（食品科学专业论文）固定化胰蛋白酶酶解酪蛋白产生酪蛋白磷酸肽的条件研究.pdf

固定化胰蛋白酶酶解酪蛋白产生酪蛋 白磷酸肽的条件研究 食品科学专业 研究生张黎明指导教师袁永俊 摘要 酪蛋白是乳中含量最丰富的蛋白质，含有人体生长发育所必需的氨基酸。 近年来的研究结果表明，酪蛋白除具有营养功能之外，还具有非常重要的生理 功能，是生物活性肽的重要来源。其中酪蛋白磷酸肽在动物的小肠环境中能防 止二价金属离子产生沉淀，增加肠内可溶性矿物质的浓度，从而促进肠黏膜对 钙、铁、锌、硒的吸收和利用，尤其是钙的吸收和利用，被誉为“矿物质载体”。 酪蛋白磷酸肽是目前唯一一种促进钙吸收的活性肽，同时对提高机体免疫力、 改善繁殖性能等方面也有重要作用。 研究了胰蛋白酶的固定化条件，以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，采用 交联吸附法对胰蛋白酶进行固定化。分析了酶用量、戊二醛浓度、p h 值、温 度、交联时间以及吸附时间等因素对固定化酶活力和活力回收率的影响。从中 选择较显著的四个因素进行b ( 3 4 ) 正交实验，以酶活力为指标，对胰蛋白酶的 固定化条件进行优化，以获得固定化的最佳反应条件。 壳聚糖固定化胰蛋白酶，最佳固定化条件为：酶用量1 4 r a g ，戊二醛浓度 o 2 ，p h 值7 5 ，温度3 5 ，交联时间2 h ，吸附时间5 h 。在最佳固定化条件 下制得的固定化酶活性为3 9 7 2 9 u ，活力回收率达7 6 5 7 。 用制备好的固定化酶装柱进行连续水解制备酪蛋白磷酸肽，以水解液的 p h 值和n p 为实验指标，重点讨论了酶装柱水解过程中p h 值、底物浓度、 温度、底物流速等因素的最佳作用条件。固定化酶装柱水解最佳作用条件为： 温度6 0 ，底物浓度4 ，p h 值为9 0 ，恒流泵转速为2 0 r m i n 。 利用交联葡聚糖( s e p h a d e xg 2 5 ) 凝胶柱对酪蛋白磷酸肽的分子量分布情 况进行测定，以0 0 1 m h c l 为流动相。根据s e p h a d e xg - 2 5 分离蛋白质的标准 曲线方程：l g m = 4 7 8 5 6 4 1 9 8 4 k a y ，得到分子量与洗脱体积的关系，根据产物 的洗脱体积计算分子量。流动相流速为0 4 m l m i n ，检测波长2 8 0 n m ，柱压 0 3 m p a ，得到标准品比较理想的色谱图，测得的产物主要峰的洗脱体积为 1 1 4 9 m l 和1 2 0 1 m l ，分子量为2 5 0 0 0 和4 5 0 0 。 关键词：酪蛋白：固定化胰蛋白酶；酪蛋白磷酸肽；连续酶解；葡聚糖凝胶层 析 r e s e a r c h o n h y d r o l y s i s c o n d i t i o n so fc a s e i n b y i m m o b i l i z e dt r y p s i nt og e n e r a t e ca s e i np h o s p h o p e p t i d e s m a j o r ：f o o ds c i e n c e c a n d i d a t e ：z h a n gl i m i n g a d v i s o r ：y u a ny o n g j u n a b s t r a c c a s e i n ，w i t he s s e n t i a la m i n oa c i df o rg r o w t h ，i st h em o s ta b u n d a n tp r o t e i ni n m i l k r e c e n t l y , m a n yr e s e a r c h e sd e m o n s t r a t e dt h a tc a s e i nn o to n l yh a dn u t r i t i o n f u n c t i o nb u ta l s oh a dv e r yi m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，i n a d d i t i o n ，c a s e i nw a s a ni m p o r t a n ts o u r c eo fb i o a c t i v ep e p t i d e s ，a st h e ”c a r r i e ro fm i n e r a l s ”c p p sc a n p r e v e n tt h ed i v a l e n tm e t a li o np r e c i p i t a t i n gi nt h ei n t e s t i n a le n v i r o n m e n t o fa n i m a l s ， a n di n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no fi n t e s t i n a ls o l u b l em i n e r a l s ，w h i c hw i l lp r o m o t et h e a b s o r p t i o na n du t i l i z a t i o no fc a l c i u m ，i r o n ，z i n c ，s e l e n i u mb yt h ei n t e s t i n a lm u c o s a ， e s p e c i a l l yf o rc a l c i u m p r e s e n t l y , c p p si st h eo n l ya c t i v ep e p t i d ew h i c h c a n p r o m o t ec a l c i u ma b s o r p t i o n ，f u r t h e r m o r e ，i ta l s op l a y s a ni m p o r t a n tr o l eo n i m p r o v i n gt h eb o d yi m m u n i t ya n dt h er e p r o d u c t i v ep e r f o r m a n c e ，a n ds oo n i nt h i sp a p e r ，t h ei m m o b i l i z e dc o n d i t i o n so ft r y p s i nw e r es t u d i e d ，a n dc r o s s l i n k i n g a d s o r p t i o nw a su s e dt oi m m o b i l i z e dt r y p s i n t h ec a r t i e rw a sc h i t o s a n ，a n d t h ec r o s s l i n k i n ga g e n tw a sg l u t a r a l d e h y d e t h e s ef a c t o r sw h i c hw e r ee n z y m e d o s a g e ，g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o n ，p h ，t e m p e r a t u r e ，c r o s sl i n k i n gt i m ea n d a d s o r p t i o nt i m ei n f l u e n c i n go ni m m o b i l i z e de n z y m e a c t i v i t ya n dd y n a m i c r e c o v e r yw e r e r e s e a r c h e d t h es i g n i f i c a n tf a c t o r sw e r ec h o s ef o rl 9 ( 3 耳) o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s ，e n z y m ea c t i v i t y w a sc h o s ea se x p e r i m e n t a li n d i c a t o r ，a n dt h e nt h e i m m o b i l i z e dc o n d i t i o n so ft r y p s i nw e r eo p t i m i z e d ，s oa st oo b t a i nt h eb e s tr e a c t i o n c o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z e d w h e nc h i t o s 卸【1w a su s e dt oi m m o b i l i z e dt r y p s i n ，t h e b e s ti m m o b i l i z e d c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：e n z y m ed o s a g e14 m g ，g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o n o 2 ，p h 7 5 ，t e m p e r a t u r e3 5 ，c r o s s l i n k i n gt i m e2 ha n da d s o r p t i o nt i m e5 h o nt h e b e s ti m m o b i l i z e dc o n d i t i o n s ，t h ei m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t ya n dt h ed y n a m i c r e c o v e r yw e r e3 9 7 2 9 ua n d7 6 5 7 ，r e s p e c t i v e l y h n m o b i l i z e de n z y m ew h i c hh a db e e np r e p a r e dw a su s e dt o 衄c o l u m n ，a n d t h e nc o n t i n u o u sh y d r o l y s i so fc a s e i nt og e n e r a t ec c p s a p h a n dn po fh y d r o l y s i s s 0 1 u t i o nw e r ec h o s ea se x p e r i m e n t a li n d i c a t o r s t h e s ef a c t o r sw h i c hw e r ep h ， s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r ea n df l o wv e l o c i t yo f s u b s t r a t ew e r ed i s c u s s e d i nt h eh y d r o l y s i sp r o c e s s t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rh y d r o l y s i s w e r ea sf o l l o w s ： t e m p e r a t u r e6 0 c ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n4 ，p h 9 0a n ds p e e do fc o n s t a n t 。c u 盯e m p u m p2 0 r m i n t h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fc c p sw a sm e a s u r e db yu s i n gs e p h a d e x g e l ( s 印h a d e xg 2 5 ) c o l u m na n d 0 01m h c iw a su s e da st h em o b i l ep h a s e a c c o r d i n gt op r i n c i p l eo fp r o t e i ns e p a r a t i o nb ys e p h a d e xg - 2 5 ，w ec o u l da c q u t r e t h es t a n d a r dc u r v ee q u a t i o n ：l g m = 4 7 8 5 6 4 1 9 8 4 k a y ，s ot h a tw ec o u l dg a i nt h e r e l a t i o n s l l i pb e t w e e nm o l e c u l a rw e i g h ta n de l u t i o nv o l u m e ，a n d t h e no nt h eb a s i so f m ee l u t i o nv o l u m eo fp r o d u c t , w ec o u l dc a l c u l a t et h em o l e c u l a rw e i g h t t h ef l o w r a t eo fm o b i l ep h a s ew a s0 4 m l m i n ，d e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s2 8 0 n m a n dc o l u m n p r e s s u r ew a s0 3 m p a ，w ec o u l dg a i na ni d e a lc h r o m a t o g r a mo fs t a n d a r dp r o d u c t u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，e l u t i o nv o l u m eo ft h em a i np e a k sw e r em e a s u r e d ，w h i c h w e r e11 4 9 m la n d1 2 0 1 m lr e s p e c t i v e l y , a n dt h em o l e c u l a rw e i g h t sw e r ea l s o m e a s u r e d ，w h i c hw e r e2 5 0 0 0a n d4 5 0 0r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c a s e i n ；i m m o b i l i z e dt r y p s i n ；c a s e i np h o s p h o p e p t i d e s ；c o n t i n u o u s h y d r o l y s i s ；t h es e p h a d e xg - 2 5 西华大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西华大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师的指导下取得的，论文 成果归西华大学所有，特此申明。 作者签名 导师签名 第7 8 页共8 0 页 2 0 0 9 年5 月2 5 日 2 0 0 9 年5 月2 日 霸恕蜘琅 删知 西华大学硕士学位论文 西华大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅，西华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口 2 、不保密 年解密后适用本授权书； 用本授权书。 ( 请在以上口内划4 ) 专谊浼立j 惦釜毛：孤浆日| q 。岳泌， 第7 9 页共8 0 页 讯一 易番千 狮 ， 施 西华大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 酪蛋白( c a s e i n ) 1 1 1 酪蛋白的来源 酪蛋白来源于乳，是乳蛋白中主要的蛋白质之一。乳是哺乳动物乳腺的分 泌产物，是一种十分复杂的生物液体。乳中各成分之间具有合适的比例，具有 很高的营养价值，同时乳对人类和动物免疫保护与生长调节具有独特功能，因 而是新生哺乳动物最好的营养素。乳脂、乳糖和乳蛋白是乳的基本成份，牛乳 中蛋白质含量约为3 3 ，人乳中为1 4 。乳蛋白的成分相当复杂，牛乳中主 要的乳蛋白是酪蛋白( c a s e i n ) ，约占总蛋白的7 8 8 ( 人乳中酪蛋白约占总 蛋白的3 2 ) ，酪蛋白有a 、1 3 、i c 、丫四种，其中p 酪蛋白占酪蛋白总量的2 8 2 ( 占人乳中酪蛋白总量的6 0 ) ，其次为乳球蛋白( 1 3 - 1 a c t o g l o b u i n ，占9 7 ) 。此外还有乳清蛋白( c 【1 a c t a l b u m i n ，占3 6 ) 、白蛋白( 1 2 ) 、微量乳 铁蛋白( 1 a c t o t r a n s f e r r i n ) 及少量的免疫球蛋白( 2 1 ) 【1 1 。酪蛋白( c a s e i n ) 中含有人体必需的8 种氨基酸，是一种全价蛋白质( p e r 值为2 5 ) ，能够为生物 体生长发育提供必需的氨基酸。除了营养功能外，其在动物消化道中经蛋白酶 分解产生的肽段的潜在生物学活性已受到广泛重视【2 1 。 1 1 2 酪蛋白的组成及结构 酪蛋白是各种蛋白质中研究最深入的一种蛋白质，无论从组成还是从结构 上看，酪蛋白都是非常不均一的混合体，其主要组成如下表1 1 所示3 1 。 第1 页共8 0 页 西华大学硕士学位论文 表1 - 1 酪蛋白的主要组成 疋出l e l 1t h em a i nc o n s t r u c t i o no f c a s e i n l - 酪蛋白 c c s 2 酪蛋白 p 一酪蛋白 k - 酪蛋白 其他成分 钙 3 5 6 9 9 3 3 6 1 1 9 2 3 2 9 镁 钠 钾 柠檬酸 牛乳糖 半乳糖胺 0 1 0 1 0 3 0 4 o 2 0 2 仪。1 酪蛋白的级结构于1 9 7 4 年测试完毕，共由1 9 9 个氨基酸构成，a 。2 酪蛋白的一级结构于1 9 7 9 年测试完毕，共由2 0 7 个氨基酸构成，k 酪蛋白的 一级结构于1 9 8 0 年测试完毕，共由1 6 9 个氨基酸构成，p 酪蛋白的一级结构 于1 9 8 2 年测试完毕，共由2 0 9 个氨基酸构成。u 。1 酪蛋白、2 酪蛋白、佟酪 蛋白和1 3 - 酪蛋白的一级结构如下图1 - 1 ( a ) 图1 - 1 ( ( 1 ) 所示。 h a 堰一p r o 一l 弘一h i s p f o l i e i ，y 曩一h i 一g l n g l y l e u p f o g i 丑一g i n v a i l e u a 鲰一g l u a 辄一 2 03 0 l e - l e u a f l p h e p h e v - i a l - 一p o p h e p f o g l 缸一v a l p h e g i y l p g l n l y l v a i a i n g l u o，5 0 l e 且一s e r l ”一a l p i l e g i y s e r g i u s e f t h r g l t a ，p g i n 一 i a m c t g i u a l p i i e l y s - 6 07 0 g 【且一m t t g 口一a i 矗一g i u s e f l i e s e f s e l 卜- s e f g l u g i u l l e v a l p f o a l n s e r v a l g i u g i n 8 09 0 l y s hi 一l i 粤一g l n i 伊一g i n a 。p v 曩i p r o s e f g l u a f 譬一t y r l e u g i y t y f l c i l g l u g l n 一 1 0 01 1 0 l e - l e u - a r g - - l e u - - l y s - l y s - t y r - l y l v i p f o g l a l e n g l n 一1 i e v a l p f o a n s e f a l a 1 2 01 3 0 g i u g i u a f e l e u h i 一s e r m e t - - l y s g i u g i y i l e h i s - a i a a n g i 一l y s g l u 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l l y 一1 l c 二t h f v - i a 叩 8 0 9 0 一a l p l ”一h i 毫一t y f g l 矗一l 驴一a l 一l e l a - 口一g l t 一i l e a 5 丑一g l u p h e t y r g i 丑一l 了s p h e 1 0 01 1 0 p r o g l 一t y f l e n g i n t y r l e u t y r g l n g l y p r o i l e v a l 一l e l 工一a 暑n p r o t f p a 暑p 1 2 0 g i n v a i 一【和一a r g a 3 n a l b v 矗i p r o i l e t h r p r o t h r l c u a s n a r g g i u g l n l e u 一 1 3 01 4 0 s e f t h r s e r g i 伍一g i u a n s e r l y 一l y ，一t h f v a l a 。p m e t g l u s e r t h r g l 乜一v 8 l p h e 1 5 0 1 6 0 一t h r l y 一【伊一t h f t 和一l e 口一r h f g l n g l 缸_ g l u l 丫- 一a 缸一a f g l e u a s n p h e _ l e u l y s 一 1 7 01 8 0 l y ? 一i l e s e f g i n a f g t ，r g l n l 扣一雅e a 1 8 一l e u p f o g i n t ，f l e u l y - 一t h f v a i t y r 1 9 02 0 0 - - g | n - - h i ，一g l n l y 童一a i a m e t l 如一p f o t r p n t g 1 蕾一p l o 山，一t h r l 弘一v 扛l n e p t o t y f 2 0 7 一v a l a r g t 和一l e 0 h f i g l - 1 ( b ) p r i m a r ys t r u c t u r eo f 啦c a s e i n 图l - l ( b ) g , s 2 一酪蛋白的一级结构 p y r o g i n g i 一g i n a s a g l n - - g l u g i n - - p r o l i e a r g c y s g l u l y s a s p g l t t - - a r g p h e 2 03 0 一p h e s e r a l p l r s i i c a l a i y s t y r l l e p f o 一“e g l n t y r y a l l e u s e r a r g t j r r t 4 0s o p r o s e r t y r g l y l e u a s n t y r t y r g l n g l n l y s p r o v a i a 1 8 一l c n i l e a s n a s n 一 6 07 0 g l n p h e l e u p r o t y f p r o t y r t f a l a l y s p f o a l a a i a v a l a f g s e r p r o a 1 a g i n 8 0 9 0 l j e l e 一( h 丑一t r p g i n v 8 l l e u s e r a s p t h r y a l p f o a l a l y $ - - s e f c y s g i n a l 各一g l n 1 0 0 一p f o t h r t h r r m e t 。a i a a f l h i 5 一p r o h i o p f o h i $ 一l e u s e f p h e m e t a i a i i e p f o 1 1 0 1 2 0 p r o l y s l y s a ，口一g i n a ，p l y ，一t h r g 1 u i i e p f o t h r l l e a s 吐一t h r l l e a l a s e r g l y 1 3 01 4 0 g l u p r o t h f s e r t hr p r o t h r i l e g l u a l a v a l g l u s e r t h r v a l a i a t h r l e u g l u 1 5 0 1 6 0 一a i a s e f p f o g l u v 8 i i l e g i u s e r p f o p r o g i u i i e a s n t h r v a l 一g 1 丑一v a i t h f s er 1 6 9 一t h r a i a v a i 。0 h f i gl 1 ( c ) p r i m a r ys t r u c t u r eo f1 ( - c a s e i n 图1 一l ( c ) k 酪蛋白的一级结构 第3 页共8 0 页 西华大学硕士学位论文 h a f g g i u l e u g l i 卜g l u l e u a 暑n v l p r o g l y g l u i l e v 矗l g l u s er l e u s e 卜一s e f ， 2 03 0 s e f g l 乜一g l u s e r l l e t h f a f | 一l i 一a - n l 弘一i 舯一l l e g l u l y l p h e g l 一s e f g l l l _ g l u 4 05 0 g i n g l 丑一g i 丑一t h r g l n a 。p g l t l l e 廿一g l 丑 s p l ”一i l e h i s p r o p h e a l a g l 丑一t h f g i n 8 07 0 s e r l e u v a l t y r p f o p h e p f o g i y p r o i i e p r o a 丑一s e r l e u p r o g i n a 姐一i i e p r o 8 09 0 p r o l e n t h f g i n t h f p r o v t l v i v _ l p r a p f o p h e l e u g l 吐一p f o g l u v a l m e t 一 1 0 01 1 0 一g l y v a i s e r l ”一v a l 一l y | 一g l n a l a m e t a l b 二p f o l y t h i l l y i g h m e t p r o p h c p r o 1 2 01 9 0 一l y 0 一t ，r p f o v l g l 丑一p f o p h e t 五r g l n s e 卜一g l 丑一s e f l e u t h f l c u t h r 一 s p v a l 1 4 0 g l u - - a - n i 止u h i s l e u p r o p r o l e n l e u l e u g l n s e f t f p m e t h i s g 1 且一p r o h i s - - g i n 1 5 0 1 6 0 p f o l e 4 一p f o p f o t k f v - l m e t p h e p f o p f o g l 矗一s e f v i l 矗l 卜- s e r r l “一s e f g i 且一s e f 1 7 01 8 0 l y s v 8 l l e 一p f o v 8 卜一p f o g i u i y 。一a 1 矗v _ l p f o t y f p f o g i n a f g a 。p m e t p r o l i e 1 9 0z o o g i n a l a p h e l e u i ，e q t y f g i n g l n p f o v - l l e 位一g l y p f o v a l a r 一g l y p f o p h e 一 2 0 9 p r o i l e i i e v a i 0 h f i g l - 1 ( d ) p r i m a r ys t r u c t u r eo fp - c a s e i n 图1 - l ( d ) 1 3 - 酪蛋白的一级结构 从构成0 【s 1 酪蛋白、( 1 s 2 - 酪蛋白、k i 酪蛋白和p 酪蛋白一级结构的氨基酸组 成看，c c s l 一酪蛋白和a s 2 酪蛋白的一级结构呈高度磷酰基化，其亲水部分和疏水 部分无规则地交替排列，尤其是2 酪蛋白明显的磷酰基化构成了酪蛋白的最 亲水部位，其末端对钙十分敏感。k - 酪蛋白同样有一种磷酰基化结构，由三分 之二的疏水n 一端和三分之一的亲水c 端构成。在其它部位中，大量存在的脯 氨酸使其结构不太有秩序。p 酪蛋白具有明显的两极特性，其n 端( 1 - 6 0 ) 呈 酸性和亲水性，其c 端( 1 4 1 2 0 9 ) 呈碱性和疏水性，这部分也构成了酪蛋白 的最疏水部位。 1 2 乳蛋白源的生物活性肽 迄今为止，在乳中已经发现多种生物活性肽，主要的生物活性肽及其生物 学功能如表1 2 所示。 第4 页共8 0 页 西华大学硕士学位论文 表1 - 2 主要的酪蛋白源生物活性肽及其生物学功能【4 】 t a b l e1 2 m a j 0 1 b i o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sd e r i v e df r o mm i l ka n dt h e i rf u n c t i o n s 活性肽 生物学功能 抗菌肽( f1 2 3 ，f r o m a s l c a s e i n )抗感染 a c e 抑制肽( f2 3 3 4 ，f1 9 4 1 9 9 ，f r o m a s l c a s e i n ，f1 7 7 1 8 3 ，f r o m1 3 - c a s e i n ) 免疫调节肽( f 9 2 9 4 ，f r o ma s l c a s e i n ) 酪蛋白磷酸肽( f 4 3 5 8 ，f 5 9 7 9 ，f 6 6 7 4 ，f r o m a s l c a s e i n ，f1 - 2 5 ，f r o m1 3 - c a s e i n ) 细胞生长调节肽( f1 6 5 1 9 3 ，f r o ma s l c a s e i n ) 糖基化肽( c g p ，f1 0 6 1 1 6 ，f r o m1 c c a s e i n ) c m p ( f1 0 6 1 6 1 ，f r o m | ：- c a s e i n ) 凝乳酶抑制肽( f 9 9 1 0 5 ，f r o m l c c a s e i n ) c a s o x i n ( f3 3 3 8 ，f r o m k c a s e i n ) 1 3 - c a s o m o p h i n s ( f6 0 7 0 ，f r o m1 3 - c a s e i n ) a l a c t o r p h i n ( f5 0 5 3 ，f r o m0 【l a c t o g l o b u l i n ) p - l a c t o r p h i n ( f1 0 2 1 0 5 ，f r o m1 3 - 1 a c t o g l o b u l i n ) 1 3 - 1 a c t o t e n s i n ( f1 4 6 1 4 9 ，f r o m1 3 - 1 a c t o g l o b u l i n ) 抗血小板凝集肽( f3 9 - 4 2 ，f r o mh u m a n l a c t o t r a n s f e r r i n ) 抑制血管收缩，降血压作用 免疫刺激作用 促进钙的吸收和利用 细胞生长调节作用 促进胆囊收缩素的释放，抑制胃泌素的 释放抑制血小板的凝集 抑制胃酸分泌，免疫调节作用 抑制凝乳酶活性 阿片活性拮抗肽 抑制胃肠道运动，免疫促进作用，促进 胰岛素、生长激素分泌 阿片样活性 诱导豚鼠回肠收缩 诱导豚鼠回肠收缩 抑制纤维蛋白原的结合抑制血小板凝 集 由表1 2 可见，乳蛋白在消化道酶的作用下，产生各种具有特殊生物学功 能的肽几乎均为小肽，它们通过作用于胃肠道或吸收入体内，影响机体生理功 能。 1 3 酪蛋白磷酸肽( c a s e i np h o s p h o p e p t i d e s ，c p p s ) 第5 页共8 0 页 西华大学硕士学位论文 以牛乳酪蛋白为原料，选用适当的蛋白酶将其水解后，从中分离纯化而得 到的一类富含磷酸丝氨酸的生物活性肽，被称之为酪蛋白磷酸肽( c a s e i n p h o s p h o p e p t i d e s ，c p p s ) 。酪蛋白磷酸肽可作为无机离子载体促进肠膜对钙、 铁、锌、硒，尤其是钙的吸收和利用【5 1 ，是目前报道的唯一能有效促进钙吸收 的生物活性肽，在中国具有巨大的发展潜力。 1 3 1c p p s 的分子结构 根据酪蛋白各亚基的一级结构，c p p s 是由( i s i ，( i s 2 和p 酪蛋白经适当的 蛋白酶水解、分离纯化而得。( i s 酪蛋白含8 个磷酸丝氨酰基，p 一酪蛋白含5 个 磷酸丝氨酰基，磷酸基团连接在蛋白质一级结构的丝氨酸位点处，其活性中心 是成串的磷酸丝氨酸和谷氨酸簇，基本结构表示为s e r p s e r p s e r p g l u g l u - 【6 1 。 现已证明，这种结构对于发挥其生理功能是必不可少的，不同的c p p s 结合c a 2 + 的能力差异很大，这可能与距磷酸结合位点较远的氨基酸残基有关【7 1 。h i r o s h i 等( 1 9 7 4 ) 8 悃动物实验表明，酪蛋白可在动物体内形成c p p s ，并确定其结构为 s e r p s e r p s e r p g l u i l e p r o a s n ：n i c h o l a s 等( 1 9 9 6 ) 9 】用胰蛋白酶水解酪蛋白， 得到包含有s e r p s e r p s e r p g l u g l u 序列的c p p s 。 以下是几种已经分离到的c p p s 结构【l o 】： 牛：来源( i s t 酪蛋白，氨基酸序列为： g l y 4 s - s e r p g l y - s e r p t h r - g 1 u a s p 5 1 _ g l u 6 3 s e r p i l e s e r p 。s e r p s e r p g l u g l u 7 o a 8 n 7 4 s e r p v a l g l u g 1 n 7 8 牛：来源( i s 2 酪蛋白，氨基酸序列为： v a l l 7 s e r p s e r p s e r p g l u g l u - s e r - i l e i l e s e r p g i i l l 2 7 _ g l y 5 - s e r p s e r p s e r p g l u g l u s e r p a l a g l u 6 3 g 1 n 1 2 7 - l e u s e r p t h r - s e r p g l u g l u l 3 3 g l u l 4 2 _ s e r p t h r - o l u t 4 5 一 牛：来源p 酪蛋白，氨基酸序列为： g l u l 4 _ s e r p l e u s e r p s e r p s e r p g l u g l u 2 1 _ g l n 3 4 s e r p g l u g 1 u 3 7 人：来源p 酪蛋白，氨基酸序列为： 一g l u 2 一t h r p i l e g i u s e r p l e u s e r p s e r p s e r p g l u g 1 u 1 2 一 大鼠：来源o l 酪蛋白，氨基酸序列为： 第6 页共8 0 页 西华大学硕士学位论文 a s p 1 8 s e r p s e r p s e r p g l u a s p 2 3 由此可见，c p p s 是一类含有磷酸丝氨酸和谷氨酸簇的短肽，其产品的分 子量是不均一的。c p p s 分布于d s l 酪