玉米细胞SOD的提取和分离及活力测定.doc

玉米细胞SOD的提取分离及活力测定【目的要求】（1） 掌握了解超氧化物歧化酶的提取、分离方法。（2） 了解超氧化物歧化酶的活力测定方法。【实验原理】超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.ZnSOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰（Mn）金属辅基的称（MnSOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（FeSOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。植物中玉米的SOD含量丰富，通过组织细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将沉淀析出。SOD抑制50%肾上腺素自氧化所需的酶定义为一个酶活力单位。【试剂与器材】1、 材料玉米粒2、 试剂（1） 磷酸缓冲液：0.05mol/L pH7.8（用0.05mol/L Na2HPO4和0.05mol/L NaH2PO4以体积比为91.5:8.5混合即可）。（2） 氯仿-乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇=3:5（V/V）（3） 丙酮（4） 碳酸盐缓冲液：0.05mol/L pH10.2（用0.05mol/L Na2CO3 和 0.05mol/L NaHCO3 以体积比为6:4混合即可）。（5） EDTA溶液：0.1mol/L。（6） 肾上腺素液：2mol/L（或在药店、医院购买1mg/ml盐酸肾上腺素注射液，取1ml注射液加1.33ml蒸馏水制得）。3、 器材（1） 研钵；（2）托盘天平；（3）离心机；（4）恒温水浴锅箱；（5）吸量管；（6）试管和试管架；（7）722型分光光度计。【实验方法】一、组织细胞破碎称取10g玉米粒，置于研钵中研磨，使组织细胞破碎。2、 提取SOD（1）将上述破碎的组织细胞加入15ml 0.05mol/L pH7.8 磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到磷酸缓冲液中，然后3000r/min 离心15min，弃沉淀，得酶提取液。（2）去杂蛋白：取上述提取液8ml加入1/4倍体积的氯仿-乙醇混合溶剂，搅拌15min，3000r/min离心15min，去除杂蛋白沉淀，得粗酶液。（3）取上述粗酶提取液5ml加入等体积的冷丙酮（用前冷却至410），搅拌15min，3000r/min离心15min,得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于10.0ml 0,05mol/L pH7.8 磷酸缓冲液中，5560水浴15min，3000r/min离心15min，弃沉淀，得SOD酶液。3、 SOD活力测定取5支试管，按下表操作。酶提取液为样品管1，粗酶液为样品管2，酶液为样品管3。空白管对照管样品管1样品管2样品管3碳酸缓冲液/ml5.05.05.05.05.0EDTA液/ml0.50.50.50.50.5蒸馏水/ml0.50,5样品液/ml0.50.50.5混合均匀肾上腺素液/ml0.50.50.50.5A480酶活力/U在加入肾上腺素前充分摇匀，30水浴中预热5分钟，加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应2min，立即以空白管调零，测定其余各管在480nm处的吸光度。【实验结果】酶活力（单位）=2（A-B）N/A式中：A和