（生物化学与分子生物学专业论文）黑曲霉木聚糖酶的发酵、性质及其应用研究.pdf

中文摘要 采用固体和液体发酵，确定温度、p h 、碳源组成等因素对黑曲霉 产木聚糖酶菌株产酶的影响。结果表明，初始p h 6 0 ，温度2 8 ，麸皮 添加量为2 ，摇瓶培养至9 6 h 时酶活力达到高峰。粗酶液的最适反应 温度为4 5 - - 5 5 之间，酶反应的最适p h 在4 8 左右。从实验数据可以 得出，固体发酵能显著提高木聚糖酶的活力，因此，固体发酵法优于 液体发酵。 木聚糖酶属于水解酶类，可将木聚糖分解为膳食纤维和低聚糖。 经离心、超滤、s e p h a d e x6 - 7 5 凝胶层析，聚丙烯酰胺凝胶制备电泳制 备后，分离得到了黑曲霉菌株的木聚糖酶同工酶xi 、x i i ，其最适反 应温度均为4 5 5 5 ；其最适反应p h 均为4 8 5 5 。s d s p a g e 法测得 xi 、x i i 的相对分子质量分别为2 2 k d 和4 0 k d 。c d 光谱表明，xi 、x 1 1 分别在2 1 5 n m 处和2 1 8 n m 有一个负峰，说明0 一折叠结构是组分xi 、 x i i 的主要构象，也是它们发挥催化功能的结构基础。 此外，将玉米皮用1 n a o h 处理，在不同条件下通过木聚糖酶与 纤维素酶的联合作用降解玉米皮木聚糖，酶解产物采用c l 6 b 凝胶色 谱分析。结果表明：木聚糖发生随机降解，随着酶解时间的延长，木 聚糖的被降解程度增大。因此推断，此酶解过程适合膳食纤维和低聚 木糖的工业化生产。 关键词：黑曲霉木聚糖酶c d 光谱低聚木糖玉米皮 a b s t r a c t t h ei n f l u e n c eo fc o n d i t i o n s ( p h ，t e m p e r a t u r e ，c a r b o ns o u r c e sa n d o t h e r s ) o i lt h es y n t h e s i so fx y l a n a g e sp r o d u c t i o no fa s p e r g i l l u sn i g e rs b - 0 2 w i t hs o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o na n dl i q u i df e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e d w h e n t h eg r o w t ho fs b 一0 2i ns h a k ef l a s k sa t2 8 f o r9 6 h o u r sw i t hi n i t i a lp h 6 0 a n d2 b r a no nh e m i c e l l u l o s es u b s t r a t e si ts h o w e d h i 曲a c t i v i t y o f x y l a n a s e 。鼹l eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ef o rt h ec r u d ee n z y m ef i l t r a t e a c t i v i t yo f s b 一0 2a r ep h 4 8 4 5 5 5 i ti sc l e a rf r o mt h e s ed a t at h a ts o l i d f e r m e n t a t i o nw a sa b l et oi n c r e a s et h ex y l a n a s ea c t i v i t y c o m p a r e dw i t h l i q u i d f e r m e n t a t i o n 。s ow ec a r tm a k eac o n c l u s i o n t h a ts o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o l li sp r i o rt o1 i q u i df e r m e n t a t i o n 弧棼x y l a n a s eb e l o n g st ot h eh y d r o l y t i c 强z y n l e st h a tc a l ld e c o m p o s e t h ex y l a nt of o r mx y l a nd i e t a r yf i b r ea n do l i g o s a c c h a r i d e t w ox y l a n a s e s o fa s p e r g i l l u sn i g e rs b - 0 2xi 、x1 1w e r ep u r i f i e db yc e n t r i f u g a t i o n u r r a f i l t r a t i o n g e ls e p h a d e xg 一7 5a n dp r e p a r a t i o ng 。le l e c t m p h o r e s i s 。弧e r a n g eo f o p t i m a lt e m p e r a t u r e a n do p t i m a lp ho fxi 、xi if o r h y d r o l y s i s o fx y l a nw e r e4 5 5 5 a n dp h4 8 - 5 。5 r e s p e c t i v e l y 。d a t a f r o mt h e s d s g e le l e c t r o p h o r e s i si n d i c a t e dt h em o l e c u l a rw e i g h to fxi 、x i ia r c 2 2 ，0 0 0a n d4 0 ，0 0 0r e s p e c t i v e l y 强ec ds p e c t r t m as h o w e dt h a t 出e b o l e a t o ds h e e ts t r u c t u r eo fx y l a n a s e sxi 、x1 1w e r et h em a i n c o n f o r m a t i o nw i t hx y l a n a s e sa c t i v i t i e s a f t e rt h ec o r nc o r t e xp o w d e rw a st r e a t e d 蛾镪| n a o hs o l u t i o n ，i ti s d e c o m p o s e db yx y l a n a s ea n de e l l u l a s eu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s t h e e n z y m i cp r o d u c tw e r ea n a l y z e db yu s i n gs c p h a r o s eg e l6 b 。t h er e s u l t so f t h i sp o l y m e r i z a t i o ns h o w e dt h a tt h ed e p o l y m c r i z a t i o no f x y l a nf o l l o w e da r a n d o mm e c h a n i s ma n dt h ed e g r e eo ft h ed e p o l y m e r i z a t i o ni n c r e a s e da s e n z y m i c r e a c t i o nt i m ei sp r o l o n g e d 。i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a tt h i se n z y m i c p r o c e s sw a s s u i t a b l ef o rt h e p r o d u c t i o n o fs o l u b l e d i e t a r y f i b r ea n d x y l o o l i g o s a e c h a r i d e s k e y w o r d s a s p e r g i l l un i g e r s b 一0 2 x y l a n a s e c d s p e c t r u m x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s c o m c o r t e x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：盔盎日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阗。本入授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：奎盘 日 期：历啦正 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：趔 日 期：o 趔生生二生 电话： 邮编： 文献综述 全球光合作用产生的植物物质每年高达1 5 5 x 1 0 9 吨，其中8 9 未被人类利用，只有1 1 为农作物和饲料，可提供1 6 x1 0 9 吨的食物 饲料物质；其中经加工和转化后，真正能供人类食用消费的只有3 6 x 1 0 9 吨，除部分消耗外，剩下的1 3 5 1 0 9 吨为农业废弃物和残余物。 我国的纤维素类资源也很丰富，仅农作物秸杆、皮壳一项，每年即达 数亿吨，林业副产品，城市垃圾和工业废物也数量可观；这些资源大 部分都被烧掉，不可避免地造成了严重浪费，环境污染，破坏了生态 平衡，造成农业上的恶性循环，威胁人类的生存，后果堪虑。因而， 研究更加有效的方法利用这一丰富资源，以解决全球面临的食品短缺、 能源危机和环境污染等问题，已属刻不容缓的紧迫任务。 一、天然植物中半纤维素成分的概述 植物性纤维材料除了含有纤维素外，还含有半纤维素( 约1 5 3 0 ) 和木质素( 约1 0 2 0 ) 。后两者的存在，阻止了纤维素酶接近纤维素， 使之难于被分解。所以在纤维素酶转化农业废物时，常常用酸或碱进 行预处理，以除去半纤维素和木质素。但这种处理方法不仅造成环境 污染，原料浪费，同时由于成本过高，经济上过不了关，难于达到商 品化生产的目的。七十年代后期以来，人们提出了“生物量的全利用” 的观点，在这一背景下，半纤维素与半纤维素酶的研究逐渐受到观注。 半纤维素的研究结果表明，降解半纤维素可以获得各种戊糖。其 中最主要的是木糖，木糖可以经过异构化后，由酒精酵母发酵成酒精， 或由管束酵母直接转化成酒精。戊糖还可以生产糠醛，木糖醇，2 ，3 丁二醇，又是葡萄糖异构酶和木聚糖酶的良好诱导物及原料，在塑料 工业、医药工业和食品工业上有着重要的应用。近年来每年都有几百 篇的有关文献资料在刊物上发表。引起人们愈来愈大的重视。 半纤维素和木聚糖的理化性质概述 1 8 9 1 年e s c h u l z e 最先指出：在植物中与纤维素共生的植物细胞壁 多糖，可被碱水溶液抽提，酸水解较纤维素容易得多。对半纤维素而 言，这一概念无论在化学结构或生物功能方面都比较含糊。近二十多 年来，随着多糖分离纯化的改进以及各类色谱、光谱、核磁共振、质 谱和电子显微镜等的应用，人们对半纤维素的知识日益深入。 g c a s p i n a l l l 9 6 2 年叙述，“半纤维素是来源于植物的聚糖类，含有d 木糖基，d 甘露糖基与d 葡萄糖基或d 一半乳糖基的基础链，其它糖基 可成为枝链基而连接于此基础链上”。t e t i m e l l l 9 6 4 年叙述：“半纤维 素是低分子量的聚糖类( 平均聚合度近2 0 0 ) 和纤维素一起，e 常地产 生在植物组织之中，他们可以从原来的或脱去木素的物料中被碱水溶 液抽提而分离出来”。与纤维素不同，半纤维素不是由一种单糖组成的 均一聚糖，而是以不同的几种糖单元组成的共聚物。半纤维素就是这 样一群共聚物的总称。陆生植物的大多数半纤维素虽常有各种短枝链， 但主要还是线状的，它是由有限的几种糖基构成的，如d 木糖，d 甘 露糖，d 葡萄糖，d 半乳糖，l 阿拉伯糖，4 氧一甲基- d 葡萄糖尾酸， d 半乳糖尾酸，d 葡萄糖尾酸及较少量l 鼠李糖，l 岩藻糖和各种氧一 甲基化了的中性糖基。 半纤维素中最主要的聚糖为木聚糖，木聚糖由p 一毗喃木糖基通过 b 一1 ，4 - 糖苷键联接成的“骨架”组成，具有分枝侧链，分枝侧链含有 不同量的l 呋喃阿拉伯糖，d 一木糖，d 葡萄糖和d 吡喃半乳糖基及糖 醛酸组成，在天然木聚糖中的许多木糖基被乙酰化，但在碱抽提中， 这些替代物往往被除去。 图为小麦杆木聚糖的结构简图。 d x y l p l 一 4 0 x y l p l a r a fd g l u p a 图1小麦杆木聚糖结构简图 d x y l p - 一d 一吡喃木糖基 l a r a f - - - l - 呋喃阿拉伯糖基 d g l u p a - - - d 一毗喃葡萄糖尾酸基 2 一 岛2 f 蚰专阻l h 仰h1 u 3 如n 蛆 眦， m i 撕 加 我国每年可产生几千万吨秸秆等农业废料，如玉米芯、玉米秸杆、 稻草、麸皮、蔗渣【2 l 等，此外，玉米加工生产淀粉的过程中产生了大量 的玉米皮，它们均含有丰富的半纤维素物质。例如，玉米是世界三大 粮食作物之一，自2 0 世纪5 0 年代以来，世界上的淀粉、淀粉糖和酒 精工业愈来愈多地用玉米作原料，这大大地促进了玉米作为工业原料 的进程。美国是世界上第一玉米生产大国，年产2 亿多吨，我国玉米 产量1 1 亿吨左右，居世界第二位，在加工玉米淀粉时会产生占玉米质 量1 4 - - 2 0 的玉米皮，由于玉米皮中半纤维素成分占很大比例，约 4 0 以上，而纤维素成分只占到1 3 左右，因此玉米皮的合理利用受 到人们的极大关注。玉米皮作为一种产量大综合利用价值还不高的谷 物加工副产品，已成为我国需优先研究和开发的膳食纤维源之一。 玉米皮中纤维含量高，纤维质结构好，是难得的物美价廉的食物 纤维源。但是它还含有一定量的与玉米种皮结合的热量物质如淀粉、 蛋白质和脂肪等。卢敏【4 】等人探讨了如何去除这些成分，制取低热量的 玉米膳食纤维。李凤敏等人比较了化学法和酶法去除蛋白、淀粉等热 量物质，结果表明，酶法处理的效果更好。处理后的玉米皮，采用木 聚糖酶水解精制工艺，可以得到低聚木糖。我国是农副产品生产大国， 提高其综合利用水平和高技术含量一直是农副产品加工研究的一个热 点。 二、木聚糖酶概述 1 木聚糖酶的作用机理 木聚糖酶是一组可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。由 于木聚糖分子结构复杂，含有许多不同的取代基。因此，木聚糖的生 物降解就需要一个复杂的酶系统中不同组分之间的协同作用，才能将 其转化为基本单糖。作用于主链的有两种酶：b i ，4 内切木聚糖酶和 0 一木糖苷酶。一般而言，前者的作用是切开木聚糖主链内的糖苷链， 降低基质的聚合度。在内切木聚糖酶作用的前期，所形成的主要产物 是聚合度较大的低聚木糖，随着水解的深入主要生成木三糖、木二糖， 但一般不会生成木糖。内切木聚糖酶根据其水解产物可分为有脱支活 性与无脱支活性两大类，前者水解产物中只存在阿拉伯低聚木糖，无 游离阿拉伯糖；后者水解过程中释放出阿拉伯糖。b 木糖苷酶，是木 聚糖的外切水解酶，主要水解短链的低聚木糖或木二糖，并从非还原 性末端释放出木糖。木二糖是此酶的最后底物，酶对低聚木糖的亲和 性随聚合度的增加而降低。b 木糖苷酶在细菌与酵母中主要是与细胞 结合在一起，或者只存在于细胞内，酵母c y p t o c o c c u sa l b i d u s 通过b 木糖苷透性酶转运系统将木二糖与木三糖转运到细胞内，在细胞内通 过b 一木糖苷酶转化成木糖。研究过的绝大多数1 3 一木糖苷酶都受其水解 产物木糖的抑制。此外，许多0 木糖苷酶都有转苷酶活性，在底物浓 度高时尤其如此，转移反应主要形成p 一1 ，3 与b l ，4 键，形成比底 物分子量高的产物。 木聚糖酶可切开6 1 ，4 糖苷键，其作用机理【5 】是保守性的活性 位点氨基酸残基( 如谷氨酸) 的羟基提供一个质子到要切开的键上， 而正碳离子中间物的稳定性是由负电荷基团或者由组氨酸残基维持。 在催化反应中，有关酸性氨基酸残基和组氨酸的证据材料表明，这对 裂褶菌木聚糖酶来说，可能确实是这样。在研究有关的化学修饰时得 到了有关羧基的证据。具体地讲，木聚糖酶催化反应有两类，即保持 异头构型的两步置换反应机制以及形成倒位异头构型的一步置换反应 【6 7 。前者的详细机制为：l 由非离子化的天冬氨酸或谷氨酸残基对最 初要降解的糖一号碳的亲核攻击。2 产生的糖片段从活性部位移去。3 正碳离子与离子化的谷氨酸或天冬氨酸共价作用。4 水分子的羟基加到 正碳离子，质子加到亲核基团上，结束反应。 木聚糖水解酶具有多重性与协同效应例如s t r e p t o m y c e s s p 的 一个菌株b 一1 2 2 在燕麦木聚糖上培养可以产生5 种内切木聚糖酶，根 据其理化特性可分成两组，组是低分子量的碱性蛋白，另一组是高 分子量的酸性蛋白，都可以将大分子木聚糖降解为低聚木糖。但是， 属于前一组的两种内切木聚糖酶对木四糖的活性很低，很难将其水解 为木二糖。而属于后一组的三种内切木聚糖酶则对木四糖有较高的活 性，能较好地将其降解为木二糖。除内切木聚糖酶外，1 5 - 木糖苷酶，洳l - 4 阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰木聚糖酯酶等木聚糖水解酶，都存在这种多 重性现象。木聚糖水解酶的多重性现象从遗传学的角度看可以由不同 的基因造成，或者是同一基因的不同等位基因引起，从生物化学的水 平来看，它与是否转录有相应的m r n a ，酶分泌后发生的蛋白水解修 饰，单体酶的自动集合等有关。酶的多重性是其进化过程中对底物适 应性的一种表现，有助于对结构复杂的底物发挥协同作用，增强催化 功能。木聚糖的生物降解需要多种酶的参与，在具有不同催化功能的 酶之间，协同增效作用是十分明显的。从t a l a r o m y c e se m e r s o i i 纯化出 来的内切木聚糖酶不能水解麦秸木聚糖( 阿拉伯木聚糖) ，但如果此麦 秸木聚糖先经由同一菌株产生的旺l _ 5 可拉伯呋喃糖苷酶处理，则前述 的内切木聚糖酶立即表现出催化活性。同样，乙酰木聚糖酯酶作用于 乙酰化的木聚糖后释放出醋酸，除去了乙酰基的屏蔽作用，使木聚糖 主链更易于接近内切木聚糖酶活性中心，提高了催化效率。而内切木 聚糖酶水解主链产生的乙酰化低聚木糖，则又是酯酶更好的基质。内 切木聚糖酶与1 3 木糖苷酶之间也同样存在协同作用。加入1 3 木糖苷酶 后能加速内切木聚糖酶对底物水解。其作用机理主要是降低了终产 物一一木二糖对内切木聚糖酶的抑制作用。木聚糖酶与纤维素酶及其 它多糖水解酶的催化作用也存在密切的关系。彼此相互促进，加速了 总反应的进行。 在木聚糖降解酶中，虽有少数微生物产生的木聚糖酶为组成型酶， 但大多数微生物产生的木聚糖酶主要还是诱导酶。因此，除了菌株本 身的特性以外，基质中的诱导物与酶的合成有着密切的关系。酶的生 物合成是在基因控制下进行的，调节基因所产生阻抑蛋白可通过与操 纵基因的结合或分开而控制有关结构基因转录成m r n a ，进而翻译成 对应的酶。木聚糖酶诱导物的作用就是它能与对应的阻抑蛋白结合， 降低阻抑蛋白与操纵基因的结合力，使结构基因能转录生成对应的 m r n a ，产生对应的酶。 2 木聚糖酶的应用【9 】 1 ) 在饲料行业上的应用 饲料中一般含有较多的非淀粉多糖( n s p s ) ，主要包括阿拉伯木聚 糖和0 - 葡聚糖，因单胃动物不能分解n s p s ，从而使其成为一种抗营养 因子。已有实验证明：n s p s 能结合大量的水，使采食动物消化道中的 食糜体积增大，粘度增加，并形成凝胶，这会干扰消化酶的功能和吸 收作用，影响食糜在小肠中滞留，而引起微生物异常繁殖，造成动物 生长受阻，饲料转化率降低。在饲料中添加木聚糖酶，就可显著降低 阿拉伯木聚糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改 善饲料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。 2 ) 在造纸工业上的应用 木聚糖酶可作为生物漂白剂。在化学或机械制浆过程中，大部分 的木质素可从木材或其他粗原料的纤维素中除去，但仍残留3 1 2 ， 这部分残留的木质素会造成纸浆呈褐色，并降低纸浆的强度。传统的 化学漂白法是采用酸性漂白剂如氯气、二氧化氯来去掉木质素，这就 会使造纸废水中含有大量的、有毒的强烈致癌物质，造成环境的严重 污染。如果在化学漂白之前，用木聚糖酶对纸浆进行预处理，就会使 氯气等化学漂白剂更好地渗透到纸浆里面，从而大大减少化学漂白剂 的用量。 3 1 在食品工业方面的应用 木聚糖酶在食品行业的应用体现在采用木聚糖酶降解木聚糖生产 可溶性膳食纤维及功能性低聚糖上。 3 木聚糖酶的研究现状 由于木聚糖酶有如此广泛的应用价值，国内外有很多研究者致力 于木聚糖酶的开发研究，研究集中在高产菌的选育、工程菌的构建、 优化培养条件、分离耐高温、耐酸碱【1 0 1 、无纤维素酶污染的木聚糖酶 菌株、寻找便宜的原料来源等多个领域。 已报道的产木聚糖酶的微生物分布很广，有细菌、链霉菌、曲霉、 青霉、木掣1 1 等。很多研究者已筛选出产木聚糖酶活性较高的菌株， 并对菌株进行诱变，如日本的入江利夫 l 列等人对球毛壳霉菌株进行诱 6 变，大幅度提高了该菌株的产木聚糖酶能力，诱变后菌株的木聚糖酶 酶活从出发菌株的2 1 u g 培养物提高到2 4 1 0 u g 培养物，酶液用于水 解桦木木聚糖得到的水解产物的低聚木糖与木糖之比也从原来的3 4 6 6 上升到7 2 2 1 。他们进一步以玉米芯为原料，利用球毛壳变异菌株1 1 6 1 进行固态发酵生产木聚糖酶。目前已将该项技术用于低聚木糖的工业 化生产。 孙迅【l3 等人以小麦秸半纤维素为碳源，从土壤中分离和筛选了一 株木聚糖酶发酵周期短、酶特性良好、酶活力高的短小芽孢杆菌菌株 1 0 1 ，细菌繁殖快，酶专一性强，对纤维素破坏程度小，该菌在3 2 振 荡培养4 8 h ，总半纤维素酶活力达2 3 5 6 u m l ，木聚糖酶活力达 11 6 4 2 u m l 。酶反应的最适温度为5 0 ，最适酸碱度为p h 6 5 ，n a + 、 m 9 2 + 等离子可提高木聚糖酶的水解活性，而z n 2 + 、c u 2 + 等离子则对木 聚糖酶活性有明显的抑制作用。 吴克 1 4 】等人经自然筛选分离得到一株产高木聚糖酶活力的拟青霉 属菌，初步鉴定为宛氏拟青霉菌，该菌所产的木聚糖粗酶液分别经硫 酸铵、乙醇沉淀，s e p h a d e x g 1 0 0 ，d e a e s e p h a d e x a 5 0 分离纯化后得 4 个组分，各组分酶反应最适温度和p h 值都具有一定的差异。这说明 该菌产生的木聚糖酶是由多组分构成的。与丝状真菌产生的木聚糖酶 都属于多组分构成的分离结果相似。 刘月英【1 5 等人报道了棒曲霉u a 一2 木聚糖酶的蔗渣固态发酵，蔗 渣的半纤维素含量约为3 0 ，主要成分为木聚糖，可被微生物产生的 木聚糖酶降解生成木糖和少量的其它单糖，该菌株经紫外线诱变，选 育得到一株能在p h 9 0 蔗渣固态培养基上很好生长，且其木聚糖酶活力 比出发菌株提高3 6 3 的变株u a 一2 ，2 8 培养1 0 8 h ，其木聚糖酶、 滤纸降解酶和羧甲基纤维素酶的活力分别为2 6 9 5 6 、2 8 5 、4 2 7 u g 蔗 渣，酶反应的最适p h 5 0 ，最适温度5 0 ，在p h 4 o 一1 1 0 内酶活性十 分稳定。5 0 z z 保温1 h ，酶活剩余5 5 ，8 c 下放置2 3 d ，活力几乎不变。 为了适应工业化生产的需要，许多研究者进行耐酸碱、耐高温菌 株的筛选。例如，b a d a lc s a h a 等人从土壤中筛选到一株降解玉米纤维 木聚糖的菌f u s a r t u mp r o l t f e r a t u m ，通过s d s - p a g e 测其酶分子量为 2 2 4 0 0 ，最适温度为5 5 。c ，在p h 5 0 7 5 之间稳定，该酶水解木聚糖来 源比较广泛，且没有木糖生成，而且，此酶不需要金属离子维持其活 性和稳定性。r 2 n a s c i m e n t o 等人分离出s t r e p t o m y c e ss p a m t - 3 菌株， 该株细菌在以工农业副产品和废料等为原料时有较高的胞外木聚糖酶 活性，最佳产酶温度为6 0 ，最适p h 值6 0 ，在5 5 条件下保温2 0 小时存留5 0 酶活力，因此该木聚糖酶被认为是很有效的耐热生物催 化剂。周世宁 1 6 1 等人通过碱性选择平板分离到耐碱的芽孢杆菌b 一1 4 1 菌株，该菌在碱性p h l 0 条件及木聚糖存在下能产生胞外木聚糖酶，该 酶最适反应温度为6 0 ，酶反应的最适p h 为3 7 ，但在碱性条件下稳 定，在p i l l 0 环境处理6 0 m i n ，仍保持约7 0 的活性。从t l c 分析可 知，该酶作用于燕麦木聚糖时，主要产物为大于三体的寡糖。 此外，在发酵条件、优化工艺方面有许多探索。如培养基最佳碳 源组成，最佳氮源，接种量、温度、p h 等参数对产酶的影响。我国陈 惠忠 i 等人对黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) c 2 菌株的突变株a n - 7 6 的发 酵条件进行了研究。结果表明此菌在以葡萄糖等为碳源时，可检测到 很低水平的胞外酶活，而只有在木聚糖、木糖和麸皮这类含木糖苷类 的诱导物中培养，才大量合成胞外酶。且半纤维素在低浓度范围内， 酶活随其浓度增大而升高，当浓度超过4 ，酶活趋缓至下降，表现出 高浓度下的“阻遏”作用。初始p h 5 5 - 6 5 、2 8 ，产酶量最高。v i n o l a r e d d y ”肄人研究了通风对t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u ss s b p 产酶的影 响，结果表明，在一定限度内，通风量越大，酶产量越高，但当通风 量大于1 0 v v m 时，增大通风量反而酶产量降低。 木聚糖酶作为一种工业酶制剂在我国正逐步形成规模化生产。吴 克【1 9 等人报导了黑曲霉a 3 菌株固体发酵培养的产酶过程，发酵3 d 产 木聚糖酶活最高，固体曲最适浸提比为1 ：7 ( w v ) ，通过6 0 - 6 5 饱 和度的硫酸铵盐析，获得的木聚糖酶活力最高，冻干酶粉活力为 1 5 4 0 0 u g ，得率为7 1 ，4 0 c 烘干酶粉活力为1 5 3 9 5 u g ，得率为5 1 ，酶反应最适温度5 5 ，最适p h 4 6 ，酶对四种不同底物半纤维素水 解作用得亲和性为麸皮最强，稻草最弱。还原糖生成量为麸皮最高， 蔗渣次之，其次是稻草，最后是玉米芯。此外，蔡敬民【2 0 1 等人报道了 木聚糖酶及固定化酶的性质和应用，研究壳聚糖吸附和戊二醛交联对 木聚糖酶固定化条件，将酶液加入到经醋酸溶液处理过的脱乙酰壳聚 糖的p h 4 8 的悬液中，加入浓度为0 3 0 4 0 的戊二醛溶液，室温下， 8 h 后得到固定化酶。固定化酶的半失活温度比游离酶高，由5 1 升至 7 1 ，k 。值由游离酶的1 2 m g m l 增加到1 5 m g m l ，最适反应温度也 由5 5 增加到7 1 ，而最适反应p h 由4 6 下降到3 8 ，该固定化木聚 糖酶可用于制造低聚木糖，经过1 0 次连续应用实验后，该固定化酶的 活力保持8 1 。黑曲霉木聚糖酶的固体发酵及其粗酶制剂的制备在中 小型企业中易于推广应用，因此，其应用潜力也较好。 4 木聚糖酶的分子生物学 随着对木聚糖酶研究的深入，近年来己开展了木聚糖酶基因的克 隆和表达研究【2 ”。到目前为止，有近百种不同菌株的木聚糖酶基因被 克隆或表达出来【2 “。在这些研究工作中所应用的受体细胞大都为大肠 杆菌，而所运用的载体及限制酶则形式多样。重组质粒转化受体细胞 的方式一般为c a c l 2 处理法或电穿孔法。与往常的基因克隆技术所不同 的是，多数情况下对阳性克隆的筛选是基以其对底物的分解，而不是 只用质粒所带的抗药性标记进行的。m o r o s o l i 等将目的基因插入p j h s 质粒，在目的基因前引入了树干毕赤酵母的木聚糖诱导启动子x y l l ， 将构建好的质粒p l a f l 4 5 转化受体细胞树干毕赤酵母p j h 5 3 ，可表达并 分泌有活性的胞外酶。a 1 i 和s r i v a s t a v a 将黄灰链霉菌i a f 4 5 c d 的木 聚糖酶基因克隆到p u c l 8 上，构成p s x 4 ，然后在对九噬菌体c i 8 5 7 具 溶源性的e c o l i j m 8 3 中表达，九噬菌体在4 2 。c 时可使大肠杆菌溶解， 导致木聚糖酶释放到胞外环境中。 近年来，已测定了许多木聚糖酶基因的完整核昔酸序列，根据这 些序列可推测酶的结构和性质，并为酶的蛋白工程研究打下了基础。 k r e u z e r 对枯草杆菌w 2 3 木聚糖酶基因序列分析表明其操纵基因为 2 5 b p 核苷酸序列，位于启动子的下游1 0 b p 处。该1 0 b p 序列含有一个 回文结构，而中间的5 个碱基对不是回文结构，并且这一序列的倒数 第二个碱基对与阻遏物的结合有关。在此序列之后为一编码3 8 4 个氨 基酸的开读框，它以g t g 为起始密码子，以t a a 为终止密码子。s h a r e c k 对变铅青链霉菌编码三种木聚糖酶的基因分析表明，x i n a 基因含有一 编码4 1 个氨基酸，分子量为4 0 8 3 的信号肽基因序列，其后为编码分 子量为4 7 1 2 9 的基因序列。从推测出的氨基酸序列可知，它是由3 6 疏水氨基酸，4 4 亲水氨基酸和分别都为1 0 的碱性和酸性氨基酸残 基构成。植物组织中的各种多聚糖是密切联系在一起的，微生物为了 将它们更迅速彻底地分解，需产生多种糖分解酶，并且这些酶的基因 往往聚簇在一起，能够同时或独立地转录翻译。嗜热脂肪芽孢杆菌一2 1 的一个3 4 k b 基因片断可编码木糖苷酶和木聚糖酶。木糖苷酶基因位于 后者上游，含有启动子和s d 序列。木聚糖酶基因可能含有两个启动子 和一个s d 序列位于木糖苷酶的3 端，两基因至少可部分地独立表达。 三、采用木聚糖酶生产膳食纤维与低聚木糖概述 ( 一) 木聚糖酶生产膳食纤维 随着生活水平的提高，人们对饮食与健康的问题更加重视，逐渐 认识到由于膳食不平衡和营养过剩会造成各种疾病的产生，危害人们 的身体健康。因此，开发对身体健康有益的食品显得十分重要。膳食 纤维对人体有重要的生理功能 2 ”0 1 ，例如1 具有较强的吸水功能和预 防肠道疾病的作用，富含膳食纤维的食物在肠胃中吸水膨胀并形成高 粘度的溶胶或凝胶，易于产生饱腹感抑制进食量，对肥胖症有较好的 调节减肥功能。膳食纤维能缩短食物在肠道内的滞留时间，一般低纤 维食品需2 8 小时从肠道排空，而高纤维食品只需1 4 1 6 小时，使粪便 中的有害物质特别是致癌物质及时排出体外，大大减少肠道癌和痔疮 等的发病机率。2 具有吸附有机物的功能与预防心血管疾病的作用。 膳食纤维能吸附胆汁酸、胆固醇变异原等有机分子，从而降低人体血 浆和肝脏胆固醇水平。实验证实，膳食纤维能降低胆酸及其盐类的合 成与吸收，从而阻碍中性脂肪和胆固醇的胆道再吸收，限制了胆酸的 肝肠循环，进而加快了脂肪物的排泄。因此，可直接扼制和预防冠状 动脉硬化、胆石症、高血脂症，对预防心脑血管疾病有重要作用。3 1 0 对阳离子有结合和交换功能和降低血压的作用。有关资料报道，膳食 纤维尤其是酸性多糖类，具有较强的阳离子交换功能，故它能与肠道 中的钠、钾离子进行交换，促进尿液和粪便中大量排出钾、钠，从而 降低血液中的钠钾比，直接产生降低血压的作用。4 有改变肠道系统 中微生物群落组成的物理特性。膳食纤维中非淀粉多糖经过食道到达 小肠，由于它不能被消化酶分解吸收，而直接进入大肠。这对于大肠 内上百兆的“食物”，不仅供给繁殖需要的能量，并能在纤维代谢中产 生大量短链脂肪酸，如乙酸、乳酸等。这对形成肠道良好的环境有重 要的生理作用。由于改善有益细菌的繁殖条件，使得如双歧杆菌等群 落能够迅速扩大。这对抑制腐生菌生长，维持维生素供应，保护肝脏 等都是十分重要的。膳食纤维虽然不被人体消化酶分解吸收，却是维 系人类身体健康、不能被其它物质所代替的一种营养素，所以人们又 将其称为人体的第七营养素。 ( 二) 木聚糖酶生产低聚木糖 低聚木糖是2 7 个木糖以b 一1 ，4 一糖苷键结合而成的低聚糖， 是木糖的直链低聚糖。低聚木糖一般是从富含木聚糖的植物为原料， 通过木聚糖酶的水解作用，然后分离精制而获得。自然界中很多霉菌 和细菌能产生木聚糖酶，工业上多采用球毛壳霉产生内切型木聚糖酶 进行木聚糖的水解，然后分离提纯而制得低聚木糖，低聚木糖产品的 主要成分为木糖、木二糖、木三糖和三糖以上的木聚糖，其中木二糖 为主要有效成分。木二糖是两个木糖分子以b l ，4 键相连而构成的， 甜度为蔗糖的4 0 。 1 低聚木糖的生理功能 低聚木糖对人体有重要的生理功能【3 1 ：1 ) 有显著的双歧杆菌增殖 能力，实验表明，每天只需口服0 7 克，2 周后，大肠杆菌中的双歧杆 菌的比例从8 9 增加到1 7 9 。2 ) 不被消化特性，与其他低聚糖相比， 木聚糖在消化系统中最稳定，不被消化酶水解，且代谢不依赖胰岛素， 可满足患有糖尿病、肥胖症和高血脂症等特殊人群的需要。3 ) 无龋齿 性，低聚木糖不能被豳腔内变异链球菌等细菌分解成粘着性的单糖如 蘩莓耱、果糖、半羲耱等，与藏糖著爱眩韪瓣壹蔗糖被龋齿痰蘸蔻终 用而生成水不溶性的高分子葡浆糖( 牙垢) ，因此无龋齿性并具有抗龋 逸性，逶合作为足耄食品魄蘸噱裁。4 ) 促进入体对钙嬲吸收，实验表 明，摄入低聚木糖后，大鼠对钙的消化吸收率可提高2 3 ，体内钙的 保留率提裹2 1 。嚣毖，低聚木猿可作为开发孕妊、老年食黠鲍理想 原料。低聚木糖的p h 值稳定雠和热稳定性优辫，在各种食晶中添加， 其产品具有可长期保存的特性。 2 低聚术糖的歼发研究 诲多醑究蠢进行了这方嚣鹃磅究截导，蘩静平【3 2 1 等久扶5 3 耱真菌 中筛选出3 株能分解玉米芯木聚糖并产生低聚术糖的菌株。结果表明： 粉红擎端憨霉，卷毛蠢秘黑鹜霉产生鬣聚本糖戆憩力较强，焚它各鏊 种虽然有的分解木聚糖的能力很强，但产物只有木糖。用薄层层析法 对产低聚本糖藏秘的发酵产甥分辑表明，主要产物为本二糖，吴夕 恣 含少量的木糖和木四糖。杨本宏【33 】等人用酶法从低聚术糖中摁纯木二 糖，半野维素经本聚蕤酶承鼹褥到滢会鲸低聚本糖，月蘩聚糖凝胶挫 s e p h a d e xg 一10 层析分离后，出现四个组分峰，经商散液相色谱分析 鉴定，箕孛3 号峰为本二糖纯缎分峰。鲮呆表嬲：利用睨。5 e m 1 2 0 c m 凝胶梳，以蒸馏水为流动相，流速为1 0 m l h ，在室温下，可以分离出 赢纯度的本二糠。陈洪章 3 4 】等人探索用汽爆端萃千方法提取低聚木糖的 全新路线，以便迸一步降低生产成本和为其他活性低聚糖的象产提供 新思路。秸秆汽爆生产活性低聚术糖的方法是基于蒸汽爆碎处理小麦 秸秆，可使其中木聚糟选择梭缝降解分离静特点，开辟应用物理原理 制低聚糖的新方法。稽秆汽爆生产活憾低聚木糖的方法具有生产过程 简单( 简纯了碱提取本聚糖、术聚耱辩的生产稍备帮本聚糖豹酶永辩 过程) 、无污染( 固行渣作为发酵蛋白饲料原料) 、产品得率简( 在汽 爆过稳中，本聚糖没鸯损失，本聚糖潮牧率8 0 ) 、生产残奉鬣( 汽溪 过程仪消耗蒸汽，其用缀为o 5 吨蒸汽吨小麦秸秆) 等优点。纛建国 3 习 等人 羹对撬聚本耱豹臻究秀发终了掇邀，曩痰汤壤莽蒺热入本聚耱， 1 2 筛选出木聚糖酶产生菌，以u v + n t g 复合诱变处理，得到高酶活力菌 株，酶活力达4 5 0 u m l ，经连续传代5 次，酶活力稳定，未出现衰退变 异现象。根据伯杰氏细菌鉴定手册，鉴定该菌种为短小芽孢杆菌。通 过大量的实验研究得，酶解木聚糖时，将玉米芯粉碎至颗粒直径5 m m 以下，用0 1 h 2 s 0 4 在6 0 下浸泡2 h ，滤去浸泡液，用清水洗至p h = 6 0 ，加入约1 0 倍水，1 5 0 蒸煮l h ，1 2 0 保温3 h ，料液压入酶解 罐，调p h 至7 5 ，冷却至5 0 。c ，加入木聚糖酶进行酶解，用时1 0 h 。 酶解后料液经离心分离、精制，可得低聚木糖。精制过程为，将酶解 后的糖液调p h = 5 0 5 5 ，加入0 5 的活性炭，6 0 搅拌吸附4 0 m i n ， 板框过滤，真空下于6 0 浓缩到固形物含量为1 5 2 0 ，进行第一次 离子交换，然后，进行第二次浓缩和离子交换，此时糖液p h = 5 5 6 0 。 第二次离子交换后的糖液加1 左右的活性炭，6 0 搅拌吸附4 0 m i n ， 板框过滤，真空下于6 0 浓缩到固形物含量为7 0 以上。结果表明， 低聚木糖含量达到6 7 8 。 3 低聚木糖的制取方法 低聚木糖的生产分为木聚糖的提取与精制 3 “，木聚糖的水解和低聚 木糖的纯化两个过程，要获得低聚木糖含量高( 木二糖与木三糖含量 高) 的产品，这两个过程都相当重要，木聚糖的提取过程不仅要做到 木聚糖的提取充分，而且还同时要保证其降解生成的木糖量要少。后 采用木聚糖酶作用，将植物纤维中的木聚糖糖化分解，使之生成低聚 木糖，而后，进行脱色、过滤、脱盐、浓缩精制可得到糠浆状产品， 另外，若在浆状产品中添加糊精作赋形剂混合，再进行喷雾干燥，可 制粉末状产品。 在低聚糖的生产中，一般采用碱或酸法来提取木聚糖。杨瑞金【3 7 等人通过对几种不同的木聚糖提取方法的比较，确立了酸预处理后加 水蒸煮的方法提取低聚木糖生产用木聚糖的工艺路线。蒸煮法提取木 聚糖是利用木聚糖自身含有的乙酰基在高温作用下脱落形成乙酸，体 系的p h 值降低，从而使木聚糖在较高温度下p 一1 ，4 糖苷键断裂发生 自水解作用，木聚糖分子量降低，溶解度增大。蒸煮法提取木聚糖与 加酸水解相比条件较为温和，因而水解程度较低，副产物相对较少， 有利于低聚木糖的生产。邵佩兰【38 等人对低聚本糖生产中影响木聚糖 提取率的因素进行了研究，其方法是粉碲玉米芯经n a o h 浸提得到的 木聚糖粗提液在p h 4 5 5 5 下，用9 5 乙醇按粗提液乙醇为1 ：2 的条 件下沉淀、离心、干燥所得木聚糖提取率可达3 1 。而其它沉淀剂如 工业酒精，丙酮，蒸馏水等提取效果不如乙醇好。石波 39 等人开展了 玉米芯酶法制取低聚木糖的研究，采用s p e 8 6 菌株制备木聚糖酶，探 讨了发酵时间与木聚糖酶活以及木聚糖酶液p h 值之间的关系，同时提 供了一种以玉米芯为原料，采用质量分数为2 的n a o h 溶液预处理， 5 0 水浴中保温1 5 2 h ，离心过滤，水洗滤饼至p h = 7 ，加入木聚糖酶 液，5 5 水浴中以2 0 0 3 0 0 r p m 转速搅拌，2 4 h 后停止反应。抽滤，滤 液置于沸水中煮5 m i n ，冷却倒室温；薄层层析测定酶解过程生成的产 物。结果表明，酶解反应时间增加，低聚木藉生成量也随之增加，其 平均聚合度则逐渐降低。采用t l c 法对s p e 8 6 菌株产木聚糖酶酶解玉 米芯产物的测定结果可以看出，酶解产物主要以木糖、木二糖为主， 另外还产生有少量的木三糖和阿拉伯糖，酶解产物中没有测到葡萄糖 成分，因此说明s p e 8 6 菌株产木聚糖酶组分较纯，纤维素酶的含量较 低。杨瑞金【4 0 1 等人探索了碱法提取木聚糖的酶法水解，采用3 4 的 底物浓度和2 0 u 幢底物的加酶量比较合适，在优化的条件下，产品的 低聚木糖含量达到7 9 1 ( 对总糖) ，得率达到6 6 8 。不同浓度的碱 法提取玉米芯木聚糖进行酶法水解试验，试验条件为：加酶量为1 9 u g 底物；水解温度为4 5 ；底物浓度为1 ，3 5 2 ；从结果可以看出， 还原糖和可溶性总糖在不同的底物浓度下随时间的变化规律基本一 致，开始时还原糖和可溶性总糖的生成速度较快，随着水解时间的延 长，生成速度逐渐减慢。水解至4 h ，可溶性木聚糖的平均聚合度从原 来的8 6 迅速下降到3 2 左右；4 h 以后，平均聚合度下降非常缓慢，到 达2 4 h ，下降到2 6 左右。在相同的加酶量和水解条件下，底物浓度对 可溶性总糖得率有很大的影响，底物浓度越高，可溶性总糖的得率越 低。从低聚木糖的生产来考虑，选用3 4 的木聚糖底物浓度比较合 适。通过对碱法提取木聚糖的加酶水解可获得有效物含量很高的低聚 1 4 木糖产品，产品中低聚木糖的含量可达到7 9 1 ( 对总糖) ，此外用于 低聚木糖生产的植物材料中的木聚糖与木质纤维的其它组分如木质 素、果胶和纤维素等【4 l 】连接在一起的，连接方式有共价键、氢键等 4 2 删。 与木聚糖结合的这些成分以及