（发酵工程专业论文）广地龙中纤维蛋白溶酶的提纯及性质研究.pdf

夭津商学院硕 卜 学位论文 摘 要 摘要 血栓性疾病对人类的威胁越来越大，目前使用的溶栓药物均存在这样那样的缺 陷且价格昂贵，新型溶栓产品的开发刻不容缓。叫纤维蛋白溶酶 ( e a rt h w o r m fi b r i n o l y t i c e n z y m e , e f e ) 是一类具有较 好溶栓 效果且毒副作用较小的 新型溶栓因 子， 有望发展为一新型溶栓剂。本课题以广地龙为原料，致力于开发出一条易于放大为 规模化生产的叫纤维蛋白溶酶提纯工艺路线，并对得到的产品进行了进一步纯化， 然后进行了性质研究。 首先考察了广地龙中叫纤维蛋白 溶酶的水提取工艺，分别考察了提取时间，提 取次数和溶剂体积三个因素对提取效果的影响， 最终确立了加入7 . 5 倍的 溶剂( v / m ) , 提取三次，每次 2 h的水提取工艺。并进行了盐析浓度段的考察，最终确定了选取 3 07 0 % 硫酸钱浓度段进行盐析。 然后考察了d 4 0 2 0 , d 3 5 2 0 , a b - 8 , n k a - 9 , s - 8 , x - 5 , 2 0 1 x4 , 2 0 1 x7 , d 2 9 6 , d 3 8 0 , d 2 9 0 , d 2 8 0 等1 2 种树脂应用于酬纤维蛋白 溶酶提纯的可能性， 最终筛选出 了d 4 0 2 0 和d 3 5 2 0 两种树脂。 对d 4 0 2 0 树脂的吸附条件进行了优化。 确立了采用5 0 %的乙醇溶液作为洗脱剂; 上柱 液的 最 佳固 性物 浓度为5 0 m g / m l ; 不 需 考 虑p h ; 最 适吸附 流 速1 .0 m l / m in ; d 4 0 2 0 树脂和上柱液的比 例为1 : 1 2 ; 最适洗脱流速为1 .0 m l / m i n ; d 4 0 2 0 树脂和洗 脱液用量比为 1: 8 等参数。并计算了d 4 0 2 0 树脂的提纯效果，认为酶的总得率为 7 4 .9 9 %，与水提取液相比纯度提高1 5 . 1 4 倍， 最终产品纤维蛋白活性达2 9 .4 5 i u / m g 固性物。 对提纯产品进行了进一步的纯化 该物质仍具有纤溶活性，且纯度较高 在p h 3 .0 - 9 .0 稳定; 最 适反 应p h 7 .4 ; 糖量为 1 . 1 9 %; v m a x =1 3 4 .9 5 b a e e 截取了6 - 2 0 k d分子量段的物质。经检验， 达电泳纯。对其进行了性质研究，认为该 酶 低于 效价， 6 0 时稳定;最适反应温度5 5 - 6 0 0c ;含 k m=0 . 1 6 8 7 mg / m l 关键词:纤维蛋白溶酶，大孔吸附树脂，纯化，广地龙 天津商学院硕士学位论文 摘 要 ab s t r a c t t h e h a r m o f t h r o m b i t o h u m a n i s b e c o m i n g m o r e a n d m o r e s e v e r e , b u t t h e t h r o m b o l y t i c s u s e d n o w h a v e s o m u c h l i m i t a t i o n t h a t t h e f i n d i n g o f n e w t h r o m b o l y t i c i s a v e r y u r g e n t t a s k . e f e ( e a rt h w o r m f i b r i n o l y t ic e n z y m e ) h a s g o o d t h r o m o b o l y t i c c a p b i l i t y a n d i s i n n o c u o u s , w h i c h c a n b e d e v e l o p t o a n o v e l t h r o m b o l y t ic . s o t h e i m p o rt a n c e o f t h e a rt ic l e w a s a t t a c h e d t o s e a r c h i n g a p i e c e o f e f e - p u r i f y i n g t e c h n i c s , w h i c h w a s e a s y t o i n v e rt t o i n d u s t r i a l i z e d p r o d u c t i o n . a n d t h e p r o d u c t i o n o f t h e t e c h n i c s w a s f u rt h e r p u r i f i e d , t h e n t h e p r o p e rt y s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d f r i s t , t h e d i s t i l l i n g t e c h n i c s b y w a t e r w a s r e s e a r c h e d . t h e e ff e c t s t o p u r i f i c a t i o n o f d i s t i l l - t i m e , d i s t i l l - t i m e s , a n d t h e v o l u m e o f s o l v e n t w e r e s t u d i e s . t h e n t h e t e c h n i c , a d d i n g 7 . 5 t i m e s s o l v e n t o f e a r th w o r m , d i s t i l l i n g 3 t i m e s , 2 h p e r t i m e s , w a s a c h i e v e d . i n a d d i t i o n , t h e c o n t e n t r a n g e o f 3 0 - - 7 0 / o n h 4 s o 4 w h e n s a l t i n g o u t w a s c o n f i r m e d . t h e p o s s i b i l i t y o f a p p l y in g 1 2 ma r s ( m a c r o p o r o u s a d s o r p t i o n r e s i n ) , d 4 0 2 0 , d 3 5 2 0 , a b - 8 , n k a - 9 , s - 8 , x - 5 , 2 0 1 x 4 , 2 0 1 x 7 , d 2 9 6 , d 3 8 0 , d 2 9 0 , d 2 8 0 , t o p u r i f y i n g e f e w a s s t u d i e d . 2 ma r s o f t h e m , d 4 0 2 0 a n d d 3 5 2 0 , w e r e s i n g l e d o u t . t h e w o r k i n g c o n d it i o n s o f d 4 0 2 0 w e r e o p t i m i z e d . i t w a s c o n f i r m e d t h a t 5 0 % e t h a n o l s o lu t i o n a s p u r g i n g r e a g e n t ; t h e m o s t a p p r o p r ia t e c o n t e n t o f a d s o r b i n g s o l u t i o n w a s 5 0 m g l m l ; p h w a s n t n e e d t o t h i n k ; t h e m o s t a p p r o p r i a t e a d s o r b s p e e d w a s 1 .0 m l l m i n ; t h e v o l u m e r a t i o o f d 4 0 2 0 a n d a d s o r b i n g s o l u t i n w a s 1 : 1 2 ; t h e m o s t a p p r o p r i a t e p u r g e s p e e d w a s 1 .0 m l l m i n ; t h e v o l u m e r a t i o n o f d 4 0 2 0 a n d p u r g i n g s o l u t i o n w a s 1 : 8 . t h e a c h i e v i n g r a t i o o f e f e w a s 7 4 . 9 9 % , t h e p u r i f i c a t io n t i m e s w a s 1 5 . 1 4 , a n d t h e f i n a l p u r i t y w a s 2 9 .4 5 i u 加9 . t h e e n z y m e a c h i e v e d a b o v e w a s f u rt h e r p u r i f i e d . t h e m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e o f 6 2 0 k d w a s g a i n e d , w h i c h w a s e l e c t r o p h o r e s i s p u r i f i c a t io n b y s d s - e l e c t r o p h o r e s i s t e s t . a ft e r p r o p e rt ie s s t u d y i n g , i t w a s s t e a d y a t p h 3 .0 - 9 .0 a n d 6 0 c , t h e m o s t p r o p e r r e a c t i n g p h a n d t e m p e r a t u r e w a s 7 .4 a n d 5 56 0 ，t h e c o n t e n t o f g l u c i d e w a s 1 . 1 9 % , v m a x = 1 3 4 .9 5 b a e e e ff e c t io n , k m=0 . 1 6 8 7 m g l m l . k e y w o r d s : e f e ; ma r ; p u r i f i c a t i o n ; e a rt h w o r m 天津商学院硕 1 _ 学位论文 第一章前 六 第一章前言 1 . 1选题的背景 血栓性疾病一直以来就是威胁人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织 ( wh o ) 统计，全世界每年大约有 1 2 0 0万人死于心脏病和脑卒。 卫生部统计资料 表明， 每年我国 死于心脑血管疾病的人数超过2 0 0 万人，发病人数超过2 0 0 0 万人。 近年来4 0岁以下人群发病率比5 年前增加6 倍。今后2 0 年我国将进入老龄社会， 目前6 0 岁以上的老人已达到 1 亿以上， 占人口比例的8 .7 %， 而血栓性疾病又是中老 年人的高发病， 致死、 致残率极高， 再加上现在使用的溶栓药物如链激酶 ( s k ) , 尿 激酶 ( u k ) 、 组织型纤溶酶原激活剂 ( t -p a ) 等都存在几个明显的不足: 半衰期短、 产生再栓塞且价格昂贵。另外，由于它们对纤维蛋白无特异性，诱发血栓溶解的同 时伴有严重出血副作用。因此，对新型溶栓因子的研究已是一项迫在眉睫的工作。 1 . 1 . 1 血栓的形成和溶栓的理论基础 血液中存在着相互拮抗的凝血系统和抗凝血系统 ( 纤维蛋白 溶解系统)。在生 理状态下，血液中的凝血因子不断地被激活，从而产生凝血酶，形成微量纤维蛋白， 沉着于血管内膜上，但这些微量的纤维蛋白又不断地被激活了的纤维蛋白溶解系统 所溶解，同时被激活的凝血因子也不断地被单核吞噬细胞系统所吞噬。这样，凝血 系统和纤维蛋白 溶解系统的动态平衡，即保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证 了血液的流体状态。然而，有时某些能促进凝血过程的因素的存在或者内源性纤溶 途径发生紊乱，打破了上述动态平衡，就会因纤维蛋白的持续存在或异常堆积导致 血栓的形成。这时就需要外源性溶栓因子来参与纤维蛋白降解，从而达到防止和治 疗血栓的目 的 ， 。 目 前 溶解血栓一般有两类溶 栓剂 阴 。 一种是纤维蛋白 溶酶原 激活剂， 其可以 激活 天津商学院硕 1 _ 学位论文 第一章前 六 第一章前言 1 . 1选题的背景 血栓性疾病一直以来就是威胁人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织 ( wh o ) 统计，全世界每年大约有 1 2 0 0万人死于心脏病和脑卒。 卫生部统计资料 表明， 每年我国 死于心脑血管疾病的人数超过2 0 0 万人，发病人数超过2 0 0 0 万人。 近年来4 0岁以下人群发病率比5 年前增加6 倍。今后2 0 年我国将进入老龄社会， 目前6 0 岁以上的老人已达到 1 亿以上， 占人口比例的8 .7 %， 而血栓性疾病又是中老 年人的高发病， 致死、 致残率极高， 再加上现在使用的溶栓药物如链激酶 ( s k ) , 尿 激酶 ( u k ) 、 组织型纤溶酶原激活剂 ( t -p a ) 等都存在几个明显的不足: 半衰期短、 产生再栓塞且价格昂贵。另外，由于它们对纤维蛋白无特异性，诱发血栓溶解的同 时伴有严重出血副作用。因此，对新型溶栓因子的研究已是一项迫在眉睫的工作。 1 . 1 . 1 血栓的形成和溶栓的理论基础 血液中存在着相互拮抗的凝血系统和抗凝血系统 ( 纤维蛋白 溶解系统)。在生 理状态下，血液中的凝血因子不断地被激活，从而产生凝血酶，形成微量纤维蛋白， 沉着于血管内膜上，但这些微量的纤维蛋白又不断地被激活了的纤维蛋白溶解系统 所溶解，同时被激活的凝血因子也不断地被单核吞噬细胞系统所吞噬。这样，凝血 系统和纤维蛋白 溶解系统的动态平衡，即保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证 了血液的流体状态。然而，有时某些能促进凝血过程的因素的存在或者内源性纤溶 途径发生紊乱，打破了上述动态平衡，就会因纤维蛋白的持续存在或异常堆积导致 血栓的形成。这时就需要外源性溶栓因子来参与纤维蛋白降解，从而达到防止和治 疗血栓的目 的 ， 。 目 前 溶解血栓一般有两类溶 栓剂 阴 。 一种是纤维蛋白 溶酶原 激活剂， 其可以 激活 天津商学院硕士学位论文第一章前 言 血浆内的纤维蛋白溶酶原成为纤维蛋白溶酶进而降解纤维蛋白，从而达到溶栓治疗 目 的。目 前临床使用的多为此类溶栓剂， 如尿激酶 ( u k )、链激酶 ( s k )、 组织性 纤溶酶原激活物 ( t - p a ) 等; 事实上， 无论在体内 还是在体外， 还存在另一种能够 直接溶解纤维蛋白的酶类，其可以额外地加强血浆纤溶活性，在不影响纤维蛋白溶 酶原的条件下。达到理想的溶栓效果。有关这方面的研究无论在理论上还是在治疗 学上，都有一定的意义。这类酶体内的有:多形核粒细胞弹性蛋白酶、多形核粒细 胞糜蛋白酶等;体外的有蛇毒去纤酶、蛆0纤维蛋白溶酶等。 1 .1 .2 地龙中溶栓因子的研究进展 地龙，又称c叫、曲鳝，为常用中药， 在我国作为活血化癖的药材使用己有儿 千 年的历史。 最早的本草学著作 神农本草经就将其为6 7 种动物药之一， 其后历 代医药著作也均有记 载. 本草纲目 在地龙条目 下列有4 0 余方， 用于各科临床， 医 林改 错 列 动物药5 种9 个方， 地龙占4 方， 这些 足见历代医 药学家对地龙的 重视2 1 现代中药典认为地龙性咸、寒，清热定惊，通络，平喘，利尿，可用于高热神昏， 惊痈抽搐， 关节痹痛， 肢体麻木，半身不遂， 肺热喘咳， 尿少水肿，高血压症等13 1 对地龙中溶栓因子的科学研究是近几十年逐步发展起来的。1 9 8 3年日 本学者 m i h a r a t4 嗜次发现地龙水提物有直接溶解纤维蛋白 及纤溶酶原激活物作用， 健康人服 用该药后，纤维蛋白平板法测得外周血优球蛋白的纤溶活性明显增高，优球蛋白 溶 解时间明 显缩短。 此后其用4 周龄、 体重3 0 1 2 g 的 雄性老鼠 作急性毒性 试验。以口 服、腹膜内给药和静脉注射三种方式施用叫纤维蛋白溶酶的生理盐水液，观察 1 4 d 以 上， 没发 现毒 性 症状 和死 亡现 象。 6 个 组中口 服的l d 5 。 都大于5 妙g , 腹 膜内 给 药的l d s o 为2 09 2 m g / k g ， 平均为5 9 . 7 m g / k g , 静脉注射的l d 5 。 为2 71 3 5 m g / k g , 平均为7 2 .5 m g / k g 。 从而认为 该 提取物可望发 展为一新型无毒溶栓剂。 此后关于 地龙 中溶栓因子的研究逐渐活跃起来。现在一般认为， 地龙体内的溶栓因子主要有叫胶 原 酶和蜕纤维蛋白 溶酶 ( e a r th w o r m f i b r i n o l y t i c e n z y m e , e f e ， 简称妇纤溶酶) 两种 酶系，其中蝴纤溶酶因为又常具有纤维蛋白 溶酶原激活作用，因此又常被称为叫激 酶15 1 天津商学院硕士学位论文第一章前 言 血浆内的纤维蛋白溶酶原成为纤维蛋白溶酶进而降解纤维蛋白，从而达到溶栓治疗 目 的。目 前临床使用的多为此类溶栓剂， 如尿激酶 ( u k )、链激酶 ( s k )、 组织性 纤溶酶原激活物 ( t - p a ) 等; 事实上， 无论在体内 还是在体外， 还存在另一种能够 直接溶解纤维蛋白的酶类，其可以额外地加强血浆纤溶活性，在不影响纤维蛋白溶 酶原的条件下。达到理想的溶栓效果。有关这方面的研究无论在理论上还是在治疗 学上，都有一定的意义。这类酶体内的有:多形核粒细胞弹性蛋白酶、多形核粒细 胞糜蛋白酶等;体外的有蛇毒去纤酶、蛆0纤维蛋白溶酶等。 1 .1 .2 地龙中溶栓因子的研究进展 地龙，又称c叫、曲鳝，为常用中药， 在我国作为活血化癖的药材使用己有儿 千 年的历史。 最早的本草学著作 神农本草经就将其为6 7 种动物药之一， 其后历 代医药著作也均有记 载. 本草纲目 在地龙条目 下列有4 0 余方， 用于各科临床， 医 林改 错 列 动物药5 种9 个方， 地龙占4 方， 这些 足见历代医 药学家对地龙的 重视2 1 现代中药典认为地龙性咸、寒，清热定惊，通络，平喘，利尿，可用于高热神昏， 惊痈抽搐， 关节痹痛， 肢体麻木，半身不遂， 肺热喘咳， 尿少水肿，高血压症等13 1 对地龙中溶栓因子的科学研究是近几十年逐步发展起来的。1 9 8 3年日 本学者 m i h a r a t4 嗜次发现地龙水提物有直接溶解纤维蛋白 及纤溶酶原激活物作用， 健康人服 用该药后，纤维蛋白平板法测得外周血优球蛋白的纤溶活性明显增高，优球蛋白 溶 解时间明 显缩短。 此后其用4 周龄、 体重3 0 1 2 g 的 雄性老鼠 作急性毒性 试验。以口 服、腹膜内给药和静脉注射三种方式施用叫纤维蛋白溶酶的生理盐水液，观察 1 4 d 以 上， 没发 现毒 性 症状 和死 亡现 象。 6 个 组中口 服的l d 5 。 都大于5 妙g , 腹 膜内 给 药的l d s o 为2 09 2 m g / k g ， 平均为5 9 . 7 m g / k g , 静脉注射的l d 5 。 为2 71 3 5 m g / k g , 平均为7 2 .5 m g / k g 。 从而认为 该 提取物可望发 展为一新型无毒溶栓剂。 此后关于 地龙 中溶栓因子的研究逐渐活跃起来。现在一般认为， 地龙体内的溶栓因子主要有叫胶 原 酶和蜕纤维蛋白 溶酶 ( e a r th w o r m f i b r i n o l y t i c e n z y m e , e f e ， 简称妇纤溶酶) 两种 酶系，其中蝴纤溶酶因为又常具有纤维蛋白 溶酶原激活作用，因此又常被称为叫激 酶15 1 天 津商学院硕十学位论文第一章前 言 1 . 1 .2 . 1 酬胶原酶的研究进展 胶原酶可水解胶原，因而可降解陈旧性血栓表面坚固的外壳蛋白而对陈旧性血 栓 起作用 6 1 ， 这是叫纤溶酶所不具 备的 性质。 由 于 种种原因， 关于蝴胶原酶的 报道较 少。 钟良 玮等17 1 从双胸叫组织中 分离出 三种胶原 酶， 其中 胶原酶h 是不具亚基的 大分 子 糖蛋白 ， 酸性氨基酸含量高， 缺乏胧氨酸。 最适p h为 6 - 7 ， 最适温度3 5 - - 4 5 0c ， 在8 0 保 存1 0 m in 酶 失 活 ， c a , m 扩 + 、 b a t + , m n 2 + 促 进 酶 活 性， c o 2 % h g 2 + , e d t a , 琉基化合物及正常人血浆抑制酶活性，相对分子量为9 2 .9 k d. 0胶原酶的研究才 刚刚开始，许多性质还有待进一步探讨。 1 . 1 . 2 . 2蚜 纤维蛋白溶酶的研究进展 叫纤维蛋白溶酶是从地龙中提取的一类具有溶栓活性的复合酶类，由于其不仅 具有直接纤溶作用，还具有纤维蛋白溶酶原激活作用，因此又常被称为叫激酶。自 mih a r a首次发现地龙水提物有直接纤溶活性和纤溶酶原激活物作用后，国内外学者 先 后对 其 进行了 提 纯、 性 质 研究 和药 效学 研究 工 作 8 -1 11 ， 并 进 行了 许多 体内 体外实 验， 观察到m i 纤维蛋白溶酶具有抗凝、纤溶、抗血栓及溶血栓作用。临床研究表明， q l 纤维蛋白溶酶可使体内外血栓形成时间延长，即抗凝又不影响止血，有利于血栓的 防 治 1 2 1 1 . 1 .2 . 2 . 1 n纤维蛋白溶酶的提取和性质研究进展 张祖殉等 1 3 1通过给家兔静脉注射地龙组织提取液研究了 地龙的活血化癖作用， 认为地龙提取液中含有多种与溶栓有关的酶，尤其是通过纤维蛋白溶酶的作用使血 液循环得到改善，防止了血栓形成。 易八 贤等 1 4 1 采用聚丙烯酞 胺凝 胶电 泳进行了 赤子爱 胜酬( e i s e n i a f o e t i d a ) 和秉 代 环毛蜕( p h e r e t i m a c a m o s a ) 纤溶酶谱的研究， 认为纤溶酶主要存在于蛆叫的体腔内。 刘芳 等1 5 采用反相色谱进行了分 离赤子爱 胜酬中纤维蛋白 溶酶的 研究，并 采用 s d s -聚丙烯酞胺凝胶电泳法测定了其分子量，认为分子量分布在 1 5 0 0 06 4 0 0 0之 天津商学院硕十学位论文 第一章前 台 间。 程 牛 亮、 郑国 平 等以 双 胸 叫 为 对 象 【 16 - 1 8 3 ， 采 用d e a e 一 纤 维 素 柱 层 析 和s e p h a d e x 凝胶过滤等方法，分离出了三种电泳纯的纤维蛋白溶酶并对它们的性质进行了研究 后认为:地龙组织中的纤溶酶根据地龙种属的不同而异，但性质基本相同。等电点 3 - - 5 ， 在p h = 4 .7 - 1 0 ， 低于6 0 时 稳定，因而可在常 温下操作。 通过人纤维蛋白 平 板和加热平板法，测得纤溶酶i 、川只具有直接纤溶作用，而纤溶酶h 既具有直接 纤溶作用，又具有激活纤溶酶原为纤溶酶进而降解纤维蛋白的作用。另外金属离子 h g 2 和c a t + 对纤 溶酶i 活 性有明 显 的 抑制 作用， 而 利马 豆 胰蛋白 酶 抑 制剂( l b t i ) 和二异丙基辅磷酸醋 ( d f p ) 也可使纤溶酶1 1 活性受到完全抑制， 提示纤溶酶可能为 丝氨酸蛋白酶。 国 外学者也进行了 这方面的研究。1 9 9 3年 n . n a k a j im a报道 19 3 分离出了 l u m b r i c u s r u b e l l u s( 一种双胸躬 )中所有的纤溶酶，分别命名为f - 1 1 1 - 2 , f - i i i - i , f 一 1 1 , f 一 1 - 2 , f 一 1 - 1 和f 一 1 - 0 . s d s凝胶电泳和凝胶过滤测定，它们的分子量 具有较大差异。等电点分别为3 .4 0 , 3 .6 0 , 4 .2 0 , 4 .0 0 , 4 .3 0 , 4 . 8 5 。该组酶具有强的 纤溶活性，但无纤溶酶原激活作用。 迟 玉 杰 等 2 0 -2 2 3利 用s e p h a d e x 凝 胶 过 滤 分 离 纯 化出 一 种 叫 纤 溶 酶 并 对 其 性 质 进 行 了 研究， 得到了类似的结果。另外其采用的以酪蛋白或b a e e( 苯甲酞-l 一精氨酸 乙 酷 盐 酸盐) 为 底物测定 酶活 性的 方 法 2 0 ,2 3 简化了 程牛 亮 等采 取的 较 普遍使用的 纤 维蛋白 平板法。 邵承斌等 2 4 3 也 报道了以b a e e为 底物测定 叫纤维蛋白 溶酶活 性的 方 法，并进行了改进。 林 少 琴 等 2 5 用自 制 的 牛 血 纤 溶 酶 原s e p h a r o s e 4 b 亲 和 层 析 柱 对 太 平1 1 号 叫 提 取 物进行亲和层析，得到了一种单一的0纤溶酶。 经研究认为该酶为糖蛋白， 含糖量 为1 .4 3 %，分子量为3 0 k d 。 苯甲基磺酞氟 ( p ms f ) 对其活性有显著的抑制作用， 显 示该纤溶酶为典型的丝氨酸蛋白酶。另外在其实验中测定纤溶酶原激活活性时，采 用了改进的 s k i m m i l k 琼脂平板法，简化了一般采用的加热平板法。 汤涌、 张季平2 6 -2 7 3 得到了 赤子爱胜酬的一种纤溶酶组分的单晶并测定了晶 体结 构。 该晶体属斜方晶系， 空间群为p 2 1 2 1 2 1 ， 晶胞参数为a = 4 0 . 6 , 6 = 1 2 7 . 5 , c = 1 2 9 .2 , 每一个不对称单位含有 3 个蛋白 质分子。另外还确定了每个不对称单位中3 个独立 天津商学院硕士学位论文第一章前 言 蛋白质分子之间的非晶体学对称关系， 并利用其对初始的电子密度进行平均， 大大 提高了电子密度质量， 为进一步的结构解析奠定了基础。 吴 学勤等1 2 8 进行了 叫纤溶酶的固定化的 研究。 将纤 溶酶川一 1 固定化在 基二咪哇活化的交联琼脂糖树脂中，结果虽然活性下降到了天然酶的 6 4 %, 固定化在澳化氰活化的树脂上活性高。 ，1 - 挨 但要比 近年来， 基因重 组技术也逐 渐应用于蝴纤 溶酶的 研究中。 陈飞!2 9 1 、 徐义辉3 0 1 等 分别从双胸叫中获得了纤溶酶基因 p 2 3 9 , p 2 4 2 ,随后构建了 p b v 2 2 0 / p 2 3 9 , p t r x f u s / p v 2 4 2 重 组质 粒， 并 分 别 在大 肠杆 菌d h 5 a 、 g 1 7 2 4 中 进行了 表达， 经 活 性测定，其表达产物均具有纤维蛋白平板溶解活性。 表 1 - 1 各种属地龙中纤溶酶性质一览表 地龙种属名称 1 1 - 2 1 1 - 4 分子量和性质稳定性抑制剂 p a i 科钳齿远v i 2 3 士2 k da 4 0 士2 k da 1 1 - 2 正叫科双胸蜘属纤溶酶 1 1 赤子爱胜蝴 丝 ef卜- d ( 凝胶过滤，电泳) 单体酶, h 一直接，间接活性 3 6 士1 . 2 k d a ( 3 .6 4 ) ( 凝胶过滤，电泳) 单体酶 直接，间接活性。 2 4 . 8 9 2 k d ( 4 .0 ) 直接，间接活性 p h = 4 - 1 0 室温 6 0 m i n ; 5 5 以 下6 0 m i n , 水溶液室温4 个月， 3 7 -c 4 d ;5 0 -c i h ; 6 0 - c 3 0 m i n l b t i ( 1 0 0 % ) t l c k ( 6 0 % ) d f p ( 2 0 % ) l b t i ( 1 0 0 % ) d f p ( 1 0 0 %) p ms f ( -6 0 % ) t p c k ( -6 5 %) t l c k ( -7 0 o b ) 赤子爱胜蝴b川. l b姗 1 b v in - 2 赤了爱胜叫地龙纤溶酶 3 0 k da . 2 5 k da , 3 0 k da ( 凝胶电泳) 直接，间接活性. 2 7 k da ( 凝胶电泳)， 中牲己 糖2 .9 2 % , 唾液酸0 .2 2 % , n 乙酞葡萄 糖胺 1 . 0 3 %, 直接，间接活性. b v m - 2 慈菇蛋自 酶抑制剂 ( 1 0 0 % ) p ms f ( 8 3 % ) 注:l b t i ， 利马豆胰蛋白 酶抑制剂: t l c k , n 一 对甲 苯磺酞赖氨酞氯甲基酮; 磺酞苯丙氨酞氧甲酮:d f p ，二异丙基氟磷酸醋;p m s f ，苯甲 基磺酞氟。 t p c k,甲苯 天津商学院硕士 学位论文 第一章前 含 n . n a k a j i m a 、 杨嘉树 等先 后 完 成了 t 3 纤 溶酶 单体 氨基 酸组 成 分 析 3 1 - 3 3 ， 研究 发 现这些单体具有相似的氨基酸组成，其中甘氨酸、天冬酞胺、丝氨酸、丙氨酸和苏 氨酸含量较高，谷酞胺、脯氨酸、 亮氨酸及异亮氨酸在某些单体中含量也较高，但 赖氨酸的含量均较低，这点同人纤溶酶的氨基酸组成有明显的差异。 总之，目 前对叫纤维蛋白溶酶分离提取和性质方面的研究非常活跃。 从己有的资 料看，叫纤溶酶是一组同工酶，地龙种属不同，纤溶酶组成各异。一般来说，叫纤 溶酶是一 种糖蛋白 ， 属于 丝氨酸蛋白 酶。 其p i 值偏酸性， 分子量在1 5 0 0 0 - - 6 4 0 0 0 , 在p h = 5 - - 1 0 , 低于6 0 条件下稳定。 大部 分纤溶酶同 时具 有直接纤 溶作用和激活纤 维蛋白溶酶原的作用，少数纤溶酶只有直接纤溶作用。不同种属的叫纤溶酶性质见 表 i 一 1 34 1a 1 . 1 .2 .2 .2蚂 纤维蛋白溶酶溶栓效果研究进展 叫纤维蛋白 溶酶溶栓的 机制为 3 5 -3 6 1 : 1 ) 与纤维蛋白 有特殊的 亲和力， 能与纤维 蛋白结合而使纤维蛋白迅速降解，同时还能降低血液粘度，提高血氧饱和度，改善 微循环:2 )水解凝血因子 i ，抑制了血小板在其表面的粘附;3 )类似 t - p a作用， 激活纤溶酶原成为纤溶酶进而降解纤维蛋白，从而发挥间接作用。 血纤维蛋白原可以促进血小板及红细胞凝集。增加血浆粘度。血纤维蛋白原及 其降解产物还可以作用于血管壁，并可直接参与血栓的形成。因此纠正高纤维蛋白 原 血症 对于防 止和治疗血栓性疾病十分重要。高颖等3 7 】用蝴纤维蛋白 溶酶治疗心肌 梗死合并高纤维蛋白原血症4 3 例，分别于用药前、后测定了血纤维蛋白原，发现用 药2 周后， 血纤维蛋白原含量明显 下降( 4 .3 3 土1 .0 9 g / l , ) ， 与用药前( 5 . 3 4 士 0 .8 9 g / l ) 相比 有 显著 性差异 ( p 0 . 0 5 ) 。 用 药3 周后纤维蛋白 原 进一步降 低 ( 3 . 7 1 士 0 .4 8 g / l ) , 与用药前和用药后2 周相比均有显著性差异 ( p 0 . 0 5 ) 。用药后2 周和3 周，叫纤维 蛋白溶酶组与对照组相比亦有显著性差异 ( p 0 . 0 5 ) ，且无明显不良反应。 采用妇纤维蛋白 溶酶防止和治疗脑血栓，效果极其显著。许多临床资料都证实 了 此点，并对酬纤溶酶治疗缺血性脑病和其他药物做了比较。凌霄3 8 观察了 酬纤溶 酶治疗急性缺血性脑血管病的疗效，治疗组在对照组基础上加用叫纤溶酶治疗2 1 d , 天津商学院硕士学位论文第一章前 言 显效率为 8 8 .2 3 %，对照组为 6 7 . 6 4 %，两组显效率比较有显著性差异 ( p 0 .0 5 ) 。黄 占东 等3 9 观察蝴纤 溶酶治 疗脑梗塞的 疗效并 与 右旋糖配- 4 。 加川芍 嚓进行了比 较， 结 果显示蚜 纤溶酶治疗脑梗塞，基本治愈率及总有效率分别是3 8 % 及9 0 %，疗效优于 右旋糖配- 4 0 加川芍嗦。 总之，叫纤维蛋白溶酶有较强的溶栓活性且已大量应用于临床。一期临床耐受 性实验结果表明， 在所试验剂量( 1 0 0 , 2 0 0 , 4 0 0 , 6 0 0 m g ) 下， 不影响受试者的神经系统、 心血管、呼吸系统、肝脏和肾脏的功能3 5 1 。 三期临床观察总有效率为8 8 .2 1 %， 显效 率为6 8 .9 1， 未发现不良反应和副作用， 这与国外报道有效率8 0 %以 上一致4 0 1 对叫纤维蛋白溶酶的开发应用也有不少报道。如南京医药股份有限公司南京恒 生 制药厂等单 位4 11 研制开 发的复 方地龙 胶囊组方和中国 科学院 生 物物 理研究所吴 骋、 樊蓉等研制的口 服酬激酶胶囊14 2 1 均是以 叫 纤溶酶为主要成分的 溶栓新 药。 据报 道，这些药有较强的溶栓作用且安全可靠，无毒副作用。 1 . 1 . 2 . 2 . 3 目前研究的不足 由上可知，目 前对叫纤维蛋白 溶酶进行了包括提取技术、性质和药效学研究等 在内的一系列研究工作，且已有产品上市。由 其溶栓效果方面的研究可知，该酶确 实具有较好的溶栓疗效，且毒副作用较小， 是一种值得期待的新型溶栓剂。 但是目 前对其的研究主要集中在实验室的分离提取及其溶栓活性上，对其具体结构和溶栓 机理的研究不多。更重要的是，对叫纤溶酶分离提取技术的研究还集中在实验室阶 段，不易放大为规模化生产，即便是已经推出的产品也只是采用了传统的水提法， 纯度不高，药效较低，影响了对其大规模的开发利用口因此，今后可考虑使用大孔 吸附树脂技术分离提取0纤溶酶方面的研究，以用于大规模的生产。 1 . 1 .3 大 孔吸附 树脂 ( m a c r o p o r o u s a d s o r p t i o n r e s in , m a r ) 技术 应 用 现 状 大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物， 理化性质稳定， 不溶于酸、 碱及有机溶剂，对目 标产物有浓缩、分离作用且不受无机盐类及强离子、低分子化 天津商学院硕士学位论文第一章前 言 显效率为 8 8 .2 3 %，对照组为 6 7 . 6 4 %，两组显效率比较有显著性差异 ( p 0 .0 5 ) 。黄 占东 等3 9 观察蝴纤 溶酶治 疗脑梗塞的 疗效并 与 右旋糖配- 4 。 加川芍 嚓进行了比 较， 结 果显示蚜 纤溶酶治疗脑梗塞，基本治愈率及总有效率分别是3 8 % 及9 0 %，疗效优于 右旋糖配- 4 0 加川芍嗦。 总之，叫纤维蛋白溶酶有较强的溶栓活性且已大量应用于临床。一期临床耐受 性实验结果表明， 在所试验剂量( 1 0 0 , 2 0 0 , 4 0 0 , 6 0 0 m g ) 下， 不影响受试者的神经系统、 心血管、呼吸系统、肝脏和肾脏的功能3 5 1 。 三期临床观察总有效率为8 8 .2 1 %， 显效 率为6 8 .9 1， 未发现不良反应和副作用， 这与国外报道有效率8 0 %以 上一致4 0 1 对叫纤维蛋白溶酶的开发应用也有不少报道。如南京医药股份有限公司南京恒 生 制药厂等单 位4 11 研制开 发的复 方地龙 胶囊组方和中国 科学院 生 物物 理研究所吴 骋、 樊蓉等研制的口 服酬激酶胶囊14 2 1 均是以 叫 纤溶酶为主要成分的 溶栓新 药。 据报 道，这些药有较强的溶栓作用且安全可靠，无毒副作用。 1 . 1 . 2 . 2 . 3 目前研究的不足 由上可知，目 前对叫纤维蛋白 溶酶进行了包括提取技术、性质和药效学研究等 在内的一系列研究工作，且已有产品上市。由 其溶栓效果方面的研究可知，该酶确 实具有较好的溶栓疗效，且毒副作用较小， 是一种值得期待的新型溶栓剂。 但是目 前对其的研究主要集中在实验室的分离提取及其溶栓活性上，对其具体结构和溶栓 机理的研究不多。更重要的是，对叫纤溶酶分离提取技术的研究还集中在实验室阶 段，不易放大为规模化生产，即便是已经推出的产品也只是采用了传统的水提法， 纯度不高，药效较低，影响了对其大规模的开发利用口因此，今后可考虑使用大孔 吸附树脂技术分离提取0纤溶酶方面的研究，以用于大规模的生产。 1 . 1 .3 大 孔吸附 树脂 ( m a c r o p o r o u s a d s o r p t i o n r e s in , m a r ) 技术 应 用 现 状 大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物， 理化性质稳定， 不溶于酸、 碱及有机溶剂，对目 标产物有浓缩、分离作用且不受无机盐类及强离子、低分子化 天津商学院硕士学位论文 第一章前 言 合物的干扰。其本身由于范德华力或氢键的作用，具有吸附性;又具有网状结构和 很高的比表面积，而具有筛选性能，所以为一类不同于离子交换树脂和凝胶树脂的 吸附和筛选性能相结合的分离材料。 大孔吸附树脂分离技术是2 0 世纪6 0 年代木发展起来的继离子交换树脂后的分离 新技术之一。 1 9 7 7 年南开大学 何炳林教授4 3 ! 率先在 石油化工 杂志上，以“ 吸附 与吸附树脂”为题，就国内外关于大孔吸附树脂的吸附作用、影响因素的研究以及 在环保、医药、轻纺等方面的应用和实验室工作做了系统介绍。此后关于大孔吸附 树脂技术的报道和应用研究逐渐活跃起来。目前大孔吸附树脂技术在抗生素、天然 产物和生化药物的分离中的应用非常普遍。 1 . 1 .3 . 1大孔吸附树脂技术在天然产物分离中的应用 大孔吸附树脂技术在天然产物分离中有着广泛的应用前景， 尤其在水溶性成分的 分 离中 显 示出 越来越重要的 作用。 如马 双成等4 4 1 进行了 从薄盖灵芝中 提取赤芍总 贰 的 研究， 倪学文等4 s 进行了 大孔吸附 树脂提取纯化银杏酚酸的研究， 均取得了 较 好 的效果。 1 . 1 .3 . 2大孔吸附树脂技术在抗生素分离中的应用 近年来，国内外应用大孔吸附树脂技术分离抗生素的报道不少，其中抗生素的 分离、提取、浓缩、纯化方面几乎包括目前已知抗生素的各种类型化合物，如按化 学结构分包括内酞胺类、糖昔类、醒类、含氮杂环类、多烯类、蕙环类、大环内 酷 类 和 聚 烯 类等 种类。 例 如刘 叶 青等 4 6 等以 国 产 b z - 8 4 吸附 树 脂进行了 分离 纯化 大 环内 酷 类抗生素泰乐星的 研究， k u l a n t h a i v e l p 等 4 7 1 以h p - 2 0 s s 树脂进行了 分离纯化 醒类抗生素n a p h t h o q u i n o n e s 1 - 4 的研究，均取得了 较理想的效果。 1. 1 .3 .3大孔吸附树脂技术在生化药物分离中的应用 随着生化药物的不断涌现，大孔吸附树脂技术在这方面的应用日益成熟，其特 天津商学院硕士学位论文 第一章前 言 点在于树脂在提取酶、氨基酸、蛋白 质和多肤等生物活性物质时条件温和，设备简 单，操作方便，可避免成本昂贵以及加热、化学处理过程造成的生物活性降低等问 题。 钱庭宝等4 s 将一定量的人血清白 蛋白 通过南开大学3 5 2 0 吸附树脂， 适当 选择溶 液p h , 严格控制上柱条件， 获得了 较为理想的分离纯化及浓缩效果。 钙调蛋白( c a m ) 过去常用亲和色谱法制备， 手续较为复杂， 改用d e a e 纤维素色谱配合吸附柱色谱的 方法分离纯化c a m，可得聚丙烯酞胺凝胶电泳为单一区带的样品，其效率、比活性 都较高。 解芳 等4 9 1 考察了 5 种型号的 大 孔吸附 树脂， 最终确认用s i p - 1 3 0 0 树脂从猪血 红细胞中提取s o d,取得了较好的效果。 实践应用表明，大孔吸附树脂比其他吸附剂和凝胶性树脂具有更大的吸附能力， 洗脱容易， 机械强度大，抗污染能力强，价格低廉等优点， 适于工业化大规模生产。 特别是其孔径和孔容大小、比表面积、骨架密度、极性等性能都可以 控制调节，并 任意选择，因此可适合于吸附各种物质。由于其弥补了离子交换树脂和凝胶树脂的 不足，用于蛋白质类等生物活性物质的分离可达到较为满意的纯度且操作简便，因 而可考虑将其引入生物领域用于生物物质的分离、 提取、 浓缩、 纯化等方面的研究。 天津商学院硕士学位论文第一章前 言 1 . 2选题的依据及意义 血栓性疾病越来越成为威胁人类健康的主要杀手， 而目前使用的溶栓药物如尿激 酶 ( u k ) 、 链激酶 ( s k ) 、 组织型纤溶酶原激活剂 ( t -p a ) 等都存在这样那样的 缺 陷且价格昂贵。因此，对新型溶栓因子的研究是一项非常重要且迫在眉睫的工作。 地龙在我国作为活血化癖的药材使用已有几千年的历史。目前对地龙中溶栓成 分叫纤维蛋白溶酶进行了大量的研究工作。研究表明其具有较好的溶栓疗效且 毒副作用较小，因而尽快将其开发出来用于临床是一项极有意义的工作。但是目 前 对其进行的分离提纯技术的研究多集中在实验室阶段，不易放大为规模化生产。即 便是己经推出的产品也只是采用了传统的水提法，纯度不高，降低了药效，影响了 对其的开发利用。因此本文致力于探索出一条易于放大为规模化生产的分离提取妇 纤维蛋白 溶酶的工艺路线的研究。 大孔吸附树脂技术问世4 0 多年来，己 广泛用于各种物质的大规模分离提取， 用 于蛋白 质的分离、浓缩和提纯的工作也有不少报道，因而本文以大孔吸附树脂技术 作为主要手段进行地龙中0纤维蛋白溶酶的初步提纯，期望有助于其大规模分离提 取的实现。 虽然大部分叫纤溶酶同时具有直接纤溶作用和激活纤维蛋白 溶酶原的作用， 但是 仍然