境污染的 生物标志物研究。目前认为c y p l 家族成员是监测水环境污染最敏感的指 示器( s c h l e n k e ta l ，2 0 0 2 ) 。c r i s t i n en a s e i 等研究了p 4 5 0 在海洋鱼类中的分 布。b r i u b o 证明，鱼类的p 4 5 0 主要分布于肺、肾和鳃。而赤鲷鱼( s c u p ) 心肌中的p 4 5 0 含量明显低于肝脏。法国g a l g a n i 等利用两种海鱼的e r o d 活性作为监测p a hs 和p c b s 的指标( g a l g a n l fe t a l ，1 9 9 2 ) ，对周边海域环 境多环芳烃与多氯联苯进行监测；挪威也把蛤鱼c y p i a 的诱导作为监测 周边海域石油类化合物、p a h s 、p c b s 、t c d d s 其他卤代化合物以及农药 等污染的指标( a n d e s ，1 9 8 7 ) 。r v a n d e ro o s t 等以鲤鱼为研究对象的研究中 亦发现高污染处p 4 5 0 酶类的变化显著，数据的多元化分析为评价内陆水 环量的一种有效方法。相对来说，国内在此方面的工作较少。朱必风等 ( 1 9 9 5 ) 提出可用鲫鱼肝微粒体芳烃羟化酶指示水体中多环芳烃的污染。 霍传林等用鱼肝e r o d 活性作为生物标记物来指示大连近海部分水域多 氯联苯类物质的污染状况。 此外，c y p 4 5 0 不仅可作为环境污染物敏感的生物标记物，还可作为 人体内异生物对体内血红素紊乱、肺癌诊断和预防的早期标志物。 莠去津对斑马鱼解毒酶系及d n a 损伤的影响研究 1 4g s t 概述 1 4 1g s t 简介 自然界中的各种生物，为避免受到内源性或外源性化学物质，尤其是 毒性物质的损害，在进化过程中形成了一套代谢此类物质的解毒酶系统。 谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) ，广泛存在于各种生物体内的由多个基因编码的、 具有多种功能的一组同工酶，分子量为2 3 - 2 9k d a ，是生物体内最重要 的i i 相解毒代谢酶，可分为胞质型、胞膜型、线粒体型等。g s t 主要功 能为：一方面，催化还原性谷胱甘肽( g s h ) 与毒性化合物的活性产物共轭 结合，可减弱毒性，增加水溶性，利于毒物从尿和胆汁排泄，在解毒系统 中起重要作用( 张酉哲，1 9 9 6 ) 。另一方面，还可催化g s h 与亲电中间代 谢物的结合，减少这些化合物与细胞内生物大分子如d n a 等结合的可能 性，清除脂类过氧化物，抑制脂质过氧化作用，间接诱导d n a 修复，维 持细胞基因组完整性的作用，是抗氧化酶系的组成之一( 向华，2 0 0 0 ；彭佑 群，2 0 0 4 ) 。 和哺乳类动物类似，g s t 也是广泛在鱼类各组织中，如s e n 和 k i r i k b a k a n ( 2 0 0 4 ) 发现野生黑海鲻i z as a l i e n s ) 肝、肾、睾丸、前肠和鳃 中g s t 活性都很高( s e n e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。但不同组织之间g s t 活性也有差异， 通常是肝脏g s t 活性最高。如尼罗河中3 种鱼类，尼罗罗非鱼( o r e o c h r o m i s n i l o t i c u s ) 、鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 和c l a r i sl a z e r a 肝脏g s t 活性都高于肾 脏和鳃( h a m e de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。大马哈鱼( s a l mo s a l a r ) 和( s a t mo t r u t t a ) 肝脏 g s t 活性也都显著高于肾脏( n o v o a v a l i n a se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。这种分布特征和 哺乳动物类似。 1 4 2g s t 作为生物标志物在毒理学上的应用 g s t 活性对机体的保护作用至关重要。有研究指出，g s t 的表达水 平是决定细胞对化学物质敏感性至关重要的因素，g s t 的诱导是生物对化 学胁迫的适应性反应( g a d a g b u ia n dj a m e s ，2 0 0 0 ) 。g s t 的活性可在许多情 况下被诱导而发生变化。h a y e s 和p u l f o r d l s s ( 1 9 9 5 ) 报道，g s t 参与有机磷 农药的轭合和卤化还原反应是g s t 表达和催化作用的一个重要特征。一 1 6 山东农业大学硕士学位论文 些报道指出，鱼类、虾类、贝类暴露于有机磷、有机氯和菊酯类农药后， 其g s t 活性发生明显变化，活性受到诱导，并与暴露时间和暴露浓度相 关( a l v e s a e ta l 。，2 0 0 2 ；g o w l a n d ae ta l 。，2 0 0 2 ) ，因此其变化可以作为监测环 境污染的一项灵敏指标。 在以g s t 活性为生物标记物的毒理诊断中，g s t 活性对污染物暴露的 指示作用在水体环境中的研究较多( d ig i u l i oe ta 1 ，19 9 3 ；b e b i a n n oe ta 1 ， 2 0 0 6 ；f e r r e i r ae ta 1 ，2 0 0 6 ) ，而水生动物g s t 的研究主要集中在鱼类。 有机污染物对鱼类g s t 活性的影响。d ig i u l i o 等( 1 9 9 3 ) 将鲶鱼暴露子 b l a c kr o c k 海港底质中，发现肝脏g s t 活性在1 4d 时被显著诱导，但2 8 d 时与对照无明显差异。w a n g 等( 2 0 0 4 ) 发现，苯并( a ) 芘和芘暴露7d 对 梭鱼肝脏中g s t 活性的影响主要为诱导效应，而在暴露于两者的混合物 1 5d 后，g s t 活性被显著抑制。孙媛媛等( 2 0 0 6 ) 报道暴露于0 0 5m e j l 菲 的金鱼肝脏g s t 活性被显著抑制。b ( a ) p 暴露剂量分别为5m g k g 和1 0 m g k g 对非洲鲶( c l a r i a sg a r i e p & u s ) ( m d e g e l ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 、鲽( l i m a n d a l i m a n d a ) ( v a ns c h a n k ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 肝脏g s t 活性都没有显著影响。 农药对鱼类g s t 活性的影响。有机磷农药如谷硫磷( a z i n p h o s m e t h y l ) 暴露可以使尼罗罗非鱼和鲤鱼的肾脏以及鲤鱼肝脏g s t 活性升高，但对 尼罗罗非鱼肝脏g s t 活性没有影响( o r u ea n du n e r ，2 0 0 0 ，2 0 0 2 ，2 0 0 4 ) 。最 近r a o 等人( 2 0 0 6 ) 报道了一种新型有机磷农药r p r 2 i i ( 2 b u t e n o i c a c i d 3 ( d i e t h o x y p h o s p h i n o t h i o y l ) m e t h y l e s t e o 使用量为0 0 1 7 m g l 时就可以 诱导莫桑比克罗非鱼( o r e o c h r o m i s mo s s a m b i c u s ) 肝脏g s t 活性。除草剂 方面，复禄芬( o x y f l u o r f e n ) ( p e i x o t oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 和百草枯( p a r a q u a t ) ( f i g u e i r e d of e m a n d e se ta 1 ，2 0 0 6 ) 暴露都可以导致尼罗罗非鱼肝脏g s t 活 性增加。在国内，朱国念等( 2 0 0 2 ) 发现杀虫安( 0 2 3 4m g l ) 对麦穗鱼 ( p s e u d o r a s b o r ap a r v a ) 和鲤鱼肝脏g s t 活性均具诱导作用，而氰氟草酯 ( 1 2m g m ) 仅诱导了麦穗鱼的g s t 活性；当杀虫安与氰氟草酯混合处理时， 对麦穗鱼g s t 活性的诱导效应最为明显。陈家长等( 2 0 0 7 ) 研究结果表明， 低浓度莠去津与鲫鱼肝脏、肾脏和肌肉g s t 活性问存在较显著的剂量一效 应和时间一效应关系。总体而言，鱼类g s t 对有机磷农药和除草剂暴露比 较敏感。 1 7 莠去津对斑马鱼解毒酶系及d n a 损伤的影响研究 水生动物g s t 研究的一个广阔应用前景是以g s t 为生物标志物应用 于检测或表征水体污染程度或水生生态环境状况。目前，虽然鱼的g s t 不象p 4 5 0 那样作为一项可靠的生物指标，但它的指示作用己引起了人们 的注意。g s t 在鱼体中参与的非生物物质的解毒作用是人们很需要了解 的，而对解毒系统两阶段酶的同时检测也可以提供非常重要的信息，两者 的结合研究将更全面反映解毒系统的状态及毒物对机体影响的大小。随着 对鱼的g s t 基因的诱导、调节的表达过程的更多了解，可以预见，g s t 测定有可能成为非常有用的生物监测手段。 1 5 单细胞凝胶电泳( s c g e ) 概述 1 5 1 单细胞凝胶电泳简介 许多化学物经生物体代谢活化后，作用于细胞内的d n a ，对d n a 的 结构和稳定性产生影响，导致d n a 分子的各种损伤，包括d n a 链的断 裂、交联( d n a 链内、链间或d n a 和蛋白质之间发生交联) 、d n a 加合 物的形成。因此各种类型的d n a 损伤可以作为暴露或效应生物标志物。 单细胞凝胶电泳( s c g e ) ，又称彗星实验( c o m e t a s s a y ) ，是o s t l i n g 和 j a n h a n s o n 于1 9 8 4 年发明的一种单细胞d n a 电泳技术，其后由s i n g h 和 o l i v e 分别加以改进，使之成为一项日臻完善的定量检测d n a 双链或单链 缺口的技术。彗星实验是一种建立在单细胞水平上检测d n a 损伤与修复 的技术，因其具有简便、快速、敏感性高、迅速、所需样品少等特点被广 泛应用于所有有核细胞的检测( a s h b ye ta 1 ，1 9 9 5 ；m o l l ，e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 5 2s c g e 作为生物标志物在毒理学上的应用 近年来，在工农业生产实践中，大量的污染物质进入了土壤和水体， 通过多种途径影响环境，并最终影响人类的身体健康。早期关于土壤毒理 学的研究多是通过测定土壤中污染物质的浓度来表现的，但是因为土壤本 身组成的复杂性，单纯用污染物质的浓度是很难代表其潜在的毒性，只有 生物毒性评价的结果可以提供复杂条件下多种污染物质的综合毒性。 s c g e 从细胞