靶向整合素_v_3受体的新型RGD肽二聚体的_131_I标记与生物活性的初步.pdf

基金项目: 国家重点基础研究发展计划 ( 973计划, 2006GB705705)、 教育部教育振兴行动计划特殊专项 ( ? 九八五?工程?期, 985 -2 -056) 和放射性药物教 育部重点 实验室开放 基金 ( 0707) 资助Supported by the M ajor State Basic R esearch Program of China ( 973 Program, 2006GB705705),the Special Fund forPromotion ofEducation , M inistry ofEducation P. R. C .( 985 -2-056), and the K ey Laboratory ofRadiophar ma- ceuticals ofM inistry of Education , College ofChem istry, Beijing Nor malUniversity ( 0707) ? Corresponding author ? s e-mai, l yangm bj mu. edu. cn ,rong fu_wang2003 yahoo. com. cn 网络出版时间: 2011 -3 -4? 9? 55? 30? 网络出版地址: http: / /www. cnk. i net/kcms/detail/11 . 4691 . R. 20110304. 0955 . 005 . html ? 技术方法? 靶向整合素 ? v?3受体的新型 RGD肽二聚体的 131 I标记与生物活性的初步评价 张春丽 1 , 2, 王荣福2? , 张? 丽 2, 郭凤琴2, 李 ? 玲2, 康 ? 磊2, 闫? 平2, 杨? 铭1? ( 1 . 北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室, 北京? 100191; 2. 北京大学第一医院核医学科, 北京? 100034) 摘? 要 目的: 对所设计的新型精氨酰- 甘氨酰- 天冬氨酰 (Arg-Gly -Asp, RGD)肽进行 131 I标记, 研究其在肿瘤组织 中的靶向性及其在荷瘤鼠体内的生物分布与显像, 探讨将其应用于肿瘤血管生成显像的可能性。方法: 参照文献 报道的对环五肽 c( RGD f V )构效关系的研究结果及多肽的化学修饰方法, 设计了新型二硫键成环的并经亲水性修 饰的 cRGD肽二聚体 c( RGD) 2, 采用 ChT法进行 131 I标记, 测定 c( RGD) 2的亲和常数、 标记物的稳定性与油水分 配系数; 建立荷黑色素瘤动物模型, 研究 131 I -c( RGD )2的体内分布、 非标记肽竞争抑制及肿瘤显像。结果: 131 I对 c(RGD) 2的标记率为 ( 76. 35 ? 2. 33)% , 经 Sephadex G10分离纯化后其放射化学纯度达 ( 95. 20 ? 3. 25)% 。 c(RGD)2对受体的亲和常数 Ka为 ( 0. 137? 0. 057) ? 109/mol/L, 油水分配系数 lgP正辛醇 /水为 - 1. 628, 131 I -c(RGD) 2 在静脉注射后 1 h、 3 h 、5 h与 24 h在肿瘤中的摄取率分别为 ( 0. 67? 0. 13)% I D /g、 ( 0. 42? 0. 08)% I D /g 、( 0. 51? 0. 11)% ID /g 与 ( 0. 18? 0 . 02)% I D /g, 其在肿瘤中的清除相对缓慢, 靶本比 ( T /NT)随时间延长而增高, 静脉注射后 24 h, 肿瘤与肌肉 (T /M )和肿瘤与血液 (T /B)的摄取比值分别为 4. 42? 1. 70与 2. 27 ? 0. 45 。131I -c( RGD) 2的肝脏 摄取低, 静脉注射后 1 h肿瘤与肝的摄取比可达 2. 10? 0 . 60 ; 未标记肽可明显抑制肿瘤对 131 I -c(RGD) 2的摄取。荷 瘤小鼠全身显像可见肾显影, 在静脉注射后 3 h胸部显像可见清晰的肿瘤影像。结论: 所设计的通过二硫键成环的 c(RGD)2可应用 ChT法成功完成 131 I标记, 其可被肿瘤组织特异性摄取, 有可能应用于肿瘤血管的生成显像。 131 I -c (RGD)2的肝脏摄取低, 在肿瘤显像中具有一定优势。 关键词 寡肽类; 二聚作用; 碘放射性同位素; 整合素 ?v?3 中图分类号 R977. 6? ?文献标志码 A? ?文章编号 1671-167X( 2011) 02-0295-06 do: i 10. 3969/. j issn. 1671-167X. 2011. 02 . 026 131 I labeling and bioactivity evaluation of a novel RGD di m er targeted to integrin ?v?3receptor ZHANG Chun -li 1 , 2, WANG Rong -fu2?, Z HANG L i 2, GUO Feng -qin2,LI L ing2,KANG Lei 2, YAN Ping2,YANG M ing1? ( 1 .State Key Laboratory ofNatural and Bio m i metic Drugs,Peking University School Phar maceutical Sciences Center , Beijing 100191, China ; 2. Depart ment ofNuclearM edicine , Peking University F irstHospita, l Beijing 100034, China) ABSTRACT?Objective : To study the 131 I labeling ,tumor targeting property ,biodistrubution and i maging of a novel disulfide bridgedArg -Gly -Asp ( RGD) peptide di mer and investigate its possibility for tumor angiogenesis i m aging. M ethods : A disulfide bridged cRGD peptide di mer c( RGD)2 was designed ac - cording to the published results of structure -activity relationship study of c( RGDfV) and modified w ith hydrophilic am ino acid .The affinity of the peptide to ?v?3receptor was determ ined by binding assay. The peptidewas labeledw ith 131 Iby ChT method . The stability and lg n -octano- lwater partition coefficient of the labeled peptide were tested .The biodistribution ,inhibition w ith unlabeled peptide and i maging were perfor med by injecting the labeled peptide into them ice bearing meloma B16 . Results : The 131 I la - beling efficiency and radiochem ical purity were ( 76 . 35 ? 2 . 33 )%and ( 95 . 20 ? 3 . 25 )% , respectively . Kawas ( 0 . 137 ? 0 . 057) ? 10 9 /mol/L,and lgPoctanol/w aterwas- 1 . 628 . The tumor uptake of the labeled peptide at 1 h, 3 h ,5 h and 24 h were ( 0 . 67 ? 0 . 13) % ID /g,( 0 . 42 ? 0 . 08) % ID/g, ( 0 . 51? 0 . 11)% I D /g and ( 0 . 18 ? 0 . 02)% ID /g,respectively .The tumor clearance was low,so the T /NT increased w ith ti me . The T /M and T /B were 4 . 42 ? 1 . 70 and 2 . 27 ? 0 . 45 ,respectively ,24 h ?295? 北京大学学报(医学版) JOURNAL OF PEKI NG UN I VERSI TY( HEALTH SCIENCES) ? Vo. l 43? No. 2? Apr . 2011 pos- t injection . The hepatic uptake of the labeled peptide was low. The tumor -to - liver ratio was 2 . 10 ? 0 . 60 at 1 h pos- t injection ,coinjection of c( RGD)2w ith 131 I -c( RGD)2resulted in a significant decrease in tu mor uptake .In total body i m ages,only kidneyswere distinctive whereas tumor was clear in chest i m ages 3 h pos- t injection. Conclusion :c( RGD)2can be successfully labeled w ith 131 I by ChT method . The labeled peptide can be specifically combined w ith tumor , which suggests its possibility in tumor an - giogenesis i m aging.Its low liver uptake provides an advantage for tumor i maging . KEYWORDS?Oligopeptides ; D i merization ;Iodine radioisotopes ;Integrin alphaVbeta3 ? ? 肿瘤血管生成是肿瘤生长、 浸润、 转移中不可缺 少的生物过程。肿瘤血管生成显像可显示肿瘤血管 的生成情况, 在肿瘤早期诊断、 疗效评价、 治疗方案 制定及预后评估中具有重要的指导作用。整合素 ?v?3受体在新生血管内皮细胞和多种肿瘤细胞表 面高表达, 在肿瘤血管生成中起着关键作用, 目前已 成为肿瘤诊断与治疗的一个重要靶点 1。含精氨 酰-甘氨酰-天冬氨酰 ( Arg-G ly-Asp ,RGD)三肽序列 的多肽可特异性地与整合素 ?v?3受体结合, 经放射 性核素标记的 RGD肽已应用于肿瘤血管生成显像 与治疗研究 2- 4, 但目前研究较多的 RGD肽为酰胺 键成环的环五肽及其多聚体, 其环化过程相对困难, 我国目前尚不能自行合成, 而二硫键成环的 RGD肽 比较容易合成, 因此, 本研究根据文献报道的构效 关系研究结果及化学修饰方法设计了二硫键成环 的新型 RGD肽二聚体, 用 131 I进行标记, 对其在肿 瘤组织中的靶向性和在荷瘤鼠中的生物分布与显 像进行研究, 以探讨将其应用于肿瘤血管生成显 像的可能性。 1? 材料与方法 1 . 1? 材料 仪器: 电子天平 HANGPI NG FA1104 , 购自上海 精科电子天平公司; ?计数器 FT609 , 购自北京四新 科技开发公司; 活度计 RM905 , 购自中国剂量研究 院; SPECT显像仪 GE-MRP, 购自美国 GE公司。 主要试剂: RGD肽二聚体, 简写为 c( RGD)2, 氨基酸序列见图 1 。由上海吉尔公司合成, 经 HPLC 分析纯度 95 % , 其结构通过质谱认证; 氯胺-T, 分 析纯, 购自上海国药集团化学试剂有限公司; Na 131 I 及 Na 125 I溶液, 北京原子高科股份有限公司产品; 其他试剂均为分析纯, 购自北京化学试剂公司。 图 1?c( RGD)2的氨基酸序列 Figure 1? Amino acid sequence of c( RGD )2 ? ? ? 细胞: 小鼠黑色素瘤 B16细胞株, 购自北京大 学医学部病理教研室。人神经胶质瘤 U87细胞株, 由北京大学医学同位素研究中心提供。 实验动物: 昆明种小鼠 ( SPF级 ), 购自北京大 学医学部实验动物科学部, 体重 15 17 g, 颗粒饲 料喂养, 符合实验动物质量标准。 1 . 2? 131 I(或 125 I)标记与标记物稳定性测定 采用氯胺 T ( ChT ) 法进行标记。将 0 . 5 g/L c( RGD)2置于 0 . 5 mol/L p H 7. 4的磷酸缓冲液中, 加入 131 I -NaI(或 125 I -NaI)溶液, 再加入新鲜配制的 ChT 溶液使其终浓度为 0 . 9 g/L, 振荡反应 2 m in , 立即加至 Sephadex G10层析柱进行分离纯化。 131 I(或 125 I)的标记率和标记产物的放射化学纯 度用纸层析法测定, 支持物为新华 1号滤纸, 展开 剂为正 丁醇 /乙 醇 /氨水 = 5/1/2 ( 体积比 ), 131 I (或 125 I)-c( RGD)2的 Rf= 0 0 . 1 , 游离 131 I(或 125 I) 的 Rf= 0 . 4 0 . 6与 0 . 9 1 . 0 。 将 131 I -c( RGD)2分别置于 4 ? 冰箱和人新鲜血 清中 37 ? 孵育, 测定不同时间的放射化学纯度。 1 . 3?c( RGD)2对 ?v?3受体的亲和常数测定 将 U87细胞培养于含 10 % (体积分数 )胎牛血 清的低糖 DMEM 培养基中, 每隔 2天传代, 将对数 生长期的细胞经 0 . 25 % (质量分数 ) 胰酶消化后用 无菌生理盐水调整细胞至 5 ? 10 5 个 /100 ?L备用。 在 24支 EP管中每管加入细胞悬液 100 ?L, 离 心弃去上清液, 加入浓度分别为 0 nmol/L、0 . 125 nmol/L、 0 . 25 nmol/L、 0 . 5 nmol/L、 1 nmol/L、 2 nmol/ L、 4 nmol/L的 cRGD肽 100 ?L, 同时设一个非特异 结合管, 加入浓度为 1 ? 10 5 nmol/L的 c( RGD)2100 ?L, 再在每孔中加入计 数约 2 ? 10 5 /m in 的 125 I - c( RGD)250 ?L, 总体积用含 10 % 牛血清白蛋白、 p H 7 . 4的 Tris缓冲液调节到 200 ?L。每个浓度点 ?296? 北京大学学报(医学版) J OURNAL OF PEK I NG UN I VERSITY(HEALTH SCIENCES) ? V o. l 43? No. 2? Apr . 2011 平行设 3管, 4 ? 孵育 2 h , 测定放射性总计数 ( T), 离心吸出上清液, 用 100 ?L PBS溶液洗 2遍, 离心 吸出上清液, 在沉淀的细胞中加入 200 ?L PBS溶液 并吹匀细胞, 测定细胞中结合的放射性计数 ( B)。 用 Scatchard作图法 ( B /F对 B作图, F 为游离的标 记物浓度, 即 T-B)作图, 以直线拟合, 直线斜率的负 值即为亲和常数 Ka 。 1 . 4? 油水分配系数的测定 将 10 ?L 131 I -c( RGD)2溶解于 1mL蒸馏水中, 加入 1 mL正辛醇, 振荡 1 m in使正辛醇与水充分混 合, 3 000 r/m in离心 3 m in , 分离水相与正辛醇相, 在水相和正辛醇相各取 100 ?L样品, 测定放射性计 数。油水分配系数 lgP正辛醇 /水= lg ( cts正辛醇/cts水), cts正辛醇和 cts水分别为 100 ?L正辛醇中和 100 ?L水 中的放射性计数。 1 . 5? 荷瘤动物模型的建立 黑色素瘤 B16细胞常规培养于含 10 % 胎牛血 清的 RPM I -1640培养基中, 将对数生长期的细胞经 胰蛋白酶消化后用培养基重悬收集细胞, 用无菌生 理盐水调整细胞密度为 10 7 个 /100 ?L 备用。以 75 % (体积分数 )的乙醇溶液消毒小鼠前肢腋下皮 肤, 取已调整好密度的 B16细胞接种于小鼠右前腋 部皮下, 每只小鼠接种约 10 7 个细胞。当肿瘤直径 长至 1. 0 cm 左右时用于研究 131 I -c( RGD)2的生物 分布。 1 . 6? 荷瘤小鼠体内生物分布研究 将 25只荷瘤小鼠分为 5组, 每组 5只, 其中 4 组的每只小鼠经尾静脉注射 185 kBq( 5 ?Ci) /0 . 17 ?g的 131 I -c( RGD)2100 ?L, 于注射后 1 h、 3 h 、 5 h及 24 h各断颈处死 1组小鼠; 另外 1组为阻断实验组, 经小鼠尾静脉注射 185 kBq( 5 ?C i) /0 . 17 ?g的 131 I - c( RGD)2与 40 ?g未标记的 c( RGD)2混合液, 于 注射后 3 h断颈处死小鼠。解剖小鼠, 取心、 肝、 脾、 肺、 肾、 胃、 肠、 膀胱、 肌肉、 长骨、 肿瘤等组织, 称重并 测定放射性计数, 计算每 克组织的百分摄取率 (% I D /g , 即每克组织的放射性计数 /注入的总放射 性计数 ? 100 % )和靶与非靶的放射性比值 ( T /NT, 即每克肿瘤组织的摄取率 /每克正常组织的摄取率 )。 1 . 7? 荷瘤小鼠显像 为避免显像过程中甲状腺对 131 I -c( RGD)2脱落 的 131 I的大量摄取而影响肿瘤的显像, 实验前 3天在 小鼠饮水中加人 0 . 1 % (质量分数 )的碘化钾以封闭 甲状腺对 131 I的摄取。取 2只荷瘤小鼠, 经尾静脉注 射 7. 4 MBq ( 200 ?Ci) 131 I -c( RGD)2, 于注射后 1 h 、 3 h 、 5 h 、 24 h行全身及胸部 (用铅板遮挡腹部 ) 平面显像。显像条件为: 矩阵 256 ? 256 , 能峰 140 keV, 放大系数 2倍, 采集 100 K计数。 1 . 8? 统计学分析 采用 SPSS 16 . 0软件进行统计分析。生物分布 实验结果用均数 ?标准差表示, 阻断实验组与未阻 断组间的差异采用独立样本 t检验进行统计学分 析。P 0 . 05为差异有统计学意义。 2? 结果 2 . 1? 131 I标记、 标记物的稳定性和油水分配系数 131 I标 记 c ( RGD)2的 标记 率 为 ( 76?35 ? 2 . 33)% , 标记物经 Sephadex G10柱分离纯化, 放射 化学纯度达 ( 95 . 20? 3 . 25)%。 125 I -c( RGD)2的标记 率和放射化学纯度分别为 87 . 25 %与 99 . 01 % 。 131 I -c( RGD)2在 4 ? 冰箱和新鲜人血清中 37 ? 孵育下的稳定性见图 2和图 3 , 从图中可以看出, 131 I -c( RGD)2在 4 ? 冰箱中放置 1 d和在 37 ? 人新 鲜血清中孵育 6 h内的放射化学纯度大于 90 % 。 131 I -c( RGD)2的油 水分配系数lgP正辛醇 /水为 - 1 . 628 , 表明其具有良好的水溶性。 ?297? 张春丽, 等? 靶向整合素 ?v?3受体的新型 RGD肽二聚体的131I标记与生物活性的初步评价 2 . 2?c( RGD)2对 ?v?3受体的亲和常数 c( RGD)2对 ?v?3受 体的亲 和常数 Ka 为 ( 0 . 137? 0 . 057) ? 10 9 /mol/L。 2 . 3? 荷瘤小鼠体内的生物分布 131 I -c( RGD)2在荷黑色素瘤 B16小鼠体内的生 物分布结果见表 1 , 肿瘤与小肠、 肝、 肺、 肌肉、 骨、 心、 脾、 血液的 T /NT 值见图 4 。可以看出, 静脉注射 c( RGD)2后, 肾脏放射性计数最高, 胃的放射性计 数也相对较高, 肿瘤与肾、 胃的摄取比在所有时相均 小于 1 。肿瘤的 初始摄取 率为( 0 . 67 ? 0 . 13) % ID /g, 与正常组织对比, 131 I -c(RGD)2在肿瘤中清 除缓慢, T /NT值随时间延长而增高 (图 4)。静脉注 射后 5 h , 肿瘤摄取率即高于除肾脏、 膀胱和胃以外 的其他正常组织; 除肾脏、 膀胱、 胃和血液外, 肿瘤与 其他正常组织的 T /NT均大于 1 . 4 , 静脉注射后 24 h T /NT均大于 2。 静脉注射后 5h与 24h, 肿瘤与肌 肉的摄取比 ( T /M )分别为 4. 19 ? 0 . 31与 4 . 42 ? 1 . 70 , 肿瘤与血液的摄取比 ( T /B) 分别为 1 . 09 ? 0 . 39 与2 . 27 ? 0 . 45 。在竞争抑制实验中, 对 3 h未 抑制组与 3 h抑制组的肿瘤摄取率进行了独立样本 t检验, 结果 t= 4 . 392 , P 0 . 05, 提示两组间差异有 统计学意义。 图 4? T /NT值随时间的变化 Figure 4? T /NT at different ti me post -injection ? 表 1? 131 I -c( RGD )2在荷黑色素瘤小鼠体内的生物分布 ( ? x ? s) % I D /g, n= 5 Table 1? Biodistribution of131I -c(RGD)2in mice bearing B16 meloma ( ? x ? s) % I D /g, n= 5 T issues1 h3 h5 h24 h3 h ( I nhibition group) Bladder0 . 59? 0 . 320 . 36 ? 0. 120. 71? 0 . 360 . 24? 0. 000 . 58 ? 0. 26 Stomach1 . 88? 0 . 182 . 11 ? 0. 663. 11? 1 . 160 . 21? 0. 061 . 96 ? 0. 74 Small intestine0 . 41? 0 . 560 . 33 ? 0. 150. 34? 0 . 100 . 07? 0. 020 . 33 ? 0. 11 K idney31 . 6? 1 . 9219 . 3 ? 6. 1719. 2? 7 . 063 . 69? 1. 5522. 9 ? 4. 46 L iver0 . 32? 0 . 040 . 23 ? 0. 060. 22? 0 . 040 . 06? 0. 000 . 23 ? 0. 06 Lung0 . 72? 0 . 160 . 52 ? 0. 250. 36? 0 . 050 . 09? 0. 020 . 39 ? 0. 08 Muscle0 . 19? 0 . 020 . 11 ? 0. 060. 11? 0 . 010 . 04? 0. 010 . 13 ? 0. 03 Bone0 . 41? 0 . 130 . 17 ? 0. 160. 16? 0 . 070 . 04? 0. 010 . 15 ? 0. 13 H eart0 . 34? 0 . 030 . 23 ? 0. 060. 34? 0 . 10 . 07? 0. 020 . 21 ? 0. 05 Spleen0 . 42? 0 . 080 . 37 ? 0. 190. 31? 0 . 080 . 07? 0. 000 . 31 ? 0. 07 Blood0 . 62? 0 . 390 . 42 ? 0. 050. 50? 0 . 160 . 08? 0. 010 . 34 ? 0. 05 Tu mor0 . 67? 0 . 130 . 42 ? 0. 080. 51? 0 . 110 . 18? 0. 020 . 26 ? 0. 02 2 . 4? 荷瘤小鼠显像 荷瘤小鼠显像结果见图 5和图 6 。由于肾脏摄 取远高于其他组织器官, 而且采集方式为定计数采 集, 故全身显像仅见肾脏影像, 而其他组织器官采集 到的计数很低, 难以清晰显示。将小鼠腹部屏蔽进 行胸部显像, 1 h后即可见肿瘤部位的放射性高于 周围组织, 3 h后肿瘤可清晰显示。 3? 讨论 整合素是由 ?亚基和 ?亚基以非共价健结合 而形成的跨膜异二聚体糖蛋白, 属于 ?型膜蛋白。 迄今已发现 18种不同的 ?亚基和 ?亚基, 组成 24 种整合素 5。整合素为细胞粘附分子家族的重要 成员之一, 主要介导细胞与细胞、 细胞与细胞外基 质 ( ECM )之间的相互粘附, 并介导细胞与 ECM 之 间的双向信号传导。整合素在多种肿瘤表面和新 生血管内皮细胞中有高表达, 对肿瘤血管生成起 着重要作用, 其中 ?v?3对肿瘤血管生成的作用尤 为重要 1。 ? v?3由 ?v亚基 ( CD51, 相对分子质量 150 ? 10 3 )和 ?3亚基 ( CD61 , 相对分子质量 105 ? 10 3 )组成, 能识别含 RGD序列的多肽 6, 因此, 目 前研究的针对 ?v?3受体的靶向药物主 要为含 RGD序列的多肽或基于 RGD肽结构设计的小分 子化合物。 ?298? 北京大学学报(医学版) J OURNAL OF PEK I NG UN I VERSITY(HEALTH SCIENCES) ? V o. l 43? No. 2? Apr . 2011 ? 环五肽 cyclo(-Arg 1-Gly2-Asp3-DPhe4-Val5-) 是 早期发现的对整合素 ?v?3受体具有亲和活性的 RGD肽类配体, 以其作为先导化合物, Haubner等 7 将 4位的苯丙氨酸和 5位的缬氨酸用不同的氨基酸 取代, 进行了构效关系研究, 研究结果表明, 4位和 5 位有一个 D构型的氨基酸时亲和活性较高, 4位 D 型氨基酸活性略高于 5位 D型氨基酸; 4位氨基酸 对亲和活性有较大的影响, 当其含有疏水性芳环或 者可能形成氢键的基团时, 会明显提高对 ?v?3受体 的亲和性; 5位氨基酸对亲和活性无明显影响。参 照环五肽 cyclo (-Arg 1-G ly2-Asp3-DPhe4-Val5-) 的结 构和构效关系的研究结果, 我们设计了含有能够形 成氢键的 D-Ser的二硫键成环的 cyclo (-Cys -Arg- Gly -Asp -DSer -Cys -)作为目标 RGD肽的基本序列。 为了提高 RGD肽在肿瘤中的摄取率, 改善药代 动力学性质, 人们对 RGD肽的结构改造和化学修饰 进行了一些研究。研究结果表明, RGD肽的多聚体 比单体具有更高的亲和力 8。对多肽的化学修饰, 包括糖基修饰 9、 亲水性基团修饰 10, 可加快多肽 在正常组织中的清除、 降低肝摄取, 提高肿瘤与正常 组织的靶本比。基于以上研究结果, 本研究将 RGD 肽制备成二聚体以提高对受体的亲和力, 在其分子 中引入 3个亲水性的丝氨酸改善水溶性, 并引入 1 个可用于放射性碘标记的酪氨酸残基和 1个可用 于 99m Tc标记的-Gly -Gly -( D) A la -G ly序列 11, 得到 一个既可用放射性碘标记又可用 99m T c标记的 RGD 肽二聚体。 人神经胶质瘤 U87细胞表面有较高的整合素 ?v?3受体表达, 因此可被用于配体与受体亲和活性 的研究 12。对我们所设计的 c(RGD) 2与 U87细胞 的 ?v?3受体亲和性能研究结果表明, c( RGD)2对 整合素 ?v?3具有较高的亲和力, Ka= ( 0. 137 ? 0 . 057) ? 10 9 /mol/L。用 ChT法标记后经 Sephadex - G10分离纯化, 放射化学纯度可达 95 % 以上; 标记 物的脂水分配系数 lgP正辛醇 /水为 - 1 . 628, 表明 131 I - c( RGD)2具有较好的亲水性, 其在 4 ? 冰箱放置 1 d 及在 37 ? 人新鲜血清中孵育 6 h的放射化学纯度 仍大于 90%, 能够满足放射性药物的基本要求。 以往文献报道的 RGD肽在肿瘤中的摄取率差 别很大, 摄取率不仅与 RGD肽的结构有关, 还与肿 瘤类型有很大关系。尽管新生血管生成是肿瘤的共 同特征, 但不同类型的肿瘤表面及新生血管内皮细 胞表达整合素 ?v?3的水平有很大差异, 因此, 对 RGD 肽的摄取率存在很大差异。本研究中, 131 I - c( RGD)2在静脉注射后 1 h、 3 h 、 5 h与 24 h肿瘤中 的摄取率分别为 ( 0 . 67 ? 0 . 13) % I D /g 、( 0 . 42 ? 0 . 08) % ID/g 、( 0 . 51 ? 0 . 11) % ID/g与 ( 0. 18 ? 0 . 02)% I D /g , 与多数正常组织相比, 肿瘤摄取率相 对较高, 且随着时间延长, 肿瘤与正常组织的靶本比 ( T /NT)增高。静脉注射后 5 h , 肿瘤摄取率即高于 除肾脏、 膀胱和胃以外的其他正常组织, 肿瘤与除 肾脏、 膀胱、 胃和血液外的组织器官的 T /NT 均大于 1 . 4 , 静脉注射后 24 h的 T /NT 均大于 2 。一般显像 要求 T /NT需达到 1 . 4 1 . 9 13, 因此, c( RGD) 2有 可能用放射性核素 99m Tc或 123 I标记, 应用于肿瘤血 管生成显像。从生物分布结果还可以看出, 131 I - c( RGD)2的肾摄取很高, 表明其主要经泌尿系统清 除, 在显像应用中有可能影响肾脏附近肿瘤的检出; 在胃中的放射性计数也较高, 考虑其原因是由于 131 I -c( RGD)2进入体内后有部分脱碘, 脱落的游离 碘被胃黏膜摄取所致, 可通过预先给予非放射性碘 封闭胃黏膜减少 131 I -c( RGD)2的胃摄取。 ?299? 张春丽, 等? 靶向整合素 ?v?3受体的新型 RGD肽二聚体的131I标记与生物活性的初步评价 竞争抑制实验结果显示, 未标记的 c( RGD)2可 明显抑制肿瘤对 131 I -c( RGD)2的摄取, 表明 131 I - c( RGD)2与 ?v?3受体的结合为配体与受体之间的 特异性结合。 131 I -c( RGD)2的一个显著特点是其肝脏摄取 低, 肿瘤与肝脏摄取比值较高, 静脉注射后 1 h肿瘤 与肝脏摄取比值即达到 2 . 1 , 静脉注射后 24 h此比 值可达 3 . 05 。表明在多肽分子中引入亲水性的丝 氨酸可减少其肝脏摄取。通常, 未经化学修饰的 RGD肽的肿瘤与肝脏摄取比值较低, 如 H aubner 等 14用125 I -c( RGD-D-Tyr -Va- l )分别对荷 M21黑色 素瘤、 骨肉瘤和 MaCaF 乳腺癌的动物模型进行研 究, 3种肿瘤与肝脏的 T /NT 值在注射后 6 h分别为 0 . 52 , 0. 42和 0 . 54 ; van H agen等 15 用 111 In -DTPA- RGD c( Arg-Gly-Asp -D-Tyr -Lys) 对荷胰腺癌 0948 的动物模型进行研究, 静脉注射后 4 h肿瘤与肝脏 的 T /NT 值为 0 . 79 。由于肝脏体积大, 并且其放射 性清除一般比较缓慢, 因此肝脏对放射性药物的高 摄取会使该药物的显像应用受到很大限制, 131 I - c( RGD)2的肝脏摄取低, 在显像应用中将具有一定 优势。 由于肾脏摄取远高于其他组织器官, 而且采集 方式为定计数采集, 在荷瘤鼠全身显像中仅见肾脏 影像, 其他组织器官采集到的计数很低, 难以清晰显 示, 胸部显像 3 h后可见肿瘤清晰显示, 提示 131 I - c( RGD)2可在注射后较短时间内, 通过局部显像或 断层显像方式, 显示不在肾脏附近的肿瘤。生物分 布与显像结果均表明 131 I -c( RGD)2具有临床应用于 肿瘤新生血管显像的潜在价值。 参考文献 1 黄云鹏. 整合素 ?v?3在肿瘤血管生成中的作用 J. 中国肿 瘤, 2007, 16( 1): 35- 38 . 2 HaubnerR, W esterHJ . 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