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海洋细菌发酵产氨基寡糖素菌种筛选及条件选择研究 摘要 采用几丁质选择性培养基富集和平板培养从北海红树林土样中分离出 可降解几丁质产生透明水解圈的细菌1 2 株，韭从中筛选出一株可降解转化 几丁质、产氨基寡糖较好的菌株( 船0 0 3 ，下同) ，经对其生物学特性和几 丁质转化产氨基寡糖发酵试验，结果表明：该菌株的菌落圆形、湿润、浅 黄；大小为0 5 x 1 - - 2l u n ，革兰氏染色阴性，无芽孢，单根极生鞭毛，可运 动；兼厌气，中温性，生长最适起始p h 7 5 - - 8 5 ，2 5 - - 3 5 ，耐盐，1 6 sr d n a 序列分析显示，该菌株与弧菌( v i b r i o ) 菌属中多株菌株相似性达9 9 。其 在以几丁质为唯一碳源基质的液体培养基，起始p h8 5 ，3 0 。c 的条件下静 置发酵6d ，可产氨基寡糖1 5 3 5m g l ；经对其产氨基寡糖素发酵条件的优 化，试验结果表明：其在配方为：甲壳素1 0g 、蛋白胨5g 、m g s 0 4 7 1 - 1 2 00 6 g 、f e s 0 4 0 0 1g 、k 2 h p 0 40 9g 、k h 2 p 0 40 6g 、n a c i2 0g ，蒸馏水1 0 0 0m l ， p h8 0 的培养基，接种量l ( v v ) 、在发酵温度3 0 、通气量摇瓶转速为 1 2 0r p m 的条件下发酵生产氨基寡糖素，产量可达到7 0 3 5m g l 关键词：海洋细菌分离特征几丁质氨基寡糖发酵条件选择 s t u d yo ni s o l a t i o no fm a i u n eb a c t e r i aa n d s e l e c t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o r p r o d u c i n gc h i t o a m i n o o l i g o s a c c h a r i d e s a bs t r a c t i nt h i sp a p e r , a d o p t i n gs e l e c t i v ec u l t u r em e d i u ma n db r i l l i a n tc l e a rc i r c l e w e r eu s e dt oe n r i c ha n ds c r e e nf o rm a r i n eb a c t e r i as t r a i n s p r o d u c i n g c h i t o a m i n o - o l i g o s a c c h a r i d e sf r o mt h es a m p l e s 12s t r a i n sw e r ei s o l a t e d a s t r a i nw i t hh i 曲c h i t o a m i n o - o l i g o s a c c h a r i d e sp r o d u c i n ga b i l i t y d e s i g n a t e d h b 0 0 3w a sc h o s e nf o rs t u d y i n gi t sp h y s i o g i c a lp r o p e r t i e s i ts h o w e dt h a tt h e c o l o n yo fh b 0 0 3i sc i r c u l a r , m o i s ta n dp a l ey e l l o wi nc o l o r ，n os p o r e ，m o b i l eb y s i n g l ep o l a rf l a g e l l u m ，f a c u l t a t i v ea n a e r o b i c i ti sg r a m n e g a t i v e i t s16 sr d n a s e q u e n c ei sh i g h l ys i m i l a rw i t hv i b r i og e n u s t h eo p t i m a li n i t i a lp hf o rg r o w t h i s8 - 8 5a n dt h et e m p e r a t u r ei s2 5 。c 一3 0 c i th a sn a c ir e s i s t a n c e 1 5 3 5m g l c h i t o - a m i n o o l i g o s a c c h a r i d e sc a l lb ep r o d u c e db yf e r m e n t a t i o no fh b 0 0 3i n i n i t i a l p h8 5 a n d3 0 * cc h i t i nc u l t u r em e d i af o r6d a y s t h ee f f e c t so f c o m p o s i t i o n s o fc u l t u r em e d i u ma n dc u l t u r a lc o n d i t i o n so nc h i t o a m i n o - 一o l i g o s a c c h a r i d sp r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u ma r e ： c h i t i n10g ，p e p t o n e5 g ，m g s 0 4 7 1 - t 2 00 6g ，f e s 0 4o 01g ，k 2 i - i p 0 40 9g ， n k i - - 1 2 p 0 40 6g ，n a c i2 0g ，h 2 010 0 0m l ，p h8 o ；t h eo p t i m a lc u l t u r a l c o n d i t i o n si n c l u d i n gf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，r o t a t i o nr a t ea n da m o u n to f i n o c u l a t i o na r e ：3 0 c ，1 2 0r p m ，a n dl ，r e s p e c t i v e l y t h ey i e l do fc h i t o - a m i n o - 一o l i g o s a c c h a r i d e sc a nb ei m p r o v e dt o7 0 3 5m g l k e yw o r d s ：m a r i n e b a c t e r i a ；i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i s t i c s ；c h i t i n ； c h i t o - a m i n o o l i g o s a c c h a r i d e s ；o p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 1 1 1 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名哥彘 肛6 月肜日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 击口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：净舌导师签名：，4 疲加踔月班日 海洋细1 1 鼍；酵产氨墓寡糖素菌种筛选及条件趋；择研究 前言 氨基寡糖( a m i n o - o l i g o s a c c h a r i d e ) 是壳聚糖和几丁聚糖降解后得到的小分子氨基葡 萄糖聚合物，具有很高的生产价值和功用。氨基寡糖不但因水溶性好而易被分散和吸收， 而且具有多种生理功能，如抗菌抗病活性【1 5 】、抗肿瘤【刀、提高肌体免疫力6 ，8 1 等，广泛 运用于食品、农业、日化和医药领域。 正因为氨基寡糖的应用价值大，市场前景广，近年来对氨基寡糖的研究和开发应用 颇受重视。氨基寡糖素生产工艺主要是利用甲壳素或壳聚糖为原料通过化学、物理或微 生物发酵、酶解转化等方式进行。 化学降解法( 见图1 1 ) 是氨基寡糖工业化生产中最早、最常用的方法。但因化学 法反应条件十分严格，不易控制，后处理也较繁琐，故不够理想，而微生物发酵和酶降解法 具有反应条件温和，寡糖得率高，不易造成环境污染等优点，是氨基寡糖生产的主要方 向。目前，对微生物发酵和酶降解法生产氨基寡糖的研究虽然开展了许多工作，但普遍 存在微生物菌种和酶制剂活力不高、发酵力低、产率不理想、生产成本高等一系列问题。 因此，筛选高效、安全、氨基寡糖发酵力强的菌株，成为生物法生产氨基寡糖的关键。 乙酰化几丁寡糖几丁寡塘一壳寡綮 图i - i 氨基寡糖的化学法生产工艺 根据研究报道，海洋环境中存在许多利用几丁质为碳源生长繁殖的微生物，使海洋 中产生的大量天然几丁质资源进入循环过程，减少几丁质的连续堆积。同时由于海洋微 1 萄胺阶 蕊 葡糖土卜 i 海洋细菌鬟醇产氨墓寡糖繁菌种筛选反条件选择研究 生物生存在含盐较多的海水生境中，具有许多陆地微生物所不具备生物学特征，人们有 可能从中找到特殊的酶和生物活性物质。 基于以上两点，本研究通过简便、快速的筛选方法，试图筛选出可直接利用几丁质 为原料发酵生产氨基寡糖的海洋细菌，并对其发酵条件进行优化选择，为建立简便、高 效、低成本、少耗能、低污染的利用几丁质发酵生产氨基寡糖的开发工艺提供优良菌种 和技术。 广西大掣强炙士掌位论文爿陆举细。膏发醇产氨墓寡翱量r 种翻f 选及条件选择研究 第一章文献综述 1 1 几丁质及几丁质衍生物低聚糖的概述 几丁质( c h i t i n ) 又称为甲壳素，是广泛存在于许多动物和真菌体内，构成其外骨 骼及细胞壁的主要成分。它由n 乙酰基d 葡萄糖胺以6 1 4 糖苷键结合而成( 图1 2 ) ， 是自然界中仅次于纤维素的第二大天然碳源【9 】。水生物圈中，每年有超过亿吨的天然几 丁质产量。但是水中并未出现连续的几丁质沉积，这是因为海洋环境中存在许多可利用 几丁质为碳源，进行生长繁殖的微生物，这类微生物是几丁质的循环中的重要部分l l o l 。 壳聚糖( c h t i o s a n ) 是几丁质脱乙酰化产物，一般把5 5 脱乙酰化的甲壳素称为壳聚糖 ( 见图1 3 ) 。相较于甲壳素来说，壳聚糖可溶于弱酸，更利于被利用等特点。 图1 - 2 甲壳素的化学结构式( n 代表1 2 0 0 0 个分子) 图i - 3 壳聚糖的化学结构式( n 代丧 i 一2 0 0 0 个分子) 几丁质水解产物乙酰氨基葡萄糖( g i c n a c ) 、乙酰氨基寡糖( c o s ) 、壳寡糖( c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e ) ( 主要以氨基葡萄糖及氨基寡糖为主) 的研究已经进行了许多年。近年 来的报道主要集中在几丁质酶的分离纯化、分类、分子生物学研究和几丁质酶结构、几 丁质降解微生物的生物代谢途径研究、几丁质衍生物的酶法生产几个方面。 y e o nj i nc h o i 等【1 1 1 火b a c i l l u ss p 菌株k c t c0 3 7 7 b p 中分离纯化出壳聚糖酶，酶活 最高达至l j l 0 0u m l ，其水解产物主要从壳三糖到壳六糖，运用葡聚糖凝胶和高效液相色 谱控制反应，可获得所需的寡糖的分子量。张立彦等【1 2 1 利用各种微生物酶类对壳聚糖和 3 广西大学司n b 掌位落吁涓陆簪细l m 发酵产氨羞娼曩糖素菌种筛选及条件选择研究 几丁质降解作用的进行研究。赵海田等【1 3 】报导了壳聚糖经水解后形成的低分子量壳聚糖 具有许多独特的生理活性，近年来已成为甲壳质研究领域中热点。并就酶法制备低分子 量壳聚糖的方法进行了综述性报道。陈西广等【1 4 】论述几丁质的自然状态、结构性能、生 物合成、提取方法和衍生物制奋技术的研究状况及其基本性能，使几丁质研究技术有一 个较全面的了解。裘迪红等【l5 l 讨论了甲壳低聚糖的制备方法重点研究了在酸性条件下 过氧化氢对壳聚糖氧化降解的影响，得出了过氧化氢降解法制取甲壳低聚糖的最佳工 艺。魏衍超、杨连生【1 6 1 介绍了甲壳低聚糖的两类制备方法化学降解法和酶降解法并 对甲壳低聚糖的生理活性和功能性质作了简单介绍。郑连英1 1 7 】综述了国内外甲壳低聚糖 研究和应用背景，系统地回顾了利用甲壳资源的历史和现状。着重介绍了甲壳低聚糖的 主要制备方法、性质用途。 1 2 氨基寡糖( 几丁质和壳聚糖的低聚体) 的制备方法 氨基寡糖等几丁衍生低聚糖具有特殊的生物活性，它被广泛运用在医疗、功能食品、 化妆品等方面。其制备方法主要包括化学法、物理法和生物酶法。其中最主要的是水解 法、氧化法、酶解法、超声波降解法。 金鑫荣等【1 8 】介绍了低聚水溶性壳聚糖( 壳寡糖) 的制备及研究进展。段杉等嘲介绍 了低聚壳聚糖的制备方法。胡志鹏【1 9 】介绍了壳寡糖的制备方法和生理功能，并对其应用 进展和市场前景作一综述。韩永萍等 9 1 介绍了壳聚糖降解制备的低聚壳聚糖和壳寡糖具 有许多独特的生理活性。介绍和评述了酸降解法、氧化降解法、酶降解法以及复合降解 法等各种制备方法的研究进展。袁向华等【6 】介绍了氨基寡糖的制备方法及功能应用。 y o u j i nj e o n 等【2 0 】介绍了化学法和酶法制各几丁质和壳聚糖的寡聚体。并介绍了其在功 能食品上的应用。李邦良等 2 q 介绍了解决壳聚糖的水不溶性的方法，拓宽壳聚糖的应用 范围。其方法是直接用过氧化氢对高分子量、高脱乙酰化度的壳聚糖进行非均相降解、 制备了水溶性甲壳低聚糖产品，对产品进行红外光谱结构表征，并用高效毛细管电泳测 定了寡糖的聚合度，探讨了温度、过氧化氢浓度对降解所需时间、产品得率及甲壳低聚 糖聚合度的影响。叶眉等 2 2 1 获得甲壳低聚葡萄糖胺的各种方法。邹超贤 2 3 1 介绍了低聚糖 的用途和生产情况等，重点介绍甲壳低聚糖的酸降解、酶降解和超声波降解等制备方法。 姚婉生等 2 4 1 介绍了近年来关于几丁寡糖制备方面的研究进展情况，对化学降解法、物理 降解法、酶法及其它方法的实验结果和优缺点进行了分析，探讨了几丁寡糖制备的产业 化前景。黄丽萍、刘宗明【2 5 】介绍了几丁寡糖、壳寡糖在几个领域的应用并介绍了制备方 海洋细曹墩翻 产氨基寡捌h 舞菌种硼i 选及条件逸舅 研完 法。夏文水等【2 6 】详细分析了甲壳低聚糖的制备方法：如化学法、酶法、葡基转移法、 物理法等，包括具体技术特点和产品类型，介绍了国内外近年来这方面研究的新进展。 张立彦等1 2 7 1 介绍了各种酶对几丁质的降解作用并进行了综述。严钦等口8 1 介绍各种制备氨 基寡糖的方法，研究进展。 化学法虽然是现今世界上最普遍的工业生产几丁质衍生类低聚糖的方法，但由于它 易产生有毒副产物污染环境危害人体，因此，酶法逐渐的成为生产制备几丁衍生类低聚 糖的主要手段。 1 3 酶法制备氨基寡糖的研究进展 酶过制备几丁类寡糖，主要是通过不同种类的酶作用于不同的底物进行的。如几丁 质酶作用于几丁质，壳聚糖酶作用于壳聚糖等等。这些酶存在于各种不同的微生物、动 植物中，人们对于几丁质酶及壳聚糖酶的研究也从未间断： 蔡静平等【2 9 1 利用假单胞茵进行了发酵生产氨基寡糖素的研究，研究其发酵生产的最 佳条件，结果在其最佳条件下产量稳定在4 51 tm o l m l 左右，产率达3 1 。l ，l a r ai s a b e l 等【3 0 】通过分离得到的根瘤菌r h i z o b i u m 野生型菌株g r h 2 中具有能够产生多样脂质几丁 寡糖( l c o s ) 硫酸盐和非硫酸盐的等位基因，生产该脂质几丁寡糖( l c o s ) ，发现其多 为5 碳寡糖，少数为6 碳寡糖，它可以诱导根系的形成和根的变形。c h o i ，y e o nj i n 等 对壳聚糖酶产生菌k c t c0 3 7 7 b p 中分离的壳聚糖酶进行纯化及特性研究，优化培养条 件使壳聚糖酶活性由1 2u m l 上升到1 0 0u m l 。最大酶比活可达1 7 0 0u m g 其产生的壳 寡糖在壳三糖到壳八糖之间。k e y h a n i 等 3 1 , 3 2 1 研究了海洋细菌弗尼斯弧菌的几丁质代谢， 其中包括了两个周质水解酶、一个甲壳糊精酶和一个1 3 - n 乙酰葡萄糖苷酶，对这些酶 的基因及蛋白表达进行研究。b a s s l e r , 等【3 3 1 对海洋细菌弗尼斯弧菌( i 巧b r i o f u r n i s s i i ) 降解 代谢产几丁寡糖进行研究。k i t t u r , 等【3 4 】从曲霉中分离的具有多聚半乳糖醛酸酶活性的果 胶同工酶在适当条件下降解壳聚糖，获得低分子量的壳寡糖( 8 6 ) 、几丁寡糖( c o s ， 4 8 ) 及单糖( 2 2 ) 。对其进行抗菌活性分析，发现六碳几丁寡糖比几丁五糖、几丁 四糖、几丁三糖及二糖具有更显著的抑菌作用。该寡糖混合物较之壳聚糖对大肠埃希菌 及蜡状芽孢杆菌具有更好的杀菌作用。g o t o h ，等1 3 5 1 对丝素蛋白改性和几丁寡糖的制备及 特性进行研究。l a u r a 等【3 6 】采用l e c a n i c i l l i u m f u n g i c o l a 几丁质酶水解几丁质生产几丁寡 糖，从c 1 和1 3 几丁质中获得的最大几丁寡糖浓度分别是2 7 7m m o l l 和4 4 4m m o l l 。 g r a h a mw 【3 7 】进行了微生物降解几丁质和壳聚糖的生理学研究。l i n 等3 8 1 利用了固定化 淘蚌细菌裳醇产氨基寡粳女苗种筛选及条件选择研究 木瓜蛋白酶制备几丁寡糖，产量是原来的1 0 倍，最大生产几丁寡糖量为2 4 7 9 5m g l 。 韩宝芹等【3 9 】乙酰丙酮法测定甲壳胺寡糖数均分子量，比传统的铁青化钾稳定准确。c h e n g 4 0 1 利用曲霉几丁质酶大规模生产壳寡糖。杜昱光等【4 1 1 通过两轮有效紫外诱变，获得高产 壳聚糖酶突变株，得到一定量的壳寡糖。逢玉娟等【4 2 】通过探讨专一性降解几丁质或壳聚 糖的几丁质酶或壳聚糖酶。对筛选株进行培养条件研究得到其筛选株的发酵液酶活为 1 7 0 4u m l 叶淑红等【4 3 】从天然土样中筛选出产壳聚糖酶的野生菌株6 株。将其中一株高 产壳聚糖酶的微生物菌株b k 2 用发酵酶液降解壳聚糖制备壳寡糖。并对壳寡糖的抑菌 性和溶解性进行研究，结果表明壳寡糖对一些常见细菌、霉菌、酵母菌等微生物的生长 均有不同程度的抑制作用，它在微酸性的条件下，溶解性及抑菌性较好。曾嘉等m 】采 用从自然界中筛选的壳聚糖酶对壳聚糖进行降解制备壳寡糖，并对其酶促反应的影响条 件进行研究，获得2 9 聚合度的壳寡糖。s h i m o d a , 等【4 5 】以几丁质及几丁寡糖为底物，用 降解几丁质的海洋细菌o k 2 6 0 7 外切酶转化生产b 1 , 6 - ( g i c n a c ) 2 ( n - 7 , 酰氨基葡二糖) 。 利用转糖机作用可使乙酰氨基葡二糖得到5 9 6 产率。z h i s h e nj i a 等m 】对降解壳聚糖产 氨基四糖并对其进行抗菌活性的研究。k i l n 等1 4 7 】酶法生产几丁寡糖及其生物活性的研 究。1 1 t i n a 等【4 司乳酸中水解壳聚糖。k u r o i w a 等删固定化壳聚糖酶连续水解壳聚糖生产 具有生物活性的壳寡糖，确定其最大反应速率及最大转化率。k o h k ia k i y a m a 等唧】以几 丁三糖为底物，利用溶菌酶转糖基作用催化生产几丁寡糖及部分脱乙酰基的壳寡糖，最 大生产量分别为5 0 1 0 0i ig r r d 。s a m a i n 等【5 l 】通过在大肠杆菌中表达编码几丁寡糖合成 酶和几丁寡糖脱乙酰基酶的基因n o d c 和n o d b ，高产5 - n 乙酰基几丁五糖及其脱乙酰基 衍生物5 - n 乙酰基几丁五糖。产量高达1 5g l 。t r a n 等【5 2 】运用光解聚作用制备壳寡糖， 并对其所得片段进行生物活性研究，发现其中一种可溶性片段在10 0p p m 浓度下可抑制 真菌的生长。v a x m n 等【5 3 】介绍了一种利用1 3 c 的分配，识别降解后的壳聚糖混合物( 包 括乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖) 的还原端和非还原端。用溶菌酶水解平均聚合度为3 0 ， 含0 6 8 的高度乙酰化壳聚糖，发现其新产生的还原端和非还原端都集中在乙酰氨基葡 萄糖上，从而发现了溶菌酶上d e 和e l 两个特异位点。该核磁共振( n m r ) 的新方法给 我们提供了研究壳寡糖完全水解及其寡糖产物分离和特性研究的高效省时方法。a i b a 5 4 1 利用几丁质酶水解壳聚糖，并乙酰化产物制备n 乙酰几丁寡糖。j c o n 和k i m1 5 5 】采用 二级反应装置以壳聚糖为底物连续生产几丁寡糖。该二级反应装置包括一个超滤膜反应 器和一个转载固定化酶的柱反应器。并可由不同大小的膜分离不同的几丁寡糖片断。严 金龙等【5 6 】综述了甲壳低聚糖的制备方法，并详细介绍了甲壳低聚糖的特性研究及其在食 g - 西大学硕士掌位论文海洋细苗发醇产氨t g x g l - g l i l t 种筛毒。及条件选择研究 品医药工业等方面的应用进展。王霞等吲介绍了酶法制备几丁寡糖并分析了其优缺点。 王风琴【5 8 】介绍了甲壳低聚糖化学法生产工艺。通过正交法确定生产条件，获得回收率为 8 0 脱乙酰度为9 3 2 的产品。h o r o w i t z 等嗍氨基寡糖分制备。k u k 等唧l 利用从 a e r o m o n a ss p g j 18 分离得到的温度敏感型壳聚糖水解酶制备n 脱乙酰壳二糖。以几丁 质为底物无需加酸预处理，直接获得产品，利用率最高达到9 4 9 。k u k 等1 6 i j 以几丁质 为底物利用从a e r o m o n a ss p 纯化的几丁质酶选择性制备n 乙酰基d 氨基葡萄糖及n 脱乙酰基几丁二糖。乙酰基葡萄糖胺酶和脱乙酰基几丁二糖水解酶的稳定温度不同，可 根据其不同的温度敏感性制备两种不同的产物。何新益等【6 2 】研究了以氨基葡萄糖盐酸 盐( g a r ) 为原料、乙酸酐为酰化剂制备了n 乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 。着重考察了反应 时间、酰化剂量、p h 值以及溶剂极性对n _ 乙酰化反应的影响。同时通过一系列的纯化 处理，得到了n a g 精制品。研究结果表明：反应时间影响较小；当n h 2 和a c 2 0 的摩 尔比为l ：4 ，在吡啶为溶剂的碱性环境下n 乙酰化反应得率较高，达7 0 。n a g 精制 品的结构通过红外图谱、熔点等进行确证。邵健等【6 3 】在中性条件下采用双氧水对脱乙 酰壳多糖进行氧化降解，制备了分子量为1 0 0 0 左右的药用低聚氨基葡萄糖。讨论了不 同的双氧水浓度，配比温度和反应时间对降解反应的影响，并用傅立叶红外分析表征了 产物的结构。王士奎【6 4 】以b e a u v i e r i ab a s s i a n al b 9 3 0 菌作为氨基多糖降解菌，以c a n d i d a s p l b 5 0 菌作为氨基糖转化菌，建立了氨基多糖生物降解及转化模型，并与纯培养比较。 粘度下降比率提高了2 3 0 ，可溶性糖含量增加1 6 7 7ug h a 。二菌混合生长时呈互生关 系。王士奎、杜声亮等【6 5 】采用微生物发酵技术制备的氨基糖寡聚体a s o x 呈白色( 或粉 红色) 粉末状，在p h 值7 - - - 1 4 范围内，最大溶解度为2 5 ， 游离氨基含量和脱乙酰度 分别为5 5 6 和6 1 6 ，相对粘度( nr ) 和比浓粘度( r ls p c ) 分别为0 0 3 和0 0 6d u g 。红 外光谱分析证明a s o x 的结构和底物相似，偶氮法分析证实a s o x 结合微量氨基酸类 物质。张虎等【_ 7 l 介绍了几丁寡糖壳寡糖的生理功能和制备方法。藤少辉等 6 6 1 报道了鞘 氨醇单胞菌c j 一5 菌株在以几丁质为碳源的培养基上生长时，既产生几丁质酶又产生壳 聚糖酶利用其发酵液进行抑制真菌，促进植物生长等生物活性的研究并探讨了其作用 的机理，发现c j 5 菌株的几丁质发酵液具有抑制番茄枯萎病菌，促进水稻扩叶生根的 效果，显示了潜在的防治植物病原菌及促进植物生长的能力。王士奎、王汉潜1 6 7 】综述了 几丁质降解的生化途径和几丁质降解菌的分布，微生物降解几丁质的应用研究进展。王 扬等 6 8 1 对用酶法制备几丁寡糖和壳寡糖研究现状与进展进行了综述。几丁质酶、壳聚 糖酶、溶菌酶和n 乙酰葡萄糖胺酶等专一性的水解酶及糖酶、蛋白酶、脂肪酶等水解 蔫睁簟细曹- 譬l l g ；产氨蓉寡稠h 女苗种筛选及条件选择研究 酶对几丁质和壳聚糖都具有部分或完全非专一性水解作用。介绍了这些酶类的作用机理 及相关微生物的种类和作用条件。吴志刚等 6 9 1 从浙江省土样中分离出一株产几丁质酶 的好氧菌，经鉴定该菌属于气单胞菌属( a e r o m o n a s 够) ，命名为c j - 5 菌株经研究发现， c j 5 菌产生的几丁质酶是一种诱导、分泌型酶，其产酶的最佳发酵条件为：起始p h 7 0 ， 温度为3 0 c ，几丁质底物质量浓度为2 2 5 ，培养基装量为三角烧瓶总体积2 0 在3l 发酵罐中进行了扩大培养，发酵液的最高几丁质酶活力为0 4 1u m l 。该酶的酶促 反应最适温度为3 6 c ，最适p h 为7 0 。在进一步的研究中，还发现c j - 5 菌株是一株 产双酶的菌株，既产几丁质酶，又产壳聚糖酶。邢荣娥掣7 0 l 综述了甲壳寡糖的应用及 制备。 可见对几丁类寡糖的研究在国外起步早，且研究的深度和广度都比国内的要深， 而随着人类面临的能源和环境危机越发的加剧，对于研究开发出无污染、又解决能源危 机的产品刻不容缓。 1 4 氨基寡糖的应用前景 自从1 8 世纪6 0 年代末发现壳聚糖以来，就有许多关于其物理化学特性的研究，直 至上世纪7 0 年代开始，科学家们渐渐将矛头转向了凡丁质及其衍生物的应用上面。由 于其具有多种功能，被广泛的运用在各个领域：食品、化妆品、生物医药、农业、环境 保护及废水处理等方面。然而，作为一种无毒无致敏性的生物材料，壳聚糖虽然具有广 泛的应用价值，但由于其不溶性往往局限了它的应用。而其水解产物一壳寡糖，由于它 具有低粘度可溶于水的特点，今年来也引起了人们研究的的极大兴趣。 几丁质的低分子衍生物大多具有较强的抗菌作用，并且对人体无害。因此对于低分 子量的几丁质衍生物如乙酰氨基寡糖及氨基寡糖的抗菌研究成为近年来研究的核心问 题【1 。5 7 1 渤】。以下举几个国内研究的例子： 胡志鹏【1 9 】介绍了壳寡糖的制备方法和生理功能，并对其应用进展和市场前景作一综 述。韩永萍等【9 】报道了壳聚糖降解制备的低聚壳聚糖和壳寡糖具有许多独特的生理活性。 介绍和评述了酸降解法、氧化降解法、酶降解法以及复合降解法等各种制备方法的研究 进展。刘幸海等 9 0 l 评述了壳寡糖在植物生长调节( 诱导抗性) 、杀菌作用以及杀虫活性 方面的应用，表明壳寡糖是对环境友好的、良好的生物源农药。竺国芳等【9 1 l 简单介绍几 丁寡糖和壳寡糖的制备并对其在抗肿瘤、抗感染、作为双歧杆菌促生长因子、作为植 物调节剂、降血脂等方面的功能及产生机制研究进展作一综述。杜昱光、白雪芳【9 2 1 介绍 海洋细- o r 发酵产氨基寡捌h 女1 0 - 种筛选及条件选择研究 了低聚氨基葡萄糖是具有调控植物生长、防治植物病害、调节人体免疫、抑制肿瘤等功 能的寡糖原料产品。应用低聚氨基葡萄糖研制的生物农药“好普对水果、蔬菜病害的 防治效果达到8 0 以上，研制的保健食品“奥利奇善胶囊和“派其安 胶囊具有调 节免疫及促进排铅的作用，已实现产业化。夏文水等【9 3 】对甲壳低聚糖的水溶性、保湿 性、吸湿性以及抑茵作用进行了研究。郝林华等i 9 4 3 论述了国内外功能性寡糖的研究进 展和应用。讨论了寡糖的主要生理功能及其提取、分离纯化和结构分析的方法，介绍了 近年来其在食品、饲料工业、农业及医药上的应用及开发前景。y o u - j i nj e o n 等【9 5 】对三 种不同分子量类型的几丁寡糖的抗茵活性研究。刘明河等i 】描述了甲壳低聚糖对日常生 活中特别是食品中一些常见的细菌、霉菌、酵母菌等具有抑菌作用，其抑菌率明显超过 对照组，相应最小抑菌质量浓度为1 1 0g l ，随着甲壳低聚糖质量浓度的增加，抑菌作 用逐渐变强。该文还探讨了甲壳低聚糖抑菌活性与溶解性之间的关系，结果表明甲壳低 聚糖的抑菌活性与氨基质子化有关。杜予民【9 7 】介绍了甲壳素是地球上的第二大再生资 源，具有生理适应性、可完全分解性、多功能反应性、立体结构与手性、可再生性与亲 水性。近年来，甲壳素在生物医用和环境友好功能材料方面取得了一些进展；由甲壳素 经化学降解和酶解而生成的甲壳低聚糖也广泛应用在医药品、农用化学品、保健食品及 化妆品中；甲壳素降解后生成的氨基葡萄糖也应用于生化试剂及医药中间体的合成。其 他包括许多品种的甲壳素衍生物均在工业、纺织、食品行业和环保方面获得广泛应用。 纵伟等【9 8 】综述了甲壳低聚糖具有抗菌、抗肿瘤、调节肠道菌群、抗氧化、降血糖等多 种保健功能。 1 5 展望 开发应用几丁寡糖壳寡糖是甲壳质行业的制高点，也是当今生物制药技术的一个亮 点。目前壳寡糖产品的年需求量在60 0 0 吨以上，其科研开发主要集中在日本、韩国等国 家。2 0 世纪9 0 年代末，酶法生产壳寡糖在日本、韩国实现了产业化。我国对该产品的 研究起步较晚，近年来趋于活跃，作了大量的工作。2 0 0 2 年8 月，山东济南海得贝公司利 用复合酶法制备壳寡糖的生产线正式投产，壳寡糖在我国第一次实现了产业化生产。方兴 未艾的壳寡糖产业将加快中国生物技术发展的步伐。 另外，对几丁低聚糖的化学研究包括分离、检出、结构鉴定、顺序测定以至合成，目 前尚缺乏有效手段，远不如蛋白质、核酸所达到的研究水平。加强对不同分子量甲壳低 聚糖与生物活性的构效关系的研究，了解其生物功能所对应的最佳分子量范围，建立新 g - 西大掌硕士掌位论文海洋细笛发酵产氨墓寡疆爱菌种筛选及条件选择研究 的分离技术，采用有效的新方法，这些方面的研制与开发都应提到十分重要的位置上 来。 综上所述，对几丁寡糖、壳寡糖的应用开发目前刚起步，尤其是酶法的研究更是兴盛 起来，对其研究也应继续加强。首先应该是继续筛选酶活高、底物特异性强的菌株，使某 一种几丁寡糖或壳寡糖的产量较高；其次是应深入研究酶的催化机理，并应用于对酶的改 造；最后，应大力开展酶法制取几丁寡糖、壳寡糖的新技术，利用虾、蟹壳这一丰富的自然 资源，降低开发成本，为其工业化生产创造条件。 广西大学硕士掌位论文镧陆攀细1 r 发酵产氨墓寡糖素菌种鲥t 选及条件选择研究 2 1 材料 第二章材料与方法 2 1 1 菌种来源 从北海山口红树林自然保护区海滩采集土样分离筛选。 2 1 2 培养基 2 几丁质胶体的制备：称4 0g 几丁质溶于2 0 0m l 浓盐酸中，待全部溶解后。边 搅拌边倒入盛有5 0 0 0m l 自来水的容器中，静置过夜，让胶态几丁质自行沉降。用虹吸 管吸去上清液，加自来水重新悬浮，如此反复洗涤5 次，再用蒸馏水洗涤3 次，纱布过 滤以除去较大的颗粒。最后所得几丁质悬液的p h 为6 o 6 5 。几丁质富集培养基：几 丁质粉末3 0g ，蛋白胨o 5g ，n a c l2 0g ，自来水1 0 0 0m l ，p h 自然； 几丁质胶体固体培养基：2 几丁质胶体2 0g ，蛋白胨2g ，k 2 h p 0 47g ， m g s 0 4 7 h 2 00 5g ，k h 2 p 0 4 3g ，f e s 0 4 0 0 2g ，琼脂1 8g ，n a c l2 0g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， p h7 0 ； 氨基寡糖素发酵培养基：几丁质粉末log ，m g s 0 4 7 h 2 00 6g ，f e s 0 40 0 1g ，k 2 h p 0 4 0 9g ，k h 2 p 0 4 0 6g ，n a c l2 0g ，蒸馏水1 0 0 0m l ，p h8 5 ； 生理测定葡萄糖培养基：葡萄糖l og ，n h 4 c i3g ，m g s 0 4 7 h 2 00 6g ，f e s 0 40 0 1 g ，k 2 h p 0 4 0 9g ，k h 2 p 0 40 6g ，n a c i2 0g ，蒸馏水1 0 0 0m l ，p h7 0 。 2 1 3 仪器与试剂 2 1 3 1 主要仪器设备 7 2 1 分光光度计、隔水式电热恒温培养箱、生化培养箱、电热恒温水浴锅、x s 2 8 d 生 物显微镜、离心机、p c r 仪、电泳仪等。 2 1 3 2 药品试剂 配置培养基的部分药品为生化试剂，其余试剂均为分析纯 2 2 方法 广西大学司n b 掌位论文奠陆i | j 细苗发酵j q 艮基寡糖素菌种筛选反条件选舅 研究 2 2 1 氨基寡糖素的测定 可溶性小片断氨基寡糖及d 氨基葡萄糖单糖在碱性条件下与乙酰丙酮反应形成色 原，其在酸性溶液中与对二甲氨基苯甲醛反应成红色，其颜色程度与氨基糖质量分数呈 线性关系。用分光光度法测定质量分数。 标准曲线的绘制： 称取0 0 2 5gd 一氨基葡萄糖胺盐酸盐( 精确至0 0 0 0 2 9 ) 于2 5m l 容量瓶中，用水定 容至刻度，作为储备液，从储备液中吸取5l i l l 溶液于1 0 0m l 容量瓶中，用水定容至刻 度，冰箱保存，标准溶液浓度为5 0ug m l 。 分别取d 葡萄糖胺盐酸盐标准溶液0 、o 5 、1 0 、1 5 、2 、2 5 和3m l 加入试管中， 按表2 1 依次加入各种试剂。以0 号试管为空白，在5 3 0r i m 处测o d 5 3 0 值。经换算可得 出o d 5 3 0 值与相应的d 葡萄糖胺盐酸盐浓度的标准曲线( 见图2 1 ) 在一定条件下，打开分光光度计预热2 0m i n ，待仪器稳定后调零( - - 次调零) ，比 色皿首先用少量待测液洗一次，然后注入待测液至比色皿体积的4 5 ，用吸水纸吸净比 色皿外表的水珠，在5 3 0 n m 下。测出吸光值( a ) 。以质量浓度( c ) 为横坐标，以吸光 度( a ) 为纵坐标，绘制标准曲线。 表2 - id _ 氨基葡萄糖胺盐酸盐标准曲线 t a b l e2 1t h es t a n d a r dc u r v eo f d - a m i n o - g l u c o s o 试管号0 l23456 d 葡萄糖胺盐酸盐 标准溶液体积( 1 l 也) h 2 0 ( m l ) e 液( m l ) 沸水浴 冰浴 无水乙醇( m l ) p 液m l 振荡 放置( 2 0 - 2 5 ) 0 0 o 5 1 o1 52 02 53 o 5 04 54 03 53 02 52 0 1 0 2 5r a i n 冷却到0 * c 3 o 1 0 均匀 lh 蔼皓i 鼻细- m - - 鼍l l g 产氨基寡捌h 女曹种筛选及条件选蝈 研究 乙酰丙酮溶液( e 液) ：取1m l 乙酰丙酮于2 4m l 碳酸钠( 0 5 m o f l ) 溶液中。 对二甲氨基苯甲醛溶液( p 液) ：称取0 8g 对二甲氨基苯甲醛溶于3 0m l 乙醇浓盐 酸( 1 ：1 ) 溶液中。 e 液和p 液均需临时配置 图2 - 1d - 氨基葡萄糖的标准曲线 f i g 2 - 1t h es t a n d a r dc u r v eo f d - g l u c o s a m i n e 2 2 2 菌体生长量的测定 7 2 1 分光光度计6 0 0 姗下测定培养液中的o d 6 0 0 值，以初始o d 6 0 0 调零，终止o d 6 0 0 表示菌体生长增长量。 2 2 3 液体菌种的制备 将纯化过的斜面菌种接种到种子诱导培养基中( 配方同氨基寡糖素发酵培养基) ， 3 0 c 静置培养约5d ，o d r , o o 值约为o 6 5 时即为液体菌种。 2 2 4 产氨基寡糖素海洋细菌的分离筛选 2 2 4 1 生产氨基寡糖素海洋细菌的富集培养及分离初筛 广西大掣啊炙士学位论文稿哼簟细菌发酵产氨墓寡拥舞菌种筛选及条件翅海习阳电 分别称取分离样1 0g 加入1 0 0m l 的无菌水中打碎，制成悬液，再各吸取lm l 接 种到1 0 0m l 几丁质富集培养基中，在3 0 ( 2 ，1 2 0r m i n 振荡富集培养，约培养7d ，待 培养液浑浊后吸取1m l 培养液适当稀释涂布于海水几丁质胶体固体平板上，3 0 培养 3d ，挑取有几丁质透明水解圈的菌落进行分离纯化培养获得分离株。 分别将分离株接种到1 0 0m l 几丁质富集培养基中，3 0 ，1 2 0r m i n 培养3d 培养 取培养液点入矽o 5c m 滤纸片放在几丁质胶体培养基平板上，经培养后，量取各个菌株 溶解圈与菌落的圈径比( d d ) ，选取圈径比较大的菌株为初筛菌株。 2 2 4 2 生产氨基寡糖素海洋细菌的复筛 将初筛得到的菌株继续接种到1 0 0m l 几丁质富集培养基中，3 0 。c ，1 2 0r r a i n 培养 7d 取培养液测定氨基寡糖素的含量并选取氨基寡糖素产量高的菌株作为筛选菌株。 2 2 5 筛选株形态观察 按照常规方法，在平板培养基中观察菌株的菌落形态、在固体几丁质胶体培养基中 观察菌株几丁质水解圈情况。在光学显微镜下观察该菌株的细胞形态并测量细胞大小， 并检查革兰氏染色和鞭毛染色结果。 2 2 6 筛选菌株的生理试验 将筛选菌株在半固体培养基中进行穿刺培养，以确定筛选菌株对氧气的需求情况。 制备筛选菌株的种子液，分别在1 0 0m l 生理测定葡萄糖代替培养基中以不同浓度的 n a c i 、不同起始p h 、不同温度的条件下，2m l 接种量3 0 静止培养( 温度实验除外) 2 4h ，用7 2 1 分光光度计6 0 0n l n 波长下测定o d 6 0 0 。 2 2 7 筛选菌株生长曲线的测定 接种2 “种子液于氨基寡糖素发酵培养基中，每隔一段时间分别测定培养液中的 菌株生长量及p h ，绘制筛选菌株的生长量和培养液中p n 值随时间的变化曲线。选择菌 株生长达到稳定期的时间作以下试验。 2 2 8 筛选菌株的分子生物学鉴定 2 2 8 1 提取筛选菌株的总d n a 将筛选菌株接种于1 0m l 的l b 培养基后，过夜培养，取1 5m l 培养液于一灭菌 e p 管，1 2 0 0 0r p m 离心1m u l ，弃去上清液，收集菌体，加入3 0 皿d d h 2 0 打匀菌体。 加4 0 0l t t l 或6 0 0 此裂解缓冲液( l y s i sb u f f e r ) 。用微量吸管快速吹打，使其混合。加裂 解缓冲液一半体积的5mn a c l ，混匀后，1 2 0 0 0r p m 离心1 叽1 5m i n 。将上清液移至另 一灭菌e p 管，加入等体积氯仿，轻轻颠倒数次混匀，直至形成奶状溶液。1 2 0 0 0r p m 离 1 4 厂西大掌硕士掌位论文嗣哼簟细菌发酵产氨墓寡糖素菌种筛选及条件选择研究 心6m i n ，吸取上层水相至另一灭菌e p 管。加2 倍体积无水乙醇离心沉淀d n a ，用7 5 乙醇洗沉淀2 3 次，室温静置干燥，溶于5 0 山i x t e 或d d h 2 0 中。 2 2 8 2 筛选菌株1 6 sr d n a 的p c r 扩增 p c r 反应体系：模板( 筛选菌株的总d n a ) 0 5i ll 1 0 b u f f e r5l il p r i m e ri ( f 2 7 )2i ll d n t p4l il p r i m e ri i ( r 1 4 9 2 )2ul e x t a q o 5 l ll d d h 2 03 6i ll t o t a l5 0pl p r i m e ri ( f 2 7 ) ：5 a g a g r 丌g a t c a t g g c t c a g 3 p r i m e ri i ( r 14 9 2 ) 5 t a c g g t t