（分析化学专业论文）纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应用.pdf

硕士学位论文 摘要 无论是在基因表达调控与基因功能等基础研究方面，还是在以基因作为药物 进行临床疾病的治疗即基因治疗方面，基因载体都具有非常重要的作用。无机纳 米颗粒类非病毒型基因载体因其稳定性好、生物亲和性好、安全、有效、无免疫 原性等优点，已引起广泛关注。但是人们对此类基因载体在基因传递过程中的各 种关键因素还缺乏深入的了解，而且其转染效率普遍不高。本论文针对上述问题 开展研究，取得了如下进展： ( 1 ) 深入研究了氨基化二氧化硅纳米颗粒基因载体的酶切保护机理。 外源基因在细胞内的酶切保护问题是影响基因转染成败的重要因素之一。氨 基化二氧化硅纳米颗粒作为新型的非病毒型基因载体，其酶切保护效应已有大量 报道，但目前缺乏深入研究。本文以氨基化二氧化硅微米颗粒为对照，从酶反应 环境以及结合的d n a 链长的角度，研究了氨基化二氧化硅纳米颗粒基因载体的 酶切保护机理，得到如下结论：相比于氨基化二氧化硅微米颗粒，氨基化二氧化 硅纳米颗粒对结合的d n a 在所有的酶切反应中均表现出更优良的酶切保护效应。 该结论为纳米基因载体的发展提供了有益的理论支持。 ( 2 ) 发展了两种基于二氧化硅微颗粒的基因转染新方法。 本文以粒径为几百纳米大小的二氧化硅微颗粒为基础，发展了两种基因转染 新方法。其一是将二氧化硅微颗粒与多聚赖氨酸通过静电结合制备出多聚赖氨酸 二氧化硅微颗粒复合物作为基因载体，进行基因转染：其二是在多聚赖氨酸介导 的基因转染中加入二氧化硅微颗粒作为转染伴侣，进行基因转染。这两种基因转 染方法均快速、简便而且转染效率高( 后者在转染效率上更胜一筹) ，在基因功能 研究以及相关基因工程研究中具有重要的应用前景。 ( 3 ) 发展了一种基于微乳液体系制备低团聚的针状羟基磷灰石颗粒的新方 法，并成功地开展了其在基因转染中的应用。 羟基磷灰石是一种极有应用前景的材料，其制备工艺也颇受关注。传统的液 相沉淀法应用广泛，但制备的颗粒易产生团聚，分散性差。本文从改变反应体系 的角度对传统方法加以改进，发展了一种基于微乳液体系进行化学沉淀制备针状 羟基磷灰石颗粒的新方法。新方法不仅保留了传统方法的优点，还有效改善了颗 粒的团聚问题，获得了低团聚的针状羟基磷灰石颗粒。由新方法制备的颗粒分散 性好，较传统方法制备的颗粒性能更优。不仅表面结合d n a 能力明显增强，具 有更好的吸附和承载能力，在抗菌剂以及药物等载体方面的应用占有优势，而且 细胞相容性也明显增强，有助于其在生物医学中的深入应用。此外，由新方法制 备的颗粒在转染效率上也有所提高。 纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应= | j 关键词：d n a 酶切保护；二氧化硅微颗粒；羟基磷灰石；基因转染 i i 硕士学位论文 a b s t r a c t g e n ec a r r i e r sa r eo fg r e a ti m p o r t a n c en o to n l yi nb a s i cr e s e a r c ho i lt h ee x p r e s s i o n a n dr e g u l a t i o no fg e n e sa n dt h ef u n c t i o no fg e n e sh u ta l s oi n g e n et h e r a p yi nw h i c h g e n e sa r eu s e da sd r u g sf o rt h et h e r a p yo fc l i n i c a ld i s e a s e s i n o r g a n i cn a n o p a r t i c l e sa s n o n - v i r a lg e n ec a r r i e r sh a v ec a u g h tm u c ha t t e n t i o nb e c a u s eo ft h e i rg o o d s t a b i l i t y ， b i o c o m p a t i b i l i t y ，s a f e t y , e f f i c i e n c ya n dn o n i m m u n o g e n i c i t y h o w e v e r ，s o m ek e y f a c t o r si ng e n et r a n s f e e t i o no ft h e s ec a r r i e r sa r es t i l lu n k n o w na n dt h e i rt r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c i e sa r en o td e s i r a b l e t oa d d r e s st h e s ep r o b l e m s ，w eh a v ec a r r i e do u ts o m e r e l a t e dr e s e a r c ha n da c h i e v e ds o m ep r o g r e s sa sf o l l o w s ： ( 1 ) t h em e c h a n i s mo fd n ap r o t e c t i o no fa m i n o m o d i f i e ds i l i c an a n o p a r t i c l e sh a s b e e nd e e p l yi n v e s t i g a t e d p r o t e c t i o no fe x o g e n o u sg e n e sa g a i n s ti n t r a c e l l u l a rc o n d i t i o n si so n eo fk e yf a c t o r s i n g e n et r a n s f e c t i o n a m i n o - m o d i f i e ds i l i c an a n o p a r t i c l e sa sn o v e ln o n v i r a lg e n e c a r r i e r sh a v es h o w ng o o dd n a p r o t e c t i o na b i l i t yi nm a n yr e p o r t s ，b u tt h em e c h a n i s mo f d n a p r o t e c t i o nh a sn o tb e e ns t u d i e dy e t u s i n ga m i n o - m o d i f i e ds i l i c am i c r o p a r t i c l e s a sc o n t r o l ，t h em e c h a n i s mo f g e n e s p r o t e c t i o nf r o me n z y m a t i cc l e a v a g e o f a m i n o m o d i f i e ds i l i c an a n o p a r t i c l e sh a sb e e nd e e p l yi n v e s t i g a t e df r o mt h ea s p e c t so f e n z y m a t i cr e a c t i o ne n v i r o n m e n ta n dt h el e n g t ho fd n as e q u e n c e r e s u l t ss h o wt h a t a m i n o m o d i f i e dn a n o p a r t i c l e sp r e s e n tb e t t e r g e n e s p r o t e c t i o ne f f i c i e n c y f r o ma l l e n z y m a t i cc l e a v a g e st h a nt h a to fa m i n o - m o d i f i e dm i c r o p a r t i c l e s ，w h i c hw i l lp r o v i d e h e l p f u lt h e o r e t i cs u p p o r tf o r t h ed e v e l o p m e n to fn a n o m e t r i eg e n ec a r r i e r s ( 2 ) t w on e wg e n et r a n s f e c t i o nm e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e db a s e do ns i l i c a m i c r o p a r t i c l e s b a s e do nt h es i l i c am i c r o - p a n i c l e sw i t ht h es i z ea b o u ts e v e r a lh u n d r e dn a n o m e t e r s ， t w on e wg e n et r a n s f e c t i o nm e t h o d sh a v eb e e n d e v e l o p e d o n e i s u s i n gt h e p o l y l l y s i n e s i l i c am i c r o p a r t i c l e sc o m p l e x e sw h i c ha r ef o r m e dt h r o u g he l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e ma sg e n ec a r r i e r s ，a n dt h eo t h e ri su s i n gs i l i c am i c r o p a r t i c l e s a sh e l p m a t e si nt h ep o l y l l y s i n e m e d i a t e dt r a n s f e c t i o n b o t hm e t h o d sa r er a p i d ，s i m p l e a n do fh i g ht r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y t h el a t t e re x h i b i t sh i g h e re f f i c i e n c yt h a nt h ef o r m e r t h i ss t u d yp r o v i d e sg r e a tp o t e n t i a lt oa p p l yt h e s en e wg e n et r a n s f e c t i o nm e t h o d si nt h e r e s e a r c ho fg e n ef u n c t i o n sa n dg e n ee n g i n e e r i n g ( 3 ) an e wm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e dt op r e p a r en e e d l e l i k eh y d r o x y a p a t i t e p a r t i c l e s w i t h l o w - a g g l o m e r a t i o n a n dt h e s e h y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e s h a v e b e e n i i i - 纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应用 s u c c e s s f u l l ya p p l i e di ng e n et r a n s f e c t i o n e x t e n s i v ea t t e n t i o nh a sb e e nf o c u s e do nt h ep r e p a r a t i o no fh y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e s n o ws i n c et h i sk i n do fm a t e r i a ls h o w sg r e a ta p p l i c a t i o np o t e n t i a l t r a d i t i o n a ll i q u i d p r e c i p i t a t i o nm e t h o d i s w i d e l yu s e d ，b u th y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e sp r e p a r e db y t h i s m e t h o da r ee a s i l ya g g l o m e r a t e d b yc h a n g i n gt h er e a c t i o ns y s t e mo ft r a d i t i o n a ll i q u i d p r e c i p i t a t i o n ，an e wm e t h o du s i n gc h e m i c a lp r e c i p i t a t i o ni nm i c r o e m u l s i o nh a s b e e n d e v e l o p e dt op r e p a r en e e d l e 1 i k eh y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e sw i t hl o w - a g g l o m e r a t i o n t h e n e wm e t h o dn o to n l yr e t a i n st h em e r i t so ft r a d i t i o n a lm e t h o d ，b u ta l s os o l v e s t h e p r o b l e mo fa g g l o m e r a t i o n c o m p a r e dw i t ht h ep a r t i c l e sp r e p a r e db yt r a d i t i o n a lm e t h o d ， t h eh y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e sp r e p a r e db yt h en e wm e t h o da r eo fg o o dd i s p e r s i b i l i t ya n d s u p e r i o rp r o p e r t i e s t h e yh a v eh i g h e rd n a b i n d i n ge f f i c i e n c yw h i c hi m p l i e sb e t t e r l o a d i n ge f f i c i e n c ya n da p p l i c a t i o ni n a n t i m i c r o b i a la n dd r u gc a r r i e r s ，a n db e t t e rc e l l b l o c o m r ) a t i b i l i t yw h i c hw i l l w i d e nt h e i ra p p l i c a t i o ni nb i o m e d i c i n e m o r e o v e r , t h e h y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e sp r e p a r e dt h r o u g h t h en e wm e t h o dd e m o n s t r a t e sh i g h e r t r a n s f e e t i o ne f f i c i e n e yw h e nt h e ya r eu s e da sg e n ec a r r i e r s k e yw o r d s ：d n ap r o t e c t i o nf r o me n z y m a t i cc l e a v a g e ；s i l i c a m i c r o p a r t i c l e s ； h y d r o x y a p a t i t ep a r t i c l e s ；g e n et r a n s f e c t i o n 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名： 弃缸弦日期：少垆 月，日 学位论文版权使用授权书 作者签名：，扣奄嗍嘶夕月夕日 铆签名：犯蔽日期：“年夕月7 日 硕士学位论文 第1 章绪论 生物体的一切生命活动，从出生成长、到出现疾病、衰老直至死亡都与基因 有关，基因调控着细胞的各种功能：生长、分化、老化、死亡。研究发现，人类 与疾病相关的基因约有5 0 0 0 多个，至今已有1 3 被分离和确认。利用基因工程技 术消除、修饰“坏”的致病基因( 如导致结肠癌的基因) ，或者注入“好”的基因( 如 防止动脉阻塞的基因) ，有可能达到治疗疾病的目的，从而实现基因治疗。基因治 疗不仅有可能使6 0 0 0 多种与遗传有关的疾病得到有效防治，而且为癌症、艾滋病 等疑难病症的治疗带来了希望，所以，基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域。 自从1 9 9 0 年a n d e r s o n 等 1 1 首次成功地进行基因治疗的临床研究以来，迄今已完 成了5 0 0 多例的基因治疗临床研究。 基因治疗的关键之一是如何有效地将有治疗功效的基因导入需要治疗的细 胞，这涉及到基因转染技术问题。作为基因治疗的基础研究，基因转染技术也因 此受到了普遍重视并获得了蓬勃发展。基因转染即“将具生物功能的核酸转移或 运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能” 2 1 ，不仅可服务于基因治疗研 究，而且还是基因的结构与功能分析、基因的表达与调控、信号转导和药物筛选 等研究的常规技术手段。因此，深入开展基因转染研究，在生命机制研究、医药 开发以及基因治疗中都具有非常重要的意义1 3 j 。 目前基因转染技术很多，裸d n a 的直接转染是基因转染中最简单的一种形 式，而且对皮肤细胞、某些肿瘤细胞及免疫细胞较为有效。但是一般说来，裸d n a 转染的稳定性和转染效率均不高，因此常采用生物、物理和化学的方法来提高裸 d n a 的转染效率【4 1 。 常用的物理方法【5 1 主要有电穿孔、基因枪、超声波等，它们对提高转染效率 很有效果但是需要仪器的支持，使用不方便。生物方法即常用的病毒载体【6 】( 如： 逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、痘病毒等) 。病毒载体的显著 优势是转染效率高，因而是目前研究最多也是最有效的基因载体，正在进行临床 研究的基因治疗方案中病毒载体也占大多数。但是病毒载体携带基因的大小有限， 制备困难而且成本高，尤其是它的安全性问题限制了它的应用。1 9 9 9 年9 月美国宾 州大学在重组病毒载体介导的基因治疗中造成l8 岁受试者g e l s i n g e rj 不幸身亡的 悲剧 7 】以及腺病毒载体有选择的促肾上腺皮质作用的报道【8 】为基于病毒载体的人 类基因治疗敲响了警钟，使得近年来越来越多的注意力投向化学方法即非病毒型 基因载体 9 】( 如：阳离子多聚物、阳离子脂质体等) 。非病毒型基因载体因其安全、 有效、无免疫原性等优点，已成为基因转染研究的主要发展方向之一。 纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基囚载体的制备与应用 1 1 非病毒型基因载体的发展简史 非病毒型基因载体的研究起源很早，最初是作为一种增强裸d n a 的转染效 率的化学方法提出的。其基本原理就是利用化学物质与d n a 的相互作用结合形 成大的复合物，从而促进细胞对d n a 的摄取来提高转染效率。 最早的研究是在2 0 世纪5 0 年代后期，据报道，在高浓度盐环境下利用聚阳 离子蛋白质可增强核酸进入细胞的效率 1 0 j 。1 9 6 5 年，v a h e r i a 等发现二乙基氨 乙基( d e a e ) 葡聚糖可与d n a 形成复合物并介导基因传递获得有效表达，从此建 立了d e a e 葡聚糖转染法。1 9 7 3 年，g r a h a mf 等 1 2 】报道了d n a 如果以磷酸钙 - d n a 共沉淀物形式出现时，培养细胞摄取d n a 的效率会显著提高，从而建立了 磷酸钙转染法。d e a e 葡聚糖转染法和磷酸钙转染法操作比较容易，而且能有效 地将外源基因导入细胞进行表达，至今仍在实验室中广泛应用于体外基因转染。 但是磷酸钙转染法操作重复性差，实验变数多，d e a e 葡聚糖转染法重复性虽然 比磷酸钙法好，但是细胞毒性比较大，而且二者的转染效率均不是很高。 从1 9 8 7 年开始，脂质体作为非病毒性基因载体家族的重要成员登上了历史的 舞台。f e i g n e r p 和他的同事【l3 1 率先将阳离子脂质体用于基因转染并获得成功。同 年，商品化的阳离子脂质体转染试剂l i p o f e c t i n ( 司世。阳离子脂质体在基因转染中的 应用也越来越广泛。普遍认为用人工脂质膜包裹d n a ，形成的腊质体有着类细胞 膜结构，易于穿透细胞膜而将d n a 导入细胞，因而基因转染效率较高。该方法使 用简单，可携带大片段d n a ，也通用于各种类型的d n a 或r n a ，能转染各种类型 的细胞，没有免疫原性，而且在体外基因转染中有很高的效率，因而在基因载体 的发展中大行其道。但是由于脂质体在体内转染中，易被血清清除，并在肺组织 内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上会限制其在 基因治疗中的应用。不过总体上说，阳离子脂质体目前仍是开展体外转染实验， 进行基因功能研究的最广泛的工具。 阳离子多聚物也是非病毒性基因载体家族的重要成员，而且颇具发展潜力。 带正电的阳离子聚合物是通过与带负电的核酸形成带正电的复合物后，与细胞表 面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞而完成基因转染的。该 方法除了具有脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外， 在进行体内转染时效率也高，细胞毒性低，是新一代的转染试剂。 多聚赖氨酸是最早报道的阳离子多聚物基因载体。1 9 8 7 年，w ug 等1 1 4 首次 报道了与去唾液酸糖蛋白连接的多聚l 赖氨酸偶合物用于肝细胞的基因靶向转 染。其后，多聚精氨酸、鱼精蛋白、聚乙烯亚胺( p e i ) 、树状物和壳聚糖等作为 基因载体也相继问世“。 其中，树状物用于基因转染的研究最早见于s z o k a 等的报道。s z o k a 等【l6 j 于 硕士学位论文 1 9 9 3 年使用热降解的树状物进行了基因转染的探讨，开创了以树状物为基因载体 介导基因转染的先河。1 9 9 5 年，b o u s s i fq 等i ”1 首先报道了p e i 在基因载体中的应 用，接下来，p e i 变成为非病毒载体研究最快的领域之一，而且在现有的阳离子多 聚物载体中，p e i 无疑是应用最为成功的例子。 基于可降解的天然高聚物( 如：壳聚糖和淀粉等) 也是基因载体的发展方向。 1 9 9 8 年，m u m p e r f 等 1 8 】首先提出了使用壳聚糖作载体将基因释放到细胞中。之后， 壳聚糖在基因载体中的应用报道越来越多。 目前，由于非病毒性基因载体安全有效，己成为基因载体的发展趋势，因而 也涌现了许多新型的非病毒性基因载体，这将在后面小节里作详细介绍。 1 2 非病毒型基因载体介导基因转染的一般过程 在生理条件下，d n a 是带负电荷的柔性大分子，它的负电荷主要来自于主链 的磷酸根基团。一般来说，没有外力或者载体的作用，d n a 分子是很难穿过细胞 膜进入细胞的。非病毒型基因载体主要是通过电荷的相互作用与d n a 形成复合 物，复合物再通过细胞的吞噬作用进入细胞，并将d n a 释放到细胞中，从而实 现基因转染的。 非病毒型基因载体介导d n a 转染的一般途径如图1 i 所示【l9 1 。在进行基因 图1 i 非病毒型基因载体介导d n a 转染途径的示意图” a ，d n a 与载体形成d n a 复合物，b ，通过细胞吞噬完成d n a 的摄取，c ，内涵体内吞复合 物，d ，复合物逃离内涵体，溶酶体，e ，复合物在内涵体，溶酶体的降解，f ，d n a 在细胞内 的释放，g ，d n a 被细胞质降解，h ，d n a 的细胞核靶向传输，i ，d n a 进入细胞核并表达 f i g 1 1s c h e m a t i cd r a w i n go fd n ad e l i v e r yp a t h w a y so fn o n v i r a lg e n ec a r r i e r s i z g l a ，d n a - c o m p l e xf o r m a t i o n b ，u p t a k e c ，e n d o e y t o s i s d ，e s c a p ef r o me n d o s o m e l y s o s o m e e ， d e g r a d a t i o n ( e n d o s o m e l y s o s o m e ) f ，i n t r a - c e l l u l a rr e l e a s e g ，d e g r a d a t i o n ( c y t o s 0 1 ) h ， n u c l e a rt a r g e t i n g i ，n u c l e a re n t r ya n de x p r e s s i o n 纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应用 转染时，外源d n a 也就是目标基因首先与转染载体形成紧密的d n a 复合物，复 合的程度与载体的性质尤其是表面电荷有关，过量的载体会使复合物的表面带正 电荷，易于与带负电荷的细胞膜表面结合，促进细胞对复合物的摄取。复合物的 粒径通常为几十到几百纳米甚至更大，有圆形的、环形的、柱形的，也有管状的。 一个复合物颗粒可能含有一个或者几个d n a ，结构比较紧密，因而能在细胞外和 细胞内保护d n a 不被降解。通常细胞是通过胞吞作用摄取复合物使d n a 得以进 入细胞，开始其在细胞内的运输、释放以及核定位。胞吞是个复杂的多步过程， 包括结合、内在化、形成内涵体、溶酶体融合以及逃逸等。具体地说，细胞膜吞 入复合物后首先形成内涵体，再与一个或多个溶酶体前体融合形成次级溶酶体。 在溶酶体中，复合物被溶酶体中的酸性水解酶水解，同时也使d n a 降解、损失。 内涵体和溶酶体中的各种酶会导致进入其中的d n a 降解，载体的作用之一就是 保护d n a 免受降解，从而提高转染效率。复合物从溶酶体中逃逸出来后进入细 胞质，并在细胞质中释放d n a ，或者携带d n a 接近细胞核在核膜处释放d n a ， d n a 穿过核膜孔，进入细胞核，而后便开始其在细胞内的基因表达。 如图1 1 所示，将目标基因导入受体细胞内进行表达是一个非常复杂的过程， 必须克服一系列生物学的屏障。在体外的细胞实验中，存在三道屏障【2 ”。首先是 携带了目标基因的载体复合物要跨过带负电的细胞膜，即细胞膜屏障；其次通过 内吞作用进入内涵体或溶酶体后，如何有效使复合物最大限度地从溶酶体中释放， 并保证基因不被溶酶体酶降解，即转染的第二道屏障；最后，已释放出来的d n a 还要完成从胞浆到核孔的转运到达核内才能实现目的基因的表达，也称为细胞核 膜屏障。在体内实验中，基因转染还需要克服体液内环境和解决细胞靶向性等问 题，即如何将基因从注射部位定向地输送到病变的组织和细胞，并且能够有效维 持基因在体内的稳定性和最低限度地降低各种调理素对基因转染的影响。 为提高非病毒型基因载体的转染效率，就必须解决这些生物学屏障问题。在 体外转染中，无论是物理操作还是载体技术，都是为了促进细胞对d n a 更高效 的摄取，有效地克服细胞膜屏障。对于第二道屏障，在转染过程中添加适当的化 学物质( 如氯喹) 有助于加速d n a 复合物从溶酶体中逃离出来，从而避免酶降 解作用。氯喹是一个弱碱，在细胞培养基中加入氯喹，经细胞摄取后能够升高内体 的p h 值，促进内体逃逸，提高转染效率。另外，有的载体本身就能较好地克服该 问题，如阳离子多聚物p e i 、聚酰胺胺树状物等。由于溶酶体中的p h 值约为5 5 ， p e i 等在该环境下具有很高的缓冲能力，这种高缓冲能力的多聚物d n a 复合物在 溶酶体中能结合更多的质子，导致溶酶体的渗透压升高，溶酶体的膜更容易破裂， 有助于复合物的溶酶体逃逸进入细胞质。再在细胞质中扩散到细胞核的膜上。为 解决细胞核膜屏障问题，出现了核定位信号( n l s ) 2 ，2 2 1 。n l s ，其本质是来源于病 毒载体的强启动子和转录因子，如g a l 4 、s v - 4 0 等，被认为是病毒载体的转染效 硕士学位论文 率高于非病毒型基因载体的一大原因。在非病毒型基因载体的设计中，可以将n l s 直接构建于d n a 质粒载体中，或通过化学键合将n l s 修饰至d n a 或者载体上， 也可以直接先与d n a 混合，再通过静电的作用与非病毒型载体复合，这些均有 助于提高d n a 的核转运水平从而提高转染效率。 在体内转染中，细胞靶向性问题是通过对载体进行与靶细胞膜表面的特异性 受体相关的配体修饰来解决的。载体复合物携带目的基团在受体配体作用的介导 下，可以实现体内的靶向性基因传递【23 1 。常用的靶向性配体有：用于肝系细胞靶 向的去唾液酸糖蛋白【2 4 1 、半乳糖 2 5 】；用于巨噬细胞靶向的甘露糖2 6 】；用于癌细胞 靶向的转铁蛋白 2 7 1 、叶酸28 1 、上皮生长因子( e g f ) 【2 9 】；用于白血病t 细胞靶向的 a n t i j l l 抗体【3 们。 1 3 基于有机材料的非病毒型基因载体 从载体的材料性质来分，非病毒型基因载体可分为有机材料类和无机材料类。 其中有机材料类非病毒基因载体尤其是阳离子脂质体和阳离子多聚物，是其主流 发展方向。近年来，这方面的研究飞速发展，并取得了不少成果。 1 3 1 阳离子脂质体 阳离子脂质体是当前最常用的转染试剂，由于其转染效率高已经被高度商品 化。多家试剂公司推出了一代又一代的阳离子脂质体转染试剂产品。如s i g m a 公 司，推出了e s c o r t 系列转染试剂( w w w s i g m a a l d r i e h c o r n ) 。e s c o r t 转染试剂是 由阳离子脂类n f l - ( 2 ，3 一d i o l e o y l o x y ) p r o p y l n ，n ，n t r i m e t h yl a m m o n i u mc h l o r i d e ( d o t a p ) 和中性脂类二油酰磷脂酰乙醇胺( d o p e ) 按l ：1 的比例在0 2 耻m 的m b s 缓 冲液中混合而成，p h 值为6 2 。第一代e s c o r t 转染试剂在转染h e l a ，c h o - k 1 ， c o s 一7 ，c v l ，h e k 2 9 3 ，p a e 和昆虫s f 9 细胞效果较好。随后的e s c o r ti i 转染试 剂适用细胞范围增大，还在b h k - 2 1 ，v e r o ，f 9 ，j u r k a t ，p c 1 2 ，n i h 3 t 3 和l 9 2 9 等细胞中转染效果较好。接着出现了适用于原代细胞转染的e s c o r ti l l 转染试 剂，以及可转染神经细胞如星形胶质细胞的第四代产品e s c o r ti v 转染试剂。 i n v i t r o g e n 公司也发展了多种阳离子脂质体转染试剂( v c x v w i n v i t r o g e n c o r n ) 。 其中l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 和l i p o f e c t a m i n ep l u s 对大多数细胞类型都提供 了较高的转染效率。同时针对某些应用，i n v i t r o g e n 公司还提供专用型的四种阳离 予脂质体试剂。其中，d m r i e c 试剂转染悬浮细胞效率最高，如j u r k a t 细胞以及 其他淋巴细胞来源的细胞系( 如图1 2 a 与b 所示) 。使用d m r i e c 介导转染p c m v s p o r t - i - g a l 质粒d n a ，观察到染色阳性细胞的效率高达8 5 9 0 。c e l l f e c t i n 试荆转染昆虫细胞最有效，被广泛用于昆虫基因表达中( 如图1 2c 所示) 。生产 杆状病毒的s f 9 和s f 2 1 细胞以及果蝇细胞，都可以用c e l l f e c t i n 试剂高效转 纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应用 染。l i p o f e c t i n 试剂适用于转染内皮细胞，己成功用于人类和非人类内皮细胞 的瞬时转染。为将寡核苷酸导入细胞，i n v i t r o g e n 公司又推出了可成功地将反义寡 核苷酸转染至广泛的真核细胞的o l i g o f e c t a m i n e 一一反义寡核苷酸不仅可以 进入细胞，而且能发挥生物功能。 图1 2 ir l , , i t r o g e n 公司转染试剂介导的基因转染” a ，以d m r i e c 对悬浮j u r k a t 细胞进行d n a 转染( x - g a l 染色，检测1 3 - g a l 表达) ，b ，以 d m r i e c 对b h k 2 1 细胞进行r n a 转染( x g a l 染色，检测1 3 - g a l 表达) ，c ，以c e l l f e c t i n 对昆虫细胞s f 9 0 0 i is f m 进行d n a 转染( x 葡萄糖苷染色，检测b - g l u e 表达) f i g 1 2t r a n s f e e t i o nb yr e a g e n t so fi n v i t r o g e n 川 a ，d n at r a n s f e c t i o no f j u r k a tc e l l sb yd m r i e c ( s t a i n e dw i t hx g a l ，d e t e c t1 3 - g a le x p r e s s i o n ) b ，r n at r a n s f e c t i o no fb h k - 2ic e l l sb yd m r i e - c ( s t a i n e dw i t hx - g a l ，d e t e c tp g a le x p r e s s i o n ) c ，d n at r a n s f e c t i o no fs f 9 0 0i is f m c e l l sb yc e l l f e c t i n ( s t a i n e dw i t hx - g l u e o s i d e ，d e t e c t1 3 - g l u ce x p r e s s i o n ) 在实验室研究方面，基于阳离子脂质体的基因载体也有明显的进步。如日本 的n a k a n i s h im 【3 2 】等利用脂质体邛日离子胆固醇复合物纳米颗粒为基因载体，实现 了反义寡核苷酸在细胞核内高效率的表达。韩国的n o hc 等口3 1 以含有i i e c h 、 d o p e 和d p m e p e g 成分的脂质体为基因载体携带p 5 3 抑癌基因注入裸鼠体内，发 现3 周后裸鼠体内的肿瘤块体积明显减小，该方法在治疗人体前列腺癌方面很有应 用前景。 经过对阳离子脂质体的不断改进，其在基因治疗方面的研究工作也出现成 效。目前，已有几十例阳离子脂质体载体介导的人类基因治疗方案进入临床研究 阶段。 1 3 2 阳离子多聚物 阳离子多聚物，也是最常用的转染试剂，而且在体内转染应用中不会像脂质 体那样引起炎症，因而发展势头越来越猛。 1 3 3 1 聚- l - 赖氨酸( p o i y l ly s in e ) ，p l l ) 聚l 赖氨酸是最早使用的阳离子多聚物，可在任何p h 条件下结合d n a ，但 硕士学位论文 是如果既不连接靶向配体或抗体，又不添加吞噬泡或溶酶体溶解剂( 如氯喹) ， 其基因转染效果很差【3 钔。其研究进展主要集中在对其进行化学修饰以获得较高的 转染效率，如将组氨酸连接到聚l 赖氨酸中l 赖氨酸的残基上形成新的p l l 类 多聚物，该多聚物在基因转染应用中比添加了氯喹的聚l 赖氨酸混合物更有效， 这是由于在p h 6 以下，质子化的组氨酸提供了额外的内吞缓冲能力，更有助于避 免d n a 在吞噬泡中被降解。研究还表明，用半胱氨酸和色氨酸残基替代聚l 赖 氨酸中的一些氨基酸残基，也会增强此类多聚物的基因转染效果，表明d n a 的释 放可能受细胞内二巯键的还原所激发【3 5 1 。 1 3 3 2 聚乙烯亚胺( p o i y e t h y io l l i m in e ，p e l ) p e i 单体( c h c h 2 n h 2 ) 中每三个原子含一个氨基，富含阳离子，有较强的 结合d n a 和粘附细胞的能力。与聚l 赖氨酸不同的是这种支链或线形p e i 阳离子 多聚物由于其自身的内吞缓冲特性，在不需要吞噬泡或溶酶体溶解剂的情况下显 示出很好的基因转染效果。p e i 载体的有效性和细胞毒性受分子量、分支度、z e t a 电位等因素影响。低分子量( 1 0 k d a ) p e i 比高分子量的基因转染效率高，线性p e i ( 2 2 k d a ) 比分支的( 2 5 和8 0 0 k d a ) 更有效。在p e i 表面可引入靶向基团或p e g 等 可增强其空间稳定性。 p e i 目前应用很广泛。以其为主要成分的转染试剂也不少，如q b i o g e n e 公司的 j e t p e i 转染试剂、s i g m a 公司的e s c o r tv 增强试剂盒。另外，法国的生物技术公 司p o l y p l u s t r a n s f e c t i o n ( p t ) 以p e i 及其衍生物为基础发展了一系列p e i 类转染试 剂，用于基因的体内和体外转染、寡核菅酸转染以及s i r n a 转染【3 ”，如：能把基 因转入各种粘附或悬浮的细胞系中以及原代细胞的主导产品j e t p e i 转染试剂；能 通过静脉、大脑、腹膜以及气管等体内途径进行转染的i nv i v o j e t p e i 转染试剂， 目前已在小鼠、大鼠、鸭、豚鼠和猴等动物身上取得成功；具有细胞靶向性的t a g g e d j e t p e l s ，包含具有肝细胞靶向性的j e t p e i g a l i nv i v o j e t p e l g a l ，具有树突状细 胞和巨噬细胞靶向性的j e t p e i m a n & i nv i v o j e t p e i m a n ，具有上皮细胞和内皮细 胞靶向性的j e t p e i r g d ；能用于胞内定位研究的j e t p e i f l u o f 和能用于双色标记和 协同定位j e t p e i f l u o r 等。 1 3 3 3 聚酰胺一胺树枝状聚合物( p a m a md e n d r i m e r ) d e n d r i m e r s 是由美国化学家t o m a l i a d 博土于8 0 年代初最先发明并人工合成 的新型纳米材料，并于1 9 9 3 年由s z o k a 等首先用于基因转移的研究【l 。目前， 聚酰胺- 胺型树枝状聚合物( p a m a m ) 是研究得最多的一种d e n d r i m e r s 分子，其在 作为基因载体方面的研究也较多，部分试剂已商品化，如q i a g e n 公司的 s u p e r f e c t 转染试剂盒。刘习强等【3 7 优化了聚酰胺胺型树枝状高聚物纳米载体介 导增强型绿色荧光蛋白基因p e g f p n 1 体转染人舌鳞癌t e a s l l 3 细胞的转染条件， 纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应用 发现p a m a m 基因载体在优化的转染条件下，可安全高效地介导目的基因转染 t c a 8 1 1 3 细胞，是一种较理想的基因载体。l u od 等m 1 以p e g 修饰p a m a m ，获 得了种更高效的基因载体，与同类转染试剂商品s u p e r f e c t 相比，转染能力增强 了2 0 倍之多，这将大大促进p a m a m 在新型基因载体开发与基因治疗领域的应 用。 1 3 3 4 乳酸一乙醇酸共聚物