（细胞生物学专业论文）凹顶藻类组织培养研究.pdf

凹顶藻类组织培养研究中文摘要 中文摘要 本课题以三种凹顶藻：冈村凹顶藻( l a u r e n c i ao k a m u r a i ) ，三列凹顶藻 ( l a u r e n c i at r i s t i c h a ) ，波状软骨凹顶藻( c h o n d r o p h y c u su n d u l a t u s ) 为实验材料， 用藻体切段培养的方法研究了三种凹顶藻类藻体切段再生芽的形成及其再生过程 中的极性。并探索了光照，温度和盐度三种外界条件对三种凹顶藻藻段再生的影 响。发现三种凹顶藻藻体切段两端均能形成再生芽，并无明显极性；2m i l l 以上的 藻体切段在人工培养条件下不易死亡，能形成较多的再生芽；冈村凹顶藻与波状 软骨凹顶藻的皮层与髓部细胞均能形成再生芽，三列凹顶藻的再生芽全部由皮层 细胞形成；培养过程中藻体表面也能产生大量的再生芽；在实验室条件下，冈村 凹顶藻的最适光照强度为5 3 5 5l m a o lp h o t o nm - 2s - 1 ，最适温度为2 0 ，最适盐度 为3 5 ；波状软骨凹顶藻的最适光照强度为5 3 5 5i x m o lp h o t o nm - 2s - 1 ，最适温度为 2 0 ，最适盐度为3 0 ；三列凹顶藻的最适光照强度为5 3 5 5i j m o lp h o t o nm - - 2s _ 1 ， 最适温度为2 5 ，最适盐度为3 0 。藻段再生过程和三种外界条件对三种凹项藻再 生的影响研究为凹顶藻的人工培养体系提供了理论基础和依据。 关键词：冈村凹顶藻；三列凹顶藻；波状软骨凹顶藻；组织培养；生长因子。 作者：吴勋建 指导教师：沈颂东副教授 凹顶藻类组织培养研究 英文摘要 t i s s u ec u l t u r eo fl a u r e n c i ac o m p l e x a b s t r a c t i nt h i sw o r k ，t h et i s s u er e g e n e r a t i o np o l a r i t ya n dp r o c e s so ft h r e es p e c i e so f l a u r e n c i ac o m p l e x( l a u r e n c i ao k a m u r a i , l a u r e n c i at r 西t i c h a ，c h o n d r o p h y c u s u n d u l a t u s )w e r ei n v e s t i g a t e du n d e rl a b o r a t o r yc o n d i t i o n a n df o u rl e v e l so f i l l u m i n a t i o n ，t e m p e r a t u r ea n ds a l i n i t yw e r eu s e d t oe x p l o r et h e i re f f e c t so nt h e r e g e n e r a t i o no ft i s s u e sc h o p p e df r o mt h r e es p e c i e so fl a u r e n c i ac o m p l e x w ef o u n d t h a tu n d e ra r t i f i c i a lc u l t u r ee n v i r o n m e n tt h e r ew a sr i oo b v i o u sr e g e n e r a t i o np o l a r i t yo f t h r e es p e c i e so fl a u r e n c i ac o m p l e x t h es u r v i v a lr a t ea n d r e g e n e r a t i o nn u m b e ro fb u d s o fc h o p p e dt i s s u e sa b o v e2m i l ll e n g t hw e r eh i g h e r t h eb u dc o u l dg r o wo u to ft h e m e d u l l aa n dt h ec o d e xo ft h ef r a g m e n to fl a u r e n c i ao k a m u r a ia n dc h o n d r o p h y c u s u n d u l a t e s ，b u tc o u l do n l yg r o wo u to ft h ec o d e xo fl a u r e n c i at r i s t i c h a u n d e r l a b o r a t o r yc o n d i t i o n s ，t h eo p t i m a li l l u m i n a t i o no fl a u r e n c i ao k a m u r a iw a s5 3 5 5l 上r n o l p h o t o n 1 1 1 - 2s - 1 ，a n dt h et e m p e r a t u r ea n ds a l i n i t yw a s2 0 a n d3 5 ；a st o c h o n d r o p h y c u su n d u l a t u sw a s5 3 5 5l x m o lp h o t o nm - 2s _ 1 ，2 0 a n d3 09 6 0 ；a n d l a u r e n c i at r i s t i c h aw a s5 3 5 5l a m o lp h o t o n1 1 1 - 2s - 1 ，2 5 a n d3 0 o t h ep r e s e n ts t u d y l a yo u tf o u n d a t i o n sf o rf u r t h e rr e s e a r c ha n dm a s s i v ec u l t u r eo fl a u r e n c i ac o m p l e x k e yw o r d s ：l a u r e n c i ao k a m u r a i ；l a u r e n c i at r i s t i c h a ；c h o n d r o p h y c u su n d u l a t e s ； t i s s u ec u l t u r e ；g r o w t hf a c t o r s i i w r i t t e nb yx u n j i a nw u s u p e r v i s e db ys o n g d o n gs h e n 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：墨堕 日 期：趟：! 星 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 期：也尊：三：i 星 期：超掣邙 凹顶藻类组织培养研究 序言 序言 海藻在生物学分类中的地位是低等的海洋隐花类植物，人们日常所吃的海带、 海苔、羊栖菜以及石莼、石花菜等都是海藻。由于海藻富含多种生命活性物质， 如多糖、高不饱和脂肪酸、牛磺酸、类胡萝卜素、甾醇及海带氨酸等，无论是作 为日常食物，还是提取活性物质作为药品，海藻对人类都有着极大的好处。 凹顶藻类l a u r e n c i ac o m p l e x ( 包括三个属：c h o n d r o p h y c u s ，l a u r e n c i a ，和 o s m u n d e a )为大型海藻，隶属于红藻i - r h o d i p h y t a ，仙菜目c e r a m i a l e s ，松节藻 科r h o d o m e l a c e a e ，多管藻亚科p o l y s i p h o n i o i d e a e 。自2 0 世纪7 0 年代以来，凹顶藻属 在海藻化学、化学生态学和海洋天然产物研究方面引起了广泛关注( g u e l l ae ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。这个属的许多种类能够产生丰富的次级代谢产物，是红藻门中次级代谢 产物种类最多的一个属。凹顶藻属次级代谢产物不仅结构新颖独特，而且生物活 性广泛，许多化合物具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤和细胞毒活性( a n g g a d i r e d j ae ta 1 ， 1 9 9 7 ；c h a r l e se ta 1 ，2 0 0 1 ；m a y e r & h a r a a n n , 2 0 0 4 ；k l a d ie ta 1 ，2 0 0 5 ) ，可开发成药 物或作先导化合物，在海洋药物研究中占有重要地位。 迄今为止我们对该属藻类的次级代谢途径和分子机制知之甚少，该领域的研 究几乎是一个空白。但毫无疑问，该研究具有重要的理论意义和广阔的应用前 景。这不仅有助于我们更好地理解海藻次级代谢产物的生物学和生态学意义，而 且能够调控次级代谢产物的生物合成，实现按需生产有用活性物质的目的。要达 到此目的，首先必须建立起稳定的细胞和组织培养体系。研究显示，通过细胞培 养和愈伤组织诱导建立起来的大型海藻悬浮微繁殖体系具有合成与原藻相同或相 似次级代谢产物的能力。由于反应体系的温度、光照、营养盐、充气条件等可调 控，能够按需控制海藻生物量，调控次生代谢物的生物合成，最终达到稳定、足 量生产活性物质的目的( r o r r e re ta 1 ，1 9 9 5 ，1 9 9 6 ，1 9 9 9 ) 。这些研究的基础是要对 海藻的生物学特性和生态因子有详细的了解，本课题的工作正是为后续的研究打 下基础。 凹顶藻类组织培养研究 第一章 第一章文献综述：凹顶藻类l a u r e n c i ac o m p l e x 研究进展 摘要：本文对国内外大型红藻凹顶藻类l a u r e n c i ac o m p l e x 的形态学、解剖学、 分类学、化学成分、次生代谢物、药理学、生活史、生态学和生理学研究进展等 进行了系统的归纳和总结。凹顶藻类含有多种次生代谢物，如萜类、酚类和不饱 和脂肪酸，这些次生代谢物成分在药理学、食品和保健品领域有着广泛的应用和 广阔的前景。 关键词：凹顶藻类，形态，分类，成分，药理，应用 一、形态学和分类学研究 凹顶藻在红藻门中是一个大的类群，也是最具多样性的类群( g a r b a r ye t h a r o e r , 1 9 9 8 ) ，包含有大约1 3 5 1 4 5 个种，多生于热带、亚热带和温带海域 ( m a s u d ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 1 ，形态学与解剖学研究 凹顶藻类的藻体通常直立，肉质的易碎圆柱状或扁压，分枝放射状或羽状分 裂，末小枝端部凹陷，丛生着不明显无色的毛丝体，盘状固着器或者壳状基部附 着在基质上。许多种类在显微镜下都可以观察到细胞中存在内含物樱桃体。雌雄 同体或异体。雄配子体产生的精子囊集生成簇状，或生于体表面，或生在特 殊的小枝上。果孢枝由4 个细胞组成，受精后，支持细胞又产生辅助细胞，果 孢细胞与辅助细胞直接融合，融合后的辅助细胞产生产孢丝，由产孢丝形成 果孢子囊；成熟的囊果裸露或被有果被。四分孢子囊单生、集生或轮生，裸 露或生于皮层细胞中，十字形或四面锥形分裂；有的种类产生多孢子囊或副 孢子囊。藻体幼年时为青绿色或红色，成年的藻体呈现红色或紫红色，在藻体死 亡后呈现出深红色。 中国凹顶藻类在新分类系统中划分为2 属3 7 个种，其中凹顶藻属2 4 种， 软骨凹顶藻属1 3 种( 丁兰平，2 0 0 3 ) 。中国常见种有略大凹顶藻、冈村凹顶藻 和钝形凹顶藻等。略大凹顶藻j l a u r e n c i am a j u s c u l e ( h a r v ) l u c a s 广泛分布于太 平洋沿岸，如中国南海、日本海域、菲律宾、印度沿海等。藻体呈玫瑰色，株高 2 凹顶藻类组织培养研究 第一章 8 2 0c m ，基部具盘状的固着器。藻体主轴及顶，轴圆柱状，直径约1 2m m 。藻 体分枝较多，互生或亚对生，呈螺旋排列。藻体外观呈圆锥状，分枝顶端有毛丝 体，呈二叉式分歧。孢子囊枝与普通小枝没有区别，四分孢子囊为四面锥形分裂， 囊卵为球形。精子囊从树枝状，生长在最末小枝的顶端凹陷处。澳大利亚模式种 囊果异常簇生( s a i m & w o m e r s l e y ，1 9 7 4 ) 。 冈村凹项藻l a u r e n c i ao k a m u r a iy a m a d a 分布于中国沿海、太平洋西部沿岸、日 本和朝鲜半岛等。中国福建种( 庄惠如，1 9 9 3 ) 藻体为紫褐色，藻体呈披针形， 株高4 1 4c m ，具多个直立主在基部多少融合，以假根固着，主干圆柱状，圆锥状 分枝，分枝互生、对生或轮生，围周细胞4 个。表皮细胞中存在樱桃体。四分孢子 囊末小枝圆柱状，囊果株的末小枝在不育时圆柱状，成熟后呈瓶颈形( 丁兰平， 2 0 0 3 ) 。我国山东变种与福建模式种成熟个体的分枝外形以及雄体育性小枝形态 与原种有差异，原种藻体分枝舒展，小枝不密集成簇雄体育性小枝倒锥形，枝 端边缘有l 3 个更小的碗状精囊巢。而变种三生枝短，育性小枝常帚状集生其上， 外形似小技簇；雄体育性小枝呈圆筒状膨大，仅具单一精囊巢( 庄惠如，1 9 9 3 ) 。 三列凹顶 渤l a u r e n c i at r i s t i c h at s e n g ，c h a n g ，e z x i ae tb m x i a ( t s e n ge t a 1 ，1 9 8 0 ) 为中国特有种类，分布于中国南海海域。藻体一般几株丛生，具及顶 直立主枝和匍匐的假根，幼年藻体藻体淡绿色，成熟藻体黑紫色，高5 1 0c m 。主 茎圆柱状，分枝三列，不规则互生。表皮细胞成排排列，具纵向纹孔连结。分枝 每轴产生4 个围轴细胞，表皮细胞和生毛体细胞各具有一个樱桃体。四分孢子囊小 枝棒状，四分孢子囊卵形或长卵形，具疣状小枝的雄植株简单或端部分枝，精子 囊卵形。 波状软骨凹顶藻c h o n d r o p h y c u su n d u l a t e s ( y a m a d a ) g a r b a r ye th a r p e r ( g a r b a r ye th a r p e r ，1 9 9 8 ) 广泛分布于太平洋沿岸，包括中国东海和南海海域、 日本和夏威夷群岛。藻体多为紫褐色，丛生，直立。藻体近基部部分圆柱状，向 上变扁平。藻体羽状分枝，次生分枝产生许多段的多节的末小枝。皮层细胞间无 次生纹孔连结。四分孢子囊末小枝不扁压，截形或瘤状，四分孢子囊四面体型分 裂。囊果梨形，多个集生于小枝上。 2 、分类学研究 凹顶藻类组织培养研究 第一章 藻体的外部形态特征易于观察，在实验条件较差的情况下也可进行，因此在 凹项藻分类的早期工作中即是根据藻体的外部形态分类，如l a m o u r o u x ( 1 8 1 3 ) 以 外部形态特征建立了凹顶藻属，此时的凹顶藻属仅列举了8 个种。由于凹顶藻种类 复杂，且外部形态在种内和种间都存在高度的可变性，因此完全依据外部特征分 类存在很大的缺陷性。因此在发展到十九世纪六十年代后凹顶藻的分类增加了浅 显的内部解剖特征，a g a r d h 等依据藻体的分枝和形状将凹顶藻属划分为线性组 f i l i f o r m e d 、瘤状组p a p i l l o s a e 、钝形组o b t u s a e 和羽状组p i n n a t i f i d a e 四个组，共3 8 个 种，这是凹顶藻类的第一个分类系统( a g a r d h ，1 8 6 3 ) 。 y a m a d a 对太平洋沿岸分布的凹顶藻进行了研究，根据表皮细胞的横切面观和 髓部细胞壁形态的差异将凹顶藻属重新划分为羽状组p i r m a t i f i d a e 、栅状组 p a l i s a d a e 、福氏组f o r t e r i a n a e 和软骨组c a r t i l a g i n e a e ( y a m a d a ，1 9 3 1 ) ，形成了凹 顶藻分类中的y a m a d a 系统。但y a m a d a 同时也指出，海藻的外部形态受环境的影 响很大。因此，y a m a d a 系统仍存在很大的缺陷。 s a i t o ( 1 9 6 7 ) 年对亚洲沿海的凹顶藻分布进行了研究，在s a t i o 的研究中，四 分孢子囊的类型和皮层最外层细胞次生纹孔连结是分类的主要指标。s a t i o 在研究 中发现，凹顶藻的四分孢子囊存在平行排列和垂直排列两种类型，部分藻类在相 邻表皮细胞问存在次生纹孔结构。根据四分孢子囊的类型和皮层最外层细胞次生 纹孔连结的差异将凹顶藻属分为四分孢子囊平行排列，相邻表皮细胞间存在次生 纹孔连结的凹顶 藻d _ , a u r e n c i a 和四分孢子囊垂直排列，相邻表皮细胞缺乏次生纹孔 连结的软骨藻c h o n d r o p h y c u s 两个亚属；s a t i o 等对夏威夷海域的凹顶藻类进行了研 究，根据四分孢子囊和精子囊结构以及次生纹孔连结的有无提出了一个新的类群 “s p e c t a b i l i sg r o u p ( s a t i o ，1 9 6 9 ) ，该种群具有与前两个亚属不同的特征：近 轴而生的四分孢子囊原平行排列，位于侧面的精子囊生殖窠为袋状，表皮细胞五 纹孔连结。这两属一类群构成了s a t i o 系统的主体结构。但在s a t i o 分类系统中，具 交叉特征的种无法确定系统位置：( 1 ) 具有次生纹孔连结和四分孢子囊垂直排列 的种类，如上c r u s t i f o r m a n sm c d e r m i d ( 1 9 8 9 ) ；( 2 ) 缺少次生纹孔连结但四分孢 子囊平行排列的种类，包括三k a n g j a e w o n iin a me ts o h n ( 19 9 4 ) 和三t r a n s l u c i d a f u j i ie tc o r d e i r o m a r i n o ( 1 9 9 6 ) 两个种。n a m 在1 9 9 0 年提出了一藻体营养轴产生围 周细胞数目为基础的两亚属系统：凹顶藻亚属每个营养细胞产生4 个围周细胞， 而软骨凹顶藻亚属仅有2 个，并在1 9 9 5 年最终将凹项藻属定位l a u r e n c i a 和 4 凹顶藻类组织培养研究第一章 c h o n d r o p h y c u s 两个亚属。g a r b a r y 等根据凹顶藻的3 6 个形态解剖学特征为基础的 凹顶藻类的支序系统学图谱( g a r b a r ye ta 1 ，1 9 9 8 ) 作为基础的凹顶藻类的分类系 统，即g a r b a r ye th a r p e r 系统。在g a r b a r ye th a r p e r 系统中，凹顶藻属分为 c h o n d r o p h y c u s ，l a u r e n c i a 和o s m u n d e a 三个亚属。 在凹顶藻的分类中，除形态和解剖学特征外，还存在依据化学特征进行分 类。红藻中含有丰富的卤代次生代谢物，且不同的凹顶藻合成的卤代次生代谢物 存在一定的差异( e r i c k s o n ，1 9 8 3 ) ，有人在研究不同凹顶藻的卤代次生代谢物的 差异后据此将凹顶藻分为四组：s e s q u i t e r p e n o i d ，d i t e r p e n o i d ，t r i t e r p e n o i d 和 c 1 5 a c e t o g e n i n ( e f i c k s o n ，19 8 3 ) ，并受到了其他一些学者的支持( m a s u d a e ta 1 ，19 7 7 ， 1 9 9 6 ) 。因为不同的凹顶藻均存在特异性的次生卤代物，因此这种方法在分析活 的藻体的类群方面存在优越性，但由于在藻体死亡后，次生代谢物消散较快，不 易检测，因此不适于标本的分类。 在凹顶藻的分类研究中，不仅有以上的几种方法，还有以发育学为基础的鉴 定方法( a b ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 和支序系统的鉴定方法( g a r b a r y ，1 9 9 8 ) 作为藻中鉴定 过程中的辅助。 国内方面，丁兰平根据凹顶藻的解剖学特征，研究了中国凹顶藻类的分类。 在丁的研究中，分类的主要依据是营养细胞的围周细胞的数目，但同时参考了生 境、粘纸特性、植株大小、主枝直径、分枝方式、栅状表皮、表皮细胞间的次生 纹孔连结、透镜增厚、精子囊和果孢形态等3 6 个特征，将全部3 7 个种分别移入了 凹顶藻亚属和软骨凹顶藻亚属( 丁兰平，2 0 0 3 ) 。在我国的凹顶藻的分类方面具有 重大的参考价值。 三、化学成分研究 从2 0 世纪6 0 年代以来，人们从凹顶藻类中发现了多种次生代谢物。a y y a d 对 钝形凹顶藻的化学成分进行了研究( a y y a d ，1 9 9 4 ) ，s u z u k i 和r o u s s i s 分别在2 0 0 1 年和2 0 0 2 年对巢凹顶藻的次生代谢物成分做了研究( s u z u k i ，2 0 0 1 ：r o u s s i s ，2 0 0 2 ) 孙杰等在2 0 0 7 年对三列凹顶藻的化学成分进行了研究( 孙杰，2 0 0 7 ) 。经过众多 学者的研究，凹项藻中已发现的次生代谢物可分为以下几类： 1 、倍半萜( s e s q u i t e r p e n e s ) 5 凹顶藻类组织培养研究第一章 倍半萜是萜类化合物中最多的一支，从凹顶藻中分离的萜类化合物包含了无 环、单环、双环和三环这些类型，在结构上大多含有卤元素，其中以溴和氯为主。 希腊的d i m i t r a ( 2 0 0 2 ) 研究了采自希腊爱琴海的钝形凹顶藻l o b t u s a 的提取 物中发现了5 种全新的倍半萜，均为双环或三环倍半萜。a y y a d ( 1 9 9 4 ) 在三o b t u s a 中得到了单环结构的倍半萜，e r i e k s o n ( 1 9 9 5 ) 从菲律宾海域的l m a j u s c u l a 中得 到了一种具有环氧桥环的氯代倍半萜，c o i l 等人( 1 9 8 9 ) 从略大凹顶藻三m a j u s c u l a 中得到了两种双环的倍半萜化合物。凹顶藻属倍半萜衍生物大多带有双键结构， 如从西班牙的l c a e s p i t o s a 中得到的两种新的倍半萜化合物，新西兰海域的 上g r a c i l i s 和l o b t u s a 都具有这种结构。凹项藻中双环结构的倍半萜可分为 c h a m i g r a n e - t y p e ，l a u r a n e - t y p e ，b r a s i l a n e - t y p e3 种类型，其中最常见的类型为 c h a m i g r a n e - t y p e ，三c o m p o s i t ay a m a d a 、ln i d i f i c a 和三m a j u s c u l a 中提取的化合物 中有多种都是这类结构。a h m a d 等在l p i n n a t i f i d a 中提取到具环氧三元环结构的 倍半萜。具有三环结构的倍半萜在l m a j u s c u l a 中曾提取到，在l v i r i d i s 和l o b t u s a 中也曾分离到三环结构的倍半萜。卤代的倍半萜也较常见，c h a n i g r e n e 组中的化 合物多为卤代倍半萜，在三m a j u s c u l a 中分离的化合物中也分离到单溴代倍半萜。 2 、二萜( d i t e r p e n e s ) 二萜的研究也起步较早，但受分离纯化和结构测定方法的限制，早期研究中 获得的二萜较少。在1 9 7 3 年以前在海洋生物中只发现了4 种二萜类化合物( 史大 永，2 0 0 7 ) 。随着实验条件和仪器设备的不断提升，近年来提取到的二萜数目明显 增多。这些二萜类可分为链状、单环、双环、三环和四环二萜几种。 链状的二萜化合物较少，g u e l l a ( 2 0 0 0 ) 在l m i c r o l a d i a 中提取到了一个链状 的不饱和二萜。n o r t e 等( 1 9 9 6 ) 从三v i r i d i s 中得到了环植烷类单环二萜化合物， 同时还获取到一个链状二萜化合物。希腊的n i k o s 等人( 2 0 0 1 ) 从l o b t u s a 提取物 中分离到两个新的双环的含溴二萜，并测定了生物活性。1 9 8 8 年，s u z u k i 等从 l v e n u s t a 中分离得到双环溴代二萜化合物，t a k a h a s h i 等( 1 9 9 8 ) 从三s p e c i e s 中 分离到双环二萜a n h y d r o a p l y s i a d i o l 。t a k e d a 等人( 1 9 9 0 ) 从l o b t u s a 中获取到了 一个具细胞毒活性的三环二萜类化合物l a m o u r o u x 。k u n i y o s h i 等人( 2 0 0 0 ) 从 三1 u z o n e n s i s 中提取到了一种含有环庚烷环的三环二萜，苏镜娱等( 1 9 9 5 ) 从中国 南海南沙群岛的三勋r l a e 中得到了类似的化合物。b r e n n a n ( 1 9 9 3 ) 从夏威夷的 l m a j u s c u l a 中得到了结构新颖的化合物，t a k e d a ( 1 9 9 0 ) 等从l o b t u s a ( h u d s o n ) 6 凹顶藻类组织培养研究 第一章 l a m o u r o u x 中得到一种具细胞毒活性的二萜类化合物。四环的二萜化合物发现较 少， k u r a t a ( 1 9 9 7 ) 从三s a i t o i 中获取过，t a k e d a ( 1 9 9 0 ) 也从三o b t u s a ( h u d s o n ) l a n o u r o u x 中得到过。 3 ，三萜类( t r i t e r p e n e s ) 三萜类化合物是有数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成，在陆生生物 中广泛分布，又称作灵芝酸，多以四环或五环类型存在。海洋生物中的三萜 化合物类型较少，但结构与陆生生物差异较大。 s u z u k i ( 1 9 9 3 ) 从l i n t r i c a t a 中提取的三萜化合物具有对成的结构，x u 等( 2 0 0 1 ) 从中国南沙群岛的l m a j u s c u l a 中得到的一种非卤代的四环三萜末 端有烯键存在。凹顶藻类中的三萜化合物应其多是以聚醚结构存在，因此具 有较强的生物活性。s u z u k i 从l c a h i c l a d am a s u d as pi n e d 中获取的四环三萜 化合物具有抗病毒活性，从三v i r i d i s 中获取的具有环烯醚结构的三萜化合物 具有细胞毒活性。西班牙的c l a u d i ap 等人( 2 0 0 1 ) 从l v i r i d i s 中分离得到了四个 具有角鲨烯的三萜类化合物具有抗肿瘤细胞的特性，在一定浓度下可毒杀肿瘤细 胞。 4 、非萜类的c 1 5 聚乙酰( c 1 5 a e e t o g e n i n s ) 化合物 c l s 化合物在凹顶藻类的次生代谢物中含量较多，通常一链状或环氧形式 存在，结构中多有卤素存在，且多含有多个双键。在凹顶藻类中，l o b t u s a 中的c 1 5 化合物研究最为广泛，从土耳其的该种凹顶藻中提取到十二元环醚 结构化合物，o z t u n c ( 1 9 9 1 ) 等也从该藻中分离到结构类似的化合物。在其 他种的凹顶藻中也有类似的化合物存在，希腊的d i m i t r a 等( 2 0 0 2 ) 从l o b t u s a 中获取到5 中含环醚的非萜类c 1 5a c e t o g e n i n s 化合物，研究发现其具毒性抑 制作用。t a k a h a s h i ( 2 0 0 2 ) 从日本冲绳海域的l 。y o n a g u n i e n s i sm s a u d ae ta b e 中发现一种具有八元环醚结构的化合物，在l n i p p o n i c a 中获得了一系列的聚 乙醚类化合物，g u e l l a 等从l m i c r o l a d i a 中发现了c 1 5 化合物，在l c l a v i f o r m i s 和l p a n n o s a 中也发现了该类化合物。 5 、糖类和其他化合物 在凹顶藻类中，含有大量的糖类成分，是藻胶的主要原料之一( 0 c o l l a , 1 9 6 2 ) ，o p i n n a t i f i d a 含有水溶性多糖，即琼脂( b o w k e re ta 1 ，1 9 6 8 ) ，凹顶藻中 卡拉胶含量也较高( m s h i g e n ie la 1 9 7 7 ) 。 7 凹顶藻类组织培养研究 第一章 凹顶藻中还有其他的多种化合成分，w r a t t e n 等从l o k a m u r a l 中，m a t a l 从 三n i d i f i c ay a m a d a 中分离得到酚类化合物和脱溴化合物；从l o b t u s e 中分离得到具 有角鲨烯骨架的溴代醚类化合物；同时还具有内酯类化合物( 苏镜娱，1 9 9 7 ) 等。 三、药理学研究 海藻类具有陆生植物所不具备的分子结构及生理、生化特性，有着不少特殊 的医疗保健功能，对治疗人类的常见病、多发病具有显著的疗效，且具有作用浓 度小、毒副作用低等特点已成为天然产物研究的主要目标。凹项藻类也因其众多 的次生代谢物而受到药理学家的重视，进行了大量的研究。 1 、萜类化合物的药理学研究 在凹项藻的众多次生代谢物中，萜类做为一个大的类群也是学者进行药理学 研究的重点。 贺娟等( 2 0 0 5 ) 从三列凹顶藻中提取多种萜类化合物接种到s 1 8 0 肉瘤细胞株小 鼠，观察其抑瘤和免疫调节作用，并通过对正常小鼠补充不同剂量凹顶藻提取物 观察其对d n a 的损伤和对机体抗氧化能力的影响，发现凹顶藻中的萜类成分对s l 肉瘤有显著的抑制作用，提高动物的细胞免疫和体液免疫功能，且凹顶藻的萜类 成分具抗氧化作用并对d n a 的损伤有明显的保护作用。t a k e d a 等( 1 9 9 0 ) 从三o b t u s a 分离出具细胞毒活性的双萜类l a m o u r o u x 和卤化烯二醇，研究发现两种物质对体外 培养的肿瘤细胞都有很好的细胞毒活性。p e c 等( 1 9 9 9 ) a z a u r e n c i av i r i d i ss p n o v 中分离到一种对t 4 7 d z r - 7 5 1 h eh s 5 7 8 t 细胞具毒性的萜类成分。d i m i t r a 等人 ( 2 0 0 2 ) 眦o b t u s a 的c h 2 c 1 2 m e o h ( 2 ：1 ) 的提取物中发现的两种倍半萜在一定 浓度下对h i v 1 、h s v 2 、宫颈癌细胞等均有较好的毒杀性。c h a r l e s 等人( 2 0 0 1 ) 从l m a j u s c u l a d ? 分离出两种化合物，活性实验表明对葡萄状球菌、克雷柏肺炎、沙 门氏菌具有很好的抑制作用。n i k o s 等人( 2 0 0 1 ) 眦o b t u s a 提取物中分离出两种含 溴二萜，在活性实验中表现出显著的对天南属细胞的毒性。t a k e d a 等儿o b t u s a 中 分离到具细胞毒活性的二萜化合物，对体外培养的b 。1 6 细胞具有很好的毒杀作用。 c l a u d i ap 等人从l v i r i d i s 中分离到四种三萜化合物对p 3 8 8 、a - 5 4 9 等肿瘤细胞具 生物活性。 2 、非萜类化合物的药理学研究 8 凹顶藻类组织培养研究 第一章 凹顶藻的其他次生代谢物对成分也有很大的药理学价值。林勇等在2 0 0 6 年发 现用9 5 乙醇和v 甲醇：甲苯为3 ：1 的提取物的活性物质具有较强的抗姬松茸的病 原菌活性。梁惠等( 2 0 0 7 ) 研究了三列凹顶藻的乙醇提取物，发现对d n a 的抗氧 化和小鼠的烷化损伤有很好的疗效。j a m e s 等( 1 9 7 5 ) 对劳藻醇和其他的几种海藻 次生代谢产物的抗菌性做了研究，发现劳藻醇对齿垢分支杆菌和金黄色葡萄球菌 有着很好的抑制作用，在研究中同时发现，脱溴劳藻醇对白色念珠菌有着很强的 抑制效果。c h e l l i o 等( 2 0 0 1 ) 对多种海藻提取物的抑菌效果进行了研究，发现 l a u r e n c i ap i n n a t i f i d a r 扣的提取物对大多数细菌都有一定的抑制效果。b a l l e s t e r o s 等 ( 1 9 9 2 ) 研究了6 5 种海藻提取物的生物活性，发珊d , l a u r e n c i am i c r o c l a d i a 和l a u r e n c i a p e l a g o s a e 的提取物有着很好的抑菌效果。p a u l 从o b t u s e 中分离的溴代醚类化合物 对p 3 8 8 b 白细胞具显著的细胞毒杀性。苏静娱等人从l m a j u s c u l a 中分离出一种碘 代内酯，实验表明对金黄色葡萄糖核菌和油菜核菌具毒杀作用。吕杨等( 1 9 9 4 ) 从l a u r e n c i ac a r t i l a g i n e a 中分离到对s 1 8 0 肿瘤细胞具抑制作用的成分，e l e n 等 ( 1 9 9 7 ) 从该藻中分离出六萜类化合物对多种癌细胞均有毒杀作用。 四、生活史和生态生理学研究 1 、生活史 k 砌a 等( 19 9 0 ) 对特内里费岛的l a u r e n c i av i r i d i s 和c h o n d r o p h y c u sp e r f o r a t u s 的生活史进行了研究，c h o n d r o p h y c u sp e r f o r a t u s 年四季均可生长，位于岛北侧 的藻体在6 7 月份植株长到最大，并形成四分孢子囊和果孢：在岛南端，软骨凹顶 藻在十二月到翌年三月植株成熟。在春秋季形成大量的四分孢子囊，仅观察到少 量的雄配子，未发现雌配子。四分孢子散播后可附着在礁石或珊瑚上形成小苗继 续生长。岛北端的l a u r e n c i av i r i d i s 在每年的九月份到十二月份开始出现，在来年 的六月份植株成熟并放出四分孢子，七月份藻体逐渐消失。岛南端藻体的生长较 到北端早两个月。以雌雄配子体过冬，其中雄配子体出现早于雌配子体。 中国东南沿海的凹顶藻类生活史研究较少，但从阮积惠( 1 9 9 4 ) 和吴文杰 ( 2 0 0 1 ) 的报道及我们材料采集过程发现，东南沿海的凹顶藻一般在海水温度1 4 左右( 3 、4 月份) 开始生长，在海水温度达到2 0 2 2 ( 5 月份) 藻体长到最大， 在6 、7 月份逐渐消失，四分孢子囊、精子囊枝和果孢子在4 、5 月份出现。未发现 过冬配子体。 9 凹顶藻类组织培养研究第一章 2 、生态生理学研究 随着众多次生代谢产物及其药理价值的研究，凹顶藻类的潜在价值为越来越 多的人们所认识。但近年来由于人为因素和气候变化的原因野生的凹顶藻类的生 物量有所下降，凹顶藻类的人工培养成为一种需求，众多学者也开始了人工培养 所必需的生理生态学研究。 a b d e l 等( 1 9 7 3 ) 研究了亚历山大地区的l a u r e n c i ap a p i l l o s a 不同季节的半乳 糖、葡萄糖、木糖、核糖和葡糖醛酸含量的变化，以及各个季节藻体所含的胆固 醇、b 谷固醇和羊毛甾醇含量的不同，发现藻体在2 月和8 月固醇含量最高，而 在5 月份藻体的糖类成分为一年最高期。这个结果可以作为人工采集l a u r e n c i a p a p i l l o s a 时间的参考。k a z u y o s h i 等( 1 9 9 8 ) 进行了采自日本沿海的l o k a m u r a e 的实验室培养，在实验室条件下使收集的四分孢子萌发，并研究了温度光照和盐 度对l o k a m u r a e 四分孢子发育的影响，发现在1 4 5 0 的盐度条件下四分孢子都可 生长，最适盐度为2 6 ，；在1 5 时四分孢子可以萌发但不能发育成熟，2 5 c 利 于藻体的生长和成熟。同时研究了温度和光照变化对藻体劳藻醇和脱溴劳藻醇的 含量的影响，发现这两个因素对这两种物质的含量没有影响。m c c l a n a h a n ( 2 0 0 2 ) 研究了营养成分对l o b t u s a 生长的影响，利用食草鱼类的骨头作为养料来源，发 现在高营养l o b t u s a 对外界营养成分的依赖较高，只有在高营养条件下藻体才能 良好的生长。同年，e v s t i g n e e v a 等研究了l p a p i l l o s a 的叶状体干燥后间歇性浸入 营养液中和持续在营养液中培养对叶状体生长的影响，发现这两者没有区别，这 一发现可以在培养过程中减少培养基的消耗。三b r o n g n i a r t i i 生长与潮下带4m ，也 可在阴影区的礁石裂缝中生长。g r e g o r y ( 2 0 0 4 ，2 0 0 5 ) 在实验室条件下研究了光 照和温度对该藻的影响，发现2 6 ，4 4 1f l m o lp h o t o nr n - 2s - 1 和2 8 ，4 0 7 , m o l p h o t o nm - 2s - 1 的光照条件最适于该藻的生长，但长时间的光照对藻体有害。这一 结论建议我们在组织培养过程中可适当减少光照时间。 在这期间，也有学者对凹顶藻类的切段进行了培养，并获得了愈伤组织 ( r o b a i n a , 1 9 9 2 ) ，但并未形成有效的方法。前人的这些研究为以后研究中光照条 件、温度条件、盐度条件和给养方法的选择提供了参考，便于我们的研究。 五、应用前景与展望 1 0 凹顶藻类组织培养研究第一章 凹顶藻类类中含有的糖类、不饱和脂肪酸、萜类和甾醇等成分使其具有很大 的应用价值。 1 、海洋药物开发 当前，海洋已成为世界各国关注的焦点，对海洋研究开发的资金投入也不断 增大。美国投入海洋药物的研究基金达到植化药、合成药总金额l1 。1 9 9 1 年美 国国立大学与国立海洋生物技术研究中心的研究经费4 4 0 0 万美元，其中海洋生物 学的基础研究3 4 ，海洋药物研究1 4 6 。日本通产省投资1 5 0 亿日元进行海洋 药物和其他精细化学品的研究。 凹顶藻类中含有的多种的不饱和脂肪酸、甾醇和萜类等成分，在防治肿瘤、 抑菌方面有着特殊的效果，我国古代人们就认识到这一点，在新华本草纲要 中就记载了钝形凹顶藻可全藻入药，用于杀虫疗癣，外用煎汤熏洗可治疗湿 疮、顽癣、疥疮。凹顶藻类提取物在现代也逐渐成为药物开发的研究热点( 吕 杨，1 9 9 4 ；徐年军，2 0 0 1 ；梁惠，2 0 0 5 ) 。从中医和西医的角度凹顶藻类都具有广 大的药理应用前景。 2 、凹顶藻类的其他应用价值 凹顶藻类的丰富糖类成分自古以来就为人们所利用，凹项藻类一直是藻胶成 分的重要来源( o c o l l a , 1 9 6 2 ；m s h i g e n ie ta 1 ，1 9 7 7 ) 。海南岛一直有凹顶藻生长， 并利用凹顶藻制取琼胶和卡拉胶( 符帅，1 9 9 5 ) 。 在许多地区，凹顶藻类也用作食用( z a n e v e l d ，1 9 5 9 ；h o p p e ，1 9 6 9 ) 。在冰岛凹 顶藻类被当作烟草使用( l a m o u r o u x ，1 8 1 3 ) 。 现在人口基数增大，资源消耗加速，陆地资源的含量有限，资源已成为限制 人类发展的一个重要因素。海洋占了地球的四分之三的表面积，海洋资源的开发 和利用还不充分，随着人口和资源压力的进一步加大，海洋资源已经成为科技研 究的重点内容。凹项藻类作为海洋生物的一种，其多样性的次生代谢物和有效成 分必将使其在今后的研究中占有重要的地位。 口顶藻类组织培养研究 第= 童 第二章凹顶藻类切段培养研究 一、实验材料与方法 1 、材料 实验所用的三种凹顶藻类( 冈村凹项藻l a u r e n c i ao k a m u r a i