（环境科学专业论文）生物氧化锰的形成及其对典型环境雌激素的氧化降解.pdf

浙江工业大学硕士研究生学位论文 要中间产物是雌酮( e 1 ) ，然后e 1 再被进一步降解。利用重组基因酵母 法评价了反应样品中的雌激素总体活性变化，可以发现雌激素的总体 活性都有所降低，说明生物氧化锰不但能够有效降低雌激素浓度，同 时也能够降低雌激素的总体活性。 使用了s e m ，t e m - e d x ，x r d 和x p s 对生物氧化锰进行形貌分析 与表征，发现在菌表面有少量生物氧化锰存在，该生物氧化锰的存在 形式主要是m n 2 0 3 和m n 0 2 ，新生成的生物氧化锰具有纳米尺寸，长时 间培养后得到的生物氧化锰老化成结晶度较高的氧化锰。 本文的研究结果可为环境雌激素的氧化降解技术提供基础数据， 也为理解环境雌激素在土壤中的环境行为提供理论支持，对环境雌激 素的污染控制具有重要的实际意义。 关键词：生物氧化锰雌二醇乙炔基雌二醇动力学氧化降解 浙江工业大学硕士研究生学位论文 f o r m a t i o no f b i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sa n d o x i d a t i v ed e g r a d a t i o no fe n v i r o n m e n t a l r e p r e s e n t a t i v ee n s t r o g e n s a b s t r a c t i ti s v e r yp o p u l a r t h a te n v i r o n m e n t a l e s t r o g e n s d i s t r i b u t ei n e n v i r o n m e n t ，w h i c hi sh a z a r d o u sf o rh u m a n sa n da n i m a l sh e a l t h h e n c e ， t h e r ei sg r o w i n gc o n c e r na b o u tt h ee n v i r o n m e n t a lb e h a v i o ra n dd e g r a d a t i o n b e h a v i o ro fe n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s b i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sc a n a d s o r ba n dd e g r a d eo r g a n i cc o m p o u n d so rh e a v ym e t a l s s o ，i tc a nb eu s e d a san e wc o s t e f f e c t i v et e c h n o l o g yf o rw a t e rt r e a t e db yb i o g e n i cm a n g a n e s e o x i d e i no u rr e s e a r c h ，t h em i x t u r eo fm a n g a n e s eo x i d i z i n gb a c t e r i aw a s e n r i c h e df r o mp a d d ys o i lc o l l e c t e df r o mj i n h u a t h ec o l l e c t e db i o g e n i c m a n g a n e s eo x i d e sf o r m e db yi s o l a t e dm a n g a n e s eo x i d i z i n gb a c t e r i aw a s u s e da sa no x i d a n tf o rt h eo x i d a t i v ed e g r a d a t i o no fe s t r a d i o l ( e 2 ) a n d e t h y n y l e s t r d i o l ( e e 2 ) t h ea d s o r p t i o no fe s t r o g e nd e g r a d a t i o nb ym i x e d b a c t e r i aw a sn o tv e r yo b v i o u s ，a n dt h ea d s o r p t i o ne f f i c i e n c i e so fe 2a n d e e 2w e r ea b o u t2 4 a n d10 ，r e s p e c t i v e l y i tw a sa l s of o u n dt h a t7 0 o f e 2a n d5 2 o fe e 2c o u l db ed e g r a d e db yb i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e s ， m 浙江工业大学硕士研究生学位论文 r e s p e c t i v e l y w h i l ec o m p a r e dw i t ht h ec h e m i c a lm a n g a n e s eo x i d e s ，m o r e e 2a n dl e s se e 2w e r ed e g r a d e db yb i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e s t h e d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yw a sc o m p a r e di nt w od i f f e r e n ts y s t e m si n c l u d i n g s o l u t i o no fb i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sa n dt h em i x t u r es o l u t i o no fm n o x i d i z i n gb a c t e r i aw i t hm n 2 + ，a n dt h es i m i l a rd e g r a d a t i o nt r e n do fe s t r o g e n d e g r a d m i o nw a sf o u n di nt w os y s t e m s ，w h i l et h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yi n t h ef o r m e rw a sm u c hh i g h e rt h a nt h a ti nt h el a t t e rb e c a u s em o r ea m o u n t b i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sw e r ee x i s t e df i r s t l yi nt h ef o r m e rs o l u t i o n f u r t h e r m o r e ，t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yw a se v a l u a t e dw h e ns o m ef a c t o r s s u c ha sp ha n db i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sl o a d i n g c h a n g e d i tw a s f a v o r e df o re 2a n de e 2d e g r a d a t i o nw h e ni na c i dc o n d i t i o na n dm o r e b i o g e n i cm a n g a n e s e o x i d e sa d d e di nn e u t r a lc o n d i t i o n b ya n a l y z i n gt h em ss p e c t r u m ，i tw a sf o u n dt h a te s t r o n e ( e1 ) w a st h e m a i ni n t e r m e d i a t ed u r i n ge 2a n de e 2d e g r a d e db yb i o g e n i cm a n g a n e s e o x i d e s a n dt h e n ，e1w a so x i d i z e dt ol o wm o l e c u l a rm a r e r t h ee s t r o g e n i c a c t i v i t yw a sd e t e r m i n e db yy e a s te s t r o g e ns c r e e n t h ed a t as h o w e dt h a t e s t r o g e n i ca c t i v i t y w a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yb yb i o g e n i cm a n g a n e s e o x i d e s i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a tb i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sn o to n l y d e c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no fe s t r o g e n ，b u ta l s od e c r e a s et h ee s t r o g e n i c a c t i v i t y s e m ，t e m e d x ，x r d ，a n dx p sw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h e b i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e s t h e r ew a sal i t t l ea m o u n to fb i o g e n i c i v 浙江工业大学硕士研究生学位论文 m a n g a n e s eo x i d e s o nt h eb a c t e r i a ls u r f a c e ，a n dt h em o r p h o l o g yl i k e d m n 2 0 3a n dm n 0 2 t h en e w l yf o r m e db i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sh a d n a n o s c a l e a f t e r2t o4w e e k s ，t h eb i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e sw e r e m i n e r a l i z e dt oh i g hc r y s t a l l i n i t y t h i ss t u d ym a yp r o v i d eu s e f u li n f o r m a t i o nt ob e t t e ru n d e r s t a n d i n gt h e f u n d a m e n t a lk n o w l e d g er e l e v a n tt ot h ei n t e r a c t i o no fo r g a n i cp o l l u t a n t sa n d m a n g a n e s eo x i d e si nn a t u r a le n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：b i o g e n i cm a n g a n e s eo x i d e s ，e s t r a d i o l ，e t h y n y l e s t r d i o l ， r e a c t i o nk i n e t i c s ，o x i d a t i v ed e g r a d a t i o n v 浙江工业大学硕士研究生学位论文 1 1 课题背景 第一章绪论 随着工业技术的日益发展，众多的环境问题也日益突出，其中环境激素问题 就一直困扰着人类。问题主要表现在新生儿的出生性别比失衡，不孕不育的家庭 逐年增多，生殖器癌变发病率增高，雄性雌性化和雌性雄性化等。除此之外，环 境激素的存在还影响了人体中正常激素的分泌代谢，对神经系统和免疫系统都有 很严重的影响f l j 。国内外关于环境激素的研究重点主要集中在理化性质，去除机制， 分析测试以及生态毒理等方面。研究结果表明，该类物质化学性质稳定，现有污 染物处理工艺难于有效去除，具有较强的生物富集能力和较强的毒副作用，会对 环境造成持久的严重危害 2 , 3 1 。现在常用的降解雌激素的方法，主要包括物理吸附， 生物降解，生物吸附和高级氧化法降解，这些方法在实际应用中各有裨益。 锰氧化物，作为一种天然的强氧化剂，广泛参与环境中有机物和无机物的氧 化降解反应，同时还能够有效吸附重金属【4 , 5 1 。m n ( i i ) 氧化成为m n ( i i i i v ) 在热力学 上是自发的，但是该过程的动力学速率较慢。在前期的研究工作中，我们研究并 改进了一种高效氧化锰离子的方法，与自发的氧化过程相比，其氧化速率要快很 多，但是，化学氧化锰在氧化降解有机物后又重新变为游离态的锰离子，大量存 在于水体中的锰离子也是一种污染。同样在环境中大量存在的微生物解决了这个 问题。微生物，尤其是细菌，能够快速高效的催化氧化游离态的锰离子成为氧化 锰，被认为是环境中氧化锰形成的重要途径，微生物催化氧化形成的氧化锰再经 过其它无机反应或老化过程后，可形成各种具有规则结构的锰氧化矿物【6 】。关于生 物法去除水处理反应器中的铁锰的应用，已经有众多学者进行了研究，其中也有 研究得到很多具有锰氧化能力的菌株 7 1 。而具有锰氧化能力的细菌在微生物中分布 极广，涉及到微生物种群中的好几个大类，易于培养和筛选，在工程应用中可以 适当的降低氧化锰的成本。由生物氧化得到的氧化锰因为是在生物表面生成的， 所以具有结晶弱，粒径小，价态高等优点【8 】，能够更加有效地氧化降解环境中有机 物和无机物。 浙江工业大学硕士研究生学位论文 将生物氧化锰用于降解环境中的雌激素，发挥了氧化锰降解有机物高效且非 特异性降解的优势，弥补了微生物在降解过程中可能出现的专一性降解特定有机 物的不足，同时也发挥了微生物低成本，高氧化率的优点，弥补了化学氧化锰成 本高，污染重的缺点，更有利的是由于细菌在溶液中悬浮的特性，使得细菌载体 可以提高污染物和生物氧化物之间的接触，从而提高环境雌激素的降解率，为环 境雌激素的降解提供了一个高效且经济可行的方向。 1 2 研究内容和目的 该论文在理论上分析研究生物氧化锰的形成机理及其氧化降解环境中典型雌 激素的动力学、降解机理和反应的雌激素活性变化，并对生物氧化锰进行鉴定和 表征，进一步阐述了生物氧化锰氧化降解环境雌激素可能存在的机理和过程。 内容： ( 1 ) 从本地土壤中筛选具有高效锰氧化能力的细菌，并考察其氧化能力； ( 2 ) 以1 7 1 3 一雌二醇( e 2 ) 和1 7 t z 一乙炔基雌二醇( e e 2 ) 为污染物，考察生物氧化锰对 污染物的氧化降解能力； ( 3 ) 借助于g c m s ，对生物氧化锰降解环境雌激素过程中的中间产物进行分析 和鉴定，阐明其可能存在的降解途径。 ( 4 ) 通过x r d ，x p s 等分析表征实验对生物氧化锰的性质进行表征，比较其与 化学氧化锰之间的异同。 目的： 拟建立生物氧化锰氧化降解环境雌激素的体系，解释其对雌激素的降解行为， 并通过反应途径、产物活性和微生物学等方面的研究阐明其可能存在的化学和生 物学降解机理，为利用二氧化锰技术控制环境中雌激素的污染提供重要的科学依 据。 1 3 课题的创新之处 ( 1 ) 研究对象上创新。本项目将氧化锰和具有锰氧化能力的混合菌落相结合， 将化学和生物方法相结合应于环境中雌激素的降解，发挥各自所长，并使锰元素 形成循环体系，提高利用率，减小污染，这是本课题的最大创新之处。 ( 2 ) 本课题对生物氧化锰降解环境雌激素的行为和机理进行了系研究，为环境 浙江t 业大学顾 二研究牛学位论文 中雌激素的降解氧化降解技术提供基础数据和理论基础。 1 4 课题来源 本课题为浙江省自然科学基金项目“铁锰氧化物对土壤中17 p - 雌二醇的催化 氧化”( y 5 0 6 2 3 7 ) 的研究内容。 3 浙江t 业大学硕一i ：研究牛学位论文 2 1 环境雌激素 第二章文献综述 2 1 1 环境雌激素的定义与分类 图2 - 1 雌激素的种类及相互转化 f i g 2 - 1d i f f e r e n tk i n d so f e s t r o g e na n dc o n v e r tw i t h e a c ho t h e r s 环境雌激素( e n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s ，e e s ) ，又称为环境内分泌干扰物 4 f，o置悖t脚五疗：们一n卜冉卧与fo：m一 ，=臣_dog蚺_苗n皇fo：一 浙江工业大学硕士研究生学位论文 ( e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ，e d c s ) ，参照美国环保局( e p a ) 和联合国环境规划署等文献的叙述，目前较一致的描述可认为是：进入生物体内， 可通过干扰生物体自身激素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解 或产生类似生物体自身激素的作用，对生物有机体维护正常的动态平衡、繁殖、 生长及行为有不利影响的环境化学物质1 9 】。 环境雌激素按其来源，可分为天然雌激素、人工合成雌激素、植物性雌激素和 工农业化学污染物四个大类。 动物和人体内正常分泌的天然雌激素一般包括雌二醇( e s t r o g e n ，e 2 ) 、雌酮 ( e s t r o n e ，e o 和雌三醇( e s t r i o l ，e 3 ) 。 人工合成雌激素通常用作药物，如口服避孕药和一些用于促进家畜生长的激素 药物，环境中常有检出的包括乙烯雌酚( d e s ) 、乙炔基雌二醇( e e 2 ) 等。 具有雌激素干扰活性的环境化学污染物与上述其他几类物质相比，具有结构复 杂、种类繁多的特点。常见的有：农药：有机氯农药及其代谢产物、拟除虫菊 醋类农药；氯化芳烃和环烃：二嗯英( t c d d ) 、氯代酚类、多氯联苯( p c b s ) ； 去污剂洗涤剂中的表面活性物质：烷基酚、壬基酚、辛基酚等酚类；某些金属： 铅，有机锡，镉等；邻苯二甲酸酯类( p a e s ) ；二苯烷烃x 2 酚类化合物( b p s ) ： 双酚a 、双酚f 等，它们普遍用于塑料行业。这些物质在环境中难降解，且具有 生物富集等特性，因此对环境以及人类健康潜在的威胁会持续相当长的时间。【l 0 1 。 2 1 2 环境雌激素的污染现状及危害 夏勇等人1 1 2 】在一项对钱塘江水系进行的雌激素污染状况的生物毒理学研究中 发现，樟潭、富阳和袁浦三处水体都受到了不同程度的雌激素污染。宋文婷等人i l 3 j 对长江南京段的4 个断面进行环境雌激素污染状况调查，测得4 个断面均受到雌 激素的污染，其中江心洲和大桥断面受到附近污水处理厂排水的影响，雌激素污 染物主要是e 2 、e l 、e e 2 等，三汉河断面的雌激素污染物主要是工业废水中的多 环芳烃和多氯联苯等。王福玉等人【1 4 】用重组酵母y ma d e re r e 株对我国一些地 区的江水、河水、湖水及自来水厂的源水和出水进行了测定，结果表明约有5 0 的地表水样显示肛半乳糖苷酶活性呈阳性，2 5 的自来水出水显示p 半乳糖苷酶 活性阳性，另有3 个市的水源和一个自来水厂进水显示阳性，且只有一个自来水 浙江工业大学硕士研究生学位论文 厂出水显示经过处理后p 半乳糖苷酶活性有所降低。金士威等人【1 5 1 对武汉市某污 水处理厂的进出水中的8 种环境雌激素进行了检测，其中e e 2 未检出，但是e 2 、 e l 、e 3 的浓度约几十个纳克每升。 其他国内外检测到的污染状况如表2 1 所示。 表2 - 1 文献已报道的各国的雌激素e 2 、e e 2 的污染情况 t a b2 - 1p o l l u t i o ns t a t e so fe 2a n de e 2h a sr e p o r t e d 环境雌激素对人体的危害主要是通过扰乱内分泌、免疫、神经系统的正常功能， 产生多种病变。环境雌激素即使数量很少，也可能导致各种生物体的性激素分泌 量下降、活性减弱、精子数量减少、生殖器官异常、癌症等发病率增加，并影响 到各生物的生殖系统、免疫系统和神经系统等【2 7 2 引。 环境雌激素对于胚胎的影响主要表现在可引起染色体畸变或者通过对胚胎细 胞的直接毒性作用引发畸胎和其它先天性缺陷。有的环境雌激素可间接干扰雄性 激素水平，干扰正常胚胎分化过程而使胚胎发育受影响。 研究表明，虽然与天然激素相比环境雌激素在体内的浓度较低，但由于处于发 育期的机体内分泌系统尚缺乏反馈保护机制，所以幼年动物对激素水平较成年敏 感，生殖系统功能容易发生改变 2 9 , 3 0 , 3 1 】。临床资料表明，环境雌激素可导致青春期 6 浙江工业大学硕r t ：研究生学位论文 女童出现性早熟 3 2 , 3 3 , 3 4 】，可导致青春期男童出现乳腺增生，乳晕颜色变深，睾丸大 小落后于正常同龄儿，骨密度降低，左腕骨骨龄落后，血睾酮降低，f s h 和l h 正 常或稍增高等现象。 2 1 3 环境雌激素的检测方法 环境雌激素的检测方法主要分为体外检测法和体内检测法。其中，体外检测法 又可分为仪器分析测试和生物检测两大类，化学分析测试的方法适用于对已知的 雌激素进行分析和定量，而生物检测的方法适用于对多组分或未知的雌激素的综 合毒性进行检测。 环境雌激素的化学检测方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱质 谱法和液相色谱质谱法 g c 法是测定各种环境和生物样品中雌激素的主要方法之一。早期的气相色谱 法( g c ) 采用填充柱，但其用量大、灵敏度较低、干扰大而逐渐被毛细管柱所代替。 如有人采用毛细管柱g c 法双柱或三柱相连可同时测定雌激素及其代谢物。此法 的灵敏度较高，但须经过浓缩净化和衍生化过程，对仪器要求高而未能普及。 h p l c 法也是常用的分析雌激素的方法。一般采用紫外检测、荧光检测或电化 学检测的方法。其中f l d 和e d 的灵敏度较高，u v d 的灵敏度相对较低。但上述 检测方法都不能鉴定出分析物的结构，往往还需要用g c m s 确认结构，或直接使 用l g m s 系统。l g m s 法的灵敏度不及衍生后的g c m s 法，目前可达的最低检 出限为0 5 “g l 。 g c m s 法和l c m s 法测定雌激素物质不仅具有灵敏度高，精确度好，而且分 离效率高等优点。但这类方法除需要使用昂贵的仪器设备外，还经常面临常规检 测中繁琐费时的样品提取、净化、衍生化等前处理步骤，不利于大规模样品的检 测。0 5 , 1 5 ，3 6 , 3 7 , 3 8 】 生物检测分析的方法研究在不同污染物或环境样品作用下生物体内各种指标 的变化，通过检测这些生物学指标的改变来评价污染物或环境样品的雌激素活性， 反映污染可能对生物体带来的危害【3 9 】。与仪器分析方法相比，生物检测方法具有 操作简单、快速、经济、高效的优点，并且能够直接测定环境样品的内分泌干扰 活性，表征潜在的生态和健康毒性，因此成为近年来环境内分泌干扰领域的研究 浙江工业大学硕一l ：研究生学位论文 热点。 l 、子宫生长实验 子宫中含有丰富的雌激素受体，当外来化合物与雌激素受体结合后，可使子宫 的雌激素诱导蛋白0 p s ) 含量增加，刺激子宫生长，因此测定动物子宫重量或计算 其脏器系数，可以评价受试物的雌激素活性及其强度。子宫生长实验可靠性高， 简便易行，但花费高，实验所需时间长，不适合大量筛选。 2 、肝细胞卵黄蛋白原生成实验 卵黄素( v t g ) 是由卵生脊椎动物例如鱼、两栖类、爬行类和鸟的肝细胞合成的 一种复杂大分子蛋白，一般情况下只能在雌性动物体内检测到，是一种雌性特有 的血清蛋白。其合成依赖于雌激素对肝细胞的刺激作用，因此，v t g 的含量与雌 激素作用密切相关，可以反应外界物质的雌激素活性强度。一般检测v t g 的方法 有放射性免疫测定法( r i a ) ，酶联免疫法( e l i s a ) 和蛋白吸印免疫法( w e s t e r n b l o t ) t 4 0 1 。该实验方法灵敏性好，操作方便，可以检测雌激素前体物质但由于雌性 动物体内存在天然卵黄，因此其应用受到一定限制。 3 、人乳腺癌m c f 7 细胞增值实验 人乳腺癌m c f 7 细胞中含有许多雌激素调节基因，受外界物质刺激后，可诱 发胞内反应分泌一种外蛋白，这种分泌受雌激素特异性调节，因此外蛋白的产生 及其含量可用来判断受试物是否具有雌激素活性。该方法敏感性高，所用细胞来 源于人，排除了由动物实验外推到人的不肯定性，检测结果可信度高。但细胞培 养时要求的条件较高，培养基和血清都有特殊要求，成本比较高。 4 、重组基因酵母检测法 该方法灵敏性和特异性好、方法简单、易于操作、试验所需的时间短、没有同 位素污染、结果既可定性也可定量。但由于哺乳动物与酵母细胞对激素和毒物的 代谢有很大的差异，而且各自的细胞膜结构不同，这可能会影响到化合物进入酵 母细胞与雌激素受体( e r s ) 结合。并且这种方法不能用于检测雌激素前体物质，对 抗雌激素的敏感性低。 5 、酵母双杂交法 在酵母双杂交系统中，雌激素受体( e i l s ) 与酵母转录子g a l 4 的d n a 结合域 ( d n a b d ) 结合，从而产生p 半乳糖苷酶，p 半乳糖苷酶的活性大小就和e r s 的作 用强度大小一致。酵母双杂交法的实验系统更接近与哺乳动物的激素系统分，可 浙江工业大学硕士研究生学位论文 利用较少的时间达到相同的精确度，重现性较高。同时酵母双杂交法可测定抗雌 激素物质。 2 1 4 环境雌激素的降解方法 环境雌激素的常用降解方法主要有吸附法【4 1 4 2 ，4 3 m ，4 5 1 ，生物降解法【4 6 , 4 7 , 4 8 , 4 9 , 5 0 】， 光降解法 51 , 5 2 , 5 3 , 5 4 , 5 5 】和高级氧化法 5 6 , 5 7 , 5 8 】。 污水处理中，环境雌激素可吸附在有机物、活性污泥或失活污泥上，通过沉淀 除去。其中活性炭能对大量的环境雌激素物质有较好的吸附和降解能力。类固醇 类雌激素的生物吸附可以用非线性的f r e u n d l i c h 吸附等温式描述【5 9 1 。 生物降解雌激素主要在好氧条件下进行，降解速率较慢。杨俊 6 0 1 在研究中筛选 得到一株具有较强雌激素降解能力的芽孢杆菌，在初始浓度5 0m g c 的条件下，7 天可以将e 2 完全降解，比降解率达到3 3 左右。研究表明【6 1 1 ，e 1 、e 2 、e e 2 的 生物降解性次序为e 2 e i e e 2 。 光解过程分为3 类：直接光解，敏化光解，氧化反应。最近对1 7 i x 雌二醇、 1 7 1 3 乙炔基雌二醇及雌酮在汞灯或紫外光照射下的光解进行了研究，结果表明，这 些雌激素均有不同程度的降解。实验结果表明，1 7 1 3 一雌二醇在浓度为3 0 2 0m g l 范围内，初始浓度越小，降解速率越快；降解反应是假一级反应：p h 值和f e 3 + 对 降解存在明显的影响。对其降解产物的红外( i r ) 分析表明，1 7 1 3 雌二醇分子结构在 光解中其苯环被破坏 6 2 , 6 3 。邓欢欢等人研究了藻类在阳关照射下光解e e 2 的降 解率，结果发现在有藻类的环境中，自然光照对e e 2 的光降解率为1 9 0 o - - 2 0 。光 解作用是环境雌激素污染物真正的分解过程，因为它不可逆地改变了反应分子，强 烈地影响其在环境中的归趋。 化学高级氧化的主要机理就是利用一些强氧化剂和雌激素物质发生氧化还原 反应，将雌激素物质矿化成二氧化碳或者降解成其他的低分子量的降解产物。为 了提高对雌激素物质的去除率，许多研究中将几种氧化剂联合起来，例如u v 0 3 ， u v h 2 0 2 ，u v f e n d o n 等。这些方法的主要特征就是反应过程中会产生羟基自由基， 而羟基自由基的的氧化还原电位很高( 2 8 0v ) ，具有强氧化性，能有效的降解雌激 素物质。 9 浙江工业大学硕士研究生学位论文 2 2 生物氧化锰 2 2 1 锰的环境问题 水体( 地下水和地表水) 所含锰的来源，主要是由原生地质污染、含锰土壤的面 源污染和采矿的矿山尾水污染所引起的。锰虽然是人体所必需的微量元素之一， 但在生产和生活用水当中锰过量会导致一系列的问题：水出现色度，产生嗅味： 在卫生洁具和工业产品上形成斑点；由于锰的存在，输送过程中细菌会繁殖，形 成细菌粘泥沉积在管道上，减小过水断面甚至堵塞管道；更重要的是人长期饮用 高含锰水会产生一系列疾病，有些甚至不可治愈【6 5 】。各个国家对生活及工业用水 中锰的浓度做出了严格的规定，尤其饮用水中锰的最高允许浓度一般为0 0 5m g l ， 我国的标准是0 1m g l 。 地下水除锰的机理主要有m n 0 2 起催化氧化作用，锰质活性滤膜的自催化氧化 作用惭1 和生物催化说 6 7 , 6 8 这几种观点。现阶段在北方有许多的自来水厂都有建有 锰砂池，用生物的方法来固锰除锰，该方法工艺滤速高、运行费用低、抗冲击能 力强、出水条件好、效果安全稳定【6 5 1 。 2 2 2 锰氧化物的类型 已报道的锰氧化物有3 0 多种【6 9 1 ，大致可以分为以下三类【8 1 ： 第一类是具有m n 4 + 的隧道结构的锰氧化物。这种构造有m n 0 6 八面体的单、双 和三链组成，通过共棱或共角顶使链与链连接成网状，中间填充有阳离子和水分 子的隧道。m n 0 6 八面体以单、双和三链排列，沿z 轴延伸，含有不同大小的隧道。 第二类是具有m n 4 + 的层状构造的锰氧化物。这类锰矿物被认为是由h 2 0 、o h 、 阳离子和m n 0 6 八面体交替排列而成的层状矿物。 第三类是低价锰氧化物。土壤中低于四价的锰氧化物有水锰矿和黑锰矿。水锰 矿为与软锰矿构造类似的水化锰氧化物；黑锰矿为尖晶石型结构，其中m n 2 + 占据 四面体位，m n 3 + 占据八面体位，氧原子在立方面心格子排列。 l o 浙江工业大学硕士研究生学位论文 l o d o r o l d t e 巴 r a m s d e l l i t e 囊l 参 。叠k o - 0 鬈 鬈鬟鬣誊蓉鬈 萌r n e s s i t e 图2 - 2 隧道状( 链状) 和层状锰氧化物示伪1 8 i f i g u r e 2 - 2e x a m p l e so f t h et u n n e l c h a i na n dl a y e rt y p ec r y s t a ls t r u c t u r e so fm no x i d e s 2 2 3 生物氧化锰在环境中的重要作用 生物氧化溶解态的锰变成不溶的氧化锰的过程被认为是环境中锰元素转化的 一个重要过程，是自然环境中锰结核，锰矿生成的主要方式。锰氧化细菌最初发 现与海洋成矿并被应用于湿法冶金，现被广泛应用于城市用水净化除锰。同时形 成的生物氧化锰具有结晶弱，粒径小，价态高等优点，能够更加有效地吸附和氧 化降解环境中有机物和无机物。 研究发现【7 0 1 ，在氧化锰与生物共存的体系中，氧化锰能将微生物无法直接利 用的复杂腐殖酸物质降解，形成低分子量能被微生物生长所利用的有机物。细菌 也有可能把氧化锰作为电子供体和能量来源，这个猜想已经在两种海洋细菌上的 到证实。细菌s s w 2 2 字氧化m n ( i i ) 的同时伴随有a t p 的产生；一种自养细菌 s 1 8 5 一鲥也能够氧化m n ( i i ) 1 7 2 。细菌还有可能生成氧化锰保护细胞防止有毒金属、 u v 、有毒氧化物质、病毒菌素等引起的侵袭。 浙江工业大学硕士研究生学位论文 2 2 4 锰氧化细菌及锰氧化物的生物成因 图2 - 3 锰氧化菌在细菌界的分；瞧地位嗍 f i g u r e 2 - 3l o c a t i o no fm n ( 1 1 ) 一o x i d i z i n gb a c t e r i ao nan e i g h b o r - j o i n i n g ，u n r o o t e dp h y l o g e n e t i c t r e eo ft h ed o m a i nb a c t e r i a 环境中存在的锰氧化微生物种类很多，包括许多细菌、真菌、藻类和一些真核 细胞【7 3 1 。这些微生物分布很广，很多种类的细菌都具有不同程度的锰氧化能力， 可以表示成如图2 3 所示。其中，现在主要研究的细菌是加粗表示的几种，对其锰 氧化的机理和特性有较全面深入的研究。与此同时，仍有许多新的菌种被发现具 有锰氧化能力。 细菌催化氧化m n ( i i ) 可以通过直接和间接两种方式【8 , 7 9 1 。直接催化过程指细菌 分泌多糖聚合物来直接氧化m n ( i i ) 【7 4 】；间接催化过程指微生物通过改变p h ( c 0 2 的消耗和氨的释放) 或者调节微环境氧化m n ，或释放出新陈代谢产物( 如h 2 0 2 或其 1 2 浙江工业大学硕上研究生学位论文 它过氧化物) 来氧化m n ( i i ) 。 m n ( i i ) 氧化为m n ( i v ) 是一个两步反应的过程，在这个过程中产生m n ( i i i ) 中间产 物( 例女1 m n 3 0 4 ) 或含羟基氧化物( 例如p m n o o h ) 。这些含m n ( i i i ) 的氧化物首先形 成，然后经过漫长的气化反应或者质子化反应，最终形成m n ( i v ) 氧化物( m n 0 2 ) 。 第二步反应被认为是限速反应，因为在p h 8 且m n ( i i ) 浓度高于扣1 0m 时，尽管有 歧化反应的发生，m n ( i i 、i i i ) 矿物在热力学上仍是稳定的。m n ( i i ) 可能在矿物表 面被氧化。 有研究表明，在一定条件范围内，s g2 1 孢子氧化m n ( i i ) 不受初始m n ( i i ) 浓度、 0 2 或空气环境、海水或缓冲溶液介质等影响，起始产物均为类似于6 m n 0 2 的无定 形m n ( i v ) 锰矿物，当m n ( i i ) 浓度较高时，过量的m n ( i i ) 与生物锰氧化物经二次化 学过程，生成六方水锰矿【7 5 1 。 多铜氧化酶被认为是“锰氧化剂”，以多铜氧化酶为氧化基础的其它生物氧化 m n ( i i ) 的过程可能与之具有相似的机制，特别是有键合m n ( i i i ) 的可溶性酶中间体 的产生。此外，目前还很难获得权威证据证明微生物能控制并利用这些反应释放 的能量进行生长，许多微生物具有氧化m n 的能力，但氧化m n ( i i ) 作用的生理学功 能还不清型8 1 根据对多铜氧化酶氧化机理的初步推测，生物氧化锰的成矿过程可分为两个阶 段。第一阶段，微生物分泌多铜氧化酶直接氧化m n ( i i ) 得到一部分活性很高的生 物氧化锰。这些初级产物一般都是层状的锰氧化物( 6 m n 0 2 ) 和水钠锰矿【6 9 1 。同步x 射线衍射( s r - x i m ) 图谱结果表明这些初级产物是无定形态的【7 6 1 。第二阶段，这些 活性很高的锰氧化物矿物继续氧化m n ( i i ) ，形成次级产物。最终锰氧化物产物的 形成会受到环境热力学等条件的影响。 王革娇等人【7 7 l 对b r a c h y b a c t e r i u ms p m n 3 2 进行了研究，研究发现该细菌是以酶 氧化的方式氧化锰离子的，且该氧化酶是一种胞外蛋白，生成的锰氧化物存在于 细胞表面和细胞之间的间隙。另外，在对b a c i l l u ss p m k 3 1 的研究中发现该菌中含 有多铜氧化酶基因，生成的锰氧化物均匀地分布在细胞表面，细胞表面的含锰量 为19 6 0 ( w w ) t 7 8 1 。 2 2 5 生物氧化锰的检测与表征 现在研究生物氧化锰常用的表征手段是x 射线吸收光谱法( x r a ya b s o r p t i o n 浙江工业大学硕士研究生学位论文 s p e c t r o s c o p y ，x a s ) t 7 9 】：x e s 足基于产生的荧光强度( k 1 3 发射3p 1s 的跃迁) 来测量 m n 的平均氧化价态；x a n e s 可以提供锰氧化价态和吸着原子( 女l l m n ) 周围的局部结 构信息：s r x r d 与普通x r d 相比有很多优势，包括可调节能量来穿透水、减小 样品的荧光、拥有更高的统计计算能力( 因而能降低检出限和更快得到数据) 和 更多的角度变化。 表2 2 常用的生物氧化锰表征手段 t a b 2 2c h a r a c t e r i z a t i o n so fb i o g e n i cm a n g a n e s e o x i d i z i n g x 射线近边吸收精细结构 扩展x 射线吸收精细结构 x 射线发射光谱法 同步x 射线衍射 x a n e s e x a f s x e s s r x r d 这些方法能够定量地区分晶体、无定形态物质以及锰在溶液中的存在形式，还 可以在混合的多相体系中直接检测出m n 的氧化价态。由于生物氧化锰通常是几种 矿物混合的无定形态或非晶态，这些技术可以很好地对生物氧化锰进行原位分析， 对生物氧化锰的氧化价态、结构特点和与重金属离子的结合方式有更深入的理解， 揭示生物氧化锰的形成及其作用机制，可为生物氧化锰的应用提供必要的理论基 础和科学依据。 1 4 浙江工业大学硕士研究生学位论文 3 1 实验仪器与试剂 第三章实验装置与方法 3 1 1 实验仪器 涉及的实验仪器见表3 1 和表3 2 。 表3 - 1 主要实验仪器 t a b 3 - 1t h em a i ne x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t s 1 5 浙江工业大学硕士研究牛学位论文 电子显微镜 实验室常规玻璃器皿 n i k o n 表3 - 2 生物氧化锰表征实验仪器设备汇总表 t a b 3 2t h ea p p a r a t u su s e di nb i o g e n i cm a n g a n e s e - o x i d e sc h a r a c t e r i z a t i o n 3 1 2 实验试剂 涉及的实验试剂见表3 3 。 t a b 3 - 3t h em a i ne x p e r i m e n t a lr e a g e n t s 1 6 浙江工业大学硕l 研究生学位论文 实验选用的培养基为k 2 培养基【8 0 1 ，培养基配方如下： 表3 - 4k 2 培养基成分 蛋臼胨 酵母膏 n a c l k c l m g s 0 4 c a c l 2 微量元素 蒸馏水 琼脂 p h t a b 3 - 4c o m p o u n d so f t h ek 2m e d i u m 2 9 0 5 9 8 7 6 9 0 3 7 3 9 6 1 6 2 9 0 5 5 5 9 l m l l l 1 5 7 5 l1 5 湿热灭菌3 0r a i n 。为了防止m n s 0 4 高温氧化，待培养基冷却至6 0 左右时加入0 2 2g m 滤膜过滤灭菌的2 0m mt r i s h c i 缓冲液( p h7 5 ) 和m n s 0 4 。 其中，微量元素成分如下： t a b 3 - 5c o m p o u n d so ft r a c ee l e m e n t c u s 0 4 5 h 2 0 z n s 0 4 。7 h 2 0 c o c l 2 6 h 2 0 1 0 m g l 4 4 m g l 2 0 m g l n a m 0 0 4 2 h 2 0 1 3 m g l 所用试剂均为分析纯。 1 7 浙江工业人学硕士研究生学位论文 3 2 实验方法 3 2 1 锰氧化细菌的富集 在采集到的金华地区水稻土中疑似有氧化锰的部分取适量土样，在无菌超纯水 中震荡，取上清液按照1 0 3 1 0 7 的梯度稀释涂布在含有1 0m mm n s 0 4 的k 2 培养 基平板上，3 0 培养3 5 天后对呈现褐色或棕色的菌落进行划线分离。 经过多次划线分离后，对褐色菌落进行鉴定。同时用0 0 0 4 l b b 对褐色菌落 进行鉴定，变成蓝色的菌落即具有锰氧化能力，根据蓝色的深浅可以判断菌落的 锰氧化能力强弱。 3 2 2 生物氧化锰的制备 将具有锰氧化能力的细菌接种至含有1 0m mm n s 0 4 的k 2 液体培养基，全温 摇床3 0 ，1 6 0r m p 培养2 周。取lm l 菌悬液用l b b 法进行测定，验证含有生 物