（遗传学专业论文）中国果蝇亚属系统发生研究.pdf

摘要 本论文主要对果蝇亚属9 个种组1 7 个种2 5 个单雌系的n d 5 和e s c 基因部分序列测 序分析：n d 5 基因序列中人c ，g t 碱基的平均含量分别为3 2 5 ，9 3 ，1 5 3 ，4 2 6 ，其 中a + t 含量( 7 5 1 ) 较丰富，明显大于c + g 含量( 2 5 6 ) ，表现出明显的a + t 碱基偏嗜。 经比较，在4 1 2 个位点中共有3 0 0 个保守位点，占7 2 8 ；1 0 4 个变异位点，占2 5 2 ；单一位 点3 1 个，简约信息位点9 0 个。e s c 基因序列中a c ，1 3 i t 碱基的平均含量分别为2 5 6 ，2 5 3 ，2 5 4 ，2 4 5 ，其中a + t 含1 ( 5 0 1 ) 与c + g 含量( 5 0 7 ) 大致相等。经比较，在3 9 7 个位点中共有2 4 2 个保守位点，占6 0 5 ；1 6 0 个变异位点，占4 0 ；单一位点5 8 个，简约信 息位点1 0 1 个。 以d m e l a n g a s t e r 为外群，分别用最大简约( m p ) 法、领接( n j ) 法、最大似然( m l ) 法和贝叶斯分析方法根据每个分子标记的序列构建果蝇亚属系统发生树，探讨果蝇亚属 9 个种组的系统演化以及种间进化关系。结果显示：在n d 5 基因所有树都支持b i z o n a t a 种组为单独分支，r o b u s t a 种组和q u i n a r i a 种组关系最亲密，但是在e s c 基因构树中r o b u s t 种组和v i r i l i s 种组关系更亲密，且支持在果蝇亚属中，主要分化为两个中心v i r i l i s r e p l e t a 辐射和i m m i g r a n s t r i p u n c t a t a 辐射与古生物学和区系地理学的证据稳合。 关键词：果蝇亚属n d 5 基因e s c 基因系统发生 a b s t r a c t d r o s o p h i l as p e c i e s f i ee x t e n s i v e l yu s e d i n b i o l o g i c a lr e s e a r c h ；y e t ，i m p o r t a n t p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sw i t h i nt h eg e n u sa n dw i t hr e l a t e dg e n e r ar e m a i nu n r e s o l v e d w e s u b j e c t e da tl e a s t1 7s u b g e n u sd r o s o p h i l at a x at oap h y l o g e n e t i ca n a l y s i su s i n ga 4 0 0 - b a s e p a i r ( b p ) f r a g m e n to ft h ee x t r as c x c o m b s ( e s c ) n u c l e a rg e n ea n da4 1 0 b pf r a g m e n to ft h e m i t o c h o n d r i a ln a d hd e h y d r o g e n a s es u b u n i t5 ( h a 5 ) g e n e a n a l y s e ss u p p o r tt h em o n o p h y l y o ft h eb i z o n a t ag r o u pw i t ht h et o t a ln d 5t r e e ，a n dt h eq u i n a r i ag r o u pi sm o r ec l o s e l yr e l a t e d t ot h er o b u s t ag r o u pt h a nt oo t h e rs p e c i e so ft h es u b g e n u sd r o s o p h i l a ，s u c ha st h ei m m i g r a n s a n db i z o n a t ag r o u p s b u tt h ee s ce v i d e n c et r e es u g g e s t st h a tt h er o b u s t ag r o u pi sm o r ec l o s e l y r e l a t e dt ot h ev i r i l i sg r o u p w ef o u n dt h a tt h es u b g e n u sd r o s o p h i l ai sp a r a p h y l e t i ca n d s u b d i v i d e di n t ot w om a i nc l u s t e r s ：t h ef i r s tc o n t a i n i n gs p e c i e st r a d i t i o n a l l yp l a c e di nt h e v i r i l i s r e p l e t ar a d i a t i o na n dt h es e c o n da s s e m b l i n gs p e c i e so ft h ei m m i g r a n s t r i p u n c t a t a l i n e a g e o v e r a l l ，t h en d 5g e n ey i e l d e dap o o rp h y l o g e n e t i cp e r f o r m a n c e k e yw o r d s ：s u b g e n u sd r o s o p h i l a n d 5e s c p h y l o g e n e f i c 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：宋飘 e t 其 r j ：知。零年f 月力日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：卑鼽 指导教师签名：杏夯选 e l 期：2 负b e 。f1 日期：翮多2 前言 _ - k - _ 一 月i j吾 在达尔文以前，人们认为世界的一切都是上帝安排的。随着达尔文的物种起源 的问世，人们对世界的了解发生了1 8 0 度的转变。生物进化领域里的研究进展日新月异。 自达尔文时代起，许多生物学家都有一个梦想，那便是重建地球上所有生命的进化历史j 并以系统树的形式描述这部历史【1 1 。经典的系统生物学家试图通过化石记录及其形态性 状等方面的特征，来描述一幅进化历史的清晰图像。但化石记录的相对不完整，形态性 状的相对缺乏和其系统学意义的不确定性，在一定程度上限制了这门学科的深入和拓 展。1 9 6 9 年，z u c k e r k a n d l 在生物进化历史的档案一文中指出：罐存在于每一 个生物个体中的d n a 分子都是其进化历史的积累 【2 】。生物大分子蕴涵着极其丰富 的生物进化信息，随着分子生物学的诞生及其技术的不断发展，分子系统学塞门通 过对生物体内大分子的异同分析，来推测生物类群间系统发生关系的学科，也随之应运 而生并呈现出勃勃生机。 分子系统学是指通过对生物大分子( 蛋白质、核酸等) 的结构、功能等的进化研究， 来阐明生物各类群( 包括已绝灭的生物类群) 间的谱系发生关系1 3 1 。相对于经典的形态 系统分类研究，由于生物大分子本身就是遗传信息的载体，含有庞大的信息量，且趋同 效应弱，因而其结论更具可比性和客观性。尤为重要的是，一些缺乏形态性状的生物类 “群( 如微生物和某些低等动、植物) 中，它几乎成为探讨其系统演化关系的唯一手段。 由于分子系统学的上述特点，自其诞生之日起，就逐渐在各种生物类群的系统发生研究 中得到了广泛的应用。总的说来，迄今分子系统学的研究所获得的生物类群间亲缘关系 的结果，大多都和经典的形态系统树相吻合。但是，在一些生物进化谱系不明或模糊关 键环节上，它得出的结果却往往和形态系统学的推测大相径庭。 近几十年来，生命科学和相关学科不断发展和相互渗透，尤其是遗传学、分子生物 学以及生态学的飞速发展和广泛应用，为系统和进化学研究带来了前所未有的发展，也 大大拓宽了系统与进化研究领域的研究范围。从利用传统的形态结构性状、化石证据来 理解生物的亲缘关系以及理解生命的进化历史，到现在利用生物信息大分子( 核酸和蛋 白质) 提供了的大量进化信息，生物学家在重建类群系统发育关系以及在揭示整个生物 进化历史方面取得了前所未有的成绩，并且在遗传多样性保护、生态的保护、疾病的控 制等方面都取得了显著的进展。 。 湖北大学硕士学位论文 1 分子生物学与系统进化研究意义 1 1 分子进化与中性学说 分子进化的研究结果表明，分子层次的进化，呈现一些与达尔文主义不同的特点。 达尔文进化是通过自然选择保存有利变异、淘汰不利变异实现的。2 0 世纪6 0 年代末日 本学者木村资生( k i m u r a ) 和美国学者金( 硒y ) 与朱克斯( j u k c s ) 提出中性进化学说。从分子 水平上考虑大量的变异是中性的、或者近中性的。氨基酸替换的基础是核苷酸替换。其 中同义突变与保守突变( 性质相近的氨基酸之间的替换，并不影响蛋白质的功能) 占突变 的大多数，约7 5 以上。这种突变不改变或者很少改变蛋白质分子的结构与功能，因此 在选择上是中性的。此外由于d n a 非编码区与假基因的存在，以及断裂基因中内含子 的非表达性，使得大多数核苷酸替换呈中性、或近中性。也就是说突变无显著表型效应 ( 如形态、生理、行为等) 或者有表型效应但不影响适应度的改变，因此自然选择只作用 于表型，并不直接作用于分子。这些突变的保存与消失是随机的，因此进化在分子层次 上是随机漂变的结果【】；此外中性学说认为，虽然生物所处的阶梯不同，同源蛋白质 比较研究表明，核苷酸和氨基酸替换的速率却大致恒定。功能重要的分子其核苷酸替换 速率慢于功能次要的分子的替换速率，如1 6 s r r n a 以及用于构建系统发育树的定向进 化同源基因等。因此分子进化的速率是恒定的、渐进式的、不受环境、群体大小、物种 的生殖力与寿命的影响。 1 2 分子系统学与“自然阶梯及万物皆“数” 自从达尔文时代起，许多生物学家都有一个梦想，那便是重建地球上所有生命的进 化历史并以系统树的形式描述这部历史。分子生物学诞生之前，许多生物之间作比较研 究是无法进行的。不仅因为大多个体之间的差别太大，如亲缘关系很远的生物之间就无 法进行比较研究，追踪它们之间的进化关系只好靠一些基本的假定来推论；而且由于微 生物个体太小，技术的落后制约了对微生物的发现、分类及系统学的研究。 分子生物学的发展大大改变了这种局面。首先，所有的生物，不论是细菌、植物和 动物，其d n a 均有相同的四种碱基组成，因而可类比他们的进化关系。因为根据生物 大分子进化的中性学说及其相关证据表明，生物的分子进化速率是相对恒定的，大分子 进化改变的量只和大分子进化所经历的时间呈正相关。换句话说，大分子进化的改变量 2 前言 是进化时间的函数，因而可作为衡量不同进化单位( 例如物种) 之间亲缘关系的指标。从 分支系统学的观点来看，意味着找到了一种能够严格地建立物种之间亲缘关系的通用参 证系统d n a 序列。其次，生物的基因组有很长的核苷酸序列以非常复杂的方式排列而 成，因此相比形态、生理生化性状包含的系统发育信息要多得多。鉴于上述原因，分子 系统学有望澄清生命系统进化树中许多对于经典途径来说极为棘手的问题【5 卅。 古希腊圣哲亚里士多德的“自然阶梯 在两个方面对后世产生了深远的影响。一方 面，自然阶梯上存在着不同等级的生物物种，并且各等级之间存在着比较大的不连续性。 另一方面，则是将各种动植物看作是一大串生物链条中的许多个环节，它们之间的层次 不易觉察而且连续无间。这就是间断性与连续性概念的不同体现。在生物分类方法上， 他们代表了人为分类法和自然分类法两大体系。人为分类法采用少数几个特征来进行分 类，把物种分割为不连续的和界线明显的类群。自然分类法则尽可能地对生物的全部特 征进行考察，以便确定物种在自然阶梯中的自然位置，并充分地看到了物种之间的连续 性。显然以经典的外部形态学特征以及生理、生化特征为标准的分类阶元，如科、属、 种以及更高级的分类阶元的定义常常带有主观性。对同一类群进行研究的两位专家，在 将这一类群归属于亚种还是种或属等分类单元时，判断会很不一致，这是经典的人为分 类法存在的常见问题。较之分类学，系统发育学内存在的矛盾要少一些。因为它首先考 虑的是有机体间的进化关系，而将某一类群归属到一个确定的分类单元等级，则是次要 的工作。 然而，系统发育学与分类学的关系相当紧密，因为有机体的分类位置应反映他们的 进化历史和地位。由此可见，系统发育学对发展系统学的科学基础具有重要的作用，尽 管它不可能解决分类学的所有难题。但由于目前分子生物学的突飞猛进，已经为许多分 类学问题提供了崭新的见解。例如在生物学物种概念中，物种之间是生殖隔离的，即物 种是一个被保护了的基因库。这一概念对动、植物比较合适，但是显然不适合于微生物， 譬如细菌可以质粒或d n a 片断通过接合或转导的方式传递遗传物质，从而使之基因库 发生变化，这种情况在微生物界中应该很常见。 目前，解决这个问题的方法是从分子水平上，以系统学的角度出发，建立一个完善 的自然分类体系，即按照客观存在的不同微生物( 也包括动、植物) 在系统发生上的亲缘 关系来分类，使之分类更趋合理。由于所有生物的蓝图都用d n a ( 某些病毒则用r n a ) 来书写，而d n a 最终又表达为蛋白质来发挥生物学功能，因而人们可以通过比较d n a 和蛋白质序列来研究生物的进化关系。目前常用的基因性特征包括d n a 的g + cm o i 、 3 湖北大学硕士学位论文 d n a - d n a 杂交、d n a r n a 杂交、d n a 指纹分析( 包括r a p d 、r f i p 、a f l p 、s s c p 等技术) 以及物种之间d n a 的同源性、相似性计算、分析等。沃斯( w o e s e ) 认为1 6 s r r n a 序列是用于系统进化即分类研究的最适宜指标，通过对各类生物的1 6 s r r n a 序列进行 分析，并以此为标准构建了三域的生命进化树，即真核生物、古菌、细菌三域分类体系。 这是将生物的基因型特征作为生物系统进化研究及分类研究的主要依据。除此之外，近 几年，越来越多的、进化中保守的生物大分子也被用于系统发育、生命进化及分类学的 研究，譬如d n a 复制和翻译、蛋白质合成以及有关的基因调控等过程在所有生物中都 是相似的，而操纵这些过程的酶、辅酶、r n a 、各种相关因子等，他们的基因序列非常 保守，可以被作为分子计时器或分子钟。从进化的角度来看，这些基因被称为定向进化 同源基因。因为他们是从同一祖先垂直进化而来的基因，在不同的物种中行使相同的、 而且是生命活动所必需的功能。我们将不同种类生物的同源大分子的一级结构作比较， 其差异量( 氨基酸或核苷酸替换数) 只与所比较生物由共同祖先分异以后所经历的独立进 化的时间成正比。分子进化学家依此来构建系统发育树，将不同的物种归属于一个在系 统发育中更为合适的位置，最终建立一个接近于自然的分类体系。所有这些方法无一例 外的要假设一个数学模型，经过数字处理、描述，并最终给出结果，当然在当今信息化 的时代，所有这一切均由计算机及其相关软件处理。例如在细菌d n a 同源性测定中， 我们假定7 0 以上的同源性为同一个种；2 0 6 0 的同源性认为可能是同一个属的不同 种；2 0 的同源性以下为不相关。其他方法大都与此类似，最终将实验数据输入计算机， 通过统计学方法校正后给出结果。具有唯名论背景的数值分类学，也是借助计算机将大 量的表观特征( 包括生理、生化、形态等) 数据化处理，进行数学统计来定义分类单位。 毕达哥拉斯认为，自然界事物性质的多样性其实就是几何结构及数的不同比例的差异， 这就是所谓的“万物的本质是数 这一命题的内在含义。虽然他所说的“数是一种抽 象存在，反映了人的思维对实在的更抽象地把握，但我们也可以理解为丰富多彩的质的 现象，原则上可以全部还原为量的差异。即由于对“量 的抽象，从而掏空了“质 的 存在，所以在本质上可以认为这是一个均匀、单一的宇宙。那么比之于物种分类及其系 统发育，我们可以看出现代分子生物学、数量分类学对于系统进化的研究，其结果的处 理、描述完全是以“数”为标准的。以基因序列的差异作为“量 ，掏空了世间千差 万别的、丰富多彩的物种多样性这一“质。 在生物系统进化研究中，往往以不同的标准( 不同的性状特征) 对同一个物种会得出 相互矛盾的结果，即其系统进化以及分类位置有所不同。也就是说，在物种进化的历史 4 翮舌 中，除了基因突变，由于生物之间遗传物质的交流( 如接合或转导) 很容易发生，使物种 相互之间表现出的性状类似，而不能准确鉴定出其分类归属。要知道，目前由于技术的 限制，我们所了解和鉴定的生物物种多样性可以说是“九牛一毛。利用现代分子生物 学技术，我们可以建立完善的分子系统进化树，这个树上相近的物种是否有可能只有 “量”的差异，而不存在实“质 的不同? 那是否说只有个体不存在所谓的物种呢? 正如 拉马克所说：“如果我们能够将同一系的所有种采集到，那么我们就会发现，物种之间 彼此混淆，我们就无法找到一种方法或语言去区分物种，所谓种、属特征，也只有在采 集不完整的情况下存在。”当然，现在我们似乎已经找到了区分的办法，因为分子系统 学可以帮助我们建立一个令人满意的自然分类体系，但对于如何划分物种，我们仍然不 能给出一个统一的、完美的定义或办法，我们只能拭目以待未来【7 l 。 2 分子系统发生分析 系统发生学是进化生物学的一个重要研究领域，系统发生分析早在达尔文时代就已 经开始。从那时起，科学家们就开始寻找物种的源头，分析物种之间的进化关系，给各 个物种分门别类。经典系统发生学研究所涉及的特征主要是生物表型( p h e n o t y p e ) 特征， 所谓的表型特征主要指形态学的( 结构的) 特征，如生物体的大小、颜色、触角个数， 也包括某些生理的、生化的以及行为习性的特征。通过表型比较来推断生物体的基因型 ( g e n o t y p e ) ，研究物种之间的进化关系。但是，利用表型特征是有局限性的。有时候关 系很远的物种也能进化出相似的表型，这是由称为趋同进化( c o n v e r g e n te v o l u t i o n ) 的过程 造成的。例如，如果一个生物学家按照生物体是否有眼睛来构建进化树，那么他可能将 人类、两翼昆虫和软体动物放在同一个进化组中，因为它们都有光探测器官。在这个例 子中，很明显这三种生物体并不具有密切的关系，在其它特征上有天壤之别，就是它们 眼睛的构造也大相径庭。这说明表型有时候会误导我们，表型相似并不总是反映基因相 似。用表型来判定进化关系的另一个问题是，对于许多生物体很难检测到可用来进行比 较的表型特征。例如，即使用显微镜检查，也难以发现细菌的明显特性。当我们试图比 较关系较远的生物体的时候，第三个问题又出现了，即什么样的表型特征能用来比较 昵? 例如，分析细菌、蠕虫和哺乳动物，它们之间的共同特征实在是少之又少。 随着人们对生物的认识从宏观发展到微观，科学家对物种分类的依据也从宏观上的 形态发展到了微观上的分子，并且有了突破性的进展，系统发生分析进入分子层次。科 学家认为，现今世界上存在的核酸和蛋白质分子都是从共同的祖先经过不断的进化而形 5 湖北大学硕士学位论文 成的，作为生物遗传物质的核酸和作为生命机器的蛋白质分子中存在着关于生物进化的 信息，可用于系统发生关系的研究。在分子水平上进行分析具有许多表型分析所没有的 优势，所得到的结果更加科学、可靠。分子系统发生分析直接利用从核酸序列或蛋白质 分子提取的信息，作为物种的特征，通过比较生物分子序列，分析序列之间的关系，构 造系统发生树，进而阐明各个物种的进化关系。当然，这些分子不仅在序列上保留进化 的痕迹，它们的结构也保留着进化的痕迹。 在分子水平上研究生物之间的关系早在2 0 世纪初就开始了。科学家发现，当把一 个生物体的血液注射到另一个测试生物体中时，产生免疫反应的程度与这两个生物体的 进化关系直接相关，由此最早正确地推断出人和猿比它们和其它灵长类动物有更近的共 同祖先。直到2 0 世纪中期，分子数据才开始被广泛应用于系统发生研究。蛋白质电泳 使得我们可以在一些浅层特征上，如分子大小和电荷，来分离和比较相关的蛋白质。2 0 世纪6 0 年代，蛋白质测序成为可能；2 0 世纪7 0 年代，研究者开始能够获得基因组信息， 特别是d n a 序列。蛋白质序列和d n a 序列为分子系统发生分析提供了可靠的数据。 在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化史是一 个非常重要的问题。一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化过程的顺序， 有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。根据核酸和蛋白质的序列信息，可以推断 物种之间的系统发生关系。其基本原理非常简单，从一条序列转变为另一条序列所需要 的变换越多，那么，这两条序列的相关性就越小，从共同祖先分歧的时间就越早，进化 距离就越大；相反，两个序列越相似，那么它们之间的进化距离就可能越小。为了便于 分析，一般假设序列变化的速率相对恒定。关于地球上现代人起源的研究是一个典型而 有趣的例子，科学家分析了取自世界不同地区许多人的线粒体d n a ，分析结果表明， 所有现代人都是一个非洲女性的后代。线粒体d n a 非常适合于系统发生分析，因为线 粒体d n a 从母体完全传到子代，不与父代d n a 重组。由于d n a 分子非常稳定，所以 我们既可以通过d n a 分析活着的生物，也可以分析死去的生物，甚至分析已经绝种的 生物。当然，用细胞核基因来研究系统发生关系时，遇到的一个严重的问题是，基因常 常会被复制，导致在个体基因组中，一个基因可能有若干个拷贝。在进化过程中，这些 拷贝各自演变，形成两个或更多的相似基因。在对不同物种的基因进行比较时，如果选 择这类基因，其分析结果的可靠性将存在问题。 所有的生物都可以追溯到共同的祖先，生物的产生和分化就像树一样地生长、分叉， 以树的形式来表示生物之间的进化关系是非常自然的事。可以用树中的各个分支点代表 6 前言 一类生物起源的相对时间，两个分支点靠得越近，则对应的两群生物进化关系越密切。 3 分子系统学研究意义 一 随着大量分子数据的日益丰富，运用比较基因组学理论揭示生物物种进化历史研究 已经成为高效的手段，对大多数物种的记录、分类和识别主要靠形态特征，然而很多物 种无法从表型分开，常常遇到趋同进化( c o n v e r g e n te v o l u t i o n ) 等问题1 7 1 ，造成许多分类问 题悬而未决，因此必须开展更深入的研究。分子生物学技术的兴起促进了分类学的发展。 6 0 年代出现了以同工酶和细胞色素c 等蛋白质分子结构为依据的分类学研究。其中以 同工酶对果蝇进行分类的研究最早【踟，随后在很多昆虫的分类和进化研究中得到广泛应 用。聚合酶链式反应和d n a 的指纹技术促进了分子水平进行分类的研究。 分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 是检测、描述并解释生物在分子水平的多样性及 其演化规律的学科。它的研究对象是生物体内的各类分子，借助于生化方法及分子生物 学方法，通过比较不同种、种群、个体的某一种或某一类分子在质和量上的差异，再根 据一定的假设来推测这种分子的进化关系( 分子进化树) ，进而推论生物类群间的演化关 系( 系统发育树) 【9 1 。 一 分子系统学是一门综合性很强的交叉学科。生命系统从分子、细胞、个体、群体、 种、群落和生态系统的不同层次表现出多样性，低层次的多样性是高层次多样性的基础， 高层次的多样性则是低层次多样性的表现，同时每个层次的多样性又有其自身发展的规 律1 1 0 】。其中分子层次上的多样性构成分子系统学的研究领域，具有最基本的意义。分子 系统学的理论基础来源于系统学、分类学、遗传学、比较生物化学、分子生物学和进化 论，其方法来源于免疫学、仪器分析、生物化学和分子生物学。分子系统学以下列一些 基本原理为基础。1 生命的生化一致性和多样性原理：生化一致性表现在所有生物都 具有相似的元素组成、相同的单体构件、相似的遗传、食物利用和能量转化功能等。生 化多样性表现在组成生物体的化合物种类繁多、分子组成和结构变化大。2 生物大分 子进化速率恒定性原理：即“分子钟 假说，以年计时的生物大分子序列的改变速率大 致保持恒定，或大分子序列之间的差异程度与其分歧后独立进化的时间成正比。3 表 信息分子的进化原理：表信息分子是基因型在分子水平上的表现型。4 同源比较原理： 分子系统学上的同源包括直源、并源、外源、并外源和复源。5 样品同质性原理：样 品同质性或称样品均一性，是指一个样品是纯的生物学单位【1 1 】。 几个世纪以来，博物学家和生物学家一直都在对生物多样性进行描述和解释。这种 7 湖北大学硕士学位论文 工程及其结果便是生物系统学( s y s t e m a t i c s ) 。生物系统学是研究生物多样性以及它们中 间的任何一个类群和其他类群的各种关系的科学。系统学的研究是建立在分类学基础之 l 。 上的，而对生物进行分类是人类认识生物世界的第一步。3 0 0 0 年前我国的甲骨文已有了 许多动植物的名称，公元前4 世纪的亚里士多德对动植物的记述，1 6 世纪李时珍的本 草纲目等等都是人类对生物分类的初步总结。1 8 世纪林奈( l i n n a e u s ，1 7 5 8 ) 双名法的 建立为对生物多样性描述和分类奠定了基础，由于林奈这一系统的严谨性、科学性而很 快得到公认，并被进化学家拉马克、达尔文、海克尔( h a e c k e l ) 所采用。1 8 6 0 年海克尔提 出了系统发生( p h y l o g e n y ) 这一概念。研究系统发生的主要任务是探讨物种之间的历史渊 一源以及物种之间的亲缘关系。但早期建立起来的生物系统发生史很少有客观标准。这样 直到上世纪上半叶，人们关注的焦点仍然是物种、物种形成和地理变异而不是生物发生 1 1 2 1 。1 9 4 2 年赫胥里( j h u x l e y ) 出版的进化论的现代综合中仍未出现系统发生这个 词。后来德国植物学家齐默尔曼( w z i m m e r m a n n ) 建立了顶枝学说( t e l o m e t h e o r y ) ，德国 昆虫学家亨尼希( w h e n n i g ) 仓i j 建了分支系统学说( c l a d i s t i y s t e m a t i c s ) 。他们都是基于现 存生物和生物化石的共同特征来概括提炼出一些客观标准来重新构建生物进化史的1 1 2 1 。 6 0 年代开始，新的系统发生数据逐渐积累，计算机硬件和软件的建立，使系统发生学取 得了长足的进步，同时蛋白质和核酸分子结构检测方法得到迅猛发展，并且这些方法很 快被进化学家所接受且采用，这样就产生了一门新的学科一分子系统学。 分子系统学是用分子生物学的技术和方法来研究生物多样性，以及它们之间相互关 系的科学。它主要包括两大领域，即种群遗传学( p o p u l a t i o ng e n e t i c s ) t t - 口系统发生学 ( p h y l o g e n e t i c s ) ，前者主要研究种内分化，后者主要研究物种多样性及种间系统发生1 1 3 1 4 l 。分子系统学( m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ) 是近3 0 年发展起来的- - p - j 综合性前沿学科，它在 分子水平上对生物进行遗传多样性、分类、系统发育和进化等方面的研究，其研究结果 对于保护生物多样性( 尤其是遗传多样性) ，揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意 义i l 列。目前分子系统学主要应用于生物分类学，构建生物分子树或生物进化树。昆虫分 子系统学的研究一是根据蛋白质与酶，二是根据核酸。分子系统学的研究首先是通过现 代分子生物学技术，获得物种特定遗传标记的大量数据，然后把这些数据进行相关的数 学分析而对研究结果进行解释和说明。目前常用的核酸分析方法有d n a 杂交、串联重 复序列数目变异、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性、随机 扩增多态性d n a 、测序和克隆1 1 6 】。蛋白质分析技术中常用的方法有：免疫学技术，同 工酶电泳、蛋白质电泳、氨基酸分析等。染色体分析中常用的方法有：核型分析、带型 8 前言 分析、荧光原位杂交、染色体原位隐藏杂交、引物原位标记、多( 探针) 引物原位标记等， 在上述方法中主要以核酸分析为主。特别是近几年测序技术的推广和普及，自动测序技 术的发展，序列分析技术越来越多的地被采用。核酸序列分析是指通过测定核酸序列来 比较同源分子之间的相互关系的方法。比较不同类群个体的同源的核酸的核苷酸序列， 据此建立分子系统发育树，并推断类群间的演化关系，是目前分子进化和系统发育研究 的热点1 1 6 _ 7 】。数据分析中常用的一些方法有：1 ) 简约法，这种方法旨在确定最短的系统 树，对该树核苷酸或氨基酸的替代总数应取最小值。该方法中影响较大的有最大简约法， 加权简约法和进化简约法；2 ) 距离矩阵法，此处的距离指相对替代率、遗传距离或进化 距离。常见的方法有：不加权成对群算术平均法、f i t c h m a r g o l i a s h 法、转化距离法、邻 接法等；3 ) 最大似然法，以各种假设的进化数学模型对观测结果进行检验，选出具有最 大似然函数的模型构树。常见的方法有l a n g l e y 和f i t c h 法、f e i s e n s t e i n 法等，由于分子 数据由抽样获得，所以在用某种方法获得系统树后，还要用重抽样法来检验校正，常见 的方法有折刀法和自助法。总之，在数据处理时最好用多种方法进行比较，以期获得一 致的结果，提高结果的可靠性。 ， 以前常用的d n a 测序技术是双脱氧链( d d n t p ) 终止法，由于用到放射自显影涉及到 安全问题，现在多采用荧光标记的自动测序仪，而且有供序列比较的软件的开发和应用。 近年来，随着人类基因组计划的开展，在d n a 的序列测定上发生了一系列重大的改进， 国际上最新的如杂交法、质谱法和流动式单分子荧光检测法等。直接测定d n a 序列可 以测出所有的d n a 变异，从而获得最为准确的遗传信息，但是这一技术耗资较大，目 前d n a 样品制备技术和d n a 序列图象的获得及数据分析方法都不十分理想，序列数 据本身存在的多重替换问题、协同进化问题和序列进化速率的变异等问题以及数据分析 中的序列对准方法的不足都使得它目前的应用受到一定的影响【1 s l 。在分子系统学研究 中，用来进行序列测定的靶d n a 序列主要是一些进化上的高变区。如m t d n a 的细胞 色素b 区，李明等通过测定其序列对4 种鹿属动物的系统进化关系进行了研究，王义权 等对几种游蛇的演化关系进行了分析。 一 进入8 0 年代后，核酸的实验操作技术和分析方法上的巨大进步导致了对d n a 和 r n a 差异上的广泛研究，序列分析主要来自核d n a 和线粒体d n a 等遗传物质【1 9 l 。随 着分子系统学的发展，一些有重大意义的问题的解决必将日益紧迫。首先，如何用恒定 进化速率和进化距离来更为准确地估计分歧时间和推断进化历史，是分子进化遗传学中 的一个重要的研究课题。其次，现阶段的分子系统学研究很少把基因组进化与表型进化 9 湖北大学硕士学位论文 联系起来，在今后的研究中，为了追踪从d n a 进化到表型进化的途径，需要研究结构 基因和它们的调控基因间的关系及变化，需要分子水平的比较解剖学和比较胚胎学，分 析蛋白质( 主要是酶) 在结构和功能上如何进化，分析它们在生化调控途径中的组织化如 何出现，以及分析它们在不同组织或不同发育阶段中的表达是如何被调控的，从而将分 子水平与形态水平的研究有机地结合起来【2 0 】。随着分子生物学知识和技术的积累发展， 系统学家已将生物信息大分子看作重要的演化依据，人们在不断寻找新的、有良好检测 功能的分子标记及检测手段，随着技术的不断进步，来自分子方法的数据在不久的将来 可能成为系统学研究最主要的数据来源，并将引起分类、系统、发育和进化研究中的又 一次革命性的变化，而且关于种群遗传结构方面的研究必将为保护生物学提供遗传变异 证据，在生物多样性的研究和保护中起到重要指导作用【8 9 1 。随着分子系统学的形成和 发展，它在生物多样性，特别是在动物的多样性研究中得到了广泛的应用。分子系统树 在分析物种起源与分化中应用广泛，在种内及种间系统进化关系研究中，分子系统学是 应用最广的，利用物种在分子系统树的相应位置以及物种之间的分歧时间，来解决一些 分类问题【2 1 。2 2 1 。在属的水平上应用较多，即对一些物种进行属的归类，分子系统学在动 物保护中也得到应用。总之，分子系统学的产生和发展为生物多样性研究带来了一次突 破，解决了一些颇有争议的问题。 虽然利用一小片段的分子特征构建的分子系统树可能与作为一个整体的种或种群 的系统树不相同，但是通过对有代表性的样本大小的多基因的评估，就能推出种群和近 缘种间的系统进化关系，并且随着基因序列研究的不断深入，人们获得的分子信息量大 大增加，因此在动物系统进化研究中建立使用这些遗传信息的最佳方法就变得愈益重 要，这些将无疑使分子系统学为生物多样性及系统进化研究提供一条重要途径【乃j 。 3 1 分子系统学的研究方法( d n a 水平) 3 1 1 分子标记技术( 间接方法) 3 1 1 1 限制性内切酶片段长度多态性技术 j 限制性内切酶片段长度多态性技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 是8 0 年代中期发展起来的一种d n a 多态分析技术，它将目标d n a 序列经一定数目和种 类的限制性内切酶( r e ) 进行酶切，由于不同的目标d n a 的序列结构( 遗传信息) 有差异， r e 在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变，因而产生相当多的大小不等的d n a 1 0 前言 片段【2 4 1 。然后通过s o u t h e r n 杂交可以把与被标记d n a 相关的片段检测出来，从而构建 出多态性图谱( 较简单的靶序列，如m t d n a 可以省却杂交直接用电泳方法检测) ，进行 系统进化和亲缘关系的分析。 r f l p 分析数据多态信息量大，结果稳定可靠，重复性好，不受环境及物种发育阶 段影响，呈盂德尔遗传，可以有效区分纯合子和杂合子，而且非等位的r f l p 标记不存 在上位效应，只要有探针就可检测出不同物种或个体的同源d n a 分子的r f l p ，对于 物种间亲缘关系的研究特别有用1 2 5 1 。但r f l p 技术对样品纯度要求较高，当样品很少时 要结合应用p c r 扩增，探针的制备很费功夫，标准方法必需先构建e d n a 文库并筛选 出可用作探针d n a 序列，技术路线复杂，而且杂交中存在放射性安全问题，不宜为一 般的实验室所采用。另外，它无法检测靶序列中的重复序列区，多态性检测水平过分依 赖于所选用的r e 的种类和数目，由于不同的r e 识别位点的进化速率不同，因而，对 于不同的进化靶序列，如果选样不当就会导致分析结果出现偏差： 目前在分子系统学中用于r f l p 分析的靶序列主要是基因组d n a 和线粒体 d n a ( m t d n a ) ，其中m t d n a 是系统进化研究的- - + 强有力的工到2 6 1 。尤其是动物线粒 体，因为它的碱基替换速率相对较快，而且高效的单倍体遗传和母系遗传方式减小了检 测时的有效种群大小( e f f e c t i v ep o p u l a t i o ns i z e ) ，提高了遗传漂变的敏感性，是目前分子 系统学上最佳的靶序列，主要用于研究种群的系统发生及群体间亲缘关系，并在许多物 种中得到广泛应用。 3 1 1 2 微卫星d n a 指纹图谱技术 微卫星d n a 也称简单串联重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) ，在所有真核生 物基因组中随机分布，由于重复次数和程度的不同使所在的基因座位呈现一定的多态 性。微卫星d n a 的重复在基因组的进化中起着非常重要的作用，因而，被认为是遗传 信息含量最高的遗传标记，并日益成为基因组分析和分子进化最普遍的工具。在分子系 统学研究中，可以利用某个微卫星d n a 两端的保守序列设计一对特异引物，通过p c r 扩增这个位点的微卫星序列，然后用探针如( g a g a ) 。等寡核苷探针杂交检测微卫星d n a 的变异。 。 微卫星d n a 在基因组中多态性高，并且等位基因数目多，呈等显性遗传，其指纹 图谱有极高的多态性，结果稳定可靠，重复性好，适用于任何真核生物的系统进化研究 【2 7 】。但是，微卫星座位突变几率高，对变异反应极其灵敏，所以易受到趋同变异引起的 1 1 湖北大学硕士学位论文 平行演化( h o m o p l a s y ) 程度的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差；此外，这 一技术耗时较长，花费较大，并存在着放射性安全的问题，而且只能检测那些已知序列 的微卫星d n a 。由于微卫星d n a 具有许多等价基因并且表现高度的杂合性，在用其对 人类、兽类和昆虫进行种群间遗传测量时，都表现了高度的有效性，李云海等用此技术 成功地检测了中国主要杂交水稻亲本间的遗传差异。在用蛋白电泳检测大熊猫 ( a i l u r o p o d om e l a n o l e u c a ) 的遗传多样性时，得出遗传多样性贫乏的结论，而用微卫星 d n a 指纹技术检测时，却发现了极高的多态性。微卫星d n a 多态性在分析物种进化和 系统发生、生物种群内遗传变异以及种群间关系等方面均有重要意义【2 酊。 3 1 1 3 随机扩增多态性d n a 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l i m o r p h i cd n a ，r a p d ) 技术是9 0 年代发 展起来的建立在p c r 技术基础上的一种分子标记手段。它利用一系列不同的随机排列 的1 0 个碱基组成的寡核苷酸单链为引物，以生物的基因组d n a 为模板进行p c r ( 与常 规p c r 相比，退火温度较低，一般为3 6 ) 扩增，当模板上有引物的结合位点，并且一 定范围内有与引物互补的反向重复序列时，此范围内的d n a 片段就可以被扩增出【2 9 j 。 r a p d 带的多态性是由引物与模板的结合位点数及可扩增区域片段的长度决定的，基因 组的遗传变异通过琼脂糖凝胶电泳检测r a p d 产物的多态性获得。 r a p d 分析可在所有生物的基因组中进行，所需模板量少，并由于低温退火而在一 定程度上提高了检出分辨率，能够方便、快速地检出不同个体间大量的遗传差异，增加 引物种类数还可以增加遗传变异检出率；它能检出r f l p 技术所不能检出的重复顺序区， 事先未知研究对象的任何遗传背景，可以提供大量位点上的非细节信息【删。另外，实验 程序简单灵敏，安全快速，花费不高，具有良好的可操作性和实用性。但是，r a p d 标 记为显性标记，不能有效地鉴定出杂合子，结果分析中的序列同源假设( 长度相等的扩 增片段视为同源性片段) 可能会高估不同样本间的亲缘关系：此外r a p d 还极易受反应 条件的影响，不同实验室和不同实验条件下的结果难以统一，而且r a p d 的单带有可能 是多个分子的混合物，这是r a p d 技术目前在应用上存在争议的原因。在分子系统学中， r a p d 方法已广泛应用于种群间系统亲缘关系、分类和系统发生等方面的研究，并表现 了一定的优越性。k r e m e r 用r a p d 对两种存在形态差别的栎树( q u c r c u s r o b u r 和q p e t r a o a ) 进行了遗传变异分析，结果在4 5 个引物中有7 个在二者之间表现出现明显的差异，这7 个引物所鉴别的3 6 条片段里，有1 4 个出现频率差异，而利用叶绿体d n a ( c p d n a ) 和等 1 2 前言 位酶分析则无法在基因水平上找出两种树有差异的证据。可见，r a p d 能检测出等位酶 和细胞器d n a 所不能检测出的遗传变异。 由于r a p d 技术本身存在的一些缺点，有人认为r a p d 技术在应用于种间乃至近 缘属之间亲缘关系的研究时有一定的局限性【3 1 1 。对于r a p d 结果统计中弱带的取舍问 题，姚鸿等认为，当所分析的材料差异足够大，扩增产物数目足够多时，可以只分析主 带；而汪小全等则认为，产物条带重复性的