（免疫学专业论文）epsteinbarr病毒lmp1蛋白羧基端结合抑制肽的筛选与序列分析.pdf

e p s t e i n b a r r 瘸毒l m p l 蛋鑫羧麓滚缕畲静裁获戆舞选譬劳秘努羲 本文赘曩靛壤略谣 本文常用的缩略词 b s ab o v i n es e r t l ma l b u m i n 牛血清白鬣蠢 c c t c y t o p l a s m i cc a r b o x yt e r m i n u s c 翡藏浆嚣 c t a rc t e r m i n a la c t i v a t i n gr e g i o n c 端功能结构域 d t td i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醉 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e b v e p s t e i n b a r rv i r u se b 瘸毒 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ea c i d 乙二胺西我羧簸 h r ph o r s e r a d i s hp e m x i d a s e 辣根过氧化物酶 i p t g i s o p r o p y l t h i o 一1 3 一d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代一p d 半乳糖苷 l bm e d i u ml u r i a b e r t a n im e d i u m l b 培养基 细菌培养基 l m p il a t e n tm e m b r a n ep r o t e i n l 渗铰f 感染 貘强鑫1 n p c n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a 鼻咽痛 o d o p t i c a ld e n s i t y光密度 p b s p h o s 曲a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸缓冲赫溶液 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l蘩乙二簿 p f up l a q u e f o r m i n gu n i t噬斑形畿单能 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p a g e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss d s 聚丙烯黻胺凝胶电泳 t b st r i s b u f f e r e ds a l i n e ir i s 缓沸捻滚液 t b s tt r i s b u f f e r e ds a l i n ea n dt w e e n 2 0 t r i s 缓游滚热t w e e n 2 0 t e m e d n n n n t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en n n n 圜甲基乙二胺 t r i s t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 三羟甲基胺熬甲烷 x g a l 5 b m m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y l d g a l a e t o s i d e5 滔 4 等玉3 明i 旺黎一 衅孥b b 一 半摹l 耱磐 e p s t e i n b a r r 病毒l m p l 蛋白羧基端结合抑制肽的筛选与序歹q 分祈中文摘要 e p s t e i n b a r r 病毒l m p l 蛋白羧基端 结合抑制肽的筛选与序列分析 硕士研究生 导师 余琳 马桂璋副教授 中文摘要 目的 利用e p s t e i n b a r r 病毒潜伏膜蛋白1 l m p l 羧基端胞浆区的三个重要的 功能结构域 c c t c t a r 2 3 c t a r 2 对噬菌体随机1 2 肽文库进行筛选 以发现能与 l m p l 蛋白羧基端各不同区段直接相互作用的特异性短肽 进而对筛选出的短肽进行 氨基酸序列测定和序列分析 找出与l m p l 蛋白羧基端不同片段相互作用短肽配体 的共有序列 确定其关键区域 表位及共有氨基酸残基 为后续人工合成用于阻断 已知和未知的l m p l 蛋白与其他蛋白之间相互作用的小分子肽奠定实验基础 方法 l m p l c c t c t a r 2 3 c t a r 2 结构域蛋白的表达与纯化 利用已构建的l m p 羧 基端的三个原核重组表达载体 在宿主细胞 b l 2 1 中表达三个融合蛋白片段 g s t c c t g s t c t a i 也3 g s t c t a r 2 用亲和层析和酶切的方法纯化后获得 三个区段蛋白 c c t c t a r 2 3 c t a r 2 用核酸蛋白定量仪计算出浓度后 分别包 被e l i s a 板孔 封闭后加入鼠源性l m p l 单克隆抗体 待反应完全后再加入酶标二 抗 h r p 一羊抗鼠l g g 进行抗原特异性鉴定检测 一抗及酶标二抗的最佳工作浓度 用棋盘滴定法确定 1 筛选噬菌体随机肽库并进行阳性克隆鉴定 首先 用纯化的三个区段蛋白 c c t c t a r 2 3 c t a r 2 分别包被e l i s a 板 使之固相化 然后将噬菌体短 肽库分别加入上述板孔中 使噬菌体表面呈现的特定短肽与包被的三个蛋白 发生结合作用 表面含有特异性结合作用短肽的噬菌体颗粒即从溶液中结合 e p s t e i n b a 病毒l m p l 蛋白羧基端结台抑制肽的筛选与序列分析中文摘要 到固相孔板上 洗去未结合的噬菌体 再以非特异性洗脱液将结合的噬菌体 从固相板孑l 上洗脱下来 同时将其感染宿主菌 于3 7 c 剧烈摇动培养4 5 小 时 使噬菌体在宿主菌中得到扩增 收获扩增的噬菌体 再次分别与固相化 的三个蛋白发生结合作用 重复上述 结合 洗脱 扩增 操作过程 进行3 轮 淘筛 最后 通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定 通过夹心 e l i s a 方法分析噬菌体克隆与三个区段蛋白的亲和力 2 阳性克隆d n a 制备及测序分析 用最后筛选出的噬菌体阳性克隆制备 d n a 交上海博亚公司对其进行测序 并依据此d n a 序列推导出相应短肽的 氨基酸序列 从而找出与三个片段相互作用短肽配体的共有序列 确定其关 键区域 表位及菇有氨基酸残基 结果 1 三个区段蛋白 c c t c t a r 2 3 c t a i u 的浓度分别是2 0 0 u m l 2 2 3 u m 1 和 2 0 8 u 咖i 抗原特异性鉴定结果 包被纯化c c t c t 舢毪3 c t a r 2 三个区段蛋 白的e l i s a 板孔的a 值 依次为0 3 8 3 0 2 5 2 0 2 3 7 均超过只用封闭液封 闭的板孔a 值 依次为o 0 5 8 o 0 6 0 o 0 5 6 的2 倍以上 p n 2 1 判为 阳性结果 2 耐肽库进行三轮筛选后 噬菌体克隆具有良好的富集效果 三个蛋白的第三轮产 率分别是第一轮的1 4 0 倍 6 7 倍和1 7 8 倍 硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率 达到1 0 0 通过e l i s a 方法检测到噬菌体克隆与三个区段蛋白 c c t c t a r 2 3 c t a r 2 有高亲和力 3 顺9 序结果显示噬菌体上的短肽具有的共同序列分别为 i o m p p k w p w p a a h v s u k h y p t a s g l 砌 h s p g l l l y 三者共有两个氨基酸 k p 残基 它们可能是引起l m p l 信号传导活性的最小和最必要的序列 而c c t 与 c t a r 2 3 两个阳性克隆序列共有 k p a 残基 c t a r 2 3 和c t a r 2 两个阳性 克隆序列共有 l k h p 残基 序列 k p k p a 和 l k h p 可能模拟了l m p lc 端受体的配体通过折叠后在三级结构水平上形成的结合位 点 很可能是l m p l 羧基端与信号转导因子相互作用的关键区域之一 结论 e p s t e i n b a r r 病毒l m p l 蛋白羧基端结合抑制肽的筛选与序列分析 中文摘要 从噬菌体肽库中筛选到了与三个l m p ic 端胞浆区区段蛋白有高亲和力的阳性 噬菌体克隆 噬菌体表达的1 2 肽i q m p p k w p w p a a h v s l h k h y p t a s 和 g l k h h s p g l l l y 分别模拟了天然配体的结合部位与靶分子 c c t c t a r 2 3 c t a r 2 结合 直接测知配体与受体的结合位点 为设计肿瘤疫苗提供了有力的前 提 而且 这三个模拟配体位点可能与鼻咽癌细胞上表达的l m p lc 端结合 从而 阻断l m p l c 端与其他细胞内信号转导分子或蛋白之间的信号转导通路 达到拮抗 l m p l 致瘤作用的目的 这为探明l m p l 的致瘤机制 进一步研制开发生物抗癌药 物及基因疫苗奠定良好的实验基础 关键词 e b 病毒潜伏膜蛋白1c 端胞浆区噬菌体展示肽库 e p s t e i n b a r r 病毒l m p l 蛋白羧基端结台抑制肤的筛选与序列分析英文摘要 英文摘要 s c r e e n i n ga n di d e n t i i c a t i o no ft h ec y t o p l a s m i cc a r b o x yt e r m i n u so f e b vl m p lf r o mr a n d o mp h a g ed i s p l a yp e p t i d el i b r a r ya n d s e q u e n c ea n a l y s i s p o s t g r a d u a t e y ul i n s u p e r v i s o r a s s o c i a t ep r o f m ag u i z h a n g a b s t r a c t o b j e c t t h i ss t u d yw a st os c r e e nm e1 2p h a g e e p i t o p el i b r a r i e si na t t e m p tt op r e d i c tt h e l i g m dr e c o g n i t i o np e p t i d ei n t e r a c tw i t hm e3i m p o r t a md o m a i n si 1 1c 0 1 0 9 i m i cc a r b o x y t e n n i n u so fe b vl m l 1 1 1 e nt h e 锄i n oa c i d ss e q u e n c e so fs c r e e n e dp c p t i d e sw e r e d e t e c t e da n da n a l y z e df o rn n d i n go u tm ec o n s e n s u sl i g a l l ds e q u e n c e sw h i c hh a v e i n t e r a c t e dw 曲c a r b o x yt e r n l i n u so 儿m p l a n df o rc o n f i 肿i n gt h ec r i t i c a la r e a s e p i t o p e s a f l dr e m a i n e dc o n s e n s u s 锄i n oa c i d s i nt h e 如t u r e t h es c r e e n e d p e p t i d e sw i l lb e s y n t h e s i z e d f b r b l o c k i n g t h e p r c 瞳e i n p r o t e i n m t e r a c t i o no f l m p l m e t h o d 1 t h e3p r o k a 叮o t i cv e c t o r so f c a r b o x yt e 咖i i l u so fl m p lw e r eb u i l tt oe x p r c s s3m s i o n p r o t e i n si nh o s t b l 2 1 t h ep r o t e i n sw e r ep u r m e db ya m n i t yc h m m a t o 黟a p h ya n d e n z y m ea c t i o nf o rc o n c e n t r a t i o nm e a s u r e 锄ds p e c m c i t yi d e n t i f i c a t i o no fa n t i g e n l o o u lo f m ep u r i f i e dp r o t e i n s v c r cp i p e t e di n t o 廿l em i c r op l a t ec o a t e dw i t hb s a a r e r t h ee x c r e s c e n tm o n o c l o n a la f l t i b o d ya g a i n s tl m p lw a si n t e 铲a t e dw i t hm ep u r i f i e d p r o t e i n sa d e q u a t e l y t h eh r p a n t im o u s ei g gw a sa d d e dt oc o m b i n ew i t hm o n o c l o n a l a n t i b o d y t h e0 p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fm o n o c l o n a la 1 1 t i b o d ya 1 1 dm e 王j 冲一a n t i m o u s ei g gw e r ce s t a b l i s h e d b yc h e s s b o a r dt e s t 5 e p s t e i n b a n 病毒l m p i 鬣自羧蒺靖缝合抑锎敬的筛选与痔弱分析英文摘要 d i m e n s i o n a l l yf o l d e d t h e ya l el i k e l yt ob eo n eo ft h ek e yd o m a i n so fi n t e r a c t i o n b e t w e e nl m p lc t e r m i n a la n dt h ea s s o c i a t e ds i g n a l i n gm o l e c u l e s l c o n c l u s i o n l p o s i t i v ep h a g ec l o n e st h a th a v eh i 蜘a f f i n i t yw i t ht h r e ei m p o r t a n tf u n c t i o n a ld o m a i n so f l m p lc t e r m i n u sw e r es c r e e n e do u ti n 砖a g ed i s p l a yp e p t i d el i b r a r i e s t h et h r e e l 2 p e p t i d e s i q m p p k w p w p a a h v s l h k h y p t a sa n dg l k h h s p g l l l y m i m i ct h e b i n d i n gs i d eo ft h en a t u r a ll i g a n dr e p e c t i v e l y b i n d i n gs i d e sb e t w e e nl i g a n da n dr e c e p t o r c a l lb ed e t e c t e dd i r e c t l y w h i c ho f f e r sap o w e r f u lp r e c o n d i t i o nf o rt h ed e s i g no fk n u b b l y v a c c i n e m o r e o v e r t h et h r e el i g a n d s p e c i f i cb i n d e r sm a y b ei n t e r a c tw i t hl m p lc t e r m i n u si nn p cc e l l w h i c hc a nb l o c kt h es i g n a lp a t h w a yb e t w e e ni n t r a c e u u l a rs i g n a l m o l e c u l e s o rp r o t e i n a n dl m p lc t e r m i n u sa n df u r t h e r m o r ec a na n t a g o n i z et h e o n c o g e n i cr o l eo fl m p l t h er e s u l t sp r o v i d e dt h eb a s i cm a t e r i a lf o rp r o v i n gu pt h e o n c o g e n i cm e c h a n i s mo fl m p l i te s t a b l i s h e da l le x p e r i m e n t a lb a s i cf o rd e v e l o p i n g a n t i c a n c e rm e d i c i n ea n de n g i n e e r e dv a c c i n e k e yw o r d le b v l m p i c y t o p l a s m i cc a r b o x yt e r m i n u sp h a g ed i s p l a yp e p t i d e l i b r a r y 7 e p s l e m 培a r r 病毒l m p l 蛋白羧基端结合抑制肽的筛选与序列玲辑 觏蓦 e 8 病毒 e p s t e i 静 b a f rv i n l s 躲v 怒两s t e i 建葶鞋b a 球予1 9 6 4 每最先从 测 恶性淋巴瘤 b u r k sl y m p h o m a b l 组织培养中发现的 种病毒 e b 瘸毒与 奏咽癣 n p c 载发生 发震蠢菲鬻密甥豹关系1 2 在各秘不露类型瓣n p c 组织 中都梭测到e b v 基因 e b 病毒和未分化鼻咽癌的关系最为密切 与低分化和高分 纯的舞咽癌逡寤一定联系 所有来分纯彝疆爨癍弼翡瘸组织中均有病毒基因缀的存 在和表达 同一未分化鼻咽癌细胞中即使仅有单一的非常局限的原位癌中也无不例 岁 建裔病毒存在 这怒病毒参加癌形成过程的早期变化的证据之一 l m p l l a t e n tm e m b r a n ep f o l e i 娃1 是e b v 潜伏期的纂因表达产貔 在嚣种 不同类型的n p c 组织中均已检测到e b v 基因及其表热产物 其中e b v 潜伏膜蛋白 l l m p l 基因鼓认必建一秘痰毒癌蒸嚣 程奏咽上皮鲴腿敕转饯琴毪瓣癯形戏中起 着重要作用 l m p l 单基因转染实验表明同 l m p l 是众多e b v 基因液达产物中唯 一 g 转佬谑努垮蓁静曝凌类藏纾维绥藤熬瘙蛋囊 它转耽兹鬃惩接静翻潦疑涔内可 以形成肿瘤 l m p l 也是影响上皮细胞生长 分化 使细胞出现分化障碍 发生明 显形态学改交豹癯蛋鑫 醣上证据表瞩 l 凇1 在细胞转纯及器中瘸形成过程中起着 非常重囊的作用 l m p l 的编码基阏b n l f 1 位于u 5 t r 隧内 由e d l l 和l 1 下r 启动予所控 制 b n l f 1 基因含3 个外显予和2 个内含予 其翻译的l m p l 蛋自分子量为5 8 6 2 携有不同l m p l 基因顺序的e b v 亚株会发生一定的变异 目前实验赛研究 使用最为广泛躲e b v 揍是b 9 5 8 来源躲l m p l b l m p l 一秘虫3 跖个爨基酸 组成分子量为6 2 k d 的典型膜结合蛋自 它包括一个2 3 个氨糖酸组成的亲水性n 寒溃熬覆区 一个长2 0 0 令氨蒸酸鳃裁魏c 寒壤魏蘑嚣窝6 个跨貘嚣 n 束端都是 使l m p l 分子固著于膜上 在膜上呈点片状分布所必需的 c 端含有3 个小区 c 囊嫌一l c 船黻 n a 重a c t i v 越i o nf c g i o n e 彳a r 2 帮c t a r 3 它稻与l m p l 酌生 物学功能相关l 射 l m p l 的燕要生物学活性 1 l m p l 与缅胞的转化 增殖及去分化有关 它 能使鼠类成纤维细胞形态改变 缨胞闻接触挪俸i 丧失 2 l m p l 具宥促进及维持 b 细胞转化及永生化的熏要作用 能引起b 细胞标志c d 4 0 c d 2 3 c d 5 4 等的表 e p s t e i n b a f r 病毒l m pi 礅自羧蒸靖结合抑秘靛的簿选与净捌分祈 前言 这增加 使c d l o 的表达减少 熊引起细胞粘附分子l f a l l f a 2 及i c a m 1 的表 达受激活拶l 3 l m p l 程缝藏中基戮转录过程串其蠢耋要佟矮 a 它筑诱导孩转 录因予n f k b 躲表达活他 n f k b 霹激活抗凋亡基霹b n l 和 x e p s t e i n b a r r 病毒l m p l 蛋白羧基端结台抑制肽的筛选与序列分析 材料与方法 一 主要实验仪器 1 高速冷冻离心机 2 低温高速离心机 3 水平电泳仪 4 垂直电泳仪 5 电子天平 6 微波炉 7 u v p 紫外透射仪 8 凝胶图像分析仪 9 细胞超声破碎仪 1 0 核酸蛋白定量仪 1 1 台式离心机t g l 一1 6 c 1 2 超静工作台 1 3 空气浴振荡摇床 1 4 电热恒温水槽 1 5 隔水式电热恒温培养箱 材料与方法 德国h e t t i c h 公司 s i g m a 公司产品 北京六一仪器厂 美国p h a r m a c i a g 公司 上海天平仪器厂 格兰氏 c o l e r p a n n e r 公司产品 美国b i o r a d 公司 g m b h 公司 e p p e n d o r f 公司 国产仪器 苏州仪器厂 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 上海医用恒温设备厂 上海跃进医疗器械厂 二 主要实验材料及相关试剂的配制 一 主要实验材料 噬菌体随机1 2 肽库试剂盒 p 1 1 d p h a g ed i s p l a yp e p t i d el i b r a r y 复杂 度为2 7 x 1 0 9 野生型噬菌体v c s m l 3 b l 2 1 含p g e x 6 p 3 c c t 质粒 b i 2 1 含p g e x 一6 p 3 一c t a r 2 3 质粒1 b l 2 1 含p g e x 6 p 3 c t a r 2 质粒 n e b 公司 n e we n g l a n db i o l a b s 由暨南大学生命科学技 术学院向军俭教授惠赠 为本课题前阶段研究产物 e p s t e i n b a r r 癍毒l i v l p t 鬣自羧基端结合抑制敬的筛选与序列分析 材料与方法 h r p 桶f 标羊抗鼠i g g 鼠挽 m 1 3 h r p 擎克淹挠箨 m 1 3 单链d n a m a r k e r 小牛斑清白鬣自 b s a p e g 8 0 0 0 i p t g x g a l 辣躐过氧化懿底物t m b 显惫试裁鑫 碘化钠 粥孑0 酶标裁 硝酸纤维膜 蛋鑫膝 酵蹲耪 丙烯酰胺与n n 一亚甲基双丙烯酰胺 过硫酸胺 s d s t e m e d 彗畿羧 t n i s d t 彳 p r e s c i s s i o np r o t e a s e 甲醇 冰醋酸 考弩瓶亮蓝 r 2 5 0 叠氮钠 鬣撬入l m p l 荦壳隆抗体 g s t 融合蛋囱亲和层析柱 r e d i p a c kg s tp u r i f i c a t i o nm o d u l e 溴酚兰 o 4 5 u m 虑器 带滤芯吸头 1 0 u l 2 0 0 u l 1 0 0 0 u 1 1 4 晶美公司 p h a r m a c i a 嚣2 7 9 4 2 1 崦1 n e we n g l a n db i o l a b s 4 0 4 c s i g m a 宝豢克公司 宝黎克公司 宝泰克公司 宝黎克公司 宝豢夷公司 宝豢克公司 o x o l d s i g m a s i g m a m e r k 公司 b i o r a d 公司产品 上海潦达氨蘩酸厂 m e r k 公司产品 p r o m e g a 誊 产品 p h a r m a c i a 公司产品 广州化学试剂厂 a m r e s c o 公司产 西安化玻站化学厂 丹麦d a k o 公司产品 p h a r m a c i a 公司产品 a m r e s c o 公司产品 北京鼎国公司产品 j 裘爨国公鲻产品 e p s t e i n b a r r 疯凑l m p i 蛋自羧基端络会抑瓤致盼筛选与序列薹 耩 树辩每方法 二甲基甲酸黢 电泳琼脂糖 6 凝胶加样缓冲液 s i g m a 华焚生物工程公司 二 主要试麴戆嚣鐾方法 a 筛库部分 l b 完全培养罄 1 0 0 0 m 1 细菌蛋白胨b a c t o t r y p t o n e1 0 9 酵母粉y e a s te x t r a c t5 9 氯纯镳 廷 琼脂粉 圆体 1 5 9 高压灭菌 塞濑保存 i p t g x g a l 底层琼脂 2 0 0 m 1 缨蔻垂鑫黥b a c t o t r y p t o n e2 9 酵母耪y e a s te x t r a c tl g 氯化钠 1 9 琼脂粉 固体 3 9 高压灭菌 冷郄至6 0 1c 加入o 2 m li p t g x g a l 溶液 浸匀饲叛 4 c 避必媸存 上瑟骧n a g a r o s et o p 5 0 0 m 1 细菌蛋白胨b a c t o t r y p t o n e5 9 酵母粉y e a s t e x t r a c t 2 5 9 氯化钠 2 5 9 璩疆耪 3 5 9 分装5 0 m l 等徐 离压灭菌 4 c 缣存 t b sb u f f e r 1 0 0 0 m 1 t r i s p h 7 5 1 5 0 r a m 6 0 5 9 n a c i 1 5 0 m m 8 7 6 9 蒸馋零8 0 0 m l 用浓h c i 调p h 7 5 后定容1 0 0 0 m l 高压灭菌 p e g n a c i 3 0 0 m 1 e p s t e i n b a r r 虢毒l m p l 蛋囊羧基璞络赍摔制膝的筛选与痔捌分辑 材辩与方法 2 0 w v p e g 8 0 0 0 2 5 mn a c l 碘化钠溶液 5 0 m 1 碘化钠4 m i s1 0 m m p h 8 0 e d t al m m i p t g x g a l i p t g 1 2 5 9 2 0 9 3 6 0 9 1 4 6 9 3 4 3 8 9 加蒸馏水黛3 0 0 m l 定容 高魇灭菌 2 9 9 5 9 6 0 5 5 m g 1 8 6 m g x g 采l g 溶于2 5 m l 翠蒸攀溅羧中 一2 0 c 避浅保存 营氨酸一藏酸洗裁缓 薜滚 p 疆2 2 1 0 0 m l o 2 m甘氦黢5 0 m l 0 2 m 盐酸 1 6 8 m l 调整p h 值爱2 2 加蒸馏水至1 0 0 m l 高压灭菌 p b s1 0 0 e 黼l n a c lo 1 4 m 8 9 k c i 2 7 m m o 2 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 1 0 1 m m 3 6 9 k h 2 p 0 4 1 8 r a m o 2 4 9 嚣h c i 调节p h 7 3 燕拳定容至1 0 0 0 m l 裹压灭蘩 封闭缓冲液1 0 0 m l n a h c 0 3 p h8 6 0 i m b s a 5 m g m l 0 0 2 n a n 3 d d h 2 0 定骞1 0 0 m l o 2 2 u m 滤膜过滤除菌 1 mt r i s h c lp h 9 11 0 0 m l t r i sb a s e 1 2 1 1 9 热承8 0 m l 煺h c i 调节p h 至9 l 热水至1 0 0 m l 定褰 芡萤蚕爱 疆环素髓滚 1 0 m l 无水乙醇 1 0 m l e p s t e i n b a n 崩毒l m p l 蛋白羧基端结合抑制肽的筛选与序列分析材料与方法 四环素 2 0 0 m g 一2 0 c 避光储存 用前摇匀 b 蛋白表达及纯化部分 氨苄青霉素 1 0 0 m g m l 配1 0 m l 氨苄青霉素 2 9 d d h 2 0 2 0 m l o 2 2 u m 滤膜过滤除菌 i m f e p 管分装 2 0 c 储存备用 i p t g 溶液0 5 m配3 0 m l i p t g 0 7 1 4 9 9 d d h 2 0 3 0 m l 0 2 2 u m 滤膜过滤除菌 l m l e p 管分装一2 0 c 储存备用 3 0 丙烯酰胺溶液lo o m 丙烯酰胺 2 9 9 n n 一亚甲基双丙烯酰胺 1 9 加水定容至1 0 0m l 用0 4 5 u m 孑l 径滤器过滤除菌 lxt n i s 甘氨酸电泳缓冲液1 0 0 0 m l t n i s 3 0 2 9 甘氨酸 1 8 8 9 l o s d s 1 0 m l d d h 2 0 定容至10 0 0 m l 2x s d s 凝胶上样缓冲液 5 0 m l t n i s c l1 0 0 m m s d s4 d t t2 0 0 m m 澳酚蓝o 2 甘油2 0 p r e s c i s s i o np r o t e a s e 酶切缓冲液p h7 52 0 0 m l t r i s h c l 5 0 r a m 1 2 0 9 n a c i1 5 0 m m 1 1 5 9 e d t al m m o 0 7 9 d t tl m m 1 m 储备液0 2 m l 1 7 e p s t e i n b a n 病毒l m p1 蛋白羧基端结合抑制肽的筛选与序列分析 材料与方法 3 6 噬菌体肽库的筛选 3 6 1 用纯化小蛋白片段对噬菌体1 2 肽库进行第一轮筛选 每酶联孔加入1 0 0l a g m l 靶分子溶液1 0 0p 1 即5 0 u l 蛋1 当l 5 0 u 1 0 1mp h8 6 的 n a h c o 反复旋转直到表面完全湿润 小心不要使溶液溅出 在增湿容器 排列有湿纸巾的可封口吕盒 中4 轻微震荡 孵育过夜 e r 2 7 3 8 甘油菌划线接种l b t e t 平板 倒置平板3 7 培养过夜 用封口膜封闭平板 后4 避光保存 挑e r 2 7 3 8 单克隆于1 0m ll b t e t 液体培养基中 置于1 0 0m l z 角瓶内 3 7 c 震荡 培养过夜 倒掉每板中的包被液 板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液 每孔加 满封阻液 4 c 作用lh r 按上述方法除去封阻液 再 f l t b s t t b s 0 1 v v t w e e n 一2 0 缓冲液快速洗板6 次 每次均旋转以使板或孑l 的底部及边缘均被洗到 倾去缓冲液 倒置在干净 纸巾上拍甩以除去残余溶液 此操作要快以避免板干燥 用l m l 的t b s t 缓冲液稀释原肽库为2 x1 0 p f u m l 的噬菌体 即1 0u l 的原始文 库 然后加l o o u l 至t 已包被好的板上 室温温和摇动6 0m i n 倾倒除去未结合噬菌体 倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液 用t b s t o 1 洗板1 0 次 每次换一干净纸巾以避免交叉污染 每次2 m i n 用0 2m g l y c i n e h c l p n2 2 来洗脱 分离已结合的分子 1 0 0 u l j l 温和摇动1 0 m i n 洗脱液吸入另一干净微量离心管中 然后 j n 入1 5 1 a l1 mt r i s h c l p h9 1 中和上述洗脱液 将上述过夜培养物0 2 m l 稀释于2 0m ll b 中 用2 5 0m 1 三角瓶盛装 加入未扩增 洗脱物5 0 u l 3 7 c 剧烈摇动培养4 5h r 将培养物转入一离心管中 然后 4 c1 0 0 0 0r p m 离 t l om i n 上清液转入另一 离心管中 再离心 将上清的8 0 转入一新鲜管中 加入l 6 体积p e g n a c i 让噬菌体4 c 沉淀过夜 4 c1 2 0 0 0r p m 离心p e g 沉淀1 5m i n 弃上清液 再短暂离心 吸去残留上清 沉淀重悬于1m lt b s 中 悬液转入微量离心管中 4 c 离心5m i n 沉淀残余细胞 上清转入另一新鲜微量离心管 用2 0 0 u l p e g n a c i 再沉淀 冰上孵育l h r e p s t e i n b a r r 瘸毒l m p l 蛋嚣羧基端结合榔制肢的筛选与序捌分析材料苟方法 4 0 1 2 0 0 0 r p m 离一0 1 5r a i n 弃上清 露短暂离心3 0 s 用移液器吸去残余上渣 沉淀饕薰慧予2 0 0 瑟lt b s 离 lm i n 沉淀任麓袋众馥不溶物 上涛转入凝祥管 中 此即为扩增后的洗脱物 于4 0 保存 根据上述常规m 1 3 方法用l b i p t g x g a l 平板滴定扩增后的洗脱物 4 c 贮存 孬惫被一个琵准备第二轮淘透露麓 3 6 2 用纯化小蛋白片段对噬菌体1 2 歇艨进行第二轮筛选 i l 进行第二轮淘选 用第一轮淘选扩增舱洗脱物中l 2 1 0p f u 鲍噬菌体量堂囊步 骤4 1 8 褒清洗步骤中溪 t w e e n 的浓壤增至0 3 v v 在l b i p t g x g a l 平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度 再包被一个孑l 准备第三轮淘选时用 3 6 3 霜统像 j 蛋白冀段辩缓蕾体1 2 获撵进行第三辕鼯选 l l 用第二轮淘选扩增的洗脱物中2 x1 0p f u 的噬菌体缀重复步骤4 11 清洗步骤中 将t w e e n 靛浓度增至0 5 v v 在l b i p t g x g a l 平扳上溯定第三轮海选所得洗脱物来扩增的滴液 滴度测定时得 到的噬菌斑可做测序阁 平板培养时间不要超过1 8 d 时 其余洗脱物4 贮存 挑一e r 2 7 3 8 单克隆予1 0 m l l b t e t 蟮游基中3 7 c 毽滚搓庶培养避夜 3 6 4 扩增及缝讫第三轮筛选出来的单夺克隆 取分装有2 0 m l l b 培养液的三角烧瓶 每个加入0 2 m l 细菌液 随机挑选在上述计 数平板上蘸色噬菌斑接萃孛到烧瓶中 从每次洗脱的平板中随极逡取1 2 个克隧 3 7 恒滠褥晃培养 5 b 时 从每瓶吸取1 5 m l 培养液 转至1 5 m l 离心管中 1 2 0 0 0 r p m 离一l 1 5 m i n 取上清l m l 至一薪鳞嚣p 管中 每警加入2 0 0 u i p e g n a c i 4 沉淀避夜 1 2 0 0 0 r p m 离一t l 1 5 m i n 倒上清 快速离一t 3 0 秒 用无菌t i p 头吸干液体 用5 0 u l 无鬻p b s 溶解泼淀 一4 c 保存 编号为c c t i 1 2 c t a r 2 3 1 一1 2 c t a r 1 1 2 分别表示三 x e p s t e i n b a r r 病毒l m p l 蛋自羧基媾结合撺制敝的筛选与序列分析 材料向方法 噬藏体漓度测定 1 揍耱e r 2 7 3 8 单蓥藩予5 m t 0m l 臻蘩养麓中 摇凑臻赛至薅数孛 o d 鳓o 4 5 2 细胞生长时 微波炉融化上层琼脂 分成3m l 等份于灭菌试管中 每个噬菌体稀 释度一管 保存于5 5 备用 3 3 7 c 颈澄 l b i p t g x g a l 平扳 每令旗蓠俸稀释度联一个乎教餐臻 4 在l b 中准备1 0 倍系列稀释的噬菌体 扩增的蠛菌体培养物上清 1 0 8 1 0 未扩增的淘选洗脱物 l o 1 0 4 每个稀释 度换 新鲜吸头 5 当菌体培养物达对数中期 分成2 0 0 l 等份于微量离心管中 每个噬菌体稀释度 一管 6 每管加入l 爵扯i 不同稀释发的噬菌体 茯速震荡港匀 室温溢肖l 一5r a i n 7 将感染细胞加入4 5 预漩的上层琼脂培养管中 每次一管 快速混匀 童盟倾注 于3 7 c 预温雏l b i p t g x g a l 平板上 适当倾斜平嘏将上层琼服均匀铺开 8 待平板冷却5r a i n 后 倒器于3 7 c 墙游过夜 9 检查平板 计数有 l o 个噬菌斑的平板上的斑数 然后用此数目乘以稀释因子即 褥到每l eh l 噬萤俸的察斑形成单便 p f u 渡度 3 7 噬菌体的兔疫斑点梭溯 用硝酸纤维膜斑点印迹法检验阳性率 在每张2 2 e m 的硝酸纤维膜上画出0 2 5 c m 2 小格 怒l u l 扩增载噬鏊俸溶滚 终1 0 垃p f u m 1 建爨参格上 c c t l 1 2 c t a r 2 3 1 t 2 c t a r 21 t 2 号炎隆分别点在三张膜上 室滠干燥 用野生型噬菌体v e s m l 3 和b s a 作阴性对照 用备自的融合蛋白作阳性对照 恕膜放入耀糕袋中 鸯鞋入b s a 封 l l 渡封阕过夜 倒去液体 分别用稀释液1 1 0 0 的纯优蛋自渡及l 5 l m p l 单嵬隆抗体加入膜中 置小塑料窳内浸膜2 h r 窒温 把骥移至予潦烧杯内 翔e 1 t b s t 浚三次 每次3 m i n 把膜放入鹦一塑料袋中 加入封闭液1 5 0 0 0 稀释的革抗鼠h r p 标记1 9 g 孵育 l h r 室温 恕膜移至于净烧柘悫 f f o 1 t b s t 浚6 次 每次3 r a i n 把膜移至另一塑料袋中 加入2 m l 底物显色 a b 液 1 0 m i n 厢加入终止液l m l e p s t e i n b a r r 病毒l m p i 蛋白羧基端结合抑制肤的缔选与序列分析 材料与方法 然后用p b s 轻轻漂洗 拍照 根据克隆的颜色与对照点的比较计算阳性率 3 8e l i s a 分析筛选的噬菌体与蛋白的结合 在包被液 n a h c 0 3 中稀释纯化的c c t c t a r 2 3 c t a r 2 至1 0 0 u g m l 加入 e l i s a 板孑l 中 5 0 u 蚜l 4 c 过夜 置于湿盒内 轻轻震荡 倒掉孔中的包被液 倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液 每孔加入 1 0 0 u lo 5 b s a 于3 7 封闭l 小时 同时封闭一行未包被蛋白孔做空白对照 将噬菌体加到包被平板之前 在另一平板上对噬菌体进行连续4 倍稀释 因此也 要封闭第二个平板 目的是为了保证噬菌体在稀释的过程中不会被靶分子吸收 将封闭的平板置于4 孵育1 2 小时 用上述方法除去封阻液 用0 5 t b s t 快 速洗孔3 次 每次i m i n 在第二个封闭的平板上 在装有1 0 0 u 1 0 1 t b s t 的孔 中对噬菌体进行4 倍连续稀释 用加样器将每 y t j 稀释的噬菌体转移到包被靶分 子的平板上 每孔5 0 u l 摇床孵育2 小时 同时做v c s m l 3 阴性对照 0 5 t b s t 洗三次 每孔加入抗h r p m 1 3 单克隆抗体 工作浓度按试剂手册要 求 1 5 0 0 0 5 0 u l 反应1 小时 o 1 t b s t 洗板三次 每次3 分钟 用t m b 显 色 3 7 c1 5 m i n 后加入终止液 4 5 0 n m 检测o d 对比包被纯化小蛋白片段的反 应孔a 值 用封闭液封闭的孑l 反应a 值和v c s m l 3 阴性对照孔的a 值 最后在噬菌体的最佳工作浓度下 用1 2 个噬菌体克隆与对应的吸光度值作图 3 9d n a 模板的制备及测序 进行噬菌斑扩增 在第一步离心后 将5 0 0 u l 含噬菌体上清转入一新鲜e p 管 加入2 0 0 u l p e g n a c l 颠倒混匀 室温放置1 5 m i n 4 c 1 2 0 0 0 r p m 离 t j 1 0 m i n 完全吸掉上清液 再快速离 t j 3 0 s 吸干液体 沉淀物彻底重悬于1 0 0 u l 碘化物缓冲液中 反复震荡 使沉淀溶解 加入2 5 0 u l 无水 乙醇 室温温育1 0 m i n 4 c 1 2 0 0 0 r p m 离 t j 1 0 m i n 缓慢弃上清 用t i p 头吸掉残留上清液 加入2 0 0 u 1 7 0 乙醇 略加震荡后 4 c 1 2 0 0 0 r p m 离 g 1 0 m i n 迅速吸去上清 室温放置1 0 m i n 让管内的乙醇蒸发 再加入5 0 u l t e p h 8 0 以溶解沉淀 一2 0 储存 电泳鉴定 e p s t e i n b a f r 病毒l 蛐 l 蛋白羧基靖结台抑制歇的筛选与序列分析 结果 结果 一 检测l m p lc 端胞浆区c c t c r a r 2 3 c t a r 2 蛋白的生