（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥ltp3基因的功能分析.pdf

摘要 动物、植物和微生物体内厂+ 泛存在类可与疏水脂肪酸、磷脂及乙酰辅酶a 等结合并实现酯 类跨膜运输的小分子蛋白，根据其结构和功能特点被命名为酯转移蛋白( 1 i p i d t r a n s f e r p r o t e i n ) ， 简称l t p 。此类蛋白属于多基因家族，其不同家族成员问在诱导、表达利功能上存在很大差异。 最近的研究表明，该家族可能在植物微生物互作过程中起重要作用。 法国农业科学研究中心的y m a r c o 的研究小组通过拟南芥r j d 胁n 口口n m 植物病原菌互作 系统对拟南芥进行表达谱分析，其中l t p 3 基因在植株表现为病级i ( d i s e a s ei n d e x i ) 时表达量提高 了约3 5 倍，另一个l t p 4 基因的表达增强了7 0 倍。通过网上基因芯片数据分析可知l t p 3 基因 也可被其他一些病原菌所诱导。n o r t h e r n 吸印杂交结果表明干旱、a b a 、高盐等逆境都诱导了 l t p 3 基因的大量表达。同时，在r s o l a n a c e a r u m 接种却3 突变体的试验中，对被测忉j 突变 体的3 次r s o l a n a c e a r u m 接种实验显示：与野生型相比发病迅速且地上部分萎蔫症状明显较严 重，确定其表现型为增强感病，l t p 3 基因可能在植物抗病途径中起着正调控作用。拟南芥蛔3 突变体种子在含有1 4 p m a b a 和1 5 0 r a m n a c l 的m s 培养基上萌发明显延迟，另外在含有1 7 0 m m n a c i 的m s 培养基上勋3 突变体与野生型植株相比对渗透胁迫敏感性降低即更耐盐。在时片失 水试验中，f p 3 突变体叶片失水率明显低于野生型叶片，在随后的气孔观察中发现却3 突变体气 孔紧闭。n o r t h e r n 吸印杂交结果表明未经处理的砌j 突变体a b f 2 基因组成型表达，而野生型中 却没有。种种结果显示l t p 3 基因参与到植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫反应当中。 植物在长期的进化过程中形成了一套非常完善的适应不良环境的机制，同一信号刺激能引发 不同的信号传递途径，各信号途径之间存在复杂的交叉转导作用，对l t p 3 基因在植物抵御生物 胁迫和非生物胁迫中功能的分析，不仅对l t p 类基因的功能提供宝贵信息，而且对于揭示不同环 境胁迫信号途径交互作用的分子机理，具有重要的科学意义。 关键词：酯转移蛋白、l t p 3 ，生物胁迫，非生物胁迫，拟南芥 中国农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t l i p i dt r a n s f e rp r o t e i n ( l t p s ) i sak i n do f s m a l lp r o t e i n si na n i m a l s ，p l a n t s ，a n dm i c r o o r g a n i s m s ， w h i c ha r ec a p a b l eo f b i n d i n gl i p i d sp h o s p h o l i p i d s f a t t ya c i d sa n da c y l - c o ae s t e r sa n do f t r a n s f e r r i n g l i p i d sb e t w e e nm e m b r a n e si nv i t r o l t p sa r eag r o u po f r e l a t e dp r o t e i n sw h i c ha p p e a rt ob es m a l la n d u b i q u i t o u si nh i g h e rp l a n t s ，a l t h o u g hs h a r i n gs i m i l a rs t r u c t u r e s ，t h ep r o t e i n si nd i f f e r e n tp l a n t sa n d d i f f e r e n tg e n ef a m i l i e sh a v ed i v e r s i t yf u n c t i o n s ，i n d u c e m e n ta n de x p r e s s i o n s r e c e n ts t u d i e ss h o w e d t h a tl t p sp r o t e i nm a yp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ep l a n t m i c r o o r g a n i s m si n t e r a c t i o n t h ey m a r e o r e s e a r c h g r o u p o f i n r a h a s e s t a b l i s h e das y s t e m o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a r a b i d o p s i s t h a l i a n aa n d r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m b yt h et r a n s c r i p t o m ea n a l y s i s ，w ef o u n dt h a tw h e nt h es u s c e p t i b l ee c o t y p ec o l s h o w i n gd i s e a s ei n d e x l ( 0 - 2 5 l e a v e sw i l t e d ) ，l t p 3g e n ew a rg r e a t l yi n d u c e da b o u t3 5t i m e s a n d l t p 4i n d u c e da b o u t7 0t i m e si nc o lc o m p a r e dt ot h ee x p r e s s i o nl e v e la t2 4 ha f t e ri n o c u l a t i o n w h e n l t p 3m u t a n t sw e r ei n o c u l a t e d ，l t p 3m u t a n t sw e r e m o r es u s c e p t i b l et or s o l a n a c e a r u mt h a nt h ew i l dt y p e ， w h i c hi n d i c a t e st h a tl t p 3g e n em a yp l a yar o l ei nd i s e a s er e s i s t a n c ei nt h ep l a n t - p a t h o g e ni n t e r a c t i o n b y o u r n o r t h e r n b l o t ，t h e l t p 3 9 e n e w a s g r e a t l y i n d u c e d b y d r o u g h t ，a b a a n d h i g hs a l t ，w i t h d i f f e r e n tg e n ec h i pd a t ao nw e b s i t e ，i ts u g g e s t e dt h a tl t p 3i sar e s p o n s i v eg e n et ob i o t i ca n da b i o t i c s t r e s s c o m p a r e dt ow i l dt y p e ，t h eg e r m i n a t i o no f t h el t p 3m u t a n tw a sf o u n ds i g n i f i c a n t l yd e l a y e d o n a b a - c o n t a i n i n ga n dn a c l - e o n t a i n i n gm e d i u mc o m p a r e dt ow i l dt y p e b u tt h el t p 3m u t a n t ss e e d l i n g w e r em o r er e s i s t a n c et on a c it h a nw i l dt y p e ，t h e nw ea l s of o u n dt h a tt h ew a t e rl o s eo f l i p 3m u t a n t l e a v e sw a sl o w e rt h a nw i l dt y p ec o l - od u r i n ga6 ht i m ec o u p s e , f u r i h e ro b s e r v a t i o ns h o w e dt h a tm o s to f t h el t p 3m u t a n ts t o m a t a sa b n o r m a l yc l o s e dw h i l et h a to f w i l dt y p eo p e n i n g ，a n dt h ea b n o r m a l i t yo f t h e s t r u c t u r e o f g u a r d c e l l so f l t p 3 m u t a n t w a so b s e r v e d ，b y n o r t h e r n b l o t ，a a b a a c c u m u l a t i o n m a k e rg e n e a b f 2s h o w e de x p r e s s i o ni nl t p 3m u t a n tw i t h o u ta n ys t r e s st r e a t m e n t ，w h i l en oe x p r e s s i o nd e t e c t e di n w i l d t y p e a l ld a t a b a s es u g g e s t e dt h a tl t p 3g e n ep l a y e di m p o r t a n tr o l e si nb i o s t r e s sa n da b i o a t r e s s r e s p o n s e ，a n ds o m e h o w t h i sa b ai n d u c e dg e n ep r o b a b l yr e g u l a t e dt h ea c c u m u l a t i o no f a b ai np l a n t p l a n t sh a v ee v o l v e dc o m p l e xm o l e c u l a rm e c h a n i s m sb yw h i c ht h e yt o l e r a t ea n da d a p tt oa d v e r s e g r o w t hc o n d i t i o n sf o rs u r v i v a l as i n g l es t i m u l a t ec a np r o d u c td i f f e r e n ts i g n a lp a t h w a y s ，t h e r ei sm u c h o v e r l a pi nt h e s ep a t h w a y s b a s e do nt h ed a t a w e v eg o t ，i tw i l lb ev e r yi n t e r e s t i n gt oi d e n f i f yt h el t p 3 f u n c t i o ni n v o l v e di nd i f f e r e n ts t r e s sr e s p o n s e si np l a n t s k e y w o r d s ：l i p i dt r a n s f e rp r o t e i n ，a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，l t p 3 ，b i o s t r e s s ，a b i o s t r e s s i i 中国农业大学硕士学位论文缩略语 缩略语 a b f 2 a b i t e a a ： a m p ： b a r b p ： b s a ： c a m v 3 5 s c d n a ： d n a ： d t t ： e c o l i ： e b ： e d t a ： g ： h r ： 姒 i p t g ： i ( b k d a ： l ： 三印 m g ： m l ： m o p s ： t u r n a ： n g ； n t ： o d ： o l i g o ( d t ) ： p c r n a ： r p m ： r t p c r ： s d s ： t a e t r i s ： a b r eb i n d i n gf a c t o r a b ar e p o r te l e m e n t a m i n s oa c i d a m p i c i u i n b a s r ar e s i s t a c eg e n e b a s ep a i r b o v i n es e r u ma i b u m i n s c a m v 3 5 sp r o m o t e r c o m p l e m e n t a r yd n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d i t h i o t h r e i t o i e s c h e r i c h i ac o l i e m i d i u mb r o m i d e e m y l e n ed i n i t r i l o t e t r a c e t i ca c i d g r a m h o u r 3 i n d o l v la c e t i ca c i d l s o p r o p y l t h i o - b - o g a l a c t o p y r a n o s i d e ：k i l ob a s e p a i r k i l od a l t o n l i n e l i p i dt r a n a f c rp r o t e i n m i l l i g r a m m i n s u t e m i l l i l i t e r 3 - n m o r p h o l i n o - p r o p a n e s u l f a n i ca c i d m e s s e n g e rr n a n a n o g r a m n u c l e o t i d e s o p t i c a ld e n s i t y o l i g o d e o x y t h y m i d y l i ca c i d p o l y m e r a s ee h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d r o u n d sp e rm i n s u t e r e v e r s e - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i n md o d e c y ls u l f a t e s e c o n d t r i s - a c e t i c9 1 a c i a l _ e d t a t r i s ( h y t d r o x y m e t h y l ) a m i n s o m e t h a n e 独创性声明 y 9 3 8 3 2 6 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签各7 搿 时间w 年月，j 同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 时间：，年钿j 扫 时间：o ( 钳厂月 中嚣拳馥大学磷士牮证论文 第举文献综洼 零i 畜 媾一章文献综述 饕特异憷鼹藤转簿簧秘瀚n s 辞蟒嚣el i p i dt r a s t s f e rp r o t e i n 弗s l t p ) 楚鼹警蘧麓中荣遴存在游 类激蛀龌鑫成，早期髂步 磷究发现撼犍l t p 可每月肫酸、媾瓣器己虢辅酶a 摺续台，实现黯类 的踌膜运输。阑戴罄遍试为京参与生物蠛的含成。z p 属。p 茹麓函黎族，丽家族的不同醴爨在 袋这辏式、霹髓熬姥姥襄灞控土表瑰凄懿发雾态热。l t p 残褴魏薅海靛露稿霉蓬雩鼹囊蠡壤、爨 獭骧藤藩侵袭秘颞膀发商等潋摇鞠美，毽其貔褥翦 确戆的荧蒙尚不清楚。1 9 9 4 年t h o m a 簿人 ( t h q i 照蓬鞋或，1 9 9 4 ) 遗建搽挝杂交等事羧发现窀主鬻存在予撞鞠气生帮癸鹣袁疫爨串，进参壤 脆学水平上的澎健研究又震糯它存张予植物绷藏辫中，馥捺测它鳟糍鸟裰糖角葳念壤、抵黼瘸黢 蘩爱袭等臻穗窍基( k a d e r , e t # ，1 9 9 7 ) 。豫了在结梭嚣簿形戏避程孛珊辘熬掺翻癸，密予莱魑l t p 鏊鞭鹩表达爨瘸骚嫠嫒絷的强燕诱韶，捺测l t p s 辫耱在撼豹对瘸溅落的膀盟反戚巾扮演罄要角 瞧( m o l i n a a n d g a r e i a - o l m e d o , 1 9 9 3 ；j t m g 嚣a 1 ，2 0 0 3 ) 。遴露掰煮錾嚣l t p 蕊毽 羹苜戆茹辕耪秘魏 遴拣磷关( d u r u me ta l ，1 9 9 8 ；k a d e re ta l 。，1 9 9 7 ；t r e v l n oa n dm a ，1 9 9 8 ；j u n g 麟a 1 ，2 0 0 3 ； 鸶南搽秘s 毛嚣黼。曛a i 。2 0 0 3 ；w u 2 0 0 4 ；o o n o r a 瓣2 0 0 5 ；e 蠲2 0 0 6 ) a l 。l 植物姆臻原越的甄作 拣戆在妖黧豹避健建程牵，露嚣攀舔熊谣j | 、掇撬舞鞣檄垒镑懿俊鬻。槎羲耀糕互辫嫡麴莛 阉滤 e 过程牵，穰秘逐渐辩藏系列凝杂谣孝子乏蒋散豹傈护梳南来抵辩瘸蔗徽生物羽侵祭。裢秘 对瘸赋物的摧摭，表现为几种不同解途径。一方霹，植物本舞酶菜黧结构群障和纯攀硪份爨裔挠 薅赫秘能。辩黉辩缨耱藏熬撬震、辩鼷、捡矮、拳藏索最蒋撩匏气张缭褪祷；曩赣摇枣势予撬臻 物斌，影响瘸原物细胞遁性的噩自满毒口核糖体必游搬白等( j e f f e r yl d a n g le ta 1 2 0 0 1 ) 。舄外。植物 还讶迸过诱导产生的敲歪茨赢来抵御瘸蘸秘瓣橙絷；主要趣耩潇性毓的释艘、防受蒸潲表遮，避 壤囊艨通母蝌糕基w r e s p o n s e h r ) 、系魏蓑褥抗瞧( s y s t e m a t i c a c q u i r e d r e s i s t a a i c e s a g ) 及瀵尊赣 抗程( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e i s r ) 嚣( f e y s a n d p a r k e r 哦a 1 ，2 0 0 0 ；n u r n b e r g e r a n d b u r f l n e g 械 a l ，, 2 0 0 2 ) 。滔牲壤的释皴楚豁圭对瘸艇晕期的抗蠛藏应之，冀终耀髂瑷程g 起艟熊臻构凝蠢的 鬣诧变联，擞活髓耱肉一藏麓蔓基颡麓裘这。瓣辩骄究较多静防歪蕊嚣主饔蠢：渗浸德僳素段零 震豢叟锈合成麴茭键酶纂鞠，饕聚耱蟹酶、儿丁爨承瓣酶塾鼹，禽羟髓甄跛麴糖蛋囟( h r g p ) 鏊因， 宦会嚣氨馥的糖蛋自f a 揍函，璃鞭相慕骚出萋嘲，强艇一些功8 & 泰知的与防趣赢应谢哭盼 e d n a 等。 f l o rf 1 9 7 1 ) 嘏瓣甄酶对镳蕴，l 、辨特器撬蟪麴疆辩提出了鏊麓对熬鞠暇漉。其熬砖内窑照s 蛹 爨菇薅寄主教黄臻分寒簿冬幂亲嚣联辩类型，荣豢海革亲秘瘸嚣髂分鬟禽霉性蒸爨( 豫 秘舞毒鏊 囡似，索和与不亲和寄奎箭剐禽撼藕藻困力和虢瘸基囡e 鳓。警携a v r 罄黼馥瘸淼棒鸟携霹蒸 露熬衡主要谁黠，二卷衰溪季亲蟊，姆寄生褒理撬蘸牲；冀戆3 释缎台粼褒瑶燕亲鞠，鄂簿主撼 爨。逮一缓谶襁戏了璐奄毙骥痪骧体嚣毒羹瓣。# g e 嘲萃f l 攘锄撬瘸蒸圜螺g e n e ) 悯论基础。抗 中国农业人学砸i 学位论文第一章立献综述 病基因可能具有以下功能或特点：其产物可识别无毒基因产物配体，通过信号传递最终引发一系 列胁卫反应；抗病基因是组成型表达的，随时可抵御痛颞的侵染：抗痛基因具有迅速进化的能力 2 ) ，其e p l t p 3 基因的诱导表达在感病植株表 现为病级i ( d i s e a s ei n d e x l ) 时提高了约3 5 倍，另一个t p 4 基因的表达增强t 7 0 倍。见图1 - 9 。使用 实时荧光定量p c r ( r e a lt i m eq u a n t i t a t i v ep c r ) 对其表达模式进行验证结果如图l - l o 所示。 图1 - 9 使用生物芯片方法检测l t p 基因表达模式( 胡剑博士) n d ( r r s i 鼬：对r s o l a n a c e a r u m 菌具有抗性的拟南芥野生型 c o l ( r r s i 国：对r $ o l a n g l c e a r z t m 菌敏感的拟南芥野生型 o h r 2 4 h r 后接种 d i ：d i s s e i n d e x l ，0 - 2 5 叶片萎蔫； d 2 ：d i s e a s ei n d e x 2 ，2 5 5 0 叶片蒌蔫： d 3 ：d i s e a s e i n d e x 3 ，5 0 7 5 叶片萎蔫； 0 4 ：d i s e a s ei n d e x 4 ，7 5 一1 0 0 9 6 叶片萎蔫 c o l n d 中国农业大学碗士学位论文 第一章文献综述 臻 2 5 0 0 j2 0 0 0 c ；t 5 0 0 2 釜i o o o 。 l 5 0 0 q 061 22 4叭d 3 061 22 4扪l 】： t i = epoiiilti=o p o ! n t 图i - i o q - p c r 分析l t p 基因表达模式( 胡剑博士) n d ( r r s i 册：对r s o l a n a c e a r t l m 菌具有抗性的拟南芥野生型 c o l ( r r s i - 3 3 ：对r s o l a n a c e a r u m 菌敏感的拟南芥野生型 0 h r - 2 4 h r 后接种 d l ：d i s e a s e ：i n d e x l ， d 2 ：d i s e a s ei n d e f 2 d 3 ：d i s e a s ej n d e x 3 ， 1 3 4 ：d i s e a s ei n d e 。x 4 ， o - 2 5 n t 片萎蔫； 2 5 5 0 叶片蒌蔫i 5 0 7 5 叶片萎蔫： 7 5 1 0 0 n r 片萎蔫 1 4 3 坳3 突变体在植物与微生物互作中的表型( 胡剑博士工作) 在拟南芥一r s o l a n a c e a r u m 互作体系中，青枯菌株g m l l 0 0 0 进行拟南芥根部接种后5 1 0 天左 右，c o l 出现典型的枯萎症状，表现为感病，而n d 。l 表现抗病，自始至终未出现青枯病症状。对 被测坳j 突变体的3 次r s o l a n a c e a r u m 接种实验显示：与野生型相比发病迅速且地上部分萎蔫症 状明显严重，确定其表现型为增强感病( 见图1 - 1 1 ) 。 州4 薹3 ；2 喾1 0 矿一 勺b咕 9 d a ya f t e ri n o c u l a t i o n 周1 1 ll t p 3 突变体接种r s o l a n a c e a r u m 后表现为增强感病 d i ：d t s 删s ei n d e ! x l ，0 - 2 5 叶片萎蔫( 5 天) ： 1 7 2 ：d i s e a s e i n d e x 2 ，2 5 - 5 0 叶片萎蔫( 9 x ) ： d 3 ：d i s e a s e i n d e x 3 ，5 0 - 7 5 叶片萎蔫； 1 3 4 ：d i s e s s ei n d e x 4 ，7 5 1 0 0 时片萎蔫 1 6 _ 一n d l 卜_ c 0 1 - 0 一t t p 3 螋兰 我 f 】撰凝，三，即基毽霹麓终为瘸挥发震过趣中熬囊调控强子或抗瘸转里反疲熬正调控因子发 挥作用，其功能的缺失学致植株表现为植株病棵发展迅速，植株防卫反应基因滞聪表达或受到抑 制。 1 4 2 本研究的目的和意义 尽管l t p 基因在辩量反应中捧凳器程或努豹律翔旗示这些蛋鑫w 缝参与棱锈) 毒生耱耱遮期 非生物胁迫j 宄性耐性殿应，但一赢以来没有赢接证据来阐明n s l t p s 介导植物抗瘸防卫反应殿抗 逆的分子机理。本研究顶丑选择拟礴芥对生物胁迫和非生物胁迫的应管反应，作为研究l t p 熬网 奔寻茬物撬簇薅至反应耩渗透魏遥癍答爱寝分子辊瑾戆一个模式系绞，垂l 蠲爰肉避传学靛手段， 深入研究受瘸原菌且s o l a n a c e a r u m 诱导的l t p 3 基因介导植物抗病防m 反应和渗透胁迫应替艇应 的功能和特性。项目的嵬成不仅对z p 类基因的功能提供窿贵的信息，还将提供舟导不同环境胁 追信号途羟交互传瘸魏分子辊瑾，其有重要豹荤萼擎意义。 2 1 实验材料 2 1 1 德物材辩 第二章材料与方法 实验中所使用的主要植物材料是拟南莽( a r a b i d o p s i st h a l i n a n ) 。 c o l u m b i a ( c o l - 0 ) 生态型和n d - i 生态型：由法困i n r a 攘穗与镦生匏囊作所y v e sm a r c o 实验室提供。 妇3 突变体：以野生型材料中c o l - ( 为背景通过i ：d n a 插入处理、筛选、纯纯获褥。突变 俸材辩购鑫于美国俄袤俄确立大学羧毒芥生物资源中心。 2 1 。2 蘩类糖秘 大肠杆菌( 丑c o i l ) d h s o 根瘤农杆菌g v 3 1 0 1 来自农业生物技术国家重点实验室。 2 1 3 实验所需试剂及其配制 鹱鞋弧a 魏提取： 溶液i ； 5 0m m 葡萄糖，2 5 m mt r i sh c i ( p h 8 o ) ，1 0 r a me d t a ( p h 8 0 ) ，高压灭菌。 滚滚i l ： o 2 mn a o h ，i s d s ，现用现黼，贮备液0 ，4 mn a o h 和2 s d s 分开配制。 溶液i i i ： 5 m o l l 己酸镑6 0 0 m t ，溶乙酸tl , s m l ，鸯羹表定窖至1 0 0 m l ，凝瑶减麓溶液孛镩豹浓度为3 m o l l ，乙 酸根的浓度为5 m o l , i 。保存于4 ，用时置于冰浴中。 大荔抒蘩感受态蠲熬豹捌备帮转佳： 8 0 r a mc a c h 溶液，商压灭菌。 植物萋蔽缀d n as d s 法提取缀；串渡： 1 0 0 r a mt r i sh c i ( p a 8 o ) ，7 0 0 m mn a c i ，5 0 r a me d t a ( p h 8 o ) ，1 5 s d s ，1 0 m mp - 巯基 乙醇。 植物总r n a 提取 r n a 提取b u f f e r ：5 0 r a mt r i sh c i ( p h 9 o ) ，1 0 0 m mn a c l ，l 。o s d s 。 8 ml i c i ：称取3 4 9h c i ，定溶予1 0 0 m ld d h 2 0 ，高压灭菌。 串禹农溉：蜒掌顽士学挺论文第二章材料写方法 n o r t h e r j a 杂交 变毪滚： 0 5 mn a o 辩+ l 。s mn a c l 。 奎x 嚣s 8 , 糕0 r 1 7 5 0 3 9 n a c l ，8 8 2 9 攘黢兰镶，落醉 e t o ，窝褰婪l 舞嚣蔫鹾装蕊。 c h u 黼h 杂交波： | 嚣蠢s a ，i o m m 嚣蹬a ，巍5 酗鹣醺鞣p 0 4 7 2 e 1 0 x * 0 鹣魄溶b u f f e r ： 称取6 9m o p s * 3 , 4 9n a a e3 h 2 0 * 瘸n a o h 调p 薹摧乞0 嚣，怒 l 蚀矗巍5 鞯e d t a - 跫睿惩 5 0 0 m t ；慈蒸夏蘧。 t o x al o a d i n gb u f f e r ： 5 0 - t t 浊+ i n 止 i e d t a ，o 2 s 澳酶艇。 各种辩袋试裁 p o e mt - - e a 姆 v e c t o r 赡予p r o m e g a 公礴lp c r 萼l 甥瘫主海璧墨，兰薅掣公黼媛 隈铡糗 蠹饔醚，述骥臻等臻鑫t a r a k a 公霹；荻簸嫒试裁蠡黪鑫晨鸯鞋栈凳霹；i p t g 、x - g a l 、戆葵蓦， 稼臻瀚，豫辩锤、甄卞膏霉褰( a m p ) 、母郑蒜索( k a n ) m s 麓带脊霉索e b 、硫酸瘴大霉 索( 堪姻) 、剿疆举( r i d 譬撼嫩索戡致糗物激素a b a 、t a a 、s a 、m j 戎越趣s i g m a 公递， 蒸它试裁辩蕊鑫蕊鑫瓣感豁梗建厂褰帮公霉；瓣旁巍辫裴台蘩辫公嚣；避褥。 2 1 4 鬻蘧簿葵落襄装滚憋懿灏 l b 藏蒋蒸( 1l ) l 簧自黪l 麓， 辩母撩鼗黪5 蛰 n a c i l o 鐾tp w l o 嚣嚣蟪葵鼙毒魏熬1 5 9 臻粼黻，离藩泛装 m s 瓣黪舔( 1 l ) ： 辍s 麦爨嚣紫l 器嵇； n h n k n 0 3 k 冀2 p 0 4 m g s 0 4 7 i i l o c a c h2 h 2 0 鹾s 窳鼙嚣豢( j 糟嵇 糕 h 3 b o t 最强 1 9 9 l 魏 3 + 麓 4 a g 强鹅3 9 0 6 3 9 ! 里窒些盔兰硕士学靛论文 第二章 材料与方法 m n s 0 44 1 h o 2 。2 3 9 z n s 0 47 h 2 0 o 8 6 9 n a 2 m 0 0 4h 2 0 0 0 2 5 9 c u s 0 45 1 1 2 0 0 0 0 2 5 9 c o c h6 h 2 0 o 0 0 2 5 9 铁盐( 1 0 0 倍) f e s 0 47 h 2 0 2 7 8 9 n a 2 e d t a 3 7 3 9 m s 有机( 2 0 0 倍) 潮酸 o 。5 9 盐酸哦哆醇 o i g 盐酸硫胺素019 驻酵 2 0 9 甘氨酸 0 4 9 混合后加入： 蔗蕤 2 0 9 琼脂8 9 用蒸馏水定容至1 l ，用i m o u l n a o h 调p h 德s 8 。6 0 曩予突变钵表型筛选 l 冬渗透珞莽莲嚣方 ，7 0 酶，殴上溶液翅灭菌麴d e p c - - d d h 2 0 配制，承镶帮黪，氯傍，无农艺簿， r n a s e - - f r e ed n a s e ，r n a s ei n h i b i t o r ，不同大小的离心管、枪头用d e p c d d h 2 0 浸泡3 7 。c 过夜，灭 茁。研钵、药匙1 8 0 烘烤大于8 小时。 b 、热酚法勰取植物惑r n a i 、5 - 1 0 9 ( 1g ) 材料液氮研磨lo 1 5 m i n ，直至呈粉末状。待液氮刚刚挥发，马上加入已预热的6 5 c 戆5 0 m l 尖癔壤心管( 2 m l 裹，警) 中，内装已混好熬r n a 抽爨b u f f e r l 3 m l ( 6 5 0 u 1 ) 秘苯f 黔7 m l ( 3 5 0 u 1 ) 。 5 0 r n l r n a 抽提b u f f e r 中禽有： i mt r i s - h c l ( p h 9 ，o ) 2 5 m l 4 m n a c l1 , 2 5 m l 1 0 s d s5 m l d e p c h ，o4 1 2 5 m l t a l5 0 m l 2 、剧烈振荡1 0 m i n 3 、加入氯仿8 m l ( 4 0 0 u 1 ) 抽提l o m m 4 、4 0 0 0 r p m ，4 c 离, l l , 2 0 m i n ，酝上潦约1 5 m l ( 7 0 0 u 1 ) 5 、加等体积氯仿，振荡1 0 m i n ，4 0 0 0 r p m ，4 0 ，离心2 0 r a i n 6 、取上演，加l 凸体积的8 ml i c i ，4 1 2 过夜沉淀 7 、4 c ，1 0 0 0 0 r p m 离，t j , 2 0 m i n ，留墩沉淀 8 、7 0 乙醇洗一次，光水乙醇洗一次，吹干或抽干 9 、用灭菌的d e p c - d d h 2 04 0 0 t t l 溶瓣r n a 沉淀 l o 、取i 瞳，缒1 豹r n a 常规电泳，梭翱完整褴。若2 8 s r n a ：1 8 s r n a 介子1 5 - 2 ：1 ，继续菪续l 二 中国农业大学硕士学位论文第二章材料与方法 作，否则重新提取。 l l 、用d n a s e 处理，在4 0 0 u 】r n a 溶液中加入以下混合物： r n a s ei n h i b i t o r3 u 1 d n a s e5 l l o x r n a s e f r e ed n a s eb u f f e r5 0 1 d e p c - d d h 2 04 2 1 t l rna溶液4001 t o t a l 5 0 0 p 1 3 7 水浴，2 0 3 0 m i n 1 2 、抽提蛋白，苯酚一次，酚仿( 等体积比) 一次，氯仿一次，剧烈振荡1 2 0 0 0 r p m 4 c ，1 0 r a i n 分别离心。其中有机溶剂和r n a 溶液的体积比都是1 ：l 。 1 3 、取上清，加入3 v 无水乙醇和1 1 0 v3 m n a a c ( p h 5 2 ) 7 0 * 0 放置过夜，可长期放置。 1 4 、1 2 0 0 0 r p m ，4 c ，离心，2 0 m i n 。 15 、沉淀用7 0 乙醇洗一次，无水乙醇洗一次，吹干，至沉淀山现干燥裂缝。 1 6 、溶t - d e p c h 2 0 5 0 “l 一1 0 0 i _ t l 。( 而后分装，每管2 0 “l ，保存于- 7 0 c ，备用) 。 1 7 、取l 山稀释到1 0 0 1 ，测o d 2 6 0 、o d 2 8 0 ，计算浓度 4 1 0 d 2 o d 2 浓度( i t g m 1 ) = 4 8 + o d 2 6 0 + 稀释度 比值介于1 + 8 2 0 合适 1 8 、取1u l ，跑1 的r n a 常规电泳，检测完整性。 2 2 1 1 反转录p c r ( r t - p c r ) 反应体系及步骤：采用2 0 p m 体系 第一阶段：模扳r n a 5 a l 、o l i l g o ( 1 0 r a m ) t 2 山、d n t p ( 1 0 m m ) 2 m 、h 2 0 5 “l 混匀后7 0 c 变性5 m i n 迅速冰浴5 r a i n 。 第二阶段：在冰浴后的体系自l ：i x , 5 x b u f f e r 4 p m 、r n a s el 小、r n a - i n h i b i t o rl 州混匀后4 2l 小时 后9 5 c 变性。产物稀释十倍作为p c r 反应模板使用。 r t p c r 所用引物及组合( 退火温度6 0 ( 2 ，延伸3 0 s e e ) l t p 3 - 3 l t p 3 - 4 2 4 1 b p 目的基因的扩增：2 5 p 1 的体系 1 0 x p c rb u f f e r2 5 u l d n t p ( 1 0 r a m ) 0 2 5 8 1 正向引物( 1 0 m m ) o 5 1 a l 反向引物( 1 0 m m ) 0 5 1 a l t a q 酶( 5 u i ) o 2 5 u l d n a 样品 1 5 p 1 d d h 2 02 0 u l 中国农业大学硕上学位论文第二章 材料与方法 反应程序： 1 ) 9 4 2 ) 9 4 3 ) 6 4 4 ) 7 2 5 ) 7 2 ) m l n ： 3 0 s e e 3 0 s e e lm i n 1 0 m i n 2 2 1 2n o r t h e r n 杂交 a 总r n a 的变性电泳、转膜 ( 1 ) 配制含有甲醛的1 ，2 变性凝胶：1 2 9 琼脂糖，加7 2 m ld e p c h 2 0 ，微波炉融化后，依次加 入1 8 m l 甲醛，1 0 m l 的1 0 m o p s 缓冲液，混匀后倒胶；( 在通风橱中操作) ( 2 ) r n a 样品的变性( 2 5 i | t l 体系】：取2 0 l t g 的总r n a ( 体积不超过1 0 1 ) ，加甲酰胺7 5f t l ， i o x m o p s2 5 山，甲醛2 5 p 1 ，d e p c 水补足至2 5 p l ：混匀后，6 5 0 c ，l o m i n ，迅速置冰上； ( 3 ) 电泳：加入2 5 t di o x r n a l o a d i n g b u f f e r 混匀上样： 1 x m o p s 为电泳缓冲液，进行电泳 分离；先较高电压，待溴酚蓝出加样孔约l e m 后，以电压4 - 5 v e m ，继续电泳5 - 6 小时； ( 4 ) 电泳结束后，用d e p c 水漂洗凝胶数次，以去除甲醛；浸泡凝胶于0 0 1 m n a o h 3 m n a c l 溶液中2 0 m i r a ( 5 ) 剪取与胶大小一致的尼龙膜，以1 0 x s s c 为转移液，毛细管转移法转膜过夜； ( 6 ) 转膜完毕后，用6 x s s c 漂洗尼龙膜，取出吹干或晾干； ( 6 ) 样品的固定：8 0 0 c 烘2 小时；- 2 0 0 c 保存。 b 探针的准备 ( 1 ) p c r 扩增选定的e d n a 克隆，方法同前。回收纯化电泳条带，并定量； ( 2 ) 用p r o m e g a 公司的p r i m e a - g e n e l a b e l l i n gs y s t e m k i t 进行标探针；取回收的p c r 产物2 5 n g ， 用d d h 2 0 补至3 0u l 。沸水中变性5m i n ，冰浴5r a i n 。再依次加入： 5 l a b e l l i n gb u f f e r1 0 9 l d a t g ( o 5m me a c h ) 2g l b s a ( 1 0m g m 1 ) 2p l k l e n o wf r a m e n t s ( 5u n i t “9 1 ) 1 山 - 3 2 p - d c t p ( 1 0v c i p 1 ) 5u l t o t a l5 0 u l 3 7 水浴两个小时以上，沸水中变性1 0m i n ，冰浴1 0m i n ，备用。 c 预杂交和杂交 ( 1 ) 配c h u r c h 缓冲液，含1 b s a ( b o v i n es e r u ma l l o u m i n ) ，lm m e d t a ，0 2 5 m n a 2 h p 0 4 - n a i l 2 p 0 4 ( p h 7 2 ) ，7 s d s ，混匀后预热至6 5 0 c ； ( 2 ) 用5 s s c 预湿杂交膜，将膜有d n a 的一面朝内，卷成筒状放入杂交管中，a n x 预杂交液， 丁6 5 0 c 预杂交5 h r 以上； f 3 1 加入经过变性的探针，6 5 0 c 杂交1 2 1 6 h r ； 中国农业大学硕十学位论文 第二章材料与方法 ( 4 ) 杂交结束后，分别用2 x s s c + 0 5 s d s 、l x s s