（分析化学专业论文）功能纳米界面的构建及其在生物传感中的应用.pdf

摘要 基于生物识别的高度专一性与电化学信号检测的放大作用相结合的电化学 生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、成本低、易于微型化等优点，在临床 诊断和环境分析等方面有着广阔的应用前景。如何将生物组分高效、稳定地固 定在基体表面是生物传感器构建的关键本论文通过发展一系列新型的生物相 容性纳米材料，改进生物分子的固定化方法，有效提高了固定化生物组分的活 性，进而构建了几种性能优良的电化学生物传感器。主要工作如下： 1 合成了新型核壳型金普鲁士蓝纳米粒子( e b l a u ) ，采用层层组装技术成功制 备了 p b a n ) 椰电极。采用扫描电子显微镜( s e m ) 、傅立叶红外光谱( f r - i r ) 、 紫外可见吸收光谱( u v - s ) 以及电化学方法等对 p b a u ) 口，r r 0 进行了表征。结 果表明，p b a u 纳米粒子被均匀可控地组装到了i t o 电极表面，并对h 2 0 2 有 显著的催化作用。 2 基于模板技术，采用电化学方法制备了三维多孔p b 膜修饰电极。利用s e m 、 f t - i r 及电化学等方法对三维多孔结构的p b 膜进行了表征。结果表明，三维多 孔p b 膜修饰电极，有效提高了电极的比表面积和底物的扩散传质速度基于 p b 对h 2 0 2 具有良好的电催化作用，迸一步在三维p b 膜上自组装葡萄糖氧化 酶( c o x ) ，制得葡萄糖生物传感器该传感器在1 o l o 屯1 5 x 1 0 3 t o o l l - 1 浓度范 围内对葡萄糖的响应星线性关系，响应时间小于3 s 。 3 采用电化学沉积技术在i t o 电极表面沉积壳聚糖( c h 田和二氧化硅( s i 0 2 ) 纳 米粒子，去除s i 0 2 纳米粒子后获得三维多孔结构c h i t 膜，进而将乙肝表面抗 体( h b s a b ) 固定于该三维多孔结构中，制备了基于三维多孔结构的c h i t h b s a b 免疫传感器。采用s e m 、电化学方法对电极的形貌和逐层修饰过程进行了表征， 并对免疫传感器的性能进行了研究。结果表明，该免疫传感器制备过程简单、 稳定性好、灵敏度高，检测乙肝表面抗原( h b s a 曲的检测限为3 8 9 l l g m l 。将 摘要 制备的传感器用于实际样品分析，结果令人满意。该免疫传感器在临床检测方 面有良好的应用前景。 4 合成了壳聚糖- 戊二醛半胱胺( c h i t - g a c y s ) 三维网状复合物，将该复合物自 组装到金电极表面后浸入到金纳米粒子( a u n p o 溶液中，利用纳米金与氨基问的 强烈吸附作用固定h b s a b ，进而制备了壳聚糖戊二醛半胱胺金纳米粒子 ( c h l t - g a - c y s a u n p s h b s a b ) 免疫传感器。采用循环伏安法( c v s ) 和交流阻抗法 i s ) 对电极逐层修饰过程进行表征，并对免疫传感器的性能进行了研究。结果 表明，该免疫传感器制备过程简单、稳定性好、灵敏度高，对h b s a g 的检测具 有良好的选择性，应用前景良好 关键词：生物传感器；层层自组装技术；电化学沉积技术；纳米粒子 a b s t r a c t a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sb a s e d0 1 1t h es p e c i f i cr e c o g n i t i o no fb i o m a t e r i a l s w i t ht h em a g n i f i c a t i o nf u n c t i o no fd e c t r o c h v m i c a ld e t e r m i n a t i o np r e s e n ts o m e o u t s t a n d i n ge d v a n t a g c si n c l u d i n gh i g hs e n s i t i v i t y , n l c es c l c c t i v i t y , l o wc o s ta n dc o s y m i n i a t u r i z a t i o n t h ek e ya s p e c to ft h ed e v e l o p m e n to ft h eb i o s e n s o r si st h e m e t h o d o l o g yo fi m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e so nt h ed e c t r o d eg u r f a o e t h i s d i s 3 d 僦f o c u s e s0 1 1d e v e l o p i n gn 州i m m o b i l i z a t i o ns t r a t e g i e so f b i o m a t e r i a l sf o r t h ep i p o o f i m p r o v i n gt h ep c d h m 锄i a n dl o n g - t e r m 吼a b i l i t yo f b i o 蛳玛t h e m a j o rc o n t e n t s 躺a sf o l l o w s ： 1 a un a n o p a r t i d e sm o d i f i e dw i l he l e c t r o a c t i v ep r u s s i a nb l u e ( p b ) w f l f o rt h ef i r s t t i m es y n t h e s i z e db yas i m p l ec h e m i c a lm e t h o d t n m s m i s s i o nd e c t m n l cm i c r o s c o p y d l o w e dt h a tt h ea v e r a g es i z eo ft h ep r u s s i a nb l u es h 卸y a u 他h y b r i dc o m p o s i t e ( p b a 哪w a sa b o u t5 0r i m , a n df o u r i e rt r a n s f o r m 乙l i v - v t ss p e c t r aa n dc y c l i c v o l m 瑚e t r yc o n f i r m e dt h ee x i s t e n c eo f p b0 1 1t h e5 衄0 f a c co f a un a n o p a r t i c l e s u s i n g t h el b l t e c h n i q u e , m u l t i l a y e rt h i nf i l m so f p b 幽, un a n o p a r f i c l c sw 骶p r e p a r e db y t h ea l t e m a t ek i b o i f p t i o uo f o p p o s i t e l yc h a r g e dl i n e a rp o i ) d 咖i y kp o l y ( a l l y l 锄i n e h y d r o c h l o r i d e ) ( p a h ) o n t or i dg ：h 懿f o rc o n s t m 击o no f ah y d r o g e ap e r o x i d e 鞭喊 t h en o v e lm u l f i l a y e rf i l m sw 骶c h a r a c t e r i z e db ys e m , c y c l i cv o l t a m m e a ya n d u v - v i s i b l e a b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y t h e p a h p b ( 孕a u nm u l t i l a y e r - m o d i f i e d e l e c t r o d es h o w e daw e l l - d e f i n e dp a i ro fr e d o xp e a k sa n dd r a m a t i cc a t a l y t i ca o i v i t y t o w a r d st h er e d u c t i o no f h y d r o g e np e r o x i d e 2 o r d e r e d3 di n t e r c o n n e c t e dm a c r o p o r o t mp r u s s i a nb l u e ( p b ) f i l m sw e r e d c c t r o c h c m i c a l l yf a b r i c a t e db yu s i n gc o l l o i d a lc r y s t a l so fp o l y s t y r e n eb e a d sa s s a c r i f i c i a lt e m p l a t e s t h ep r e p a r e dp bf i l me l e c t r o d e sh a v ee x c e l l e n tc a t a l y t i c a c t i v i t yt o w a r d st h er e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e t h ep bs t r u c t u r ew a sf u r t h e r l a b s t r a e l u s e da sf u n c t i o n a li n t e r f a c ef o rf a b r i c a t i n ga ne n z y m e - b a s e dg l u c o s es e l l s o l b yu s i n g 吼l l r f a e om o d i f i c a t i o nt e c h n i q u eb a s e do nt h eo l e e t r o s t a t i ei n t e r a e l i o m t h er e s u l t e d s a l l s o l rh a sh i g h e rf u n c t i o n a ld e m i t y , a n dl a r g e rs u r f a t a l e a t h ei n t e r c o n n e c t e d m a e r o p o r o u ss l r u c t u r oa l l o w se l l h a n e e dm 嘲t r a a s p o l t l h e s cc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s 哪o fa a a b l eu t lt od e t e c tg l u c o s ew i t hh i g hs e m i t i v i t y t h e r e f o r e , t h ep r e s e n t3 d o r d e r e dm a e r o p o r o u sf i l ms e n s o fe x h i b i t s1 ，i d el i n e a rd e t e c t i o nr a n g et o w a r d s g l u c o 辩, a c c e p t a b l er 印删i u c i b i l 姆a n do p e r a t i o n a la n ds t o r a g es t a b i l i t y t h ep r e s e n t a p p r o a e l ai sp r o m i s i n gf o rt h eg e n e r a t i o no fh i i g l a - e n z y m c - e o n t e tt h i nf i l m sw i t h t a i l o r e db i o a e t i v i t y 3 an o v e lt h r e ed i m e m i o n a lp o r o u se l a i t o s a nm e m b r a n em a t e r i a lw a sp r e p a r e d 腿a m a t r i xt oe n c a p s u l a t eh e p a t i t i sbs u r f a c em l t i b o d yo m 认b ) f o rf a b r i c a t i o no f i l l m l l l n o $ c l l s o l t l t h ep o r o u se l a i t o s a nm a t r i xw a sp r e p a r e db ye l e e l r o d e p o s i t i n ga d c s i g n o rn a n o e o m p o s i t e ss o l u t i o no fe l a i t o s a nc n c a p s , l a t e ds i l i c an a n o p a r t i e l c s h y b r i df i l mo i li t od e e l r o d e , a n dt h e nr e m o v i n gs i l i c an a n o p a r l i e l c sw i t hi - i f s o l u t i o n u s i n gi - i b s a b 船am o d e l ，t h ep o t e n t i o m c l r i ei l n f l l t l n o s c n s o r w a f t e o m m l e t e db yl i n k i n gi t b s a bm o l t t l e st ot h et h r e ed i m e n s i o n a lp o r o u se k i t o s a n f i l mu s i n gg l u t a r a k l e h y d ca sac r o s s - l i n k e r s c a n n i n ge l e e l r o om i c r o s c o p yw a su s e d t oi n v e s t i g a t et h e8 1 1 t r a c em o r p l a o l o g i eo ft h et h r e ed i m e n s i o n a lp o r o u se h i t o s a n f i h m c y d i ev o l t a m m o g r a r a sa n de l e e t a o e h e m i e a li m l , o c l a n e cs p e c t r o s c o p yw 雠 u s e dt op r o b et h ei n t e r r a c i a lp r o p c l l j i x to f t l a ei l l l m u n o s e n $ o r , r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e f a b r i c a t e di l n m u n o s l 蓖l s o rw i t ht h r e ed i m e n s i o n a lp o r o u sf l l l u c t u r ep o s s e s s e dh i g h 翻珊r f h c ea r e a , g o o dm e e h n n i e a ls t a b i l i t ya n dw e l lh y d r o l d h i l i e i t y 。w h i c hp r o v i d e da b i o e o m p a t i b l em i e r o c n v i r o n m e n tf o rm a i n t a i n i n gt h eb i o a e t i v i t yo f t h ei m m o b i l i z e d p r o t e i na n di n c r e a s e dt h ep r o t e i nl o a d i n g t h e r e f o r e , t h ep r e s e n ti m m u l l o s e n s o l e x h i b i t saw i d el i n e a rr a n g ef r o m6 8 5 7 0 8l a g m l 1w i t hal o wd e t e c t i o nl i m i to f 3 8 9l a g m u lf o rt h ed e t e c t i o no fh e p a t i t i sbs u l - f a c ea n t i g e n ( r i b s a 曲t h i sw o r k i v a b s t r a c t i m p l i e dt h a tt h eb i o c o m p a t i b l ea n dc o n t r o l l a b l et h r e ed i m e n s i o n a lp o r o u se h i t o s a n m e m b r a n ep o s s e s s e dp o t e n t i a la p p l i c a t i o n sf o rb i o s e n s i n g 4 an o v e lm e t h o df o rf a b r i c a t i o no fh e p a t i t i sbs u r f a c 譬a n t i b o d y ( h b s a b ) i m m u n o s a l s o rh a sb e e nd e v e l o p e db ys e l f - a s s e m b l i n gg o l di m n o p a r t i d e st oa t h i o l - c o n t a i n i n gn e t w o r kc h i t - g a - c y sc o m p o s i t mw h i c hw e p r e p a r e db a s e do n c h e m i c a lb i n d i n ga p p r o a c h ad 残m e dg o l de l e c t r o d ew a s 丘r s ti m m e r s e di na n e t w o r kc h r r - g a - c y sc o m p o s i t e s ，a n dt h e ng o l dn a n o p a r t i c l e sw e l ec h e m i s o r b e d o n t ot h et h i o lg r o u p so f t h en e t w o r kc o m p o s i t e s f i n a l l y , h b s a bw a sa d s o r b e do n t o t h er e f a c eo ft h eg o l dn a n o p a r t i d e s t h ep 廿f o n n a n c ea n df a c t o r si n f l u e n c i n gt h e p e r f o r m a n c eo ft h er e s u l t i n gi l i n n w c l es t u d i e di nd e t a i l t h ep r e s e n t i m m t m o 艇l l s o re x h i b i t saw i d el i n e a rr a n g ef r o m3 0 - 1 0 6 6p g - m l 1w i t hal o w d f t o c t i o nl i m i to flp g m l 。m o r e o v o r , t h es t u d i e db i o s e n s o re x h i b i t e dh i g h s e n s i t i v i t y , g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n dl o n g - t e r ms t a b i l i t y k e yw o r d l ：b i m e n m r , i a y e r - b y - i a y e rs e l f - 8 麟m b l e ；d e c t r o d e p o s i t i n g ；n a n o p a r t i c l e s v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究： 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：聋e2 嘭签字日期：崎似月如目 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌友堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权商量太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位做储签名越扩哼导师签名霉坷缉 签字日期：7 年r 胡乃日签字日期：鹇年7 1 月k 日 第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 生物传感器是一个非常活跃的研究领域，它与生物信息学、生物芯片、生 物控制论、仿生学、生物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学的交叉 区域。自从1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 把葡萄糖氧化酶( g o x ) 固定化酶和氧电极组 装在一起，首次制备了葡萄糖生物传感器【i 】以来，各种类型的生物传感器越来 越引起研究者们的关注；到8 0 年代生物传感器研究领域已基本形成，成为电分 析化学和生物技术研究最为活跃的领域之一 在众多的生物传感器中，电化学生物传感器( e l t r 0 洲c a lb i o s e n s o r ) 以其 选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简便、可实现在线、活体分析等特点， 在分析化学的研究中起着越来越重要的地位，已经广泛应用于生命科学、环境 分析、药物分析等领域。近年来，将纳米技术、表面科学等方法引入电化学生 物传感器的研究，极大地促进了电化学生物传感器基础和应用研究的快速发展。 1 2 电化学生物传惑器的基本原理 电化学生物传感器是将分子识别物质如酶、抗原，抗体、d n a 作为分子识 别物质固定在换能器上。将待测物质的浓度转变为电检测信号的分析器件，原 理如图1 1 所示电化学生物传感器可以分为电化学生物催化传感器和电化学 生物亲合传感器。电化学生物催化传感器是利用酶识别分析底物；而电化学生 物亲合传感器是利用抗原或单链d n a 识别抗体或互补d n a 以下分别介绍电 化学生物催化传感器即酶传感器，以及电化学生物亲合传感器中电化学免疫传 感器。 圈_ 圈圉_ 画 图1 i 电化学生物传感器的原理图 第1 章绪论 1 2 1 酶传感器 酶是生物体内产生的、具有催化活性的一类蛋白质，对相应底物具有催化 转化能力。酶不仅具有一般催化加快反应速度的作用，而且具有高度的专一性， 即一种酶只能作用于一种或一类物质，产生一定的产物。根据酶的这些特性， 可以将酶固定到电极表面从而构建电化学生物催化传感器，即酶传感器。酶传 感器研究经历了三个发展阶段，下面分别介绍这三个阶段； ( 1 ) 第一代酶生物传感器( 以氧为中继体的电催化) 第一代酶生物传感器是以溶解氧为电子介体1 2 , 3 ，可通过氧电极( c l a r k 电极1 测量氧的消耗或过氧化氢的产生来测定底物的传感器。这种传感器的优点是制 作简单，无人工介体；缺点是：( 1 ) 受溶解氧波动的影响比较大；( 2 ) 测量过氧 化氢的电位较高( m 6 0v ，s c e ) ，试样中共存的还原性电活性物质给测定带 来干扰。该传感器的灵敏度和选择性相对较差。 ( 2 ) 第二代酶生物传感器( 以人造电子介体为中继体的电催化) 为了克服第一代酶生物传感器的缺点，人们研制出第二代酶生物传感器， 即介体型酶生物传感器。介体型酶生物传感器是利用人工合成的电子介体代替 溶解氧，电子介体在酶和电极之间传递电子，通过测量电子介体的电催化信号 来测定底物的传感器。电子介体加强了酶与电极问的电子传递，加速了电极反 应，降低了天然氧浓度的影响，提高了测定的灵敏度：采用氧化还原电位较低 的电子介体，可降低工作电位，减少了还原性物质的影响，干扰少，测量浓度 线性范围较宽。但该类传感器也存在缺点，比如电子介体容易流失。电子介体 对电极的污染，酶介体在酶分子上的修饰会使酶的生物活性有所下降等因此 选择一种合适的电子介体和改进酶活性物质的固定方法显得尤为重要。 常用的电子介体有：铁氰化物、聚合物、酚类、导电有机盐类和二茂铁及 其衍生物等【哩想的电子介体应具备以下几个条件： a 可以进行可逆的电子转移，且具有足够大的均相反应速率常数； b 电极反应可逆； c 具有合适的氧化还原电位； d 分子量小( 小于1 0 0 0 k d a ) ，稳定，具有合适的水溶性。 ( 3 ) 第三代酶生物传感器( 直接电催化) 第三代酶生物传感器是以酶在电极上直接电子转移为基础进行电催化的传 2 第1 章绪论 感器，电极本身就是电子的受体( 或供体) ，与氧气或其它的媒介体无关，酶与 电极之间直接进行电子交换从而完成催化循环【1 0 - 1 7 。因其简单、制作方便，是 一种极好的传感器模式。 1 2 2 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的传感技术相结合而构建的一 类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究电化学免疫传感器 和传统的免疫测试方法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗原或抗体固定在 电极表面，来检测样品中的抗体或抗原不同的是，传统免疫测试法输出结果 只能定性或半定量地判断，且一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实 时检测，而电化学免疫传感器将抗体或抗原固定在电极表面，通过传感技术使 吸附发生时产生电学的变化，转化成可检测的电学信号来测定环境中待测分子 的浓度【i ”电化学免疫传感器具有可实现在体检测，不受样品颜色、浊度的影 响( 即样品不需处理，不需分离) ，且需要的仪器相对简单等优点，因此有良好 的发展前景 根据测量信号的不同，可以将电化学免疫传感器分为电流型【i 蛆、电位型 【笠2 3 1 及电容型等免疫传感器 ( 1 ) 电位型免疫传感器 1 9 7 5 年j a n a t a 首次描述了用电位测量来检测免疫化学反应，这种免疫测量 原理是先通过聚氯乙烯膜将抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特 异性结合，抗体膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相 应发生改变膜电位的变化值与待测物的浓度存在对数关系，因此根据电位变 化值即可求出待测物浓度但灵敏度较低，故未得到实际应用1 2 ” 2 0 世纪8 0 年代，r e c h n i 乜【2 习等人将商业上取得成功的离子选择性电极、p h 电极或气敏电极引入到电位测量式免疫传感器中，使灵敏度得以改进。如将c 0 2 气敏电极用于抗生素、人体i g g 和地高辛抗体等r u o y u a n b 组【2 6 l 报道了纳米金 修饰玻碳电极用于固载抗体的电位型白喉类毒素免疫传感器的研究。该传感器 利用纳米材料大的比表面积及良好的生物兼容性，增大了固定在电极上的抗体 量，并使抗体保持良好的生物活性，从而提高了传感器的灵敏度。 ( 2 ) 电流型免疫传感器 3 第1 章绪论 该类传感器的原理主要有竞争法和夹心法两种，前者是用酶标抗原与样品 中的抗体竞争结合电极上的抗体，催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起 电流变化，从而可测得样品中抗原浓度；后者则是在样品中的抗原与氧电极上 的抗体结合后，再加酶标抗体与样品中的抗原结合，形成夹心结构，从而催化 氧化还原反应产生电流值变化。 以a f p 的测定为例，利用酶的放大作用可获得极高的灵敏度。a f p 传感 器在1 矿l f f “g m l l 范围内有定量关系。方法是将抗原固定在氧屯极表面，测 定时在待测a f p 的溶液中加入已知浓度经标记过氧化氢酶的a f p 溶液，一旦 遇到a f f 抗体时，待测的a f p 抗原与标记的抗原就在电极上产生与抗体结合 的竞争反应，最后达到一定的比例，然后将电极取出用水洗干净，在放入含过 氧化氢的酶活性物质的溶液中，由于标记的酶能催化过氧化氢分解而产生氧， 氧的增加使传感器电流值增大，从电流的增加速度或最大变化量可求出标记酶 的量，即结合于膜上标记a f p 的量。另外，再求a f p 抗体膜的最大抗原结合 量，便可推算出被测非标记a f p 抗原的量唧。r u q i n y u 实验小组制作了c 3 电 流型免疫传感器，该免疫传感器把c 3 抗体固定在溶胶凝胶修饰电极上，并与 待测溶液中的c 3 - h r p 和c 3 竞争反应，从而达到检测补体c 3 的目的【2 8 l 。此外， 用酶联免疫吸附试验及多功能电流免疫传感器还先后检测了茶碱、载脂蛋白b 、 促卵泡激素与黄体生成激素等人体血清中的生物活性物质，为该类传感器在医 学领域里的应用进一步拓宽了道路。 ( 3 ) 电容型免疫传感器 电化学电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技术。当金属电 极与电解质溶液接触，在电极溶液的界面存在双电层，它可以用类似于电容器 的物理方程来描述； c = a o r j d 其中c 为界面电容，6 0 为真空介电常数，8 为电极溶液界面物质介电常数，a 是电极与溶液的接触面积，d 是界面层厚度。电极溶液的界面电容能灵敏反应 界面物理化学性质的变化，当极性低的物质吸附到电极表面上时，d 就会增大， c 就会减小，从而使界面电容降低。众所周知，蛋白质分子是一类分子量大， 极性小的生物大分子，当它吸附到电极表面时，会显著地降低电极溶液界面电 容。电容型免疫传感器就是基于将抗体固定在电极表面，当抗原抗体在电极表 面复合时，界面电容相应地降低，据此检测抗原的量。b a t i a l a r d 等认为这种结 4 第1 章绪论 构是由几个电容器串联组成的( 如图1 2 所示) ，它们之白】关系可表示为i c i = l c i + l c b 其中c l 为总电容，c i 是免疫反应前的电容，c b 是结合抗原引起的电容。 测量电容的方法有多种。电化学交流阻抗法是对敏感电极施加- - d , 幅正弦电压， 依据交流阻抗的大小和相位可以得出电极溶液界面的电容。利用线性扫描伏安 法，恒电位阶跃法中充电电流也可以求出电极，溶液电容值。 卜 c , - - c 。 - h 卜l ，c p i ，c i + i i c hh 卜 ! c l = i i c i4 - i i c + i i c a i 图1 2 电容型免疫传感器的原理 1 3 生物分子固定化技术 生物分子识别物质的固定化技术是制作电化学生物传感器的关键，很大程 度影响着生物传感器的稳定性、灵敏度等主要性能。因此，它必须兼顾生物分 子识别物质的活性和分子识别物质固定的牢固性两个方面通常的固定化技术 可分为直接法和问接法，主要有以下几种基本方法：( 1 ) 吸附法【加川】( 直接 法) ；( 2 交联法i 蚓；用戊二醛等交联后再与蛋白质分子相互结合；( 3 ) 包埋法 【3 ”3 l ；( 4 ) 共价键合法【3 ”和( 5 ) 电化学聚合法；( 6 ) 溶胶凝胶技术；( 7 ) 纳米粒子 修饰技术；( 8 ) 分子自组装固定法；( 9 ) - - - - 维多孔材料用于构建生物传感器；( 1 0 ) 树枝状化合物的放大技术 1 3 1 吸附法 利用物理吸附法将分子识别物质固定在电极表面是一种较为简单的固定化 技术。条件较为温和，可保持分子识别物质较高的生物活性。由于载体的不同， 载体与分子识别物质的吸附作用力不同。常用的载体包括天然或人工合成的无 机有机高分子材料，比如，石墨粉m - 4 4 、石墨聚四氟乙烯、活性碳 4 6 4 7 j 、离 1 i 丫1 l l 丫， l l 了厶5 第l 章绪论 子交换树脂甜】等。如果载体是离子交换剂，则生物识别物质如酶、抗体或抗原 借助静电引力吸附在载体表面；如果载体是非极性的，则靠范德华力将分子识 别物质吸附在载体表面物理吸附存在以下缺点：分子识别物质与载体表面结 合力弱；在表面上取向不规则分布；制得的生物传感器易发生分子识别物质的 泄漏；分子识别物质的负载量有限。 1 3 2 交联法 共价交联法是用双功能基团试剂与分子识别物质交联成不溶性的网状结 构，从而使分子识别物质固定于电极表面的方法。通过采用双功能基团试剂， 在分子识别物质之间、分子识别物质与凝胶聚合物之间交联形成网状结构而使 分子识别物质固定化常用的双功能基团试剂有戊二醛4 9 划、氯甲酸乙酯和2 。 4 二异氰酸酯。如戊二醛能在温和条件下与蛋白质的自由氨基反应，其原理反 应式如下： 载体一n h 2 + o c h - ( c h 2 ) r c h o4 - n h 2 一酶一一 载体- - n h - c h ( o h ) - ( c i - 1 2 ) 3 - c h ( o h ) - n h - - 酶一 许多研究工作均采用牛血清白蛋白( b s a ) 固定分子识别物质。采用牛血清白 蛋白可让较多的分子成键和防止分子识别物质过于拥挤，同时也为分子识别物 质提供了合适的微环境，从而提高了测定灵敏度。此方法操作简单、固定化效 率高，常用来作为其它固定化方法的辅助手段以防止分子识别物质的泄漏。交 联法的缺点主要有：反应难以控制、形成的分子识别物质膨松、所需样品量多、 扩散阻力大 1 3 3 包埋法 物理包埋法一般是在温和条件下的聚合物包埋法，在形成聚合物的同时， 将分子识别物质包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构中：或利用物理 方法把分子识别物质包裹在溶胶凝胶中；也可将分子识别物质包埋在类脂层 中。采取的包埋方式通常包括凝胶包埋法和胶囊包埋法两种形式【5 m 乳。包埋法 的优点是操作条件比较温和，膜的孔径和形状可随意控制，对生物组分活性影 响较小；缺点是：高分子凝胶或半透膜分子的尺寸选择性不利于大分子底物与 产物的扩散：由于没有共价键合，也容易发生识别物质的泄漏。 6 第l 章绪论 1 3 4 共价键合法 将分子识别物质通过共价键与电极表面结合而固定的方法称为共价键合 法。通常要求在低温、低离子强度和生理p h 条件下进行。共价键合法的过程 通常包括三个步骤：基底电极表面的活化、分子识别物质的偶联及除去键合疏 松的分子识别物质。这些步骤中每一步合适的试验条件都取决于生物活性单元 及偶联剂的特性。共价键合法的优点是载体分子识别物质的连接较为牢固其 缺点主要有：共价键合反应使酶的活性损失较大，且操作过程复杂、成本较高。 1 3 5 电化学聚合法 电化学聚合法是通过将聚合物单体和生物组分同时混合于电解液内，通过 恒电位法或者电位循环扫描法使单体电氧化或还原而形成聚合物膜，与此同时 生物组分由于静电或吸附作用而被嵌入聚合物膜内常用的构成生物传感器的 聚合物膜可分为导电型和非导电型两种。导电型聚合物常见的有聚苯胺 5 6 5 7 】、 聚吡咯【5 8 别、聚噻吩【删等；非导电型常见的有聚苯酚等。电化学聚合法具 有以下优点：( 1 ) 电化学聚合和生物组分的固定可一步完成，简化了实验步骤； c 2 ) 聚合层的厚度和生物组分的量易于控制，构制的传感器的重现性较好：( 3 ) 抗干扰能力强 生物组分固定化技术的功效常取决于所选择的敏感膜载体的性质。传统固 定化技术采用的载体材料大多数材科形成的膜较厚，均匀度较差，附着力低， 因此影响了生物传感器的检测灵敏度，重现性和再生性等。随着膜技术的发展， 一些新型的成膜技术开始应用于制备生物传感器。例如，自组装技术( s a l 旧是 目前倍受瞩目的一种新技术，该技术可根据需要制备带有不同活性功能团的单 层膜，并已被广泛用做生物材料的载体膜【吲。 1 3 6 溶胶一凝胶技术 溶胶凝胶技术是近些年来发展起来的一种新技术，它是指有机或无机化合 物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经过热处理而制得氧化物或其他化合物固 体的一种方法。 采用溶胶一凝胶技术将生物组分固定在无机陶瓷或玻璃材料内，生物组分活 第1 章绪论 性的保持有明显的提高。此外选用一些无机基底材科( 如二氧化硅) 要比有机聚 合物材料具有更好的坚固性和化学惰性、可忽略的体积变形性、高的热稳定性 及光化学稳定性等。研究结果表明，溶胶凝胶的多孔网状结构不仅适合固定小 分子也适合固定生物大分子。使用溶胶凝胶固定法可以为网络中的生物大分子 提供一个水溶液的微环境，因为网络结构中含有大量的空隙水。与传统的固定 方法相比，溶胶凝胶固定法的优势还表现在它可固定任何种类的生物组分，可 以较好地保持蛋白质表面微观结构的整体性和方向均一性，从而对蛋白质的活 性和稳定性的损伤较小 溶胶一凝胶技术在电分析化学中的应用主要体现在修饰电极的制备和生物 传感器的开发上。k u n z e l m a n n 和b o t t c h e r 将葡萄糖氧化酶( c o d ) 固定在二氧化 硅的凝胶中，从而对葡萄糖进行了测定m l 。l e v 和g 1 e z e r 将掺有g o d 的v z o s 溶 胶凝胶膜涂在铂电极上，采用循环伏安法对葡萄糖进行了铡定州j 。n a r a n g 等 对比研究了g o d 的三种固定方式即物理吸附、掺入到t e o s 的溶胶凝胶膜中 ( 包埋) 及将g o d 夹心于两层的溶胶一凝胶膜中，结果表明酶在夹心式结构中的 活性比物理吸附高5 巧倍，稳定性比包埋法高3 倍脚】。溶胶凝胶技术用于固定 其它的酶如辣根过氧化酶和酪氨酸酶也有文献报道 6 6 , 6 7 l 。此外，溶胶凝胶技术 还可用于电化学免疫分析中，w a n g 和p a r a s a d 报道了基于溶胶凝胶的碳复合 l g g 免疫传感器l 锝1 1 3 7 纳米粒子修饰技术 将纳米材料弓l 入电化学生物传感器中，大大提高了电化学生物传感器的灵 敏度和再现性等，使得纳米组装屯化学生物传感嚣成为新一代电化学生物传感 器的研究热点呻】。纳米粒子具有壳层结构，它的表面层占很大比例，但表面原 子是长程、短程都无序的非晶层，可以认为粒子表面层的实际状态更接近气态。 而在粒子的心部，存在结晶完好的周期排布的原子，纳米粒子的这种特殊类型 的结构导致了它有四方面效应：宏观量子隧道效应、量子尺寸效应、表面效应、 体效应，并由此产生出许多特殊性质：奇异力学、电学、磁学、热学、光学、 化学活性等。由于大的比表面积、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效 率高、吸附能力强等优异特性，纳米粒子在传感器的研究中发挥着重要作用【7 0 】。 首先纳米颗粒表现出显著的不同于块体材料的特性，其非常大的比表面 第1 章绪论 积、较高的表面自由能及具有吸附浓缩效应，因而可以牢固固载大量酶蛋白质， 并在一定程度上钝化了酶的构型，使其不易发生进一步的变化而失活，被纳米 颗粒吸附之后不易在测试溶液中流失，增加了酶和蛋白质的稳定性，故可以显 著提高电极的电流响应 第二是定向作用：纳米颗粒的吸附场能引起颗粒的整齐排列，这样吸附在 纳米颗粒上的酶和蛋白质就具有定向作用。分子在定向之后，其功能会有所改 善，如h o s h i 【7 l 】等使酶分子定向，可以使酶的响应电流提高l o 倍以上。 第三是金属纳米粒子具有良好的导电性和宏观隧道效应的作用，使酶的氧 化还原中心与电极问通过纳米材料进行直接电子转移成为可能。起初人们只是 注意到纳米金颗粒溶胶的表面效应在固定化酶过程中起的重要作用，而忽视了 纳米颗粒其它方面的特性金属纳米颗粒其本身具有催化活性，其宏观隧道效 应可以作为固定化酶之问、固定化酶与电极之间有效的电子中介体，从而使得 酶的氧化还原中心与电极问通过金属颗粒进行电子转移成为可能它对于氧化 还原反应的催化作用早已得到了人们的共识t 7 2 , ”l ，根据g e m e y - m o t t 理论【7 4 1 ， 当金属原子簇所包含的原子数少到一定数目时，颗粒本身具有从周围体系中吸 取电子而被还原的特性，因而在酶反应中纳米颗粒迅速地从被还原的物质中获 取电子而使酶重新具