（生物医学工程专业论文）钛氧薄膜材料表面层粘连蛋白修饰以及内皮化研究.pdf

西南交通大学研究生学位论文第1 i 页以上的试验结果表明，通过对t i - - o 薄膜表面活化偶联，可以将h 成功固定在t i o 薄膜表面。在1 5 - o 薄膜表面固定l n 对内皮细胞的生长有良好的促进作用，且同时可以抑制t i - o 薄膜表面的血小板粘附和激活，提高其表面的血液相容性。因此，在t i - o 薄膜表面偶联固定层粘连蛋白是促其表面内皮化且改善其表面血液相容性的有效方法。关键词：钛氧( t i o ) 薄膜，偶联固定，层粘连蛋白，内皮化，细胞培养，血小板粘附西南交通大学研究生学位论文第i 页a b s t r a c ti nt h i sw o r k , t i t a n i u mo x i d ef 巧一o ) f i l m sw e s y n t h e s i z e du s i n gu n b a l a n c em a g n e t r o ns p u t t e r i n g ( u b m s ) a f t e rt h et i 一0t h i nf i l m sw e l ep r e t r e a t e du s i n gn a o hs o l u t i o nf o ra c t i v i t yo f h y d r o x y l , a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( a p t e ) w a si n t e r a c t e dw i t ht h eh y d r o x y lo nt h et i - of i l ms u r f a c ef r o ma c t i v a t i o n t h e n ，l a m i n i n ) w e r ec o v a l e n t l yi m m o b i l i z e dt ot h ef i l ms u r f a c eb yt h ea m i d o g e no fa p t e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，x r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ( x p s ) ，f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p yf f t m ) ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) a n dc o n t a c t - a n g l em e a s u r e m e n tw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h ec h a r a e t e d s f i c so ft h es u r f a c eo f t i - of i l m sa n dm o d i f i e d 骶of i l m s h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l so r r g e c ) w e r ei nv i t r os e e d e dt ot h em o d i f i e da n du n m o d i f i e dt i - of i l m ss u r f a c ef o re v a l u a t i n gt h ec e l lc o m p a t i b i l i t ya n de n d o t h e l i a l i z a t i o nt r e n d ，a n dt h ee x p e r i m e n t so fl a r n i n i nd i r e c t l yi m m o b i l i z i n go nt h es | 田 如eo fy i 0f i l mw e r ea l s op e r f o r m e d i na d d i t i o n ，t h eb e h a v i o ro fb l o o dp l a t e l e ta d h e s i o nw a ss t u d i e db ys e ma f t e ri n c u b a t i o no f t h es a m p l e si np l a t e l e tr i c hp l a s m af e r p ) t h er e s u l t so ff t i ri n d i c a t e dt h a tt h ef u n c f i o n 8 1g r o u po fh y d r o x y lw a sp r e s e n t e do n t ot i of i l ms u r f a c ea f t e rb e i n gp r e t r e a t c db yn a o h t h ep e a ko foe l e m e n tc o r r e s p o n d i n gt oh y d r o x y lg r o u pi n c r e a s e di nr e s u l t so fx p s ，t h ec o n t a c ta n g l eo f t i 一0f i l ms u r f a c ew a sl o w e r t h er e s u l t so ff t i ra n dx p si n d i c a t e dt h a ta p t ec o u l db ec h e m i c a l l yr e a c t e dw i t ht h eh y d r o x y lo f 甄旬f i l ms u l 血c e t h er e s u l t so fs e ma n da f ms u g g e s t e dt h a tt h es u r f a c em o r p h o l o g yh a sn o tc h a n g e da f t e ra p t ec o a t e da n dt h ec o n t a c ta n g l eo f t h ef i l ms u r f a c ei n c r e a s e d 西南交通大学研究生学位论文第页t h er e s u l t so ff t i ri n d i c a t e dt h a ta m i d ei ，a m i d ei ia n d - n h 2a d s o r p t i o np e a k sw a sp r e s e n t e da f t e rl a m i n i ni m m o b i l i z e do n t ot i of i l m s t h 。p e a ko fs u l f u r ( s ) e l e m e n tw a sp r e s e n t e di nr e s u l t so f x p s t h o s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tl a m i u l nc o u l db ei m m o b i l i z e dt ot i - of i l ms u i 正a c eb ya p t e a n dt h ec o n t a c ta n g l eo f t i 旬f i l ms u r f a c ew a sl o w e r , t h eh y d r o p h i l i c i t yo ff i l mw a si n c r e a s e d c e l lc u l t u r ei n v e s t i g a t i o ns u g g e s t e dt h a tl a m i u l nc o u l de r h a n c eh u v e ca d h e s i o na n dp r o l i f e r a t i o n , a n di m p r o v et h em n 砸c e l lb e h a v i o r d i r e c t l yi m m o b i l i z a t i o no fl a m i n i no nt h e $ u r f a c eo f 1 i - of i l ma l s os h o w e dg o o dc e l lc o m p a t i b i l i t y a n dt h er e s u r so fh u v e c sc u l t u r e de x p e r i m e n ts u g g e s t e dt h a tt i 一0f i l mw h i c hm o d i f i e db ya p t ea n di m m o b i l i z e dw i 血l ni sb e t t e rt h a nt h a to f t i - of i l mi m m o b i l i z e dd i r e c t l yw i t hl n t h 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n西南交通大学研究生学位论文第9 s 页声明本人声明所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得西南交通大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。本学位论文成果是本人在西南交通大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归西南交通大学所有，特此声明。葛胜男2 0 0 7 年4 月西南交通大学研究生学位论文第1 页1 。1 生物医用材料第1 章绪论1 1 1 生物医用材料的概念生物医用材料即生物材料( b i o m a t e r i a l ) ，也称仿生材料，是用于与生命系统接触和发生相互作用，并能对其细胞、组织和器官进行诊断治疗、替换修复或诱导再生的一类天然或人工合成的特殊功能材料，可单独或与药物一起用于人体组织或器官，起替代、增强或恢复其功能等治疗作用【l 】。生物材料学是2 0 世纪6 0 年代新兴起的一种材料学科，作为一门新兴的学科，生物材料学发展迅速，尤其在2 0 世纪8 0 年代得到高速发展。因其是一门介于生物和材料之间的学科，已成为生物以及材料科技领域众多工作者研究的重点。虽然生物材料是个新兴的学科，但是生物材料的发展已经有非常长的历史，自人类认识了解材料起，就有了生物材料的端倪。早在公元前3 5 0 0年，古埃及人就利用马鬃、棉花纤维等做缝合线；1 6 世纪就开始用黄金板修复颚骨，用陶材做齿根：用金属固定内骨板以及用金属种植牙齿等。随着医学以及材料学的发展，到目前可以说从人体的天灵盖到脚趾骨、从内脏到皮肤，从血液到五官，除了大脑以及大多数内分泌器官外，都可用人工器官来代替。医学水平的提高以及人类生活质量的改善，也促进了生物材料的发展。生物材料在人类疾病的理疗康复、诊断、检查、治疗等医疗保健领域作出了重要的贡献【2 】。西南交通大学研究生学位论文第2 页1 1 2 生物医用材料的分类根据材料的属性，生物医用材料可以分为生物医用金属材料、生物医用高分子材料、生物陶瓷、生物医用复合材料、生物医用衍生材料、组织工程( 支架) 材料【2 】。根据用途不同，可分为骨、牙、关节、肌腱等骨骼一肌肉系统修复材料和替换材料，皮肤、乳房、食道、呼吸道、膀胱等软组织材料，人工心脏瓣膜、血管、心血管内插管等心血管系统材料，衄液净化膜和分离膜、气体选择性透过膜、角膜接触镜等医用膜材料，组织粘合剂和缝线材料，药物释放载体材料，临床诊断及生物传感器材料，齿科材料等。根据材料与活体组织之间是否形成化学键合，又可分为生物惰性材料和生物活性材料。1 1 3 生物医用材料的应用要求由于生物材料在很复杂的人体生理环境里工作，且与患者的生命和健康密切相关。因此，生物材料必须具有良好的生物学性能以及力学性能等【l 、3 1 。首先，生物材料应具有良好的生物相容性。生物相容性包括血液相容性和组织相容性。生物材料如果和血液接触，它应具有良好的血液相容性，具有抗凝血和抗血栓性能，才不会引起血液凝固和溶血等现象，并且对人体无毒、无过敏反应，对机体无免疫反应。同时，植入材料具有良好的组织相容性，不致引起周围组织产生局部或全身性反应，并且最好能够与骨组织形成化学结合，具有生物活性。其次，植入的生物材料必须具备安全可靠性。这要求生物材料必须具有良好的抗拉强度、压缩强度、弯曲强度、剪切强度及合适的弹性模量和西南交通大学研究生学位论文第3 页硬度等。对于用作人工关节的生物材科，还必须要求具有良好的耐磨损、耐疲劳性能，以保证生物材料在人体内能经受反复载荷和冲击的作用。再次，生物材料还必须具有良好的耐腐蚀性能以及一定的生物可穿透性，使人体的体液可以渗透，新骨组织能够长入，材料与软组织有良好的粘连性，不会产生吸收物和沉淀物。材料本身还应易加工成形，使用操作方便。另外，除了以上的条件以外，生物材料的成本必须适中，使患者的经济条件能够承受。1 2 生物医用材料的抗凝血性能研究1 2 1 生物材料的凝血机制目前普遍认为生物材料导致凝血的基本途径是血液的凝固系统和细胞系统发生激活；其次，与机体的补体系统以及材料的表面性能也有密切的关系【4 】。当材料与血液接触以后会引发血液的许多物理化学变化，其中最快的变化就是血浆蛋白在材料表面的吸附，在材料的表面形成复杂的蛋白质吸附层。当材料表面吸附了一定的蛋白质后，血小板就会粘附在材料表面蛋白的周围，血小板受到材料的刺激后粘附性增加，进一步聚集释放大量的凝血因子，产生有活性的凝血酶，凝血酶又会激发新的凝血因子，因此循环导致凝血。但是无论凝血系统如何复杂，生物材料导致的凝血就必然与材料的表面性能有关。材料表面的成分、结构、表面形貌、表面的能量状态、亲疏水性、表面电荷、表面的导电特征等表面化学、物理及力学特性均会影响材料与生物体之间的相互作用。通过物理、化学、生物等各种技术手段对西南交通大学研究生学位论文第4 页材料表面进行改性处理，可大幅度改善生物医用材料血液相容性。因此，如何进一步改善生物医用材料的表面性质是至关重要的。1 2 2 生物医用材料的表面改性虽然目前生物医用材料的应用日益广泛，应用技术也日益成熟，但是进一步改善生物医用材料的表面性质、提高生物医用材料的血液相容性及组织相容性仍然是研究者们最关注的研究课题。生物医用材料表面改性的方法主要有以下几种 5 1 ：1 ) 生物材料的表面修饰，如：在材料表面覆盖一层内皮细胞、涂覆白蛋白涂层、聚氧化乙烯表面接枝和磷脂基团表面接枝；2 1 等离子体表面改性，如：等离子体表面聚合、等离子体表面处理和等离子体表面接枝等；3 ) 离子注入表面改性；4 1 表面涂层与薄膜合成，如：生物陶瓷涂层、低温液相沉积、气相沉积、离子柬薄膜合成和溶胶凝胶方法等；5 ) 自组装单分子层，如：硫醇( c h 3 ( c h 2 ) n s h ) 、膦酸( c h 3 ( c h 2 ) 。p 0 3 h 2 )单分子层，等等；其中，生物材料的表面修饰是指【1 1 通过一定的技术手段，使材料表面的特征发生变化，或通过在材料表面涂敷一层修饰层改变材料表面原有的性能。此方法的最大特点是在不改变材料整体组成和加工方法的前提下，改善材料的性能或赋予其某些特殊的功能，此方法与其他的方法相比有方便、安全的优点。目前来说，在材料表面种植、培养血管内皮细胞是提高材料表面抗凝血性和血液相容性的最理想途径【6 。西南交通大学研究生学位论文第5 页1 3 生物材料表面内皮化研究1 3 1 内皮细胞的作用血管内皮细胞( e n d o t h e l i a l c e u ，e c ) 裱衬在整个心血管系统的内表面，为单层扁平上皮，是血管壁与血液之问的分界细胞，且是形成心血管封闭管道系统的形态基础圈。目前人们多认为血管内皮细胞不仅仅是作为血液和组织问物质转运的屏障，其最主要的生物学功能是使循环血液保持流动状态，此外血管内皮细胞尚可合成与分泌多种结缔组织成分、参与一些物质的代谢及与白细胞相互作用等。内皮细胞具有抗血栓形成特性，从而能保持血液流动。与此同时它还有许多促凝因素，使血管在损伤时通过凝血和血栓形成以维护血管壁的完整性。随着生物医学工程的飞速发展，各种生物材料制作的人工器官或医用装置日趋增多，尤其是在心血管领域，人工心脏瓣膜、血管内支架等已广泛应用于临床，但其远期效果并不十分满意，其中血栓形成是限制其应用的主要因素。在生物材料表面种植、培养血管内皮细胞是改善材料血液相容性的最理想途径，但直接把内皮细胞种植在生物材料表面的效果并不显著。因此，生物材料表面的内皮化问题一宣是此领域研究者们关注的热点课题。1 3 2 影响内皮细胞粘附的因素细胞在材料上的粘附包括两个过程：贴附过程和粘附过程【9 】。贴附过程是由细胞与材料之间的一些物理、化学作用，如范德华力、离子力等所引起的，贴附过程非常迅速。粘附过程是由材料与一些生物活性分子如细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用而引起，因此粘附期西南交通大学研究生学位论文第6 页较长。细胞必须与材料发生适当的秸附，才能在材科表面进行铺展生长，乃至分化、增殖。细胞与材料之间的粘附作用是通过细胞膜上的受体( r e c e p t o r s ) 来调节的，这些受体能特异性地识别材料表面的粘附分子【1 0 1 。一些细胞外基质蛋白如纤维连接蛋白( f n ) 、玻璃粘连蛋白( v n ) 、层粘连蛋白( l n ) 等能够被细胞膜上的受体特异性地识别，若生物材料在培养液或体液中能够吸附这类蛋白时，细胞就可以以这类蛋白为介导，粘附于材料表面，从而进行生长、分化、迁移、增殖。目前，在材料表面种植内皮细胞，使其表面内皮化以提高植入材料血液相容性的各种研究很多，但都普遍存在一个共同难题；内皮细胞在材料表面粘附的牢固程度及其生长活性一直不能令人满意，难以形成完整的粘附牢固且持久的具有体内生命活性的内皮细胞单层。影响内皮细胞粘附的因素可以从生物学以及材料学两个方面分析。1 3 2 1 从生物学观点分析细胞对材科的粘附与细胞膜的组成和性能有很密切的关系。细胞膜由蛋白质、脂类、少量的糖及核酸组成。细胞膜外被覆具有分支的亲水性寡糖链，因而细胞膜具有一定的亲水性，又由于此寡糖链分支末端是带有负电荷的岩藻糖和唾液酸，故哺乳动物细胞膜一般带负电荷，糖链与细胞识别、细胞免疫、细胞生长调节及细胞增殖抑制等有关，这也是细胞生长需要支架材料的原因。一般说来，细胞的代谢状态、细胞与材料的接触时间、细胞的亲疏水性、细胞的表面电荷、细胞膜分子的侧向运动、细胞膜的柔韧性等都可影响细胞在材料表面的粘附。，3 2 2 从材料学观点分析从材料学观点来分析，影响材料表面内皮细胞粘附的因素可以归结为以下几点：( 一) 材料表面的亲疏水性与表面自由能西南交通大学研究生学位论文第7 页根据目前较为认可的粘附机理，细胞与材料之间的粘附是以蛋白质为介导而发生，细胞膜上的受体能特异性地识别材料上粘附的蛋白质，因而材料必须具有一定的疏水性才能吸附蛋白质。而大量研究又表明，亲水性的表面有利于细胞粘附生长，因为细胞膜具有一定的亲水性，但过于良好的亲水性表面又不利于蛋白质的吸附，因此要使吸附蛋白质层与材料之间有定的粘附强度，保证材料表面达到一定的亲疏水平衡才最有利于细胞的粘附和生长【】。与亲疏水性情况相对应，高表面能的材料表面更有利于细胞的粘附与铺展，对于某种特定的细胞同样要求在最佳表面能状态下生长情况才比较好。( 二) 材料的表面荷电特性哺乳动物细胞膜表面带有分布不均的负电荷，一般可认为带正电荷的材料表面与带负电荷的细胞之间的静电作用有利于细胞的粘附，带负电荷的材料表面与带负电荷的细胞会由于静电排斥而不利于粘附，面现实情况也不尽然。有研究者【1 2 】通过研究新生鼠颅盖骨成骨细胞在带有正电荷或负电荷的聚苯乙烯离子交换树脂微球上的粘附发现，聚合物表面的电荷能极大地影响蛋白质的吸附与细脆的迁移形态，表面无论带何种电荷，细胞都能在其上生长，但细胞形貌有很大的差别。因此可认为材料表面的电荷特性与电荷密度对细胞生长有重要的影响。( - - ) 材料的化学结构材料的化学结构是影响细胞粘附的一个重要因素。细胞的亲和性要求所用的生物材料必须既能支持细胞的粘附，又能使粘附细胞在材料上很好生长，二者缺一不可。此外，作为组织工程用的生物材料，还必须考虑到其降解产物对细胞有没有毒性。不同的生物材料有不同的表面化学结构，研究发现 瑚，在材料表面引入胺基、酰胺基、羟基、羧基、磺酸基等基团能够提高材料的表面亲水性，有利于细胞在材料表面的粘附与生长。合适西南交通大学研究生学位论文第8 页的材料表面能选择性地吸附环境中的粘附蛋白，有利于增强细胞的粘附性，比如在材料表面引入细胞识别肽段r g d ( a r g i n i n e g l y c i n e - a s p a r t i ca c i d )能有效地增强细胞的亲和性【1 4 1 。( 四) 材料的表面形态结构一般说来，粗糙表面有利于细胞的粘附，因为表面性质对生物膜的形成有影响，粗糙有利于生物膜的迅速再生长【1 习。另外，多孔结构也有利于细胞粘附与生长，因为多孔结构有利于营养物质的渗透，有利于细胞的正常代谢，且孔结构的大小对于细胞的生长也有影响。y j w a n g 1 6 】在研究用不同孔径尼龙网培养3 1 3 成纤维细胞时发现，对于同样用氨等离子体处理的多孔材料，小孔径的尼龙网培养的细胞数量大大高于大孔径的尼龙网上培养的细胞数量。( 五) 材料表面负载的活性因子来自培养基或培养细胞自身分泌的蛋白质，吸附在材料表面，将改变材料的化学性质，进而影响细胞与材料的粘附。培养液中的血清和细胞外基质都是由非常复杂的蛋白质、生物大分子和小分子组成的混合体系，其中含有对细胞粘附、生长和繁殖有促进作用的多种活性因子，这就是纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等，如果把这些具有生理活性的因子固定到材料表面，或对材料迸行预涂沉积处理，可以为细胞的粘附生长提供理想的条件。这主要是因为细胞在材料表面的粘附，实质上是细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白与材料的相互作用，其粘附作用是通过细胞膜上的受体发生的，该受体能特异性地识别材料表面的粘附位点。如果从培养液中或采用表面涂覆方法使材料表面获得了诸如纤连蛋白等蛋白，这些蛋白就会被细胞膜上受体识另j j ，细胞则以这些蛋白为介导，粘附于材料表面。西南交通大学研究生学位论文第9 页1 3 3 生物材料内皮化的研究现状血管内皮细胞位于心血管和淋巴管腔内表面，呈单层扁平覆盖，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量黏合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。内皮细胞不仅是介于血管壁和血液之间的屏障结构，而且能合成并分泌多种生物活性物质，以维持血管的收缩和舒张，凝血与抗凝平衡等特殊功能，从而保持血液的正常流动和血管的长期通畅；内皮细胞与血细胞相似，表面带负电荷，由于同种电荷的相互排斥作用而使内皮细胞具有抗血小板聚集，防止血液凝固和血栓形成的多重作用。多年的研究表明，在人工材料表面种植血管内皮细胞可以形成一个类似体内血管的抗血栓表层【17 】，是提高材料表面抗凝血、改善其血液相容性的最理想途径1 6 川。1 9 7 0 年，m a n s f i e l d 首先提出了内皮细胞种植方法。1 9 7 8年，h e r r i n g 1 8 】首次将血管内皮细胞种植子d a r c o n 人工血管后植入狗的动脉系统的实验，发现术后种植4 周后血管内皮细胞的人工血管表面无血栓面积远大于单纯的人工血管表面。s h a r e f k i n 1 9 1 和s 切血l e g 【2 川研究发现血管内皮细胞种植能够明显改善p a t t o n 人工血管在动物体内的通畅率，并减少血小板的聚集。1 9 8 8 年，v a n d e rg i s s e n 口1 】等首次进行了血管内支架的内皮化研究，实验结果证明内皮细胞可以分泌一氧化氮( n o ) 和前列环素( p g l 2 )等活性物质，能够有效防止血栓的形成。潘明新【2 2 】等的研究也表明，通过在人工血管内壁种植内皮细胞，使其早期快速内皮化，可明显改善移植血管的通畅性。由研究现状可以得知，生物材料的表面内皮化可以明显改善材料的血液相容性，促进各种生物材料，尤其是在心血管移植材料方面的临床应用。但是，由于细胞一般不会直接粘附到人工材料基体上，而是靠细胞表面的受体与材料表面相连接，所以出现了内皮细胞在材料表面粘附的牢固程度西南交通大学研究生学位论文第1 0 页及其生长活性一直不能令人满意的现状。细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增殖，而细胞与材料粘附及随后的扩散能力的大小主要由材料表面的物理化学性质决定。为了改善内皮细胞在心血管材料表面的粘附和生长活性，研究者们通过各种方法来改善材料表面的物理化学性质。目前总的来说，改善内皮细胞在心血管材料表面的粘附和生长活性的方法主要三种：在材料表面粘附各种细胞粘附因子( 如：固定生物大分子) 、改变材料表面微观形貌、高能离子处理材料表面c 2 3 】。1 3 4 改善生物材料表面内皮化的方法1 3 4 1 生物材料表面固定生物大分子( 一) 生物大分子理论上说，理想的生物医用材料应具备有效促进细胞生长的能力以及良好的组织、血液相容性，这要求材料要有一定的亲水性，因为亲水性表面有利于培养液的渗透洲，对细胞粘附有促进作用，而疏水性表面对蛋白质有强的吸附功能【2 5 1 。但是现有的生物材料大多呈现疏水性，不能有效支持细胞的生长。而细胞外基质中含有对细胞粘附、生长和增殖有促进作用的多种活性因子，如纤维连接蛋白佩) 、层粘连蛋1 3 ( l n ) 、玻璃体连接蛋白( v n ) 、胶原( c o l l a g e n ) 等【2 6 】。纤维连接蛋白( f n ) 是最具有代表性的粘附蛋白，研究也最深入。它实质上为大分子糖蛋白，分子量约4 4 0 ，0 0 0 道尔顿，主要由各种细胞产生，如成纤维细胞、内皮细胞等鲫。f n 结构上由二条肽链以二硫腱连接而成，其上有三个功能区域，分别为专一的结合胶原纤维，蛋白聚糖和细胞膜受体的位点，细胞与其结合的膜受体主要是整合素家族( i n t e g r i nf a m i l y i f ) 。玻璃体连接蛋白( v n ) 是最初在研究补体时发现的一种蛋白质，属于a 球蛋白，它与f n 一样，存在于组织，细胞及细胞外基质，主要由各种细西南交通大学研究生学位论文第1 1 页胞合成，其中包括内皮细胞。t o m a s i m i 2 s 等研究发现v n 有两条带，分子量为7 5 ，0 0 0 和6 5 ，0 0 0 道尔顿。v n 的作用主要是促进内皮细胞与细胞外基质的粘附。层粘连蛋白( l n ) 是分子量约8 0 0 ，0 0 0 道尔顿的糖蛋白 2 9 1 。其结构上至少由二条肽链以二硫腱联接而成，主要分布于基膜上，血中浓度小于1 o r j _ g n a 。研究表明，许多细胞膜能合成l n ，其中主要是各种成皮细胞。早期研究显示：l n 主要能促进表皮细胞的粘附。胶原蛋白( c n ) 是基膜的最主要成分之一，广泛存在于机体各种组织器官当中。结构上为三维螺旋状的三条带，含有3 3 甘氨酸，1 0 脯氨酸，1 0 羟脯氨酸及各种含量的羟赖氨酸。目前至少有五种它的同型分子，其分子量约9 4 ，0 0 0 道尔顿。每型仅仅是其氨基酸序列稍有差异，许多细胞能合成c n 。胶原i 源于成纤维细胞，平滑肌及上皮细胞：胶原由软骨细胞等合成：胶原i i i 由成纤维细胞和肌肉细胞分泌；胶原则产生于内皮细胞，上皮细胞；在一定条件下，平滑肌细胞，软骨细胞合成胶原v 。胶原蛋白通过直接作用和间接作用两种形式发挥促进细胞粘附及生长功效，其中间接作用需要借助f n 和l n 的参与 3 0 i 。纤维蛋白原( ) 本身是种重要的血浆蛋白，又称为第一凝血因子，主要在肝脏合成。其结构为二组通过二硫键相互连接的三条不同的肽链( a 、b 、丫链) 所组成。分子量约3 4 0 ，0 0 0 道尔顿，血中浓度约2 5 0 0 i t g m l 。纤维蛋白原是介导血小板对表层粘附的主要因子。预先在材料表面固定这些生物大分子，可为细胞的粘附生长提供理想的条件。这是由于细胞与基质材料之间的作用是细胞膜中的受体特异性识别细胞外粘附蛋白分子的结果【3 1 1 ，这些粘附蛋白含有r g d ( a r g g l y a s p )肽段，而r g d 肽段是细胞所能识别的最小的氨基酸系列。因此，在材料表面固定r g d 肽段已经成为一种有效的促进细胞粘附、增殖的方法，此西南交通大学研究生学位论文第1 2 页方法受到研究者们的重视。( 二) 材料表面固定生物大分子的方法在材料表面固定生物大分子的方法有偶联接枝、光化学接枝、表面涂覆等。偶联接枝法首先需要活化预处理材料的表面，引入各种所需活性基团，如羧基、羟基、氨基等，使其带上合适的功能团，随后用双官能试剂或偶联活化剂联结支持材料表面与生物分子。常用的双官能团试剂有戊二醛( g a ) 、对硝基苯氯甲酸酯( n p c ) 、马来酰亚胺( m a ) 、二异硫氰酸酯等。邓成华等p 习对常用的双官能团试剂、活化剂及相应基团进行了归纳。常用的偶联活化剂有y 氨丙基三乙氧基硅烷( a p l e ) 、氨丙基三甲氧基硅烷( a _ p s ) 等硅烷化试剂，硅烷偶联剂由于其特殊的结构，具有能够同时与有机基团和无机基团发生反应的特征。而且硅烷化法是一种比较成熟和应用较多的方法，已有一些研究利用a p t e 在无杌材料表面偶联上了生物分子。一般的过程是先使材料形成富含一o h 的表面，然后使用硅烷化试剂( 常用2 - - 5 的a p t e 试剂的丙酮溶液) 得到含氨基或羟基的活性表面，最后在直接进行生物体系的固定或使用双功能交联剂( 如戊二醛、水溶性碳二亚胺( e d c ) 等) 连接1 3 3 一0 1 。s m r o w l a n d t 4 1 】等将样品表面涂覆氨基硅烷，使它与材料表面共价键合，然后再浸入肝素溶液中，即可共价固定肝素。如果涂覆氨基硅烷后再使用交联剂，会促进肝素的共价键合。杨大智 4 2 1 等用y 一氨丙基- - 7 , 氧基硅烷和戊二醛作为偶联剂，分别将肝素固定于离子束合成和凝胶一溶胶合成的n 0 2 薄膜上，结果提高了表面亲水性和抗凝血性能。l a n g e r 【4 3 1 等人曾在聚醋酸乙烯( p o l y ) 表面利用1 ，1 碳酰- - ! i e 胺咪唑来固定甘氨酸精氨酸一甘氮酸- 天冬氨酸一酪氨酸序列( g r g d y ) 肽段，利用表面的r g d 肽段莱促进细胞粘附、增殖。d a v i dj m o o n e y 利用藻酸盐西南交通大学研究生学位论文第1 3 页聚合物链上的羧基官能团，通过水溶性碳化二亚胺e d c 将含r g d 胶段的g r g d y 肽段固定在藻酸盐链上，使藻酸盐材料表面含有一定量的r g d肽段，通过对鼠成肌细胞的培养观察，表明有效地促进了细胞的粘附和增殖等。武忠【4 5 1 等在聚对苯二甲酸乙二醇酯( p e t ) 薄膜表面共价接枝人工合成的r g d 三肽后，材料表面对水的接触角减小，亲水性增加，人脐静脉内皮细胞培养结果表明，亲水性材料表面可明显促进内皮细胞的粘附和增殖，加速材料表面的内皮化进程。s a n k 4 6 等用f n 、l n 、g n 、c n 、r g d 肽等分别预处理聚四氟乙烯( p t f e ) ，并以未处理的p t f e 作对照，种植内皮细胞后，发现经过处理的p t f e 的细胞粘附和生长状况明显优于未经过处理的p t f e ，类似的实验其他的学者也得出了相似的结果【4 7 】。周序珑【4 9 】等在用于制作人工血管的聚氨酯( p u )表面分别预衬f n 、v n 和c n 后培养内皮细胞，结果表明三者均能促进内皮细胞的粘附。光化学接枝法可将特异性的细胞外基质如f n 、l n 、胶原i 、胶原v 等接枝在材料的表面以提高材料的细胞亲和性嘲。g r e e n 等人将胶原通过光化学的方法接枝在聚苯乙烯培养皿上，考察了不同细胞在培养皿上的生长，发现改性后的材料非常有利于细胞的贴附和生长。但是，在材料的表面进行生物活性分子固定化，若要生物活性分子牢固地固定在生物材料表面，必须使生物活性分子中的某些基团与材料表面的反应性基团化学键合，这通常要求材料表面具有o h 、- c o o h 、- n h 2 等反应性基团。因此，通过表面改性使材料表面具有这些基团是在材料表面固定生物大分子的前提【4 9 1 。1 3 4 2 材料表面基团化( - - ) 高分子材料的表面基团化对于高分子材料，用等离子体处理、光化学、辐射接枝等表面改性方西南交通大学研究生学位论文第1 4 页法预处理材料表面，可使材料表面产生相应的功能基团，然后与生物分子键合，或直接通过这些方法将生物分子固定在材料表面。另外，利用聚合物材料本身的基团反应或通过其主链侧基上某些反应活性高的基团或原子的反应，也可使聚合物表面产生小分子功能基团。例如，主链饱和的聚烯烃材料，如聚乙烯( p e ) 、聚丙烯( p p ) ，主链较稳定，通过表面氧化可在其表面引入功能基团；用过硫酸盐氧化p p 中空纤维，可在其表面引入羟基【5 0 】；而对含有易被水解的酯基的聚合物如聚甲基丙烯酸脂( p m m a ) 、聚对苯二甲酸乙二酯( p e t ) 、聚丙交酯( p l a ) ，可以在碱溶液中部分水解使其表面产生羧基【5 l 】。徐涛【5 习等用环氧氯丙烷活化琼脂微载体，再用己二胺将其表面氨基化，从而得到表面修饰的琼脂微载体，通过在载体上培养肝细胞发现，修饰过的微载体比未修饰的微载体更易使肝细胞在其表面粘附。周春华【5 3 1 等发现，p e 纤维经铬酸处理后，引入了大量的含氧极性基团，x 射线光电子能谱( x p s ) 检测后进行分峰拟合发现为- c o o h 、c = o 、c o h ，改善了纤维表面的浸润性。近期g p a m i c h a n e t ：z i s 等【5 4 】采用间接和直接两种方法在商用的聚氯乙烯( p v c ) 、聚乙烯( p e ) 、硅橡胶、聚丙烯管( 内径2 m m ，长3 0 c m )表面固定了肝素。在7 0 。c 的1 0 过硫酸钾溶液中处理1 h ，使得表面羟基化后，在氮气气氛中的1 0 丙烯酰胺的硝酸和铈氨溶液中5 0 处理l h ，就会在材料表面形成自由氨基基团。然后浸入肝素钠溶液中，用盐酸二酰亚胺做交联剂，在室温下保持4 8 小时，即可共价接枝肝素。郎需庆等 5 5 1 采用一定浓度的钠萘络合物化学腐蚀液，有效活化了p t f e超细颗粒表面，活化处理后的表面发生了炭化，并生成一定量的羟基、羰基、羧基等活性官能团。p t f e 颗粒表面的活化为一快速反应过程，在o 1 5 m o t l 钠萘络合物化学腐蚀液中处理6 m i n ，p t f e 颗粒表面就能得到充分活化。p t f e 颗粒经腐蚀液活化后，傅立叶红外吸收图谱显示，在1 6 5 0c m 西南交通大学研究生学位论文第1 5 页和3 4 0 0 c m 1 处出现较明显的吸收，在7 6 0c m - 1 处也有一定吸收。其中，活化后的p t f e 颗粒在1 6 5 0t c l l 2 1 1 附近的吸收峰是c = o 键伸缩振动吸收；在3 4 0 0e m l 附近的吸收峰是o h 键的伸缩振动峰：在7 6 0e m - 1 附近的微弱吸收源于羧基缔合体o - h 键非平面摇摆振动吸收，这表明活化后颗粒表面上存在羟基、羰基私羧基等宫能团。吴清华【5 6 】等，将玻片浸于1m 氢氧化钠液中2h ，浸泡过程中放在摇床上震动，用灭菌水清洗干净后放入1m 盐酸液中浸泡过夜，再用灭菌水清洗干净。玻片的硅烷化，清洗后的玻片放入硅烷化溶液中( 9 的氨丙基三甲氧基硅烷a _ p s 溶于9 0 的甲醇) ，硅化3 0 m i l l ，等到氨基化。另外，研究者还配制如下包被液：o 8 的国产丙烯酸和o 2 的国产丙烯酰胺溶于双蒸水中并7 0 ( 2 j 1 1 热，加热过程中缓慢加入0 8 的过硫酸胺做催化剂。用此液包被玻片，形成氨基化表面。再经过水溶性碳二亚胺( e d c ) 活化表面之后用于固定d n a 。h e y m a n 等【5 7 1 用氢氧化钠与异丙醇溶液处理p u 后使得表面产生了自由氨基和羟基。o 【l i 【5 8 1 等采用氢氧化钠溶液表面水解聚乳酸( p l l a ) ，水溶性碳二亚胺( e d c n h s ) 活化表面羧基，共价键合壳聚糖( c s ) 分子，提高了材料表面的亲和性，在其面培养牛软骨细胞，发现细胞活性和增殖率均比未改性p l l a 显著提高。( 二) 无机材料的表面基团化对于无机材料，表面基团化的研究应用主要在生物芯片和生物传感器方面，无机材料的种类也仅为应用于电极材料方面的t i 、a i i 、a g 、p t 、p d 、创、s i 等，有以下的几种活化方法。l 、等离子处理x i a o 等 5 9 1 通过水蒸气等离子体处理使无机材料，使材料表面产生亲水性基团羟基，从丽为表面固定生物大分子提供了必要的条件。西南交通大学研究生学位论文第1 6 页2 、电化学法m s h i r k h a n z a d e n 6 0 j 等采用电化学方法在钛合金基体上用烷氧基化合物制备了t i 0 2 薄膜，他们发现这种在室温下制备的薄膜表面吸附有相当数量的羟基和小分子如c o o h 、o h 、n i l 2 、c = o 等，而且这种纳米孔t i 0 2 薄膜在室温下可与有机小分子形成化学键，这样就有可能与生物大分子相结合。这些钛氧膜可用于固定相应的生物活性物质如粘附蛋白、合成肽和生长因子等，以利于所需要的细胞的粘附生长。3 、化学处理法继用水蒸气等离子体处理使无机材料表面获得羟基之后，x i a o 等【5 9 】又通过化学预处理方法( 如：在双氧水与盐酸中浸泡的方式) 使无机材料表面产生羟基。t a d a s h ik o l m b o 等【6 1 1 认为，生物活化钛的原理归结为钛金属具有表面钛羟基( t i o h ) 。基于此原理，已发展了多种形成表面活化钛方法，如碱热处理、酸碱两步处理、酸处理、双氧水、双氧水+ 盐酸、t a c l 5 +盐酸等1 6 2 1 。童宏扬【6 3 】等，将t i t i 0 2 电极置于0 5 m o l lh 2 s 0 4 及1 0m o l l n a o h溶液中。名e n a o h 溶液中时，由于t i 0 2 膜电极外电化学活化表面区域吸附了大量0 h 一，使得不同价态t i 的转化主要发生在电极的外电化学活化表面区域。同时，作者认为电极在p h 值为1 4 的n a o h 溶液中的反应机理与其在p h = l 的h 2 s 0 4 溶液中的机理是相同。梁芳慧等蝉谰碱热处理法进行钛及钛合金表面生物活化，将钛或钛合金置入6 0 。c 的n a o h 溶液中2 4 h ，再以5 。c r a i n 升温至6 0 0 保温7 h 进行热处理。碱热处理法的活化机理认为是钛溶胶的作用：经强碱溶液处理后，钛表面形成了水合钛酸钠溶胶。6 0 ( 2 热处理时，水合钛酸钠溶胶脱水形成凝胶，并有少量金红石晶体和聚钛酸钠晶体形成。与液体接触后，无定型或晶态的钛酸钠再次水合形成钛溶胶，表面富含t i o h 。西南交通大学研究生学位论文第1 7 页w a y n ey o s h i d a 6 5 等用2 的盐酸浸泡硅膜，即可除去基体表面的污物还可使得其表面完全羟基化。刘盛辉等【删在石墨电极表面导入氨基n h 2 ：将清洗好的石墨电极( 直径a t o m ) 用混酸氧化5 h ，然后在室温下用四氢化锂铝的乙醚溶液还原1 h ，使石墨电极表面的含氧基团全部转化成羟基，为了使还原完全，须经常摇动溶液。取出电极用乙醚洗净后在室温下置于含5( v m 3 一氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中进行硅烷化，即在石墨电极表面导人- n h 2 。另外，