（临床医学专业论文）肺癌耐药相关mirna分析及功能研究.pdf

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m i r 7 、h s a m i r 1 5 b 、h s a m i r - 1 6 、h s a - m i r 一1 0 a 、h s a m i r - 1 3 0 a 、h s a - m i r - 4 5 5 3 p 、h s a m i r - 2 1 5 和h s a - m i r 1 3 8 ，进一步采用荧光实时定量p c r 进行验证，结果与m i r n a 芯片一致，在耐药细胞系a 5 4 9 d d p 中，h a s m i r 1 3 8 、h s a m i r - 2 1 5 的表达量明显上调，而h s a - m i r 7 、h s a - m i r 1 5 b 、h s a m i r 1 6 的表达量明显下调，h s a m i r 4 5 5 3 p 、h s a - m i r - 1 0 a 、h s a - m i r - 1 3 0 a 的表达量略有上调。为研究特定的m i r n a 在肺腺癌细胞耐药机制中的作用，将在耐药肺腺癌细胞a 5 4 9 d d p 中表达上调的h a s m i r 4 5 5 3 p 的表达载体质粒p m i r 4 5 5 转染a 5 4 9关键词：肺癌耐药a 5 4 9m i r n am i r n a ( m i c r o r n a ) f o u n di n l a s td e c a d ei sae n d o g e n o u sn o n c o d i n gr n a ，w h i c hp a r t i c i p a t e si nt h er e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o nb r o a d l y m i r n ap l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nc e l lg r o w t h ，d i f f e r e n t i a t i o n ，e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ，t u m o r i g e n e s sa n do t h e ra s p e c t s t h em o d eo fm o s tm i r n aa c t i o ni sp a i r e dw i t ht h et a r g e tm r n a ，a n dd e c r e a s i n gt h e i rs t a b i l i t yo ri n h i b i tt h e i rt r a n s l a t i o n a sar e s u l tt h ep r o t e i ne x p r e s s i o nd e c r e a s e d r e c e n ts t u d i e sh a v es h o w nt h a ts o m em i r n aa r ea l s oi n v o l v e di nt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fd r u gr e s i s t a n c eo ft u m o rc e l l w h i c hm i r n ap l a y sa ni m p o r t a n tp a r ti nt h er e g u l a t i o no fd r u gr e s i s t a n c e ? a n dw h i c hm i r n ac a nr e s t o r et h ed r u gr e s i s t a n tc a n c e rc e l lt h es e n s i t i v i t yt oc o m m o nc h e m o t h e r a p yd r u g s ?d r u gr e s i s t a n tl u n ga d e n o c a r c i n o m aa 5 4 9 d d pe e l ll i n e ，i n d u c e db yl o wc o n c e n t r a t i o n so fc i s p l a t i n ( d d p ) i n c u b a t i o n ，h a v el o ws e n s t i t i v i t yt od d ea n di t sr e s i s t a n c er a t i oi s10t i m e sm o r et h a nd r u gs e n s i t i v el u n ga d e n o c a r c i n o m aa 5 4 9c e l ll i n e t h ee x p r e s s i o no fg e n ec h a n g e dal o ti nt h ep r o c e s so fi n d u c i n gd r u gr e s i s t a n tc e l l ，a n dm i r n aa l s op a r t i c i p a t e di nt h ep o s t t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n s w ef o u n dt h ee x p r e s s i o no fm a n ym i r n ad i f f e r e n tt h r o u g ht h em i r n am i c r o a r r a ya n a l y s i sb e t w e e na 5 4 9a n da 5 4 9 d d et h e s ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fm i r n am a yb er e l a t e dt ot h ed r u gr e s i s t a n c eo rc e l lc y c l e a c c o r d i n gt ot h em i r n am i c r o a r r a ya n a l y s i sb e t w e e na 5 4 9a n da 5 4 9 d d p , w es e l e c th s a m i r 0 7 ，h s a - m i r 15 b ，h s a m i r 16 ，h s a - m i r - lo a , h s a m i r - 13 0 a ,h s a - m i r 4 5 5 3 p ，h s a - m i r 215a n dh s a - m i r - 138u s i n gf l u o r e s c e n tr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c rt ov a l i d a t et h er e s u l to fm i r n am i c r o a r r a y b o t ho ft h e ms h o wt h a th a s m i r 138a n dh s a m i r - 215a r eu p - r e g u l a t e ds i g n i f i c a n t l y , w h i l eh s a - m i r - 7 ，h s a m i r 1 5 ba n dh s a m i r 一1 6a r ed o w n r e g u l a t e ds i g n i f i c a n t l y , a l s oh s a m i r - 4 5 5 - 3 p ，i i ih s a - m i r 一4 5 5 w ef i n do u tt h a td r u gr e s i s t a n c ee n h a n c e si nh s a m i r - 4 5 5 3 po v e r e x p r e s s e da 5 4 9 s oh s a - m i r 4 5 5 - 3 pi sr e g u l a t i o nf a c t o ro nd r u gr e s i s t a n t ，b u th o wi tw o r k si su n k o w ny e t k e yw o r d s ：l u n gc a n c e r , d r u gr e s i s t a n c e ，a 5 4 9 ，m i r n a目录目录摘要ia b s t r a c t i i i目录v符号说明v i i第一章引言1第一节肺癌耐药的机制1第二节m i r n a 的生成与功能3第三节m i r n a 与肿瘤5第四节研究方法6第二章材料与方法8第一节实验材料82 1 1 细胞系82 1 2 实验试剂82 1 3 实验设备9第二节实验方法。1 02 2 1 细胞培养1 12 2 2 诱导a 5 4 9 d d p 耐药性。l l2 2 3a 5 4 9 和a 5 4 9 d d p 细胞系耐药性的测定1 12 2 4m i r n a 芯片检测a 5 4 9 与a 5 4 9 d d pm i r n a 的表达谱1 12 2 5 实时荧光定量p c r 验证m i r n a 表达谱芯片检测结果1 22 2 6m i r n a 在肺癌细胞耐药方面的功能研究1 52 2 7 数据统计17v目录第三章实验结果1 8第一节3 1 13 1 2第二节3 2 13 2 2第三节细胞耐药性18实验所用a 5 4 9 细胞系及a 5 4 9 d d p 细胞系18a 5 4 9 d d p 耐药系数的测定。18m i r n a 的差异表达2 1m i r n a 表达谱芯片检测a 5 4 9 和a 5 4 9 d d pm i r n a 的表达差异2 1荧光实时定量p c r 验证m i r n a 表达谱芯片结果2 4h s a - m i r 一4 5 5 3 p 在肺癌细胞耐药方面的功能研究3 6第四章讨论4 l第五章结论。4 4参考文献4 5致谢4 7个人简历。4 8v i英文缩写a 5 4 9a 5 4 9 d d pa b ca t c cc c k 8d d pd e p cghm i r n am d rm i nm lm mm r n an c r n amn t cp c rp d rp r e m i r n a印msu t r昭“l英文全称a t p - b i n d i n gc a s s e t t ep r o t e i na m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o nc e l lc o u n t i n gk i t - 8c i s p l a t i nd i e t h y p y r o c a r b o n a t eg r a mh o u rm i c r o r n am u l t i d r u gr e s i s t a n c em i n u t em i l l i l i t e rm i l l im o l em e s s e n g e rr n an o c o d i n gr n an u c l e o t i d en o n t e m p l a t ec o n t r o lp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np r i m a r yd r u gr e s i s t a n c ep r e c u r s o rm i r n ar e v o l u t i o np e rm i n u t es e c o n du n t r a n s l a t e dr e g i o nm i c r o g r a mm i c r o ii t r ev 中文全称人肺腺癌细胞人肺腺癌顺铂耐药细胞a t p 结合盒式蛋白美国标准菌种收藏所活细胞计数试剂盒顺铂焦碳酸二乙酯克小时微r n a多药耐药分毫升毫摩尔信使r n a非编码r n a核苷酸无模板对照聚合酶链式反应原药耐药m i r n a 前体转速每分钟秒非编码区微克微升引言第一章引言第一节肺癌耐药的机制肿瘤耐药是决定化疗效果、患者生存的关键因素之一。克服肿瘤耐药，恢复耐药肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性已成为当今医学面临的重要问题，是肿瘤化疗急需解决的问题。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性可分为天然耐药( n a t u r a lr e s i s i t a n c e ) 和获得性耐药( a c q u i r e dr e s i s t a n c e ) ，天然耐药是指肿瘤细胞始终对药物不敏感，而获得性耐药是指肿瘤细胞对于原来敏感的药物，治疗一段时间后产生不敏感的现象。也可以按耐药谱分为原药耐药( p r i m a r yd r u gr e s i s t a n c e ，p d r ) 和多药耐药( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ，m d r ) 原药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物不敏感，而对非同类型的药物仍然敏感，多药耐药是指肿瘤细胞在接触一种抗肿瘤药物后，产生了对多种结构不同、作用机制各异的其他抗肿瘤药物的耐药性。m d r是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的重要防御机制，同时也是导致化疗失败的重要原因。因此，对m d r 产生机制的研究已成为肿瘤治疗领域的热点。肿瘤细胞耐药性产生的机制极其复杂，近年来的研究表明，肿瘤细胞多药耐药性的普遍机制主要有以下几个方面：发生在细胞膜水平的药物摄取减少和外排增多，引起细胞内药物的绝对浓度降低。如m d r l 基因过度表达，导致其编码的p - 糖蛋白( p - g l y c o p r o t e i n ，p - g p ) 增多，p - g p 又称药物外排泵( d r u ge f f l u xp u m p ) ，是一种a t p 依赖的跨膜蛋白，可以通过向细胞外转运药物，降低细胞内药物浓度，使细胞产生耐药性。发生在细胞质和细胞器水平的药物亚细胞分布的改变，使药物无法接近作用靶点，引起药物有效浓度降低。如分布在内质网、高尔基体等细胞器膜上的多药抗性相关蛋白( m u l t i d r u gr e s i s t a n c ea s s o c i a t e dp r o t e i n ，m r ) ，它可以将药物泵入胞浆囊泡内，使药物不能到达作用靶点( 细胞核) ，从而产生耐药性【l 】。肺耐药相关蛋白( 1 u n gr e s i s t a n c er e l a t e dp r o t e i n ，l r p ) 和乳腺癌耐药蛋白( b r e a s tc a n c e rr e s i s t a n c ep r o t e i n ，b c r p ) 的作用。肺耐药相关蛋白因最早发现于非小细胞肺癌细胞而名，后来研究发现l r p 就是主穹窿体( m 旬o rv a u l tp r o t e i n ，m v p ) ，猜测l r p 可能通过参与构成核孔复合体将药物排出细胞核，使细胞产生耐药性。l r p 分布非常广泛，包括正常的支气上皮细胞，在多种实体瘤细胞中神经胶质瘤、淋巴瘤以及生殖细表达量增高，证明了l r p 与肿瘤耐药的关系，但l r p 在肿瘤耐药过程中发挥的作用尚不明确。s l e s i n am 等人发现l r p 存在于核孔复合体【2 】，支持了l r p 可能通过构成核孔复合体参与细胞核与细胞质间的物质转运的推测。但也有研究显示l r p 并不能通过增加化疗药物向细胞核外或细胞外的排泄引起细胞耐药。至今l r p 在肿瘤耐药方面的作用机制仍是未解之谜。与肺耐药相关蛋白的命名相似，乳腺癌耐药蛋白因最早发现于乳腺耐药细胞中而得名。之后研究发现b c r p 属于a t p 结合盒式蛋白( a t p b i n d i n gc a s s e t t ep r o t e i n ，a b c ) 家族的g 亚组，故又被名为a b c g 2 。b c r p分布于肠粘膜、胆小管膜、乳腺小叶、乳腺导管等细胞的细胞膜上，可以将多种药物泵出细胞，从而降低细胞内药物浓度，使细胞对多种药物产生耐药。细胞解毒系统和修复系统功能加强，使药物迅速灭活，药物引起的肿瘤细胞d n a损伤得以及时修复。如还原形谷胱甘肽( g s h ) 与谷胱甘肽硫转移酶( g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e ，g s t ) 系统，g s t 能够催化g s h 分子中的巯基与亲电子物质的亲电中心结合，使其水溶性增强，毒性减低，且易于分泌和外排1 3 】。药物靶点在质和量上的改变。主要指拓扑异构酶( t o p o ) 表达降低，并发生点突变且活性降低，减低了以t o p o 为靶点的药物的细胞毒性。真核细胞d n a 的拓扑结构由两类关键酶调节d n a 拓扑异构酶i 和d n a 拓扑异构酶i i 。这两类酶在d n a复制、转录及修复，以及在形成正确的染色体结构、染色体分离浓缩中发挥重要作用。有一类抗肿瘤药物可以通过抑制t o p o 的活性，从而干扰d n a 结构和功能。有研究发现t o p oi i 表达量下降与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性增加有关。抗凋亡基因b c l2 表达量增高及凋亡基因f a s ，b a r 表达量的降低等。很多研究证实耐药细胞中存在上述肿瘤耐药普遍机制中的各种蛋白质的表达量的改变，包括：p g p 、m r p 、p 5 3 、l r p 、b c r p 、谷胱甘肽有关的解毒系统( 包括：g s h 、g s t 、y 谷氨酰半胱氨酸合成酶等) 、t o p o 等。如由m d r j 基因编码的p g p 的过度表达与肿瘤细胞的固有耐药性有关；在经药物选择的细胞中常能检测到m r p 过度表达；l r p 在肿瘤组织中的表达率与表达水平明显高于正常组织，而且n s c l c 细胞经过与阿霉素、博莱霉素、顺铂等化疗药物培养后，l r p 的表达增强4 倍以上；b c r p 高表达细胞对米托葸醌、阿霉素、柔红霉素和托泊替康产生耐药；g s h 、g s t 增高及活性升高主要与烷花剂、铂类耐药有关；2引言t o p o 数量减少或质量改变均可导致耐药；另外，b c l 2 基因过度表达导致在化疗期间表达b c l 2 的肿瘤细胞产生耐药。以上研究表明在肺癌耐药过程中这些蛋白质的表达量都出现了异常，但是这些蛋白质是作为细胞耐药的效应分子发挥作用的，其本质是他们在转录水平和翻译水平的调控发生了改变，那么是什么原因导致了它们表达量的改变尚不明确。第二节m ir n a 的生成与功能史上第一条m i r n a 发现于1 9 9 3 年，l e er c 等在研究线虫n 4 基因时发现它的转录产物有两个大小分别为2 2 和6 1n t 的r n a 。其中分子量较小的这条r n a 与，砌j 4 信使r n a ( m e s s e n g e rr n a ，m r n a ) 的3 非编码区( 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，3 u t r ) 存在不完全互补序列，通过r n a 与r n a 的作用方式，负调控着，加1 4m r n a 的翻译( 如图1 1 ) 。基因n 一4 的这个2 2 n t 的转录产物即发现第一个的m i r n a ，被命名为l i n 4 【4 1 。墨 ；一，可翻再焉耐m i r n a 是一类在动植物细胞中广泛表达的非编码r n a ( n o c o d i n gr n a ，n c r n a ) 分子，m i r n a 参与细胞基因表达的调控，在细胞的生长和分化、胚胎的发育、肿瘤的形成等方面具有重要作用。目前己在线虫、小鼠、植物和人等多种生物中发现了几千种m i r n a 。m i r n a 的宿主基因在r n a 聚合酶i i 的作用下转录为初级转录产物p r i m i r n a ，p r i m i r n a 在细胞核内被d r o s h a 酶加工成长约7 0 n t ，具有茎环结构的单链r n a 分子，即m i r n a 前体( p r e c u r s o rm i r n a ，p r e m i r n a ) ，p r e m i r n a转运出核进入细胞质，经d i c e r 酶识别并剪切成为长约2 2 n t 的双链r n a 分子，随后整合为r n a 诱导沉默复合体( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) ，其中一条链被降解，另外一条链保留，即m i r n a 成熟体( 如图1 2 ) 。引言图1 2m i r n a 的生成及作用机制m i r n a 的表达呈现多样化的特点，有些m i r n a 在个体发育的各个阶段呈组成性表达，另一些则呈阶段性特异表达或组织特异性表达。m i r n a 表达的丰富性和表达模式的多样性表明，它们可能广泛参与基因表达的调控、细胞的增殖分化及组织的形成，m i r n a 可能有着多种多样的生物学功能。目前研究认为人类有数千个基因都受到m i r n a 的调控，这些基因约占人类全部基因的三分之一，m i r n a 是人类基因调控网络中的关键成分。m i r n a 可以通过多种方式调控基因的表达。在动物细胞中，大部分m i r n a 是通过与靶m r n ay u t r 的位点不完全互补结合，抑制m r n a 的翻译而减少蛋白质的合成的。m i r n a 也可以与靶m r n a3 u t r 完全互补配对，导致靶m r n a 降解，不能合成相应的蛋白质。这种m i r n a与靶m r n a 完全互补结合使靶m r n a 降解的作用方式多见于植物细胞。近年来人们对m i r n a 的研究逐渐深入，发现部分m i r n a 除了可以作用于m r n a 的3 u t r ，还可以作用于靶m r n a 的5 u t r 抑制m r n a 的功能1 5 j 。也有研究发现m i r 1 0 a 可以作用于靶m r n a 的5 u t r 并加强该m r n a 的翻译【6 j 。随后又有研究发现，有些m i r n a 还可以作用于靶m r n a 的编码斟。这些都是m i r n a 在对靶m r n a 转录后的调节，在转录水平m i r n a 是同样可以发挥调节作用的。研究发现m i r - 1 0 a 可以作用于h o x d 4 基因的启动子区，在转录水平抑制4引言h o x d 4 的表达和功能f 8 1 。由于m i r n a 分子与靶基因间是以完全或不完全互补的方式相结合的。因此，同一个m i r n a 分子可以有多个作用的靶基因，而同一个靶基因也可以同时受多个相同或不同的m i r n a 分子调控，如此形成了错综复杂的m i r n a 调控网络( 如图1 3 ) 。：一一+ 蛳一誓。一鼍一，? 二一一= ，一，一一一一一7_-一一一一j 气? _ ，一to：。一一l i - ：二j ：”己一。j 二。二 一三+ 嘈* _”一_ 1 ”二_。+ _ 巾一：镰。誊7蕾：一一一。=”_ m一图1 3 2m i r n a 基因调控网络第三节m i r n a 与肿瘤越来越多的研究发现m i r n a 与细胞的癌变有着极为密切的关系。目前已经发现了m i r n a 与肺癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等多种肿瘤有关。研究发现h e l a 细胞中，1 e t 7 活性的降低导致了r a s 蛋白表达水平的升高。在肺癌中发现了l e t 7 家族m i r n a 的表达量下调，且l e t 7 低表达的肺癌患者预后较差。m i r 1 7 9 2m i r n a 簇包含的7 条m i r n a 在肺癌中存在过表达的现象，尤其是在小细胞肺癌中表达量明显增高。慢性淋巴性白血病( c l l )中发现了m i r 1 5 b 和m i r - 1 6 的缺失。m i r 1 4 3 和m i r 1 4 5 表达量的下调与结直引言肠癌有关。有研究通过分析来源于肺部、胸部、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌组织标品，发现在大部分实体瘤中存在表达量异常的m i r n a 。以上研究都说明m i r n a 在实体瘤的癌变机制中发挥着重要的作用。以顺铂为代表的铂类化疗药物是治疗肿瘤最常用的药物之一，在临床广泛用于肺癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、宫颈癌等的治疗。顺铂属于细胞周期非特异性药物，进入细胞后水解成为双氯双氨铂，后者可以与d n a 双链上的碱基交叉联结，引起d n a 链间或链内交联，或形成d n a 与蛋白质交联体，从而抑制d n a 复制和r n a 转录，达到抑制细胞有丝分裂的目的。近年来研究发现很多m i r n a 参与了肿瘤细胞对顺铂耐药的机制。在乳腺腺癌m c f 7 顺铂耐药细胞株中发现了m i r 3 4 5 和m i r 7 的表达量下调，m i r - 3 4 5和m i r 7 可以通过作用于m r p lm r n a 的3 u t r 使降低m r p l 的表达，从而增加细胞对顺铂的敏感性。在卵巢癌顺铂耐药细胞系中m i r 1 3 0 a 表达量的下调与卵巢癌耐药基因m c s f 有关。在卵巢癌孙波耐药细胞系中m i r 2 1 4 表达量的上调可以导致p t e n 表达降低，细胞耐药性增强。使胃癌细胞s g c 7 9 0 1 c r 中过表达m i r 1 5 b 和m i r 1 6 ，可增加胃癌细胞对顺铂的敏感性，其机制为m i r 1 5 b 、m i r 1 6 作用于b c l 2m r n a 的3 u t r ，使癌基因b c l 2 的表达量下降。但m i r n a在肺癌细胞对顺铂耐药机制中的功能目前还没有报道，这就是本研究所要解决的问题。第四节研究方法本实验在已有研究基础上针对肺癌耐药这一具有重要临床价值的科学问题，以人肺腺癌细胞系a 5 4 9 及其对顺铂耐药细胞系a 5 4 9 d d p 为模型，依照国际上研究m i r n a 的常规方法，使用m i r n a 芯片技术检测a 5 4 9 和a 5 4 9 d d p中m i r n a 表到谱。m i r n a 表达谱芯片是基因芯片的一种。其基本原理是将m i r n a探针固定到支持物上，然后使探针与用荧光标记的样品分子进行杂交，通过检测荧光信号的强弱来分析样品中相应m i r n a 的表达量( 如图1 4 ) 。根据m i r n a表达谱芯片结果挑选部分m i r n a 进行荧光实时定量p c r 验证，确定在a 5 4 9 和a 5 4 9 d d p 中存在表达差异的m i r n a 。从这些m i r n a 入手进一步研究其在肺癌细胞耐药方面的功能，明确它们与肺癌细胞耐药的关系( 如图1 5 ) 。从而为临床耐药肺癌的治疗提供新的理论依据和药物作用靶点。6绷辑l o a 扦奢掌s u r f a c e图1 4m i r n a 芯片原理a 5 4 9 细胞系耵约系积兀丁q童i提取跳l 蛹础姐芯片续选差异袁达m 网慨荧光实时定量p c r 验证m i r n a 功能er转梁m 1 r n a 袭达栽绺赛粒细胞耐药性交化图1 5 技术路线7完2 1 1细胞系第一节实验材料实验使用来源于a t c c 的a 5 4 9 、a 5 4 9 d d p 细胞系，购自中国医学科学院肿瘤医院。2 1 2 实验试剂2 1 2 1主要试剂r p m i 1 6 4 0 干粉购自g i b c o 公司。胎牛血清( 南美血源) 购自h y c l o n e 公司。注射用顺铂( 冻干型) 为齐鲁制药产品。c e l lc o u n t i n gk i t 8 ( c c k 8 ) 购自d o j i n d o 公司。t r ir e a g e n t 、购自s i g m a 公司。1 0 p o l yab u f f e r 、e c o l yp o l yap o l 购白n e we n g l a n d 公司。a t p ，i m p r o m - i i1 m5 r e a c t i o nb u f f e r 、m g c l 2 、i mp r o mi i1 mr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 、p l u ss vm i n i p r e p sd n ap u r i f i c a t i o ns y s t e m( 包括c e l lr e s u s p e n s i o ns o l u t i o n 、c e l ll y s i ss o l u t i o n 、a l k a l i n ep r o t e a s es o l u t i o n 、n e u t r a l i z a t i o ns o l u t i o n 、w a s hs o l u t i o n 、n u c l e a s e f r e ew a t e r 、s p i nc o l u m n ) 均购自p r o m e g a 公司。d n t pm i x t u r e 、c l o n e dr i b o n u e l e a s ei n h i b i t o r 、2 0 b pd n al a d d e rm a r k e r 购自t a k a r a 公司。s y b rg r e e np c rm a s t e rm i x 购自q i a g e n 公司。f u g e n eh dt r a n s f e c t i o nr e a g e n t 购自r o c h e 公司。t o p1 0 感受态细胞、p c d n a3 0 由军事医学科学院二所五室保存，p m i r n a 表达载体质粒由军事医学科学院二所五室构建并保存【9 1 。生理盐水、青霉素、链霉素、氨苄霉素、二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) 、氯仿、异丙醇、7 5 乙醇、水饱和酚、醋酸钠( 3 mp h 5 6 ) 、无水乙醇、琼脂粉、1 t a b 、溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ，e b ) 、1 0 l o a d i n gb u f i e r 等。2 1 2 2 实验所用液体的配制8材料与方法r p m i 一1 6 4 0 培养基：r p m i - 1 6 4 0 干粉1 0 4g ，n a h c 0 31 5g ，h e p e s2 3 8g ，加纯净水至1 0 0 0m l ，用0 4 8 、o 2 2p m 的微孔滤膜过滤除菌。p b s - n a c i8g ，k c l0 2g ，n a 2 h p 0 4 。1 2 h 2 01 4 4g ，k h 2 p 0 40 2 4g ，加纯净水至1 0 0 0m l ，高压灭菌。胰蛋白酶液：称取0 2 5g 胰蛋白酶干粉溶于1 0 0m l1 p b s ，用o 4 8 、0 2 2 “m 的微孔滤膜过滤除菌。顺铂注射液：1 0m l 温生理盐水注射液溶解1 0m g 注射用顺铂( 冻干型)l b 培养基：称取胰蛋白胨1 0g ，酵母提取液5g ，n a c l1 0g ，加纯净水稀至1 0 0 0m l ，高压灭菌。氨苄青霉素：lg 氨苄青霉素溶于1 0m l 水，使用时按l ：1 0 0 0 稀释。l b 琼脂培养基：胰蛋白胨1 0g ，酵母提取液5g ，n a c i1 0g ，琼脂1 5g ，加纯净水稀至1 0 0 0m l ，高压灭菌。2 1 2 3引物本实验所用m i r n a 序列由m i r b a s e 数据库提供，引物由i n v i t r o g e n 公司合成。引物序列见表1 2 。2 1 2 4 实验材料细胞培养瓶、离心管、e p 管、移液管、e p p e n d o r f d r a g o n g i l s o n 移液器、9 6孔板、6 孔板、去r n a 酶枪头及e p 管、电泳槽、注射器、滤器等。2 1 3 实验设备超净工作台由北京半导体设备一厂生产。f o r m as e r i e si i3 1 1 1 型c 0 2 培养箱由美国t h e r m o 公司生产。3 k 1 5 低温离心机由德国s i g m a 公司生产。微量高速离心机、1 7 1 型倒置显微镜由日本o l y m p a s 公司生产。y p l 0 0 2 电子天平由上海越平科学仪器有限公司生产。d u 6 4 0 紫外分光光度计由美国b e c k m a n 公司生产。g e n e q u a n tp r or n a d n ac a l c u l a t o r ( r n a 、d n a 定量仪器) 由a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司生产。t - p e r s o n a lp c r 仪由德国b i o m e t r a 公司生产。m x 3 0 0 0 p 荧光实时定量p c r 仪由s t r a t a g e n e 生产。m u l t i m a g e 凝胶成像仪由美国a l p h ai n n o t e c h 公司生产。h w l 型电热恒温水浴箱由北京医疗设备厂生产。d y y - 6 c 稳压稳流电泳仪由北京六一仪器厂生产。e a s yp u r el f 超纯水器由美9材料与方法国b a r n s t e a dt h e r m o l y n e 公司生产。t h z - c 恒温振荡器由江苏太仓市实验设备厂生产。表1 2 实验用引物序列名称序列m i r - r tu 65 端引物u 63 端引物q p c r 反向引物h s a m i r 7h s a m i r 4 5 5 - 3 ph s a - m i r - 15 0 *h s a - m i r 1 6h s a - m i r - 15 bh s a m i r 10 ah s a - m i r - 13 0 ah s a - m i r 1 3 8h s a m i r 215h s a - m i r 2 7 bh s a - - m i r - - 3 2 4 3 ph s a - m i r 2 7 b *h s a - m i r - - 371 - - 5 ph s a - m i r - 3 3 5h s a m i r 15 b *h s a m i r 3 2h s a - m i r 13 7h s a - m i r - 5 4 2 3 ph s a m i r 15 0h s a m i r 12 4 6g c g a g c a c a g a a t t a 芦正a c g a c t c a c t a t a g g ( t ) 1 8 v nc g c t t c g g c a g c a c a t a t a c t ac g c t t c a c g a a t t t g c g t g t c ag c g a g c a c a g a a t t a 芦j a c g a ct g g a a g a c t a g t g a t t t t g t t g tg c a g t c c a t g g g c a n 虹a c a cc t g g l a c a g g c c t g g g g g a c a gt a g c a g c a c g t aaa t a 丌g g c gt a g c a g c a c a t c a t g g t j 丌a c at a c c c t g t a g a t c c g aa m g t gc a g t g c a a t g t t a a a a g g g c a ta g c t g g t g t t g t g a a t c a g g c c ga t g a c c l j a t g a a t t g a c a g a ct t c a c a g t g g c 融g t t c t g ca c t g c c c c a g g t g c t g c t g ga g a g c l 1 a g c t g a t t g g t g a a ca c t c a a a c t g t g g g g g c a c tt c a a g a g c a 芦d 1 a a c g a a a a a t g tc g a a t c a t l l 芦汀t t g c t g c t c t a1 ：汀t g c a c a t t a c t a a g t t g c at 丑盯t g c l t a a g a a t a c g c g t a gt g t g a c a g a t t g a t aa c t g a a at c t c c c a a c c c t t g t a