（化学工艺专业论文）啤酒酵母的酶解及maillard反应制备牛肉香精的研究.pdf

摘要 利用啤酒废酵母为原料，制备酵母酶解液，通过以m a i l l a u r d 反应为主的系列 反应制备牛肉香精。实验主要结论如下： ( 1 ) 啤酒酵母自溶的最佳工艺为：促进剂食盐的加入量3 ，p h 5 0 ，温度5 0 ， 酵母悬浮液浓度1 0 ，时间2 4 h 。得到的酵母抽提液氨基氮得率为3 9 2 ，产品得 率为6 1 3 。用b 葡聚糖酶进行破壁，氨基氮得率可提高3 4 0 。 ( 2 ) 研究了5 种蛋白酶对酵母水解效果及酶解液风味的影响，结果表明，风味蛋 白酶的水解能力最强且得到的酵母抽提液风味最好，氨基氮得率为4 0 4 ，产品得 率为6 4 2 。 ( 3 ) 采用b o x b e h n k c n 响应面分析优化得到复合酶解工艺条件为：酶解温度4 8 ， 食盐加入量2 1 ，p h 6 3 。在此条件下得到的酶解液总氨基酸含量为2 6 1 4m 卧n l 。 ( 4 ) 对m a i l l a r d 反应产物进行感官评价，确定了主要添加物的最佳加入量，通过 单因素试验和响应面分析法优化得到的m a i l l 莉反应的最佳条件为：反应时间 1 0 6 i 血，反应温度1 0 1 ，p h 值5 6 。 ( 5 ) 对酵母自溶液进行电喷雾质谱分析( e s i m s ) ，检测出了l y s 、h i s 、觚、 鲫、g l u 、1 砷等六种氨基酸；使用氨基酸分析仪对酵母酶解液进行分析，鉴定出 主要的1 7 种氨基酸。 ( 6 ) 对牛肉香精中的挥发性风味成分进行g c m s 分析，鉴定出2 1 种挥发性化合 物，其中包括糠醛、5 甲基2 糠醛、4 甲基5 羟乙基噻唑、二氢2 甲基3 ( 2 h ) 噻 吩酮等对肉香味具有重要贡献意义的化合物。 关键词：啤酒废酵母；自溶；酶解；m a i l l 砌反应；牛肉香精；氨基酸 i i r e s e r c ho ne n z y m a t i ch y d r o i y s i so fw a s t eb e e ry e a s tf o r p r e p a r a t i o no fb e e fn a v o rb ym a i l i a r dr e a c t i o n a bs t r a c t t h eo b j e c t i v eo fm i sr e s e a r c hw 嬲t 0p r e p a r eb e e fn a v o ru s i n gm ey e a s te x t r a c t i o n o f 、v 硒t eb e e ry e a s tb yas e r i e so fr e a c t i o l l s ，f n a i l l l ym a i l l a r dr e a c t i o n t h er e s u l t sw e r e a u sf o l l 0 、s ： 1 t h er e s u l t si r l d i c a t e dn l eo p t i m 啪a u t o l y s i sc o n d i t i o i l s 、v e r ea l sf o l i o w s ：a d d i n g 3 s a l t 嬲a u 【t 0 1 y s i sp r o m t e r ，p h 5 o ，a t5 0 a l 】【dl0 b e e ry e a s ts u s p e i l s i o nf o r2 4 1 1 m e y i e l do f 狮i n oa c i dn i 昀g e ni ns u p e m a t 明tw 嬲3 9 2 ，t h ey i e l do fp r o d u c t sw a s 61 3 。t h ey i e l do f 锄i 1 1 0a c i di l i 臼0 9 e ni i ls u p e m a _ t a n tw 嬲i n c r e 2 l s e db y3 4 0 u s i n g p - g l u c 锄a s e 2 s t u d yo nm ee 旋c to fy e a s ta q u o l y s i sa n dp r o d u c tn a v o ro ff i v ep r o t e 嬲e s ，l e r e s u l t ss h o 、e dm a tt l l en a v o r e dp r o t e i i l a s ew 弱m eb e s tc h o i c e ，m ey i e l do f 锄i n 0a c i d 砷g e ni i ls u p e m a t a n tr e a c h e d4 0 4 a n dt l l ey i e l do fp r o d u c t s 陀a c h e d6 4 2 3 o p t 洒1 豳t i o no ft l l ec o m p o 吼de m 可n l o l y s i sp r o c e s sb yr e s p o n s es p a c e m 砒l o d o l o g y ( r s m ) t h e0 p t i m u mc o n d i t i o no fs a l tc o n t e n t ，t e m p e r 狐鹏，i i l i t i a lp h a n d s i l s p e n s i o n c o n c e 腑a t i o nw 淝 2 1 ，4 8 ，6 3 a n dlo 1 ke n 巧m a t i cy e a s t h y d r o l y s 如w k c hw 硒i i l a d eu i l d e rt h eo p t i m l 娜c o n d i t i o nw 嬲d e t e 砌l i l l e db y 豳 a c i da n a b s i sm a c l l i i l e ，孤l dm er e su ：l ts h o 、7 l ，e d l ec o m e n to ft o t a la l i n oa c i dr e a c h e d 2 6 1 4m g m i ， 4 t h eo p t i i n 啪c o n t e n to fr e a c t i o np r o d u c t so fm a i l l a r dr e a c t i o nw e r ee v a l u 乏此db y i l s o 巧e v a l u a t i o n t h eo p t i n m mc o n d i t i o 璐o fm a i l l a r dr e a c t i o n 珊湘o p t i 商_ z e db y s i i l 9 1 ef k 衄e x p e r i r m n t 锄dr e s p 0 i l s es u r p a c e 涨油o d o l o g ) r ( r s m ) ，o b 捌廿l e o p t i n m mc o n d i t i o n s 嬲f o l l o w ：r e a c t i o nt i r l l e ：l0 6 m i i l ，r e a c t i o nt e m p e r a t i 姐e ：10l ，i i l i t i a l p h ：5 6 5 t h e 舡n i i l oa c i d si ny e a s ta u t o l y s i ss o l u ：t i o nw e r es t u d i e du s i i l ge l e c 奄r o s p r a y i o i l i z a t i o ni o n 仃a pi i l ：l s ss p e c 仃0 m e 缸y ( e s i - m s ) ，s 恢k i n d so fa 血n oa c i d sl 挑，eb e e n i d e n t i f i e d ：l y s i n e 、h i s t i d i n e 、衄i n i n e 、a s p a r t i ca c i d 、g l u 切瑚i n e 、t r y p t o p h a n 6 f l a v o rc 0 i n p o m n t si i l l eb e e fn a v o r 、v e r ei s o l a t e d 趾di d e n t i f i e db yg 硒 c h r o m l t o g r a l p h y m 嬲ss p e c 仃o m e 仃y ( ( 配一m s ) 1 1 1 er e s u l t ss h 0 、e dt h a ts o m ei d e n t i f i e d c o m p o u l l d si t k l d c ：趾i m p o n a i nc o 嘶b u t i o nt 0n l em e a tn a v o r s u c h 嬲f u m 腿l ， 5 一m e l y l - 2 - f i h 自腑l ，3 一e m y l - 2 h y d r 0 x y 一2 - c y c l o p e n t e n - l o n e ，d i h y d r o 一2 哪e t l 猡l 一3 ( 2 h ) 一t i l i o p t 圮n o n e ，e t c 1 ( e yw o r d s ：w a s t eb e e ry e a s t ；础o l y s i s ；e r u 了m a t i ch y d r o l y s i s ；r n a i l l a r dr e a c t i o n ；b e e f n a v o r ：锄i n oa c i d i 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作 所取得的成果。尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者c 本人签鼬怕碎硼8 年易月，石日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版( 中国科学技术 信息研究所；国家图书馆等) ，允许论文被查阅和借阅苯人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容。 保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密彰 ( 请在以上方框内打“ ” ) 学位论文作者( 本人签名) ：柏辞艿年6 月，乡日 指导教师( 本人签名) ： 奢沙年多日 致谢 本论文是在尊敬的朱凯教授的悉心指导下顺利完成的，从论文的选题、试验 的开展及论文的撰写，都凝结着朱凯老师的心血和智慧。朱老师活跃的学术思想、 严谨的科学作风、朴实的为人和忘我的工作热情给我留下了深刻的印象，让我受 益终身! 值此论文完成之际，学生谨向朱老师表示深深的谢意! 感谢王传槐教授给我提供了很多有价值的文献资料以及在试验过程中对我的 提点，王传槐教授对科研事业的奉献精神让我非常敬佩，在此向玉传槐教授表示 衷心的感谢! 在试验阶段，产品的测试分析得到了理化中心于佳老师及杨云老师无私而冀 诚的帮助，在此向他们表示感谢! 特别感谢在试验过程中陪伴及帮助我的同学们，尹昕新、吴飞、陆彩霞、王 娟、王忠华、邓从静、任静、陈科等，真心的感谢你们! 最后感谢我的家人在我的学习和生活中给予我的关心、理解和支持! 杨洋 2 0 0 8 年6 月 1 文献综述 1 1 论文选题的背景及意义 随着食品工业的发展和生活水平的不断提高，人们对食品的要求越来越高，除了关心 其营养价值和卫生质量外，还注重其色香味以获得感官上和心理上的愉悦享受。肉味食品 是人类最重要的食物源之一，它特有的“肉香”是其深受消费者欢迎的灵魂和源泉。近十 年来，国内开始了对肉味香精的研究，国内一些著名企业也率先使用m a i l l a r d 反应制备肉 昧香精川，应用于肉类食品的加香。我国对肉味香精的研究起步较晚，国产肉味香精普遍 存在着质量档次不高，产品风味不够丰满的问题，远远满足不了日益增长的市场需要。我 国每年都要从国外大量进口。因此，该产品的研究开发对于，促进我国食品业的发展具有 重大的现实意义。 肉味香精的呈味反应主要是m a i l l a r d 反应。m a i l l a r d 反应( 非酶褐变) 是发生在还原 糖和氨基酸之间的反应。氨基酸来源的选择对反应物的香气和味道有较大影响。肉类水解 蛋白或直接的氨基酸与还原糖系统经过加热反应可以生成具有肉味特征的呈味物质，但由 于成本较高，所以应用受到了一定的限制。故可考虑选择一种廉价的蛋白质原料，对其水 解得到复合氨基酸源，再与还原糖发生m a i l l a r d 反应制备出肉味香精。 啤酒废酵母( w 邪t eb r e w e r sy e a s t ) 是啤酒生产的副产品，含有丰富的蛋白质。我国 啤酒产量居世界第一。2 0 0 6 年啤酒产量为3 5 1 5 万吨。啤酒废酵母约占啤酒产量2 ，除 少部分回收再生产，或作为饲料利用，大部分都被直接排放。据计算，我国每年有4 2 万 吨啤酒酵母被排放。这不仅对环境造成了污染，同时也是对资源的巨大浪费。 用食用酵母为原料，将细胞内蛋白质降解得到的酵母抽提液氨基酸平衡良好，营养全 面，且味道鲜美浓郁，具有肉香味【2 ，”5 l 。因此用啤酒废酵母抽提液作为氨基酸源与还原 糖进行m a i l l a r d 反应制备肉味香精，这对降低生产成本、资源综合利用、绿色环保、促进 国内肉味调味品的发展等方面都能起到积极的作用。 1 2 肉类香精的研究 肉类香精是最近三十年发展起来的一类新型食用香精，它包括猪肉香精、牛肉香精、 鸡肉香精、火腿香精以及各种海鲜香精等在内的一系列具有动物肉类制品香味的食用香精 的总称，主要用于方便面调料、鸡精、罐头、熏肉、酱肉、香肠、火腿肠、香辣酱等食品 以及动物饲料和宠物食品【6 j 。自七十年代以来，在国内外已得到了广泛的应用。国际上许 多香精公司如美国的i f f 公司，英国的b b a 公司，瑞士的f i r i n e m c h 公司，日本的t a k a s a g o 公司等都大量生产肉类香精。目前我国肉味香精的生产厂有1 0 0 多家，年销售额约2 0 亿 元人民币，每年以超过l o 的速度迅速增长【7 j 。 1 2 1 肉风味形成的前体物质 肉风味主要是味觉和嗅觉的组合。其中味感成分主要是肌肉中的水溶性物质，如肌苷 ( i m p ，三磷酸腺苷分解产物) ，是重要的呈鲜物质；肌酸、次黄嘌呤是苦味的来源；氨 l 基酸具有甜味或酸味；有机和无机盐类则带来咸味【8 j 。而嗅感物质即香气成分主要是一些 挥发性的有机化合物。早期对于肉风味的研究结果表明，产生这些香气成分的前体物质主 要分为两类：肌肉组织中的小分子水溶性物质和脂质。而肌肉中的大分子物质，如肌纤维 蛋白和肌浆蛋白对肉香味的形成并不重要。 作为肉香气前体物质的水溶性小分子化合物，包括肌肉在熟化过程中生成的还原糖、 肽类和氨基酸和硫胺素等。 1 2 1 1 还原糖 还原糖和氨基酸在加热时发生m a i l l 砌反应，产生肉香味。有研究表明，肉类加热以 后，其中的核糖含量降低了，说明核糖参加了肉味的产生过程。葡萄糖、果糖与核糖是肉 昧中的主要单糖组分，它们可以通过热降解或m a i l l 2 l r d 反应间接或直接的影响肉味风味的 组成。 1 2 1 2 氨基酸和肽类 氨基酸是热反应肉味香精重要的前提物质之一，不同的单体氨基酸与还原糖反应，能 够产生不同的气味。m a b r o a l 【曾对牛肉水抽提物经透析和凝胶过滤后的组分进行分析，研 究发现蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸是产生肉香的最重要的氨基酸。 1 2 1 3 硫胺素 硫胺素的降解对肉香味的产生起到很大的作用，它的热降解生成许多有香味的物质， 包括噻唑类、呋喃酮类，呋喃硫醇类和噻吩类等。据认为硫胺素降解的第一步是噻唑环中 c - n 及c s 键的断裂形成羟甲基巯基酮，这是一个非常关键的巯基酮中间产物，由此可 得到一系列的含硫杂环化合物例。这其中的一些化合物存在于肉香气挥发成分中。 1 2 1 4 脂类 脂质是肉类风味的重要前体物质，它决定了肉类的特征风味。在已经鉴定的肉类挥发 性物质中，多数都是由脂质衍生的。主要包括：醛、酮、羧酸、醇、内酯、烷基呋喃等风 味化合物。 p i p p e n 【io j 通过感官评定指出脂肪对鸡汤香气有重要贡献，仪器分析结果同样 证实脂肪受热产生的挥发性香气成分的数量多于肌肉组织受热产生的，这说明脂肪是鸡肉 香气中挥发性成分的重要来源。h o m s t e m 和c r o w e 【l l 1 2 j 以及p e a r s o n 等人【h j 也发现牛肉、 猪肉和羊肉中水溶性的提取物加热后产生的香味相近，而当加热各种肉的脂类时便可产生 各种肉的特征肉香味。由此可以看出，脂质对肉类特征风味的产生具有决定作用。 1 2 2 热反应型香精风味的形成途径 生肉是没有香味的，只有在蒸煮或烘烤时才会散发香气及肉类特有的风味。在加热过 程中，肉的各组织成分之间发生了一系列复杂反应，生成了挥发性香味物质，产生了肉香 味。肉中的主要化学成分有：蛋白质、肽类、脂肪、糖类、有机酸等。肉类香味的形成过 2 程相当复杂，主要途径有香气前体物质的热降解、m a i l l 捌反应及脂质的氧化作用。 1 2 2 1 香气前体物质的热降解 香气前体物质的热降解主要包括氨基酸和肽的热降解反应，糖降解和硫胺素的降解三 个方面。 ( 1 ) 氨基酸和肽的热降解反应【1 4 】：氨基酸和肽在较高温度( 一般高于1 2 5 ) 下逐渐降 解，脱氨脱羧形成醛、烃、胺等化合物。其中含硫氨基酸半胱氨酸和胱氨酸是最为重要的 反应物，它们加热分解产生的一些化合物本身就具肉味( 如l ，5 二甲基1 ，2 ，4 三硫戊 烷及噻唑类化合物产等) ，而另一些分解产物与2 甲基4 羟基二氢呋喃等其它成分生成的 杂环化合物( 如2 ，4 二羟2 ，5 二甲基二氢噻吩酮等) 对肉香气的形成也有一定的贡献。 m e r r i t e 和r o b e r t 还注意到香气的形成基于肽的降解而形成的一系列氨基酸，加热一种氨 基酸不会产生香味化合物【”j 。 ( 2 ) 糖降解：h e g i l s 【1 6 】等指出葡萄糖在3 0 0 时分解可形成1 0 0 多种化合物。当温度低 于3 0 0 时，也会发生一定程度的热降解，但反应的速率和程度会降低。糖类在热降解过 程中发生了焦糖化反应，一部分经脱水、环化形成羟甲基呋喃类化合物；另一部分反应生 成醛、酮类挥发性的羰基化合物，如糖、醛及其衍生物( 4 羟基5 甲基2 二氢呋喃酮) 等【1 7 】。 肌苷单磷酸盐加热后产生的5 磷酸核糖脱磷酸脱水形成5 甲基4 羟基呋喃酮，该类化 合物易与h 2 s 反应，产生浓烈的香气。 ( 3 ) 硫胺素的降解1 1 8 】：硫胺素的热降解产物为呋喃、呋喃硫醇、噻唑和脂肪族含硫化 合物。硫胺素降解的第一步是噻唑环中c - n 及c s 键的断裂形成的羟甲基硫基酮，这一 关键的中间产物进一步反应可得到一系列的含硫杂环化合物，这些杂环化合物是肉香气挥 发性成分的重要组成部分。 1 2 2 2 m a i l l a r d 反应【1 9 】 m a i l l a r d 反应是由法国生物化学家l o u i sc a i n i l l em a i l l a r d ( 1 8 7 8 1 9 3 6 ) 于1 9 1 2 年发现 的，主要是氨基酸和还原糖之间的反应。1 9 5 3 年h o d g e 对m a i l l a r d 反应的机理提出了系 统解释，认为该反应可以分成三个反应阶段【2 0 】： ( 1 ) 初级阶段：还原糖的羰基与氨基之间进行加成，加成物迅速失去1 分子水转变为 希夫碱( s l l i 行b a s e ) ，再经环化形成相应的n 取代的醛基胺，经a m a d o r i 重排转成有反应 活性的1 氨基1 脱氧2 酮糖。初级m a i l l a r d 反应不引起褐色变，也不产生香味，但其产 物是产生极重要的不挥发性香味物质的前驱物。 ( 2 ) m a i l l a r d 反应高级反应阶段：前驱物形成之后，m 2 l i l l a r d 反应变得更为复杂，开始 形成无氮以及含氮褐色可溶性化合物，此反应阶段主要包括3 条反应路线。 第l 条路线还原酮路线：由a m a d o r i 重排反应产物1 氨基1 脱氧2 酮糖在2 3 位置不可逆地烯醇化，从c l 消去胺基生成甲基二羰基中间体，其进一步反应产物如c 甲基醛类、酮醛类、二羰基化合物和还原等酮裂解产物，反应产物包括乙醛、丙酮、丁二 酮和醋酸等风味成分； 第2 条路线o s u l o s e 和h m f 路线：恕m d o r i 产物在1 、2 位置上烯醇化，并消去 c 3 上的羰基，加水分解并失去其含氮部分而生成3 脱氧o s u l o s e ，进而生成3 、4 二脱氧 o s u l o s e ，最后又脱水生成糠醛类风味成分； 第3 条路线s t r e c k e r 降解：在s t r e c k e r 降解中，各种不同的特殊醛( 亦称s t r e c k e r 醛类) ，氨基酮经过异构化形成烯醇胺，再经环化形成吡嗪类化合物。 ( 3 ) 最终阶段：高级m a i l l a r d 反应阶段形成的众多活性中间体，如葡萄糖酮醛、3 脱氧 o s u l o s e ( 3 d g ) 、3 ，4 二脱氧o s u l o s e ( 3 ，4 二d g ) 、h m f 、还原酮类、不饱和醛亚胺等等， 又可继续与氨基酸反应，最终能够都生产类黑精色素褐色含氮色素，此过程包括醇醛 缩合、环化合反应等。 m a i l l a r d 反应十分复杂，影响因素众多，既和参与m a i l i a r d 反应的氨基酸、还原糖的 种类有关，也与p h 值、温度、反应时间、水分活度等因素与关。 1 2 2 3 脂质的氧化作用 近代的关于肉类风味的研究表明，脂质及其降解产物以及脂质一m a i l l a r d 反应的相互 作用会产生一些挥发性化合物，这些化合物对产生肉类的特征风味起到重要作用1 2 。脂 质产生肉类特征香气的途径包括：热降解及热降解产物的二次反应。首先，脂质在受热过 程中分解为游离脂肪酸，其中不饱和脂肪酸( 油酸、亚油酸、花生四烯酸等) 因含有双键， 易发生氧化作用，生成过氧化物，这些过氧化物进一步分解生成酮、醛、酸等挥发性羰基 化合物，产生特有的肉香味：而含羟基的脂肪酸经脱水环化生成内酯类化合物，这类化合 物具有令人愉悦的肉香气味。其次，热降解产物继续与存在于脂质问的少量蛋白质、氨基 酸发生非酶褐变反应，反应得到的杂环化合物中有相当部分具有肉的某些特征香气。 除去全部脂肪的肉，形成的香味物质中脂肪族醛和醇失去了主导地位，脂质的氧化降 解产物消失，烷基吡嗪的数量大幅度增加，这表明在肉中脂质或它们的降解产物通过参与 m a i l l a r d 反应而抑制杂环化合物的形成【2 2 1 。 1 3 啤酒废酵母 我国是啤酒生产大国，在重庆召开的2 0 0 7 年中国糖酒业年度峰会上，中国副食流通 协会发布了2 0 0 乒- 2 0 0 7 中国糖酒业市场年度报告。报告表明，我国啤酒产量已连续4 年保持世界第一，是世界上啤酒市场增长最快的地区之一。2 0 0 6 年我国啤酒产量为3 5 1 5 万吨，同比增长1 4 7 。啤酒酵母是啤酒生产的副产物，相对于啤酒产量约占2 以上， 其中3 0 5 0 回收再生产，其余5 0 7 0 将被排弃，据此计算，我国每年有4 2 万吨啤 酒酵母被排放。目前，包括欧、美、日在内的世界各国，由于受环境保护法的严格限制， 啤酒废酵母的综合利用获得高度重视。 1 3 1 啤酒废酵母的营养成分 其实啤酒酵母的营养成分十分丰富( 见表1 1 ) 。啤酒酵母细胞内不但含有丰富的蛋白 质、维生素、谷胱甘肽、葡聚糖及甘露聚糖等营养及保健成分，可作为食用单细胞蛋白， 此外还含有海藻糖、辅酶i 、细胞色素c 、卵磷脂、r n a 、凝血质、麦角甾醇等物厨2 3 1 ， 这些物质或其降解产物及衍生物如氨基酸制剂和核苷酸及核苷制剂等在生物化学、医药及 4 保健食品中最有重要的作用。 表1 1 啤酒酵母的主要营养成分【2 4 1 t a b 1 lm a i nn u l r i t i o n a ic o m p o n e n t so fw 弱t eb e e ry e a s t 1 3 2 啤酒废酵母的利用现状 近年来，啤酒废酵母及其提取物的应用研究重点已由传统的饲料工业转向食品、医药 行业。我国及其他国家地区已制定了相应产品的质量标准。在啤酒废酵母的应用领域中， 日本处于领先地位，进行了酵母制备甘露糖、葡萄糖、海藻糖的研究【2 5 1 。据报道，日本 有7 0 的啤酒废酵母用于饲料、食品及医药行业，其中，强化饲料1 3 1 2 ，混合饲 料5 0 ，制药1 7 1 8 ，食品2 0 。国内对啤酒废酵母的利用主要是生产饲料。 1 3 2 1 在饲料工业中的应用【2 6 】 我国蛋白质饲料严重缺乏，每年都要从国外进口大量鱼粉。而由啤酒酵母制备的干粉， 富含蛋白质、维生素、矿物质及某些水解酶类，其营养价值相当于鱼粉，是一种优良的蛋 白饲料补充源。国内外已有工艺及流水线设计用于生产这种饲料。在日本有相当一部分的 啤酒废酵母用于动物强化饲料和配合饲料；在瑞典，1 0 的牛犊食用酵母蛋白。目前我国 一些大型的啤酒生产厂家，如青岛啤酒集团公司等都大力做好啤酒酵母的回收利用工作， 这对减少环境污染和提高工厂经济效益都有非常重要的意义。 近年来，国外针对饲用酵母的研究主要集中在酵母作为饲料的功能应用方面，有的是 针对酵母丰富的营养成分，如蛋白质、维生素和核酸等。像英国有的厂家就把酵母和菜子 油混合在一起进行干燥，制成动物的饲料添加剂；有的是直接将酵母当作营养物质的载体， 像美国生产的核黄素营养饲料中，就把核黄素和酵母进行混合，以添加剂形式加到动物饲 料中，如果核黄素是直接加到动物饲料中，那很可能造成在饲料中分布的不均匀，并且纯 的核黄素带有静电，流动性差，更易导致核黄素的分配不均匀，因此核黄素不宜直接加到 动物饲料中。如用干燥的酵母当载体，当核黄素附在酵母体上时可减少核黄素之间的静电 力，提高其流动性，投入动物饲料中，可达到很好的均匀分布效果。同时，酵母本身也是 一个良好的营养蛋白源，能提高动物饲料的营养成分。 1 3 2 2 在调味品行业中的应用 酵母是人类利用最早的微生物，其成分主要是蛋白质、脂肪、糖原和灰分，并含有大 量的维生素b l ，b 2 和烟碱等。通过生物技术去除其细胞壁后，再将酵母内蛋白质降解成 氨基酸和多肽，核酸降解成核苷酸，并把它们和其它有效成分如b 族维生素、谷胱甘肽、 微量元素等一起从酵母细胞中提出来所制得的人体可直接吸收利用的可溶性营养及风味 物质的浓缩物就叫酵母提取物1 2 7 j 。它含有1 8 种氨基酸和多肽，此外还含有核苷酸、维生 素、有机酸和矿物质等多种有效成分( 见表1 2 和表1 3 ) 。其氨基酸平衡良好，味道鲜美 5 浓郁，具有营养保健和调味三大功能，在食品领域内具有广阔的应用前景。 表1 2 啤酒酵母中部分矿物质含量【2 8 j 1 a b 2 1m i n e r a lc o n t e n t so f w a s t eb e e ry e a s t 表1 3 啤酒酵母中氨基酸种类及含量1 2 9 】( p p m ) t a b 卜3a m i n oa c i ds p e c i e sa n dc o n t e n t so f w a s t eb e e ry e a s t 目前，全世界众多国家如美国、日本、荷兰、丹麦等把天然调味料的研制与开发集中 于酵母抽提物。我国对于酵母抽提物的研究和生产正处于初始阶段，特别是以啤酒酵母泥 生产酵母抽提物还有许多待解决的问题。在国内，酵母抽提物最近几年也逐步为人们所认 识和接受，需求量不断上升。由于生产厂家较少和产品质量上的差距，目前国内酵母抽提 物在一定程度上还依赖与进口。面对巨大的国内外市场，我国应该加快酵母抽提物的研制、 开发与生产，提高质量和产量，降低成本，不仅可以满足国内市场的需求，还可以出口创 汇，其应用前景是非常乐观的。 目前，一般采用自溶法生产酵母抽提物，虽然个别厂家具体的生产工艺流程有所差异， 但其重要工艺流程基本一致： 啤酒酵母泥一过筛洗涤分离一预处理一分离一酵母泥一酵母悬浮物一自溶一加热灭 菌一酵母提取物一喷雾干燥一粉状产品 1 3 2 3 在医药行业中的应用 啤酒废酵母是单细胞微生物，他的细胞内除了含有多种生物活性物质，还含有许多种 完整的酶系，因此啤酒废酵母是提取多种生化物质及生化药物的宝贵资源。 r n a ：啤酒酵母中含有丰富的核糖核酸( 褂蛆) ，主要存在于细胞质内，含量可达到 4 5 8 3 ，是生产核酸和核苷酸药物的良好原料1 3 0 3 1 1 。核酸和核苷类药物具有扩张末端 血管，增加血红蛋白的浓度，增加红血球数、白血球数，减轻浮肿和抗病毒等作用。 酵母胞壁多糖：啤酒酵母约含2 0 的细胞壁，酵母细胞壁中含有丰富的活性多糖， 可用作膳食纤维，其抗癌效果也很好【3 引，是一种非常有前景的抗癌药物。如酵母b ( 1 ， 3 ) d 葡聚糖作为一种功能因子，具有独特的生物活性，能增强脯乳动物免疫活力，有抗 癌、抗细菌、抗病毒、降低血脂等功能【3 3 3 4 1 ，可以作为免疫调节剂。 谷胱苷肽( g s h ) ：利用啤酒废酵母可以制取谷胱苷肽谷胱甘肽，谷胱苷肽是由谷氨 酸、半胱氨酸、甘氨酸构成的三肽，具有参加肝细胞内的氧化还原反应及对s h 酶的激活 和提高f e 2 + 酶活性作用，在肝炎、解毒以及白内障治疗上都具有良好的临床应用。食品加 6 工将其作为食品添加剂可提高营养、加强食品风味和防止变质。 果糖二磷酸钠( f d p ) ：利用啤酒酵母中完整的酶系生产果糖二磷酸钠是啤酒废酵母 开发的一个全新途径。f d p 是人体糖代谢中的一种活性生化物质，可作为恢复和改善细 胞代谢的分子水平药物。 1 3 3 啤酒废酵母蛋白质的提取方法 酵母菌属真菌1 35 。，多数为单细胞，其外层是厚达约1 2 “m 的细胞壁，它的化学成分 主要是葡聚糖( 3 0 3 4 ) 和甘露聚糖( 3 0 ) 。此外，脂类8 5 1 3 5 ，蛋白质6 8 ，还 含几丁质。酵母菌的葡聚糖，分子量为2 4 0 0 0 0 道尔顿，是一种分支的多糖聚合物。主链 以d 1 ，6 糖苷键结合，支链则以b 1 ，3 糖苷键结合；甘露聚糖也是一种分支聚合物，主键以 a 1 ，6 糖苷键结合，而支链则以a 1 ，2 或a - l ，3 糖苷键结合，葡聚糖与甘露聚糖之间由蛋 白质维系起来。近1 0 的甘露聚糖的侧链，通过磷酸二酯键与磷酸连接。所有这些连接 方式，都使得酵母的细胞壁变得坚固。如果不把细胞壁破坏，作为细胞内容物的蛋白质， 多肽等就很难溶出，也不便进一步被酶解。所以，对酵母蛋白利用的一个关键问题就是破 坏酵母的细胞壁。目前，对酵母蛋白提取的方法主要有水解法、机械破碎、酶解法以及自 溶法。 1 3 3 1 水解法【3 6 3 7 】 水解法是酵母菌体中添加酸或碱后加水分解的方法。菌体中的氨基酸类成分通过加水 分解可收得比较高的得率，但其中分解而成的有机物和无机物微量营养成分却在营养上和 呈味性上都是低水平的物质，因而用这种方法制成的成品风味和色泽都很不理想。但水解 法常用的酸或碱为盐酸、硫酸、磷酸、氢氧化钠等，由于它们价格低廉，易于得到，仍然 被广泛应用着。 1 3 3 2 机械破碎法 机械法破壁主要有液体剪切法和固体剪切法两种。前者是利用流体高速流动时，在均 质机头的隙缝处，产生强烈的剪切作用而使细胞破碎的。使用均质机操作时，可按对细胞 的破裂要求，反复循环操作数次。 1 3 3 3 酶解法d 8 3 9 】 这是在酵母自身含有的酶以外，再另行加酶进行分解的方法。添加的酶一般可以是淀 粉酶、蛋白分解酶等。有资料表明【4 0 4 1 1 ，当p 1 ，3 葡聚糖酶和木瓜蛋白酶结合使用时，约 有9 0 - 9 3 的酵母酶解。其中，p l ，3 葡聚糖酶作用于细胞壁中的p - l ，3 葡聚糖，导致细 胞破裂；木瓜蛋白酶主要用于增加蛋白水解的速度。在用酶法破壁时，需注意各种酶的配 比和添加顺序，并尽量采用那些价格低廉，易于得到的酶类。 1 3 3 4 自溶法【4 2 ，4 3 ，4 4 ，4 5 j 这是利用酵母菌体本身含有的各种酶( 各种蛋白酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等) 的综合作用分解细胞壁的方法。自溶过程可以用如氯化钠、蔗糖、乙醇以及氯化钾这类质 壁分离剂来加速。酵母蛋白的提取程度取决于温度、p h 、时间等因素，因为酶发挥作用， 需要一定的条件，而且菌体内的酶多数处于酶原状态，如果不将酶原激活，很难发挥作用。 1 4 本课题的研究内容 本课题结合国内肉味香精的发展现状和趋势，从国内实际出发，利用啤酒工业的副产 品啤酒废酵母为原料，通过自溶、酶解得到啤酒酵母酶解液，并以其作为反应基料， 添加氨基酸、还原糖、脂类及其它添加物进行以m a i l l a r d 反应为主的热反应，制备香味纯 正、浓郁的牛肉香精，研究主要内容如下： ( 1 ) 首先通过单因素实验确定酵母自溶较适宜的悬浮液浓度、食盐加入量、自溶温 度、自溶初始p h 和自溶温度；接着通过正交试验，确定最佳酵母自溶工艺条件。 ( 2 ) 比较机械粉碎、高压均质和添加p 葡聚糖酶三种破壁方法，以氨基氮得率为评 价指标，确定较佳破壁方法。 ( 3 ) 以氨基氮得率和可溶物得率为评价指标，比较风味蛋白酶、a l c a l a s e 酶、中性 蛋白酶、木瓜蛋白酶和酵母抽提酶五种蛋白酶对酵母蛋白的酶解效果，选择最优酵母蛋白 水解酶。 ( 4 ) 研究d 葡聚糖酶和蛋白酶的加入次序对酵母蛋白水解效果的影响，确定加酶次 序；利用响应面分析法( r s m ) 优化复合酶酶解的工艺条件。 ( 4 ) 选择还原糖、氨基酸等辅料，研究各种添加辅料及反应条件对产品风味的影响， 并用r s m 对热反应制备牛肉香精的工艺进行优化。 ( 5 ) 酵母水解液成分分析。用电喷雾质谱( e s i m s ) 对自溶液的组成进行分析，用 氨基酸分析仪分析酵母蛋白复合酶水解液的氨基酸组成及含量。 ( 6 ) 牛肉香精中挥发性风味成分分析及检测。用有机溶剂萃取牛肉香精中的挥发性 风味成分，并通过气质联用( g c m s ) 对挥发性风味成分进行分析，确定其组成及含量。 2 啤酒废酵母自溶工艺的研究 2 1 引言 自溶法是以具有酶活性的新鲜活酵母为原料，利用酵母细胞本身的酶系，添加一定量 的自溶促进剂，在一定条件下，将酵母体内的糖类物质、蛋白质和核酸分解为还原糖、氨 基酸、肽类、核苷酸等小分子物质并从酵母细胞内抽提出来的一种方法【4 6 7 ，4 引。利用自溶 法生产酵母抽提物，成本较低，欧美及我国所生产的酵母抽提物绝大部分都是采用这种方 法。 破坏酵母细胞壁是加速酵母自溶，缩短自溶时间，提高酵母抽提物氨基氮含量和得率 的有效手段，破壁的方法主要有化学法、机械法、酶法。化学法主要是指酸处理或碱处理 破壁，其效果并不是很好，不适合在酵母抽提物的生产中应用。 本章研究了酵母自溶的较佳工艺条件，并比较了械粉碎破壁、高压均质破壁和p 葡 聚糖酶酶解破壁三种方法。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 实验原料 啤酒废酵母( 酵母含量8 2 9 8 ) n a c l ( a r ) n a h c 0 3( a r ) p 葡聚糖酶3 3 0 1 0 6 i ，m i ， 2 2 2 实验仪器 j a 3 0 0 3 n 电子天平 精密p h 计p h s 2 5 型 离心机l g lo 2 4 a 数显恒温水浴锅h h 2 温控电热磁力搅拌器 电喷雾质谱仪l c m s 2 0 1 0 e v 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 工艺流程 南京金陵啤酒厂 南京化学试剂厂 上海久亿化学试剂有限公司 和氏璧生物技术有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海精科雷磁 北京医用离心机厂 国华电器有限公司 美国莱伯泰科有限公司 日本岛津 啤酒废酵母一前处理一离心分离、酵母泥一酵母悬浮液一自溶一加热一灭酶一冷却一 离心分离一酵母抽提液 9 2 2 3 2 啤酒酵母的前处理 啤酒废酵母有很浓的啤酒味，而且在啤酒生产过程中，由于酒花的苦味物质及一些代 谢产物吸附在酵母泥中，使酵母泥呈现红褐色，所以必须要进行前处理。将啤酒废酵母加 水搅拌均匀，用1 2 0 目筛过筛两次，5 0 0 0 转分下离心分离，离心洗涤数次，直至离心上 清液澄清，且无啤酒味。然后采用0 5 的n a h c 0 3 脱苦，o 5 h 离心分离得到乳白色泥状 酵母。测定酵母绝干含量。 2 2 3 3 啤酒酵母的自溶 取适量前处理好的酵母，放入烧杯中，加蒸馏水配成一定浓度的酵母悬浮液，加入一 定量n a c l ，用n a o h 和h c l 调p h 值，在一定温度下自溶。自溶结束后升温到9 0 灭酶 2 0 i i l i n 以中止反应。在5 0 0 0 转分下离心分离，收集上清液，沉淀加水洗涤离心两次，合 并上清液，得到酵母蛋白水解液。 2 2 3 4 机械粉碎破壁 由于细胞粉碎机在高速旋转的过程中会产生热量，而过高的温度会使酵母细胞内的内 源酶失去活性，从而使酵母菌丧失自溶的能力。为了在细胞破碎的同时，保持酵母菌内源 酶的活力，破碎前将经过前处理得到的啤酒酵母泥放入4 的冰箱中冷藏，同时破碎过程 间歇进行，每次的启动时间不超过1 0s 。为了使酵母细胞得到充分的破碎，每次只放入少 量的酵母泥，其量刚好淹没细胞粉碎机的搅拌叶片。收集机械粉碎过得酵母备用。 2 2 3 5 高压均质破壁 其原理是利用突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂，在撞击力和剪切力等的综合作 用下破坏细胞壁。配置一定量悬浮液浓度为1 0 的酵母液，放入4 的冰箱中冷藏2 h 后 进行均质处理，在4 0 的压力下分别均质一次和两次，收集均质后的酵母液备用。 2 2 3 6 p 一葡聚糖酶酶解破壁 葡聚糖层靠近细胞膜定位于细胞壁内层，是细胞壁结构的主要成分，除去葡聚糖层将 使细胞壁彻底解体【4 9 】。因此选用p 葡聚糖酶对酵母细胞进行破壁。d 葡聚糖酶是由绿色 木霉代谢生产的，它能水解p 葡聚糖生成寡糖，葡萄糖。自溶前，在酵母液中加入适量p 一 葡聚糖酶，其他操作同2 2 3 3 。 2 2 4 分析检测 2 2 4 1o 【氨基酸的测定：甲醛电位滴定法【5 0 】 取酵母蛋白水解液5 m l ，于2 5 0 n 正烧杯中，加入7 5 m l 蒸馏水，插入酸度计的玻璃 电极，开动磁力搅拌器，用o 1 m o l l 氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示p h 值8 2 ，记 录用去的氢氧化钠标准溶液的毫升数；再向其中加入甲醛溶液5 i n l ，反应l m i n ，继续用 l o 0 1 m o l l 氢氧化钠标准溶液滴定至p h 值9 2 ，记录用去的氢氧化钠标准溶液的毫升数。 同时做一试剂空白试验。 氯基氮含量，( g 1 0 0 “1 ) ： ! 兰：兰! 兰! 兰! ：! ! ! 1 0 0 5 式中：v l 为测定用的样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，m l ； v 2 为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，m l ； c 为氢氧化钠标准溶液的浓度，m o l l ； 酵母抽提液氯基氮含量酵母抽提液的总体积 氟基氮得率脱= 百藩丽磊酉千至一l o o 目f i j 日u 旨干粤i 呈 2 2 4 2 啤酒废酵母蛋白质含量测定 采用凯氏定氮法酬来测定啤酒废酵母中的蛋白质含量。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸共热消化，使蛋白质分解，其中氨与硫酸化合 生成硫酸铵，然后加碱蒸馏放出氨，氨用标准酸( 硼酸) 吸收，再用标准盐酸滴定，求出氮 量，换算为蛋白质含量。 蛋白质含量j | | 一 c ( v l - v 0 ) 1 4 叭 f 1 0 嗽 m 1 0 0 0 式中：c 为盐酸标准溶液的浓度，n 1 0 儿： v l 为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，i n l ； v o 为滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，m l ； m 为样品质量，g ； f 为氮换算为蛋白质的系数，取6 2 5 。 测得啤酒废酵母的蛋白质含量为5 5 0 4 。 2 2 4 3 可溶物的测定：常压干燥法【5 2 l 可溶物含量脯il 1 i i 1 0 0 式中：m l 为干燥前样品与称量皿的质量，g ； m 2 为干燥后样品与称量皿的质量，g ； m 3 为称量皿质量，g ； 酵母水解液中的可溶物包括酵母蛋白水解成的氨基酸和多肽，核酸降解成的核苷酸， 酵母细胞中的b 族维生素等可溶