（食品科学专业论文）甜菊糖的重结晶分离及酶法改性.pdf

摘要 摘要 甜菊糖是一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂，其甜度相当于蔗糖的2 0 0 3 0 0 倍， 而热量仅为蔗糖的1 3 0 0 。在已知的八种甜味成份中，甜菊甙含量最高，甜度是蔗糖的3 0 0 倍，但具有一定的苦味和不愉快的后味，影响甜菊糖的味质和应用；莱鲍迪甙a 含量次 之，甜度相当于蔗糖的4 5 0 倍，甜味特性也与蔗糖接近，是理想的甜味成分。本文首先 对这两种主要组分进行分离，然后对甜菊甙进行酶法改性，以改善其味质，提高甜菊糖 的综合价值。 采用甲醇异丙醇混合溶剂对甜菊糖进行重结晶，以结晶中甜菊甙与莱鲍迪甙a 的含 量比( s r a ) 为主要指标，考察了结晶溶剂、溶剂用量、结晶温度以及结晶时间的影响。 通过正交试验得到重结晶的最佳工艺为：混合溶剂中异丙醇含量3 0 ，溶液初始浓度 4 0 ，结晶温度5 ，结晶时间1 2 h ，结晶中s r a 由原料中的0 9 6 提高到3 3 0 ，得到高s 甜菊糖。重结晶后的母液在1 5 进行二次结晶，结晶中s r a 仅为0 0 7 2 ，得到高r a 甜菊 糖，为分离甜菊甙和莱鲍迪甙a 提供了一种简便的方法。 采用高峰淀粉酶对结晶甜菊糖进行改性，考察了酶反应过程中各种因素的影响，并 对新生成物的结构进行了初步鉴定。酶法改性甜菊糖的最佳条件为：甜菊糖浓度 0 0 2 m o l l 、底物比例为淀粉：甜菊糖= 1 0 ：1 、酶用量为1 u m l 、淀粉加酶水解2 h 后加入 甜菊糖、反应体系温度5 0 、反应时间1 2 h 。经过高峰淀粉酶的作用，部分甜菊甙转化 形成了甜菊甙一葡萄糖衍生物，即莱鲍迪甙a 的同分异构体，转化率达到6 0 以上。感 官评定表明，改性后的甜菊糖甜度略有降低，后苦味明显减轻，味质大为改善，特别是 在低浓度时效果更显著。 经过两次结晶后，尚有部分甜菊糖残留在母液中，为了提高甜菊糖的综合利用率， 采用树脂吸附法对母液进行分离纯化。在静态吸附和洗脱的基础上选择树脂d 8 6 0 ，其 吸附率达到9 7 3 ，吸附量为8 8 3 m g g 湿树脂。比较5 0 甲醇、8 0 甲醇、5 0 乙醇、 7 5 乙醇和甲醇异丙醇混合溶剂的动态洗脱，8 0 甲醇效果最好，甜菊甙和莱鲍迪甙a 两个峰基本能够分离开来。 关键词：甜菊糖；重结晶；酶法改性；树脂吸附 a b s t r a c t a b s t r a c t s t e v i o s i d e si san a t u r a ls w e e t e n e ri s o l a t e df r o ms t e v i ar e b a u d i a n al e a v e s ，a n dt h e r ea r e u s u a l l ys e v e r a lc o m p o n e n t si ni t r e b a u d i o s i d e - ah a st h eh i g h e s ts w e e t n e s sa n dt h eb e s t o r g a n o l e p t i cp r o p e r t i e s s t e v i o s i d ei su s u a l l yt h em a j o rc o m p o n e n ti nc o m m e r c i a lp r o d u c t s ， b u ti th a sab i t t e ra f t e r t a s t ea n d ，f o rt h i sr e a s o n ，a t t e m p t sh a v eb e e nm a d ei no r d e rt om o d i f y i t sm o l e c u l e m e t h a n o l i s o p r o p a n o l m i x t u r ew a s e m p l o y e d t o s e p a r a t es t e v i o s i d e ( s ) a n d r e b a u d i o s i d e - a ( r a ) b ym e a n so fr e c r y s t a l l i z a t i o n 1 1 1 ee f f e c t so fk e yo p e r a t i o np a r a m e t e r s ， i n c l u d i n gs o l v e n t s ，c o n c e n t r a t i o no fs t e v i o s i d e s ，t e m p e r a t u r ea n dc r y s t a l l i z a t i o nt i m e ，o nt h e r a t i oo fst or ai nt h ec r y s t a lw e r es t u d i e d u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，w h i c hw e r e m e t h a n o l ：i s o p r o p a n o l = 7 0 ：3 0 ，i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n4 0 ，c r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r e - 5 c ， c r y s t a l l i z a t i o nt i m e121 l s r ai n c r e a s e df r o m0 9 6i nr a wm a t e r i a lt o3 3 0i nt h ec r y s t a l t h e nt h em o t h e rl i q u o rw a sc r y s t a l l i z e da t15 f o rs e c o n dt i m e a n ds r aw a s0 0 7 2 i nt h i sw o r k ，t h es t e v i o s i d ec r y s t a lw a sm o d i f i e db yt a k a - d i a s t a s ef r o ma s p e r g i l l u s o r y z a e ，a n dt h ep a r a m e t e r si ne n z y m a t i cm o d i f i c a t i o np r o c e s s ，i nt e r m so fc o n c e n t r a t i o no f s t e v i o s i d e ，t e m p e r a t u r e ，e n z y m e sa m o u n t sa n dr a t i oo fs t a r c ht os t e v i o s i d e sw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm o r et h a n6 0 s t e v i o s i d et r a n s f o r m e dt os t e v i o s i d e g l u c o s e d e r i v a t i v ea f t e rt h em o d i f i c a t i o n ，t h es w e e t n e s so fs t e v i o s i d er e m a i n e db a s i c a l l yu n c h a n g e d ， a n dt h eo r g a n o l e p t i cp r o p e r t i e sw a si m p r o v e de v i d e n t l y t h em o t h e rl i q u o rs t i l lc o n t a i n e dp a r to fs t e v i o s i d e sa n dm o s tf o r e i g nm a t t e r sa f t e r c r y s t a l l i z a t i o n t oi m p r o v et h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fs t e v i o s i d e s ，t h em o t h e rl i q u o r w a sp u r i f i e dt h r o u g hf l o w i n gi nt h ec o l u m n ，w h i c hw a s6 l l e dw i t hm a c r o p o r o u sr e s i n sd 8 6 0 t h ed e s o r p t i o ns o l v e n tw a sm e t h a n o la n dw a t e r ，a n dt h e i rr a t i ow a s8 0t o2 0 a n dh p l c s p e c t r u m s c o p yd a t ep r o v e do u tt h a tt h et w om a i np e a k sw e r es t e v i o s i d ea n dr e b a u d i o s i d e a r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：s t e v i o s i d e s ；r e c r y s t a l l i z a t i o n ；e n z y m a t i cm o d i f i c a t i o n ；m a e r o p o r o u sr e s i n s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注争致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 垄监 日 期： 塑堕垒：缝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： 查篮 导师签名： 日 期： 1 引言 1 引言 1 1 甜菊糖概述 1 1 1 甜叶菊 甜叶菊( s t e v i ar e b a u d i a n a n ) 系菊科多年生草本植物，原产于巴拉圭东北部与巴西 接壤的阿曼拜山脉，早在4 0 0 多年前就被当地的居民用来作甜茶，直到1 8 8 7 年才引起 人们的注意。1 9 0 5 年由植物学家b e r t o n i 命名为s t e v i ar e b a u d i a n a 一直沿用至今，1 9 5 5 年开始人工苗圃栽培试验，1 9 6 4 年巴拉圭从事大田移植驯化获得成功【l 】。上世纪6 0 年 代，由于世界范围内普遍对人工合成甜味剂的安全性持怀疑态度，因此这种植物受到许 多国家和地区的重视。日本、新加坡、马来西亚、韩国、以色列、美国以及中国现均有 大量种植，特别是日本，自1 9 7 1 年首先引种甜叶菊获得成功，于1 9 7 6 年实现工业生产 并一直应用至今。我国对甜叶菊的栽培利用研究始于7 0 年代末，经驯化、繁殖和扩大 种植，全国已有2 7 个省市积极推广生产，我国已成为甜叶菊的最大出口国，日本所需 的甜叶菊大都是从我国进1 3 的【2 1 。 1 1 2 甜菊糖 甜菊糖是从甜叶菊的叶子中提取的一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂，其甜度 相当于蔗糖的2 0 0 3 0 0 倍，而热量仅为蔗糖的1 3 0 0 。甜菊糖为白色或微黄色的结晶性粉 末或颗粒，熔点1 9 6 1 9 8 ，易溶于水，可溶于乙醇和甲醇，不溶于苯、醚、氯仿等有 机溶剂，在空气中吸湿性强，干燥失重为1 5 4 0 【3 1 。甜菊糖具有清凉甜味，似蔗糖， 可感甜浓度约0 0 0 2 ，略带后涩味。在一般加工条件下，对热、酸、碱、盐稳定，p h 4 1 0 范围内，甜菊糖溶液加热到1 2 0 也不会发生变化，当p h 大于9 或小于3 时，长时间加热 ( 1 0 0 ) 会使之分解，甜味降低【4 】。 甜菊糖具有非发酵性，不影响食品的凝固性、粘稠性，并且有非着色性，不会引起 美拉德反应。仅有少数几种酶能使其水解，在人体内大都不被代谢，基本以原来状态排 出。大量药物实验证明，甜菊糖无毒副作用，经常食用可预防高血压、糖尿病、肥胖症、 心脏病、龋齿等病症，是一种可替代蔗糖的理想甜味剂【5 】。甜菊糖广泛应用于食品、饮 料、酿酒、医药、日用化工等行业，较蔗糖可节省成本7 0 。 1 2 甜菊糖的结构及性质 甜菊糖甙，又名甜菊糖苷，简称甜菊糖，是甜叶菊提取物中8 种不同甜味成分的混 合物，按照天然植物化学的划分，属于四环二萜的糖苷类。甜菊糖各组分的结构及其性 质如图1 1 和表1 1 所示，它们具有相同的甙元一甜菊醇，只是甙键上结合糖的种类和数 量不同。这8 种甜菊糖甙分别是：甜菊甙、莱鲍迪甙a 、b 、c 、d 、e 、杜尔可甙a 和斯 替维伯甙【6 】。 江南大学硕十学位论文 注：g 一葡萄糖基，r 鼠李糖基 在甜菊糖已知的8 种糖甙中，各组分的含量、甜度和1 2 1 感各不相同，其中甜菊甙( s ) 、 莱鲍迪甙a ( r a ) 、莱鲍迪甙c ( r c ) 的含量较高，共占9 0 以上。r a 甜度最高，相当于蔗 糖的4 5 0 倍，甜昧特性也与蔗糖相接近，是理想的甜味成分；s 甜味相当于蔗糖的3 0 0 倍， 具有定的苦味和不愉快的后味，影响了甜菊糖的味质。 2 l 引言 1 3 甜菊糖的安全性 甜菊糖原产地的居民食用甜菊糖已有几百年的历史，至今未发现有任何毒害作用。 世界卫生组织和联合国粮农组织联合食品添加剂专家委员会曾于1 9 9 8 年对甜菊糖进行 安全性评价，未作出对人体健康有害的结论。日本从1 9 7 5 年开始对甜菊糖进行了一系列 安全性研究，经急性、亚急性、慢性毒性与致癌性试验等证明甜菊糖是安全的，并将其 确定为不需特殊限量使用的甜味剂【8 】。 我国于1 9 8 4 年将甜菊糖作为食品添加剂，并列入食品添加剂使用卫生标准，规 定其使用范围为液体和固体饮料、糖果和糕点等。我国卫生部于1 9 8 5 年和1 9 9 0 年分别批 准甜菊糖为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料，在2 0 0 0 年以后又批准扩大使 用范围，按正常生产需要使用。在2 0 多年的使用过程中，未发现甜菊糖有安全问题【9 】。 此外，巴西、马来西亚、阿根廷、巴拉圭等2 0 多个国家已批准甜菊糖作为食品添加 剂使用，美国于1 9 9 5 年允许将甜菊糖作为“膳食补充剂 食品使用【l o 】。 1 4 甜菊糖的应用 甜叶菊原产地的居民将这种植物添加到茶叶中以增加甜度，这是甜菊糖最初的用途 t i l l 。近些年来，由于大规模的商业化生产以及安全毒理方面的研究，使得这种天然甜味 剂在工业上的应用日趋广泛，并已取代一些人工合成的甜味剂，如甜蜜素、阿斯巴甜等， 为糖尿病、肥胖症患者及中老年人所食用。广义上讲，凡是用糖产品几乎都可以用甜菊 糖替代部分或全部蔗糖。利用甜菊糖替代蔗糖加工食品、饮料，可降低用糖成本，也符 合低糖化要求【1 2 1 。因此，甜菊糖是一种发展前景广阔的新糖源。 1 4 1 食品中的应用 甜菊糖与乳糖、麦芽糖、果糖等一起用于制造硬糖，还可用于口香糖和泡泡糖及各 种风味的软糖【i3 1 。甜菊糖与山梨糖醇、甘氨酸、丙氨酸等混合用于蛋糕粉，制成饼干、 甜饼类，可防止回潮、褐变，因甜菊糖对热稳定，特别适合这方面的应用【m 】。 各种软饮料，如低能量可乐，用甜菊糖和高果糖浆混合物来增甜，可改善砂糖浓厚 的甜腻感，使之具有清凉爽口的甜味，在满足人们对甜味要求的前提下，实现了饮料的 低糖化，适宜糖尿病患者饮用【l 5 1 。 甜菊糖还广泛应用在方便榨莱和腌菜上。使用甜菊糖代替蔗糖，可以弥补单独使用 蔗糖的某些缺陷，如防止脱水，不与氨基酸反应引起褐变，在某种程度上能控制微生物 的繁殖，不会引起产品发酵酸败，从而加工出色、香、味俱佳的方便榨菜、咸菜【1 6 1 。 1 4 2 其他方面的应用 甜菊糖用于各种酒的调味，由于用量甚微，可大大减少酒中固形物含量，降低成本， 且甜味持久，特别适用于高甜度酒。在啤酒中适当添加甜菊糖，可使啤酒的泡沫更加丰 富，洁白持久【l 7 1 。 甜菊糖在卷烟中的应用。甜菊糖具有持久、清爽的甜味，与蔗糖掺配并用，再添加 少量柠檬酸钠，有助于甜味的发挥，还能赋予卷烟独特的风味。甜菊糖能将易挥发的香 江南大学硕士学位论文 味物质( 如薄荷醇、香兰素等) 吸附在自己的周围，长期存放，香气只有极少损失【1 8 】。 在医药工业上，甜菊糖可作为矫味剂应用于糖浆剂、散剂和片剂等制作上。因为多 数药物本身带有一定的苦味，所以甜菊糖的苦涩味在配药中几乎显示不出来，可与药物 苦味很好的融合在一起【1 9 1 。利用甜菊叶与茶配伍可制成减肥保健茶。 由于甜菊糖不被微生物利用，故可作为甜味剂添加到口香糖、牙膏和漱口液等口腔 清洁用品中，抑制1 ：3 腔内细菌的滋生，减少龋齿发生【2 0 1 。 1 - 5 国内外研究进展 1 5 1 甜菊糖的组分分离 有关甜菊糖的组分分离技术，国外自6 0 年代起就己有研究。由于这几种糖甙具有相 同的甙元，其分子结构与极性也非常相近，给分离工作带来一定的困难。目前报道的分 离手段主要有高效液相色谱法【2 1 1 、液滴逆流分配层析【2 2 】、薄层色谱法【2 引、超临界萃取 法和毛细管电泳法【2 4 1 。但这些方法可处理的样品量太少，不适合工业化生产。 张扬等用甲醇和水不同比例的混合溶剂对甜菊糖以及分离出甜菊甙的母液浓缩物 分别进行重结晶研究，经过多次重结晶，得到了纯度高于9 0 的莱鲍迪甙a ，并对其进 行熔点测定和h p l c 表征 2 5 1 。 日本科学家通过研究甜菊甙与莱鲍迪甙a 在甲醇水混合液中溶解度的差异，采用较 为简单的工艺技术，将甜叶菊提取液经提取、脱色、吸附等处理后，在一定配比的甲醇 水体系中重结晶，得到了r a 含量高于6 0 的甜味剂产品，从而改进了甜菊糖的味质【2 6 1 。 1 5 2 甜菊糖的味质改善 改善甜菊糖不良味质的方法归纳起来有以下几种： ( 1 ) 化学改性法 廖德仲对于甜菊糖构一味关系的研究报道，通过改变连接在甜菊糖分子上的不同基 团，可以达到改善其不良风味的目的【2 7 1 。 ( 2 ) 环糊精包埋法 环状糊精是最常用来掩盖不良风味的物质，对于改善甜菊糖的味质也有效，其中p 环糊精可以掩盖苦味，丫环糊精可掩盖苦涩味，带盐环糊精可改善产品的整体风味【2 8 】。 ( 3 ) 与其他物质混用 甜菊糖与其他物质混用时具有较好的协同效果，可起到增加甜度或改善风味的作用 2 9 1 o ( 4 ) 酶法修饰 通过生物酶的糖化作用，在甜菊糖分子上引入一些新糖元或进行糖元的转换，可以 合成具有更好味质的甜菊糖配糖体，目前主要采用以下几种酶： 环糊精葡萄糖基转移酶( c g t a s e ) 。环糊精葡萄糖基转移酶的主要作用是通过形成 l ，4 一q d 一糖苷键，使1 ，6 a 三葡聚糖链部分环化。此外，c g t a s e 还可以将淀粉的c t 1 ，4 位 连接的葡萄糖基经转葡萄糖苷作用转移给其它糖元【3 0 1 。借助c g t a s e 的这一功能，山田 4 等人取甜菊甙、可溶性淀粉同c g t a s e 作用，在甜菊甙的糖基上引入新的低聚糖元，通 过h p l c 分离得到三组转葡萄糖基化产物。再由异头碳分析和1 3 cn r m 谱图分析可知分 别为单葡萄糖基、双葡萄糖基和三葡萄糖基转化产物【3 1 1 。 p 味喃果糖苷酶( f f a s e ) 。f f a s e 的主要作用是催化d d 呋喃果糖糖苷链末端的非还原 性b 呋喃果糖苷残基的水解【3 2 1 。i s h i k a w a 等人利用f f a s e 的这一性质，在甜菊甙c 1 9 位 所连的葡萄糖基上通过b 2 ，6 糖苷键引入一分子呋喃果糖，再经过甲醇重结晶，得到高纯 度的甜菊甙呋喃果糖产物。通过专家们的感官鉴定，甜菊甙呋喃果糖产物在甜度、味 质方面都明显好于甜菊甙【3 3 】。 用b 半乳糖苷酶催化转糖苷反应，将半乳糖基连接至甜菊甙的c 1 9 羧基相连的葡萄 糖基上，再用该产物作为c g t a s e 催化的底物，这样就可以选择性地在c 1 3 o h 相连的葡 糖基上进行转糖苷反应以改良甜菊苷的甜味特性【3 4 】。 日本学者k a n e d a 等人用高峰淀粉酶( t a k a d i a s t 对甜菊甙糖基部分c 【葡萄糖一p 葡 萄糖甙的末端葡萄糖基进行选择性水解，然后经过一系列有机合成反应将甜菊甙转化成 莱鲍迪甙a 。类似的研究工作还有，h i t o s h i 等人将筛选且纯化好的酶固定在d e a e 一琼脂 糖凝胶柱上，使甜叶菊萃取液循环流过柱子，2 4 h 后5 0 的甜菊甙可转化成莱鲍迪甙a ， 从而达到了改善味质的目的f 3 5 1 。 1 5 3 树脂层析法分离甜菊糖 大孔吸附树脂分离技术是2 0 世纪6 0 年代末发展起来的新型分离技术之一，大孔树 脂具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附和交换容量大、选择性好、吸附和交换速 度快、吸附条件温和、再生处理方便、使用寿命长等优点，主要应用于工业脱色、环境 保护等领域。近几年来，大孔吸附树脂已广泛应用于天然植物中活性成分，如苷类、黄 酮、生物碱等大分子化合物的提取分离，在工业上得到了广泛应用【3 6 】。 近年来，南开大学高分子化学研究所设计并合成了对甜菊糖具有吸附选择性的大孔 亲和性树脂，探讨了它们对甜菊糖的吸附性能与吸附机理，并成功地分离出r a 产品， 且纯度较高。采用树脂吸附法提取、精制甜菊糖具有快速、经济、稳定等优点，是目前 甜菊糖精制过程中不可缺少的工艺流程【了7 1 。 1 6 立题背景及意义 在天然甜味剂中，应用最多的是蔗糖，但蔗糖是一种高热量的甜昧剂，摄入过多会 导致肥胖症、糖尿病、龋齿等疾病的发生。无论是发达国家还是发展中国家，在其提出 的“国民健康指南 中，无一例外地劝告国民限制蔗糖的摄入。因此，新型低热量( 或 无热量) 天然甜味剂的开发与研究越来越受到重视【3 8 】。 甜菊糖是目前世界己发现，并经我国卫生部批准使用的最接近蔗糖口味的天然低热 值甜味剂，是继甘蔗、甜菜糖之外第三种最具有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品， 被誉为“世界第三糖源”。 甜菊糖的八种甜味成分中，甜菊甙( s ) 、莱鲍迪甙a ( r a ) 和莱鲍迪甙c ( r c ) 的相对含 量较高，共占9 0 以上，是决定甜菊糖味质的主要成分。r a 甜度最高，相当于蔗糖的4 5 0 s 江南大学硕士学位论文 倍，甜味特性也与蔗糖相接近；s 甜味相当于蔗糖的3 0 0 倍，具有一定的苦味和不愉快的 后味，影响了甜菊糖的味质，限制了其更为广泛的应用。目前市售甜菊糖一般以甜菊甙 为主要成分，其中莱鲍迪甙a 约占2 5 左右，而含8 0 r a 甙的甜菊糖市价比一般混合型 甜菊糖高和5 倍。因此提取分离高r a 甙含量的甜菊糖产品成为国际、国内甜菊糖工业的 研究热点。 这几种糖甙具有相同的甙元，其分子结构与极性都非常相近，很难用常规手段将其 分离。与其它糖甙相比，甜菊甙在甲醇中的溶解度相对较低，通过特殊条件控制的甲醇 重结晶方法可析出大量高纯度的s ，从而使母液中r a 的含量超过其它糖甙。因此如何 控制重结晶的条件，尽可能多的在结晶中除去甜菊甙，提高母液中剩余莱鲍迪甙a 的相 对含量是分离提纯的关键【3 9 1 。 关于甜菊甙的苦涩味，大多数研究者认为根源在于其自身化学结构。因此，人们进 行了大量研究，采用酶促修饰法改变甜菊甙的结构，或者经一系列有机合成反应将甜菊 甙转化成菜鲍迪甙a ，以改善其味质。目前所采用的酶主要是环糊精葡萄糖基转移酶、1 3 呋哺果糖苷酶和d 半乳糖苷酶等，这些酶价格昂贵，本研究采用工业化的高峰淀粉酶， 其价格远远低于上述几种酶，也达到消除苦味的效果，从而降低了生产成本。 1 7 主要研究内容 本论文以市售甜菊糖为原料，对其中的两种主要组分甜菊甙和莱鲍迪甙a 进行分离， 然后对甜菊甙进行酶法改性，以改善其味质，提高甜菊糖综合价值。主要研究内容包括： 1 研究重结晶法分离甜菊甙和莱鲍迪甙a 的工艺，确定最佳的结晶条件，分别得到 高s 和r a 的甜菊糖产品。 2 采用高峰淀粉酶对结晶甜菊糖( 主要为甜菊甙) 进行改性，并对改性前后产品 的味质进行感官评价。 3 通过液质联用的方法，初步鉴定酶法改性过程中新生成物的结构。 4 采用吸附树脂对结晶母液进行分离纯化。 6 2 实验材料与方法 2 实验材料与方法 2 1 材料与设备 2 1 1 实验材料与主要试剂 甜菊糖( 纯度9 0 ) 葡萄糖( 分析纯) 蔗糖( 分析纯) 乳糖( 分析纯) 麦芽糖( 分析纯) 糊精( d e l 0 1 5 ) b 环糊精( 化学纯) 可溶性淀粉( 分析纯) 甜菊甙标样( 纯度9 8 ) 莱鲍迪甙a 标样( 纯度9 7 4 ) 高峰淀粉酶 甲醇( 分析纯) 乙醇( 分析纯) 异丙醇( 分析纯) 正丁醇( 分析纯) 。乙腈( 色谱纯) 树脂d 8 6 0 树脂s e p l i t el x - 3 6 2 1 2 主要仪器 s h a 2 a 冷冻水浴恒温振荡器 7 6 1 型恒温玻璃水浴 温度指标控制仪 j b 3 0 0 d 型强力电动搅拌机 s h b i i i 循环水式多用真空泵 d z g 6 0 5 0 型真空干燥箱 u v - 2 1 0 2 c 型紫外可见分光光度计 c t l 4 d 台式高速离心机 高效液相色谱仪 质谱仪z m d 4 0 0 0 d h l a 电脑恒流泵 d b s 1 0 0 电脑全自动部份收集器 7 上海达盛科技有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 山东保龄宝生物科技有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 日本和光纯药工业株式会社 日本和光纯药工业株式会社 美国s i g m a 公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 安徽三星树脂科技有限公司 西安蓝晓科技有限公司 江苏金坛市亿通电子有限公司 上海标本模型厂 上海医用仪表厂 上海标本模型厂 郑州长城科工贸有限公司 上海森信实验仪器有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 上海天美生化仪器设备工程有限公司 w a t e r s 公司 w r a t e r s 公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 江南大学硕士学位论文 h d a 电脑采集器 h d 3 紫外检测器 2 2 实验方法 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 2 2 1 甜菊糖溶解度的测定 在一定量溶剂中加入过量的甜菊糖固体，恒温条件下持续搅拌足够时间( 1 h 左右) ， 使其充分溶解，再静置使未溶解的甜菊糖沉降。取少量上清液，迅速通过0 4 5 1 t m 微孔 滤膜过滤，将滤液稀释到合适的浓度后，用紫外分光光度法测定2 1 0 h m 吸光值，并计算 相应温度下的溶解度【删。 2 2 2 甜菊糖的重结晶 称取l o o g 甜菊糖粉末于三口瓶中，加入一定体积的溶剂，置于7 0 4 c 水浴中加热搅 拌至全部溶解，于4 水浴中搅拌1 2 h ，析出白色晶体。过滤，得到的晶体在8 0 、0 1 m p a 真空度干燥至恒重【4 l 】。甜菊糖结晶率和结晶中s r a 的计算如下： 甜菊糖结晶率( ) = 主蓦1 x 蓦糕l 。坩卜r 日口利储伙皇 结晶中s r a = 器 2 2 3 毛细管气相色谱法测定结晶中甲醇、异丙醇残留 色谱条件：p e g 2 0 m 3 0 米柱，i d 0 5 3 m m ；t d = 2 5 0 ，t c = 5 0 。c 恒温4 m i n ，以8 。c m i n 的升温速率升至2 4 0 ( 2 ，再恒温2 0 m i n ；载气为氮气，压力0 6 k g c m 2 ，流速1 1 2 m l m i n ， 分流比3 0 ：1 ；进样量l 山；汽化室温度2 4 0 * ( 2 ；采用氢离子火焰检测器( f i d ) 检测【4 2 1 。 2 2 4 甜菊糖的酶法改性 将淀粉悬浮液煮沸5 m i n ，冷却后与一定量的甜菊糖混合，加入适量高峰淀粉酶， 反应体系总体积为2 0 m l ，水浴振荡1 2 h 。取出样品，置于1 0 0 沸水中保持1 0 m i n ，使 酶丧失活性，以终止反应【4 3 】。离心沉淀除去剩余的淀粉，上清液通过微孔滤膜过滤后， 用高效液相色谱法检测改性结果。甜菊甙的转化率按照下式计算： s 转化率c ，= 堕磷器慕笋堕量枷。 2 2 5 高效液相色谱法测定甜菊糖各组分含量 ( 1 ) 色谱条件 色谱仪：w a t e r s2 6 9 0 ；检测器：w a t e r s2 9 9 6 紫外检测器，波长2 1 0 n m ；色谱柱：a s a h i p a k n h 2 p 5 04 e ( s h o d e x 公司) ；流动相：乙睛：水= 8 0 ：2 0 ( v v ) ；流速：lm l m i n ；杠温： 3 5 ( 2 ；进样量：1 0 a l t 4 4 】。 ( 2 ) 标准曲线的绘制 将甜菊甙和莱鲍迪甙a 标准样品置于1 0 5 c 干燥箱中烘2 h ，分别称取1 2 0 、9 0 、6 0 、 8 2 实验材料与方法 3 0 m g 四份样品，均m 8 0 ：2 0 的乙腈水溶液溶解，并稀释至2 5 m l 【4 5 1 。分别测定不同浓度 的标准溶液，以峰面积对浓度作标准曲线，并计算回归方程。 1 e + 0 7 8 e + 0 6 娶6 e + 0 6 咀 髫4 e + 0 6 2 e 州) 6 o e 枷 0123 4 5 甜菊甙浓度( m g m l ) 图2 1 甜菊甙标准曲线 f i g 2 - 1t h ec a l i b r a t i o nc u r v eo fs t e v i o s i d e ( 3 ) 结晶样品的测定 1 e 卜0 7 8 e 0 6 聚6 e + 0 6 喧 警4 卧舶 2 e + 0 6 0 e + 0 0 ol2345 莱鲍迪甙a 浓度( m g m l ) 图2 2 莱鲍迪甙a 标准曲线 f i g 2 - 21 1 1 ec a l i b r a t i o nf f l 1 r v eo f r e b a u d i o s i d e - a 称取经1 0 5 干燥2 h 的样品1 2 0 r a g ，用8 0 ：2 0 的乙腈水溶液溶解，并稀释至2 5 m l ，摇 匀，经0 4 5 p , m 微孔滤膜过滤后进样。 2 2 6 液质联用的测定 质谱仪：w a t e r sp l a t f o r mz m d 4 0 0 0 质谱仪；离子方式：e s i + 和e s i ：毛细管电压： 3 8 k v ；锥孔电压：3 0 v ；离子源温度：1 2 0 ；脱溶剂温度：2 5 0 c ；质量范围：1 0 0 - 1 3 0 0 m z ； 光电倍增器电压：7 0 0 v ；分析器真空度：2 6 x 1 0 一m b a r ；雾化气流速：4 2 l h t 4 6 1 。 2 2 7 甜菊糖味质的评定 甜味强度的测定目前只能通过尝味评定的方法来进行，因为尚无甜度的仪器测定 法。随着生物化学的发展，如果有可能从舌头中分离出具有活性甜味感觉的受体蛋白来， 最终就有可能出现精确的仪器测定法。 分别配制不同浓度( 间隔1 ) 的蔗糖溶液、0 0 2 的甜菊糖溶液、0 0 2 的改性甜 菊糖溶液。以上溶液均由去离子水配制而成，冰箱放置过夜，评定时样品溶液温度为 2 5 士1 。评定小组由1 0 人组成，男女各5 名。品尝2 个样品之间要漱口，直到感觉不 到甜味为止。 首先要求品尝成员将不同浓度的蔗糖溶液按甜度增加的顺序排列，约9 0 的成员能 够正确排序。然后分给每个成员一定浓度的原料甜菊糖和改性甜菊糖，要求对甜味剂样 品及不同浓度的蔗糖溶液进行比较，找出与试验品甜度相当的蔗糖溶液，并对样品的味 质作出评价，包括甜味感觉速度、甜味持续时间和后苦味。 样品的品尝结果用相等甜度( e s ) 和相对甜度( r s ) 来表示。定义相等甜度为与 样品甜度相当的蔗糖溶液浓度。相对甜度是指相等甜度的蔗糖溶液与相应的样品溶液浓 度之比【4 7 1 。 9 江南大学硕士学位论文 2 2 8 树脂层析法分离甜菊糖 2 2 8 1 树脂的预处理 将树脂用无水乙醇浸泡2 4h ，使其充分溶胀，然后用无水乙醇洗至2 1 0 h m 无吸收峰， 再用蒸馏水充分漂洗后备用【4 引。 2 2 8 2 树脂吸附能力的测定 分别量取处理好的湿树j l 旨 5 9 于5 0m l 具塞锥形瓶中，加入浓度为2 0m g - m l 1 的甜菊 糖溶液2 5m l ，于3 0 c 、1 6 0r m i n - 1 的恒温水浴中振荡1 2h ，采用紫外分光光度法在2 1 0 n t o 测定吸附前后溶液浓度。树脂吸附能力的计算公式如下【4 9 】： 吸附率e = ( c o c 。) c o 1 0 0 吸附量q = ( c o c e ) x v i w 式中：c o 一吸附前溶液浓度，m g m l c 。一吸附后溶液浓度，m g m l v i 一吸附溶液体积，m l w 一树脂重量，g 2 2 8 3 树脂的静态洗脱 吸附饱和后的树脂用蒸馏水洗去残留的甜菊糖后，分别加入2 5 m l5 0 乙醇，7 5 乙醇、5 0 甲醇、8 0 甲醇以及甲醇异丙醇= 8 0 ：2 0 ，于3 0 、1 6 0r m i n d 的恒温水浴中振 荡1 2 h ，测定洗脱液浓度【5 0 1 。 解吸率d = c d v 2 ( c o c 。) v i x l 0 0 式中：c d 一解吸液浓度，m g m l v d 一解吸液体积，m l 2 2 8 4 树脂的动态吸附和解吸 用2 6 x 5 0c i i l 的层析柱装满树脂，在室温条件下上样，先用去离子水洗涤层析柱， 然后用不同的洗脱剂洗脱，流速为lm l m i n ，用紫外检测器检测流出液在2 1 0 n m 处的吸 光值【5 i 】。用高效液相色谱法测定洗脱峰的成分。 1 0 3 结果与讨论 3 结果与讨论 3 1 甜菊糖的重结晶 本研究对甲醇重结晶分离甜菊糖进行了改进，采用甲醇异丙醇混合溶剂进行重结 晶。以结晶中甜菊甙与莱鲍迪甙a 的含量比( s r a ) 为主要指标，综合结晶率，考察了 结晶溶剂、溶剂用量、结晶温度以及结晶时间的影响，通过正交试验进行工艺优化，得 到高s 含量的结晶。对母液进行二次结晶，可得到高r a 含量的结晶。通过两次结晶对甜 菊糖的主要组分s 和r a 进行分离、富集，为分离甜菊甙和莱鲍迪甙a 提供了一种简便的 方法。此外，为保证产品安全性，采用气相色谱法对结晶中的溶剂残留进行了测定。 3 1 1 结晶溶剂的选择 关于结晶溶剂，有文献报道，甜菊甙和莱鲍迪甙a 在甲醇中的溶解特性有所不同， 通过特殊条件控制的甲醇重结晶的方法可析出大量的甜菊甙，从而使母液中的莱鲍迪甙 a 的含量较高，从而达到分离的目的。也有研究指出，由于水的极性很强，在甲醇中加 入少量的水会对结晶性能有影响。常用溶剂的极性见表3 1 ，乙醇、异丙醇和正丁醇的 极性与甲醇相近，于是考察了其纯溶剂以及甲醇水、甲醇异丙醇混合溶剂的结晶性能。 表3 - 1 常用溶剂的极性 t a b 3 - 1s o l v e n tp o l a r i t y 在1 0 o g 甜菊糖中，分别加入2 5 m l 不同的溶剂，7 0 。c 溶解后于4 9 c 水浴中结晶1 2 h 。 其中甲醇水混合溶剂中，水的体积分数为2 ：甲醇异丙醇混合溶剂中，异丙醇的体积 分数为2 0 ，结果如图3 1 和图3 2 所示。 囊 盖 姆 l羹 原料甲醇异丙醇正丁醇甲醇水甲醇异丙醇 结晶溶剂 图3 1 结晶溶剂对组份分离的影响 f i g 3 一le f f e c to fs o l v e n to ns e p a r a t i o n 8 5 2 9 6 3 0 l l 1 o 0 o o 江南大学硕士学位论文 7 0 6 4 零5 8 铸 臻5 2 4 6 4 0 甲醇异丙醇正。 酵甲醇水甲酵异丙醇 结晶溶剂 图3 - 2 结晶溶剂对结晶率的影响 f i g 3 - 2e f f e c to fs o l v e n to nc r y s t a l l i z a t i o nr a t e 甲醇和异丙醇纯溶剂对甜菊糖均具有一定的分离效果，结晶中s r a 分别由原料的 0 9 5 7 提高到1 1 5 和0 9 8 6 ，而正丁醇效果最差。本研究也尝试了以乙醇作为结晶溶剂， 结果并不理想，主要是结晶时间很长，结晶量很少，可能是出于甜菊糖在乙醇中溶解度 较大，使得体系粘度大，析晶困难，且晶体相互粘连不易分离【5 2 1 。由于水的极性很强， 因此在甲醇中加入少量水( 体积分数2 效果最好) ，即对甜菊糖结晶性能有明显影响， 结晶中s r a 为1 3 0 9 ，有所提高，而结晶率略有降低，因为甜菊糖在水中的溶解度较大。 以异丙醇作为溶剂，结晶率比较高，在甲醇中加入2 0 的异丙醇，不仅提高了结晶率， 对分离效果更有利，s r a 达到1 6 2 7 。不同溶剂对于结晶率的影响不大，均在6 0 - 6 5 之间。因此，在后续试验中采用甲醇异丙醇混合溶剂作为结晶溶剂。 3 1 2 异丙醇含量对结晶的影响 既然在甲醇中加入一定量的异丙醇对组分分离有促进作用，那么有必要探讨异丙醇 在混合溶剂中比例的影响。在1 0 o g 甜菊糖中加入2 5 m l 含不同比例异丙醇的甲醇异丙 醇混合溶剂，7 0 溶解后于4 水浴中结晶1 2 h ，结果如图3 3 和图3 4 所示。 囊 - 嚯e - 姆 251 02 03 0 异丙醇含量 图3 3 异丙醇含量对组份分离的影响 f i g 3 - 3e f f e c to fi s o p r o p y la l c o h o l0 1 1s e p a r a t i o n 1 2 8 5 2 9 6 3 0 l l l o o 0 0 3 结果与讨论 7 0 6 4 霉5 8 瑶 惩5 2 4 6 4 0 251 02 03 05 0 异丙醇含量 图3 - 4 异丙醇含量对结晶率的影响 f i g 3 4e f f e c to fi s o p r o p y la l c o h o lo nc r y s t a l l i z a t i o nr a t e 异丙醇含量越高，结晶率越高，说明甜菊糖在异丙醇中的溶解度受温度的影响较大。 在甲醇中加入少量的异丙醇( 4 0 ，在异丙醇中 6 0 c ) ，溶解度随温度升高增加比较明显。 这表明在高温下溶解，在低温下结晶，即具有较大的温度差，才能得到较高的结晶率。 甲醇的沸点为6 4 7 ，异丙醇的沸点为8 2 5 ，选择溶解温度7 0 c ，虽然高于甲醇的沸 点，但由于溶解时间很短，影响不大，却能溶解更多的甜菊糖。 3 1 4 溶液浓度对结晶的影响 物质普遍具有过饱和能力，即溶质能在溶液中以高于饱和浓度的浓度保持稳定而不 析出。某温度下，溶质析出的浓度称为极限过饱和度，不同温度下溶质的极限过饱和度 构成了超溶解度曲线。溶解度曲线和超溶解度曲线将浓度温度分割为三个区域，溶解 度曲线以下是稳定区，超溶解度曲线以上是不稳区，二者之间的部分是介稳区，。介稳 区宽度可作为选择适宜过饱和度，即确定溶液初始浓度的依据。一个特定物系只有一根 明确的溶解度曲线，而超溶解度曲线的位置却要受很多因素的影响。多年来，人们曾研 究了各种介稳区宽度的测定方法，各种方法都有可争议之处，使用更精确的方法，例如 使用电子显微镜或微粒子分析仪等来检测首批晶核的出现，所得的介稳区宽度就会更窄 些【5 7 】。由于设备的限制，难以达到如此高的精度，所以对此没有测定，而是探讨了溶液 浓度对结晶的影响，操作起来比较容易。 过饱和度的大小直接影响着晶核形成过程和晶体生长过程的快慢。提高溶液的浓度 可以加快结晶速度，同时也伴随着溶液粘度的增加，势必增大扩散阻力，减慢结晶速度。 此外当浓度过高时，还会导致伪晶的产生【5 8 1 。因此，控制好溶液浓度相当重要。 1 6 l ，2 聋 善0 8 唾 您0 4 o 0 2 02 53 0 溶剂用量( m l ) 1 52 02 53 0 溶剂用量t m l ) 图3 _ 6 溶剂用量对组份分离的影响图3 - 7 溶剂用量对结晶率的影响 f i g 3 - 6e f f e c to fc o n c e n