（预防兽医学专业论文）农杆菌介导新城疫病毒Lasota株HN基因在苜蓿表达研究.pdf

捅要 农杆菌介导新城疫病毒l a s o t a 株h n 基因 在苜蓿表达研究 预防兽医硕士研究生：胡拥军 指导老师：王豪举玉永雄 摘要 新城疫( n d ) 由新城疫病毒o m v ) 引起，该病传播迅速，发病率和死亡率都在9 5 以上， 常给养鸡业造成了巨大的经济损失。n d v 的h n 糖蛋白具有良好的免疫原性，已经在痘病毒、 杆状病毒和大肠杆菌等载体系统中获得表达。随着基因生物技术的迅速发展，利用植物生产 转基因蛋白成为了研究热点，而苜蓿作为一种生物反应器，具有操作方便、可规模化生产等 优势。将n d v 的f i n 基因导入苜蓿中表达后饲喂鸡群，既有可能使动物机体产生n d 抗体， 增强免疫力，又可提供营养、改善畜禽产品品质。因此，其潜在应用前景非常良好。 1 重组质粒p b l l 2 1 - h n 的稳定性 取菌种农杆菌菌株l b a 4 4 0 4 接种于y e b 液体培养基中复苏，然后转接于含s 0 m g lk m 的y e b 培养基中选择培养。为了检测重组质粒p b i l 2 1 - h n 的稳定性，取对数生长期中的农 杆菌l b a 4 4 0 4 培养物离心洗涤，提取质粒d n a ，并进行酶切和f c r 鉴定。结果酶切和p c r 扩增均得到了预期目的条带，表明重组质粒p b i l 2 1 - h n 在农杆菌l b a 4 4 0 4 中稳定。 2 转化中抗生素及其浓度的筛选 选取青霉素类和头孢菌素类几种抗生素，对农杆菌菌株l b a 4 4 0 4 进行药敏试验：将西农 1 5 号苜蓿叶片接种子含c e f 培养基中，观察苜蓿愈伤组织形成情况。结果浓度为4 0 0 m g l 的 c e f 完全能抑制农杆菌l b a 4 4 0 4 的生长；c e f 对西农1 5 号苜蓿叶片出愈影响不大，浓度范围 在2 0 0 4 0 0 m g l 时愈伤组织诱导率为7 9 8 4 ，与对照组无显著差别。表明农杆菌菌株 l b a 4 4 0 4 对头孢噻肟钠( c e f ) 敏感，故我们选用浓度为4 0 0 m g l 的c e f 作为脱菌剂。 以苜蓿总d n a 为模板扩增n p t i i 基因的7 3 5 b p 片段，检测西农1 5 号苜蓿对卡那霉素 ( k i n ) 的内源抗性。结果未能获得目的条带，表明西农1 5 号苜蓿不存在k m 抗性基因，可 以作为转化材料。 以西农1 5 号苜蓿叶片为外植体，经不同的处理，然后转入含k ms h 培养基中。观察愈 伤组织形成及分化成胚状体的情况，统计诱导率和分化率；将愈伤组织接种于含k i nm s 0 培 养基中，观察胚状体形成的情况，统计分化率。结果：不经过预培养处理，叶片在i o n 浓度达 到4 0 m g l 时，出愈率仅为8 ，分化率也仅为2 ，抑制作用明显；黑暗下预培养3 天，叶 片在1 0 m g lk m 浓度下诱导率和分化率较高，分别为6 8 和4 6 ，其它浓度下诱导率及其 分化率都比较低，与对照组相比；光照下预培养3 天，叶片在k m 各浓度下诱导率较高，均 在5 8 以上，在1 0 m g lk i n 培养基中所形成愈伤组织的分化能力较强，分化率达到5 4 ， 但在4 0 m g lk m 培养基中所形成愈伤组织的分化能力较低，分化率仅为6 ：当k m 浓度在 1 0 8 0 m g l 的范围内时，黑暗或光照下预培养8 天叶片的诱导率均比较高，但分化率随k m 浓度升高而显著下降，在超过4 0 m g lk m 浓度下所形成的愈伤组织大部分不能继续分化；愈 西南大学硕士学位论文 伤组织在k m 浓度超过2 0 m g l 时。分化率随浓度升高而迅速下降，当k m 浓度达到5 0 m g l 时，基本不分化。以上结果表明：k m 对脱分化和再分化期细胞作用强烈，能显著抑制愈伤 组织形成和胚状体萌发，对分裂期细胞作用缓慢，不能显著降低叶片的出愈率，但明显减弱 所得愈伤组织后期分化成胚状体的能力，在转化中浓度为4 0 m g l 的k m 对转化体作用3 0 天 能够筛选出转化体。 3 ，新城疫病毒l a s o t a 株h n 基因的转化与鉴定 通过农杆菌介导，将重组质粒p a l l 2 1 - h n 中的h n 基因整合到西农1 5 号莒蓿d n a 中。 并用4 0 m g l 的k m 作用3 0 天对转化体进行筛选，结果共获得了3 8 株再生植株。以苜蓿总 d n a 进行标记基因( n 阼基因) 与目的基因( h n 基因) p c r 扩增，结果共有5 株能再生 植株能够扩增出n p t - i i 基因的7 3 5 b p 片段和i - i n 全长基因。提取苜蓿蛋白进行新城疫病毒 i n 蛋白质s d s - p a g e 检测，结果从其中4 株再生植株中获得目的蛋白质带，表明已经成功 表达了新城疫病毒l a s o t a 株h n 基因蛋白。本实验优化了转化系统，并获得了新城疫病毒 l a s o t a 株f i n 基因转基因苜蓿，为生产新城疫口服疫苗研究打下基础。 关键词：新城疫病毒；h n 基因：农杆菌；苜蓿；表达 i i s t u d i e so ne x p r e s s i o no fh ng e n eo fn d vs t r a i n l a s o t ai na l f a l f ab y a g r o b a c t e r i u mm e d i a t e d m a j o r ：p r e v e n t i v ev e t e r i n a r y c a n d i d a t e ：h uy o n g j u n a d v i s o r ：w a n gh a o j u y u y o n g x i o n g a b s t r a c t n dw h i c ho f t e nc a u s e db yn d vh a sl e dt h eh u g ee n 删cl o s st op o u l t r yr a i s i n g b e c a u s e n d vi n f e c t e dr a p i d l y , t h em o r b i d i t ya n dt h em o r t a l i t yo fn dw e r eo v e r9 5 b c c a n s eo fi t sg o o d i m m u n o g e n i c i t y , h ng ：【u c o p m t e i no f n d vh a de x p r e s s e di ne x p r e s s i o ns y s t e m sw h i c hw e r ef r o m t h e p o x v i r u s , b a c u l o v i r u s , e n l i b a c i l l u s , a n d s o o i l a l o n gw i t hg e n e f i cb i o g e n g i n e e rr a p i d d e v e l o p m e n t ，t r a n s g e n i cp r o t e i np r o d u c tf r o mp l a n th a db e c o r n et h er e s e a r c hh o ts p o t a s0 1 1 0o f t h e b i o l o g i c a lr e a c t o r s , a l f a l f ah a ds u p e r i o r i t yi n t h e e a s yo p e r a t i o n , t h em a s sp r o d u e t i o m a n d8 0 o n a f t e rb e i n gf e dt of o w l s , t r a u s g e n i ca l f a l f ac o n t a i n i n ge x p r e s s i o np r o d u c to fh ng e n eo f n d v , n o to n l ym a yc 锄】s ct h en da n t i b o d yt op r o d u c ei na n i m a lb o d ya n dg n h a n c et h er e s i s t a n t a b i l i t yo ft h ea n i m a lo r g a n i s mt od i s e a s e ，b u ta l s oc a np r o v i d et h en u t r i t i o na n di m p r o v ep o u l t r y p r o d u c t q u a l i t y s o t r a n s g e n i ca l f a l f a c o n t a i n i n ge x p r e s s i o n p r o d u c t o f h n g e n eo f n d v h a s a g o o d p o t e n t i a la p p l i c a t i o np r o s p e c t 1 s t a b i l i t yo f r e c o m b i n a n tp l a s n l i dt h ep b l l 2 1 - h n a f t e rr e v i v i n gi nt h el i q u i dm e d i u my e b ，t h ea g r o b a e t e r i u ms t r a i nl b a 4 4 0 4g r e ws e l e c t i v e l y i nt h em e d i u my e bc o n t a i n i n g5 0 m g lk m 1 no r d e rt od e t e r m i n et h es t a b i l i t yo fr e c o m b i n a n t p l a s m i dt h ep b l l 2 1 一h ni nt h ea g r o b a c t e r i o m ，d n ae x t r a c t i o nf r o mc u l t u r eo ft h ea g r o b a c t e r i u m s w a i nl b a 4 4 0 4o nl o gp h a s et h r o u g hc e n t r i f u g ea n ds e r u b b i n g i h a db e e nd i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i o n e r l z y m ea n da m p l i f i e db yp c t h ea n t i c i p a t e dg o a lb a n d i n ga p p e a r e d s or e c o m b i n a n tp l a 蛳i dt h e p b i l 2 1 - h ne x i s t e ds t a b l yi nt h ea g r o b a c t e r i n ms t r a i nl b a 4 4 0 4 2 ，t h es e n s i t i v ea n t i b i o t i ca n di t se f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o ns e l e c t i o nd u r i n gt r a n s f o r m a t i o n t h ed r u gs e n s i t i v i t yt e s t sh a db e e nd o n eo nt h ea g r o b a c t e r i u r ns t r a i nl b a 4 4 0 4b ys o m ep e n i c i l l i n s a n dc c p h a l e s p o r i n s , a n dc a l l u sf o r m a t i o nw e r eo b s e r v e da f t e rt h e1 5 t hx i n o n ga l f a l f al e a v e sb e i n g c u l t i v a t e di nt h em e d i u mc o n t a i n i n gc e f t h ec o n c l u s i o nw a st h a t ：4 0 0 m g lc e fc o u l ds u p p r e s s d e f i n i t e l yt h ea g r o b a c t e r i u ms t r a i nl b a 4 4 0 4g r o w t l xc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，t h e i n f l u e n c eo fc e fo ni n d u c i n g - r a t eo fl e a v e sf r o mt h e1 5 t hx i n o n ga l f a l f ad i dn o th a v et h e r e m a r k a b l ed i f f e r e n c e ，a n dt h ec a l l u si n d u c i n g - r a t eo ft h el e a v e sw h i c hg r e wi nt h em e d i u m c o n t a i n i n g2 0 0 4 0 0 m e , lc e fw a sb e t w e e n7 9 8 4 i ti n d i c a t e dt h a tt h ea g r o b a c t e r i u ms t r a i n l b a 4 4 0 4 w a ss e n s i t i v e t o c e f s 0 4 0 0 m g l c e f w a ss e l e c t e d a sd e g e r m i n gr e a g e n t i no r d e rt od e t e c tt h eo r i g i n a lr e s i s t a n c et ok mo f t h e1 5 t hx i n o n ga l f a l f a t h e7 3 5 b pf r a c t i o no f n p t - i ig e n ew o u l da m p l i f i e df r o mt h ea l f a l f at o t a ld n at e m p l a t e t h eg o a lg e n ed i dn o ta p p e a r t h e l i t 西南大学硕士学位论文 l c o n c l u s i o nw a st h a tt h e1 5 t hx i n o n ga l f a l 血d i dn o th a v et h er e s i s t a n c eg e n et ok ma n di tc o u l d b e e nu s e di n1 1 1 et r a n s f o r m a t i o nt e s t a f t e rd i f f e r e n tp r e - c u l t u r em a n a g e m e n t ，e x p l a n tt h e1 5 t hx i n o n ga l f a l f al e a v e sh a db e e n i n d u c e dc a l l u si nt h em e d i u ms hc o n t a i n i n gk i n q u a l i t yo ft h ec a l l u sa n dt h ee m b r y o i df r o mt h e c a l l u sw e r eo b s e r v e d e n ds t a f f s t i ca b o u tt h ec a l i n si n d u c i n g - r o t ea n di t sd i f f e r e n f i a t i o nr a t ew a s d o n e w h i l ec a l l u sw a sg r o w i n gi nt h em e d i u mm s 0c o n t a i n i n gk m ，c a u u sd i f f e r e n t i a t i o nw a s 0 6 s e r v e da n ds t a t i s t i ca b o u tt h ec a h u sd i f f e r e n t i a t i o nr a t ew a sd o n e 殇ec o n c l u s i o nw a st h a t ：w h e n k mw a s4 0 m g l ，t h ei n h i b i t i o n0 nc a l l u sf o r m a t i o na n dc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o ns i g n i f i c a n t l y , c a l l u s i n d u c i n g - r a t eo fl e a v e s p r e - c u l t u r ew a so n l y8 a n dt h ec a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nr a t ew a s 2 a f t e r p r e c u l t u m3d a y si nd a r k ，l e a v e sg r e wi nt h em e d i u mc o n t a i n i n gt o m g & ，a n dt h er a t e so fc a l l u s i n d u c i n ga n dd i f f e r e n t i a t i o nw e r eh i g h , w e r e6 8 a n d4 6 t h er a t e o fc a l l u si n d u c i n ga n d d i f f e r e n t i a t i o nw g g q gl o w e ri nt h eo t h e rc o n c e n t r a t i o ng r o u pt h a ni nt h ec o n t r o lg r o u p a f t e r p r c - c u l t u r e3d a y so nl i g h t ，t h ec a l l u si n d u c i n g - r a t eo f l e a v e sg r o w i n gi nt h em e d i u mc o n t a i n i n ga l l k i n d sk mc o n c e n t r a t i o nw a s h i g h ，w a so v e r5 8 ；t h ea b i l i t yo f c a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nw a sp o w e r f u l a n dt h em t eo fd i f f e r e n t i a t i o nw a s5 4 w h e nl e a v e si n d u c e dc a l l u si nt h em e d i u mc o n t a i n i n g 1 0 m g lk r i l b u tt h ea b i l i t yo fc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nw a sw e a ka n dt h er a t eo fd i f f e r e n t i a t i o nw a s 6 1 e a v e si n d u c e dc a l l u si nt h em e d i u mc o n t a i n i n g4 0 m g a k i n a f t e rp r e - c u l t u r e8d a y si nd a r ko r o nl i g h t ，t h ec a l l u si n d u c i n g - r a t eo fl e a v e sg r o w i n gi nt h em e d i u mc o n t a i n i n gk ma tt h er a n g eo f 1 0 m g lt o8 0 m g lw a sh i g h ；m o s tc a l l u sc o u l dn o tc o n t i n u e t o d i f f e r e n t i a t i n g w h e nk m c o n c e n t r a t i o nw a so v e r4 0 m g l w h e nk i nc o n c e n t r a t i o no v e r2 0 m g l ，w i t ht h ei n c r e a s i n go fk m c o n c e n t r a t i o n , t h ec a l l u si n d u c i n g - r o t ed r o p p e dr a p i d l y ；w h e nk mc o n c e n t r a t i o nw a s5 0 r a g l , c a l l u sc o u l dc o n t i n u et od i f f e r e n t i a t i n gh a r d l y i ts h o w e dt h a n ：c a l l u sf o r m a t i o na n de m b r y i o d s g e r m i n a t i o nw e r eh o l db a c kr e m a r k a b l y , w h i c hw a sd u et ot h ek a nf i e r c er e s t r a i n t so nt h ec e l la tt h e d a d i f f e r e n t i a t i o na n dr e - d i f f e r e n t i a t i o np e r i o d c o n t r a r i l y , t h ei n f l u e n c eo fk mo nt h ec e l ld i v i s i o n p h a s ew a ss l o w , a n dc o u l dn o to b v i o u s l yr e d u c et h ec a l l u si n d u c i n g - r a t eo f t h el e a v e s ，b u tt h ea b i l i t y o f c a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nt oe m b r y i o dw a sw e a k e n e do b v i o u s l y t r a n s f o r m a n tc o u l db e e np i c k e do u t w i t h4 0 m g lk m t h r o u g h3 0d a y sd u r i n gw a n s f o r m a t i o n h n g e n eo f r e c o m b i n a n tp l a s m i dt h ep b i l 2 1 - h nh a db e e ni n s e r t e dd n a o f t b e1 5 t hx i n o n g a l f a l f ab ya g r o b a c t e r i u mm e d i a t i o n ，a n dt r a n s f o r m a n t sw e r ep i c k e do u tw i t h4 0 m g lk mt h r o u g h3 0 d a y s ，a n dw eo b t a i n e d3 8s t r a i n sr e g e n e r a t i o np l a n ta l t o g e t h e r m a r k e rg e n e ( n p t - i i ) a n dg o a lg e n e ( h n ) w e r eh a db e e na m p l i f i e df r o mt h ea l f a l f at o t a ld n at e m p l a t e a n dt h e7 3 5 b pf r a c t i o no f n p t - i ig e n ea n d t o t a l i - i ng e n ec o u l d b e e na m p l i f i e d f r o m d n a o f 5s w a i n sa m o n ga 1 1r e g e n e r a t i o n p l a n t s f o rs d s - p a g ea n a l y s i s ，t o t a lp r o t e i no fa l f a l f aw a se x t r a c t e d ，a n dt h e r ew a st a r g e t i n gp r o t e i n i n4s h a i n sa m o n ga 1 1r e g e n e r a t i o np l a n t i ts h o w e dt h a th ng e n eo f n d vo f s t r a i nl a s o t ah a db e e n e x p r e s s e di nt h i s4s t r a i n sr e g e n e r a t i o np l a n t w eo p t i m i z e dt h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e ma n do b t a i n e d t r a n s g e n i ca l f a l f ac o n t a i n i n gh ng e n eo f n d v o f s t r a i nl a s o t a t h es l u d yh a db u i l tt h ef o u n d a t i o n f o r t h er e s e a r c ha b o u tb i do r a lv a c c i n ep r o d u c t i o n k e yw o r d s ：n d v ；h ng e n e ；a g r o b a c t e r i a m ；a l f a l f a ；e x p r e s s i o n 独创性声明 学位论文题目：盔扛菌金昱堑越瘥瘤耋l 堑q 堕拯至丛基因在苴蕉麦运 班究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：掮抵罨 签字日期：列刀年夕月二1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文储张獭i 导师签哆蛳 i 签字日期：2 叼年岁月d 日签字日期：御年易月z 日 t 第一章文献综述 第一章文献综述 n d 又称亚洲鸡瘟，由n d v 引起的，该病传播迅速，发病率和死亡率都在9 5 以上，给 养殖业造成了巨大的经济损失【”】。在国际动物卫生法典中，新城疫与高致病性禽流感同属a 类病世界各国对本病均高度重视，它是中华人民共和国进出动植物检疫法规定的进境 动物一类传染病，是世界动物卫生组织( o r e ) 规定的对国际贸易具有重要影响的动物传染 病。目前，大多数国家都采用预防接种作为控制新城疫的主要措施，但由于免疫程序不同， 使用疫苗类型不同以及综合防制n d 观念上的差异，导致n d 不能得到有效的控制p - 7 1 ，近几 年n d 流行又有增强的势头 1 1n i ) v 概述 1 1 1n d v 的形态特征及基因组结构 n d v 为副粘病毒科( p a r a m y x o v i r i d a e ) 副粘病毒亚科( p a r a m y x o v i r i n a e ) 腮腺炎病 毒属( r u b u l a v i r u s ) 的成员，成熟的病毒粒子直径约1 0 0 4 0 0 r t m ，通常为1 8 0 h m ，病毒粒子 外具有双层囊膜，囊膜内侧衬有一层特殊的m ( m a t r i x ，m ) 蛋白，囊膜外层具有8n m 的纤 突，纤突由具有血凝素和神经氨酸苷酶活性的h n 蛋白和具有功能的融合蛋白组成。核衣 壳由一条直径为1 8 n m 的多盘绕的管组成，围绕中央孔心轴呈螺旋对称排列，核衣壳中央是 病毒的核酸。 n d v 为单股负链r n a 病毒，n d v 基因组是一条单股负链r n a ，全长1 5 1 5 6 个核苷酸。 如图1 - 1 所示：编码6 种结构蛋白，即核农壳蛋白( n u c l e o e a p s i d p r o t e i n ，n p ) 、磷蛋i ! i ( p h o s p h a t e p r o t e i n ，p ) 、基质蛋白( m a t r i x ，m ) 、融合蛋白( f u s i o np r o t e i n ，f ) 、血凝素神经氨酸酶 ( h a e m a g g l u t i n i nn e u r m i n i d a s ep r o t e i n ，h n ) 和高分子量的r n a 聚合酶( l a r g ep r o t e i n ，l ) ，顺 序为3 ，- n p - p - m f - h n - l - 5 ( s - 9 1 。病毒基因组有9 8 8 被转录成上述6 种蛋白的m r n a ，各 m r n a 之前均有一个保守的起始信号n l ，序列为y - u g c c c a u c u u 0 5 ( 只有l 基因的起始 信号有所不同，为3 - u u c a u u g u u a - 5 ) ，终止时又都有一个保守的p o l y a 信号n 2 。序列 为3 ，- a u u c i 兀h h n n j - 5 。此外在h n 基因和l 基因的起始端还分别有一个4 l 和5 0 个核苷 酸的小开放阅读框【1 0 l ，p 基因除编码p 蛋白外还编码一个分子约3 6 k d 的v 蛋白。 3 ，- n ppmf i - i n l 5 囝1 1n d v 基因组结构模式 ( s i e 分剐衰示m r n a 的起始序列，基因见序列和终止序列) 西南大学硕士学位论文 1 1 2n d v 的结构蛋白特征及功能 n d v 共含有6 种病毒编码的结构蛋白，其中囊膜内含有i - i n 蛋白、f 蛋白、m 蛋白，余 下的n p 蛋白、p 蛋白和l 蛋白围绕r n a 形成核衣壳。另外在病毒感染细胞中尚含两种由 n d v 的p 基因编码的3 3 k d 和3 6 k d 非结构蛋白。 h n 蛋白分子量约为6 3 1 4 9 u ，是构成n d v 囊膜上较大纤突的糖蛋白。f i n 以n 端插入病毒 囊膜内，c 端露于囊膜表面，从而根据蛋白所处囊膜的位置把h n 蛋自分为尾部( 胞质区) 、 杆状部( 跨膜区及近膜区) 和球形的头部( 胞外远膜区) 三部分，其氨基酸残基长度分别为： 1 2 6 、2 7 - 4 8 、4 9 5 7 7 “j 。f i n 蛋白对n d v 的感染有重要作用，兼有血凝和神经氨酸酶两种活 性，前者负责识别靶细胞含唾液酸的受体，并介导病毒对靶细胞的吸附，神经氨酸酶则具有 分解、破坏受体的能力，并促使新生的病毒粒子从感染细胞的细胞膜上释放i l “。n d v 的感 染可被h n 单抗和特异性h n 糖蛋白抗血清所中和1 1 3 ，l ，应用单抗的研究还表明f i n 的血凝 素和神经氨酸酶位点在抗原性上是独立的。近年来的许多研究表明。f i n 蛋白还有促进膜融 合的功能，即f 蛋白的融合作用需要h n 蛋白的参与【l 。成熟的i - i n 是一种四聚体寡聚蛋 白，亚单位之间通过二硫键形成二聚体，两个二聚体再以非共价方式结合成四聚体8 q 。f i n 蛋白有6 个潜在的糖基化位点，分别位于1 1 9 、3 4 1 、4 3 3 、4 8 1 、5 0 8 及5 3 8 位氨基酸，其中 前4 个位点可以被糖基化，后2 个位点不能被糖基化1 2 l 】。糖基化对h n 向膜的转运并无作用， 但是神经氨酸酶起作用所必需的口“。n d v 的f i n 蛋白膜外区有1 2 个完全保守的半胱氨酸残 基，分别位于1 7 2 、1 5 6 、1 9 6 、2 3 8 、2 4 7 、2 5 1 、3 4 4 、4 5 5 、4 6 1 、4 6 5 、5 3 l 和5 4 2 氨基酸处。 这些c 残基对h n 蛋白的成熟起着重要作用，这些c 残基突变成其它残基后，将显著影响 h n 蛋白的生物学活性。在一些n d v 弱毒株。h n 蛋白是以非活性多肽前体( h n o ) 形式合成 的，在体内某些细胞系中被裂解成具有活性的f i n 蛋白，而在大多数n d v 毒株中没有这种 前体。i - i n 。和f i n 的差异，是由于编码f i n 基因的终止密码位置不同所致。 尾部 杆状部 头部( 卜2 6 a a ) ( 2 7 1 6 0 从)( 1 6 1 5 7 7 从) 田卜2n d v 洲蛋白结构示意田 f 蛋白是n d v 感染细胞所必需的，它不仅能促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，而且能促 进相邻宿主细胞之间发生融合，是构成n d v 致病力的重要成分1 2 3 。所有的n d v - f 蛋白首 先以无活性的前体f 0 ( 6 8 k d ) 形式存在，病毒感染细胞后，在蛋白修饰酶的作用下，裂解产 生由二硫键连接的f 。和f 2 时，才出现f 蛋白的融合活性口”，f o 蛋白构成顺序 n h 2 一f 2 s - s f 1 c o o h ，其中f 1 分子量为5 5 k d ，f 2 分了量为1 2 5 k d ，裂解点位于1 1 2 一1 1 7 位氨基酸处，其氨基酸序列及裂解能力是决定病毒毒力的关键j 。现已证明，n d v 强毒株 r 蛋白裂解区域的氨基酸序列一般为1 1 2 r k r - q - k r - r - f 1 1 7 。而弱毒株在该区域则以中性 2 第一章文献综述 氨基酸代替碱性氨基酸。尤其是1 1 2 位和1 1 5 位，从而使相应序列变成 1 1 2 g e k r - q 4 3 l e - r - l 1 1 7 ，由于这种f 0 蛋白不易被裂解，使病毒囊膜与宿主细胞膜融合的 活性低。导致病毒感染性很低或无感染性【2 6 】大多数n d v 毒株的f 蛋白都舍有六个潜在的 糖基化位点，它们分别位于第8 5 、1 9 1 、3 6 6 、4 4 7 、4 7 1 和5 4 1 位氨基酸残基处，除第一个以 外其它位点均在f ，多肽上。5 4 1 位残基潜在塘基化位点因位于蛋白c 端胞浆区尾端而认为不 会被糖基化。另外，中国f 4 8 e 9 株在4 6 2 位多出一个糖基化位点口”，但该位点对功能的影响 有待于进一步实验证明。另有报道f 蛋白的成熟形式为三聚体，这种多聚体形式是在内质网 内完成的，而且f 蛋白在融合中可能是多个三聚体共同作用【z ”。 m 蛋白分子量为4 1 k d ，是非糖基化膜相关蛋白，位于病毒囊膜的内表面，构成病毒囊膜 的支架，主要介导核衣壳与囊膜之间的识别。维持病毒粒子结构的完整性。m 蛋白至少有两个 功能区，一个是蛋白在脂质双层膜上的嵌着部位，另一个区域与核心中的核衣壳结构互相作 用【2 9 】。在m 蛋白的第2 4 7 和2 6 3 氨基酸残基之间存在一个由两组相互依赖的碱性氨基酸团簇构 成的细胞核定位信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a t ，n s l ) ，在病毒感染期对细胞核和核仁中的 m 蛋白浓集起着重要作用刚。在病毒感染过程中，m 蛋白集中在被感染的细胞核分泌区。而 n d v 其它蛋白则存在于细胞浆中。总之，m 蛋白在病毒各蛋白组装成完整病毒粒子以及病毒 的出芽和释放的过程中扮演着重要的角色【3 1 4 2 】。 n p 蛋白分子量为5 6 k d ，构成病毒r n a 的衣壳，是n d v 进入细胞后翻译的第一个结 构蛋白。n p 与病毒基因组紧密结合在一起，形成一个螺旋棒状的核糖核蛋白复合体 n p ) ， 该复合体既是n d v 基因组转录和复制的模板，又可以保护病毒基因组不受r n a 酶的攻击， 并在病毒转录与复制中可能充当切换因子作用【3 3 】。p 蛋白m r n a 同时编码p 蛋白和非结构蛋 白c ，即p 蛋白的m r n a 有两个阅读框架，第一个编码p 蛋白，在第一个a u o 下游几个核 苷后的a u g 起始，编码第二个蛋白，即c 蛋白。部分n d v - p 蛋白序列分析表明不同毒株问 p 蛋白的保守性较小，故可能在病毒中起特异性作用例。l 蛋白分子量为2 2 0 k d ，在病毒的 转录和复制过程中起r n a 聚合酶的作用。序列分析表明，大部分r n a 的合成和修复活性在 l 蛋白n 端第二和第三个氨基酸上定位，这一区段具有高度保守性，而c 端的保守性相对较 小，与病毒的特异性有关。 1 2n d v 致病性的分子基础 自然界中存在着各种具有不同毒力的n d v 。从不同种类的外观健康鸟体内也经常能分离 到n d v ，一些具有潜在致病性的毒株能在某些特定种类宿主中增殖、生存而不产生任何损害， 但当高度易感禽类，如鸡暴露于这些病毒中时，其致病性就会充分表现出来。这种感染性与 致病性的差异现象既与病毒本身的特性有关，也与宿主的反应性有关，主要体现在病毒和感 染细胞表面的分子结构关系上。 n d v 表面有两种糖蛋白即h n 蛋白和f 蛋白。h n 主要负责病毒粒子与细胞受体( 神经氨酸) 最初的结合( 吸附) 和破坏这种结合的相互拮抗作用，它还作用于受体位点，使f 蛋白充分接近 而发生病毒与细胞膜的融合。吸附作用是融合的前提，神经氨酶可以裂解宿主细胞膜寡糖链 末端的神经氨酸，与神经氨酸结合的区段为a s p a r 旷l y 9 一s e r - c y 卜一s e t ，位于f i n 的第 2 3 4 _ - 3 2 9 氨基酸之间。神经氨酶的活性位点位于f i n 糖蛋白的中心，而血凝位点靠近c 端。h n 3 西南大学硕士学位论文 以n 端插入病毒脂质膜内。f 糖蛋白主要负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，使病毒基因组能 进入细胞内。该蛋白为一惰性前体f o ( 6 8 k r ) ) ，须经裂解产生由二硫键连接的f l 和f 2 后才使病毒 具有感染力，这两个片段的顺序为n h r _ f 2 一f 1 c o o h 3 5 j ，f 1 分子量为5 5 k d ，f 2 为1 2 5 k d 。 f 糖蛋白以f 。的c 端插入脂质膜内。以脂肪共价连接，f 糖蛋白基因编码一个5 3 3 个氨基酸的多 肽：有3 1 个高疏水区、裂解的n 端信号序列、c 端膜固定点，f 裂解片段在n 端的内部疏水区， 是病毒的融合肽州。 f 糖蛋白的裂解发生在成熟蛋白经高尔基体从内质网到细胞膜的转移过程中，或通过高尔 基体运输小泡时由细胞的胰酶样内蛋白酶进行的，这种转移实际上是一个加工过程。瞒蛋白 是在粗面内质网上由细胞糖化酶将碳水化台物侧链加到潜在位点上而被连续糖基化的p “。含 有1 3 个半胱氨酸残基的f 糖蛋白在离开粗面内质网后，进入高尔基体运输小泡前被内蛋白酶裂 解成以二硫键连接的f l 和f 2 活性结构，这样才使病毒具有感染力。 裂解决定于病毒毒株和宿主细胞的特性。所有强毒株f 塘蛋白均能裂解成f l 、f 2 ，因此具 有感染力。由于它们具有融合性而使红细胞溶解。而病毒粒子中只含有未裂解f 湔体的无毒株 则有感染性，不能溶解红细胞。在某些适宜宿主细胞中强毒n d v 能产生裂解结构的f 蛋白，而 在其它宿主细胞中，产生的病毒粒子却只有非裂解结构。在同一种宿主细胞中，有些毒株的 糖蛋白能发生裂解，而另一些则不发生裂解。不管在什么宿主细胞的裂解形式中，强毒株始 终含有两种活性糖蛋白，