（环境科学专业论文）提取测定大型海藻叶绿素a的新方法研究.pdf

尖锐，洗脱时间接近的色素能够实现基线上的分离，易于定性和定量，是优秀的 提取溶剂。 所选的8 种溶剂对裙带菜进行浸提和研磨所获得的h p l c 色索分析结果表 明：在浸提方法中，以e t h a n o l 浸提所褥的c h l - a 结果最高，其次是d m a c 浸提。 但是e t h a n o l 浸提极性色素( c h l - c l 和c h l c 2 ) 的结果琨显低于d m a c 和其它溶 剂，同样，a c e 和9 0 a c e 对c h l c l 和c h l c 2 的结果也比d m a c 差。在所研 究的试剂范围内，d m a c 是提取大型海藻色素能力最优秀的溶剂。 对d m a c 提取的大型海藻掖( 以裙带菜做实验材料) 用分光光度法和高效 液相色谱法测定，二者结果一致。 关键词：大型海藻；叶绿素a ；浸提；研磨；n ，n - 二甲基乙酰胺 t h er e s e a r c ho fn e wm e t h o df o re x t r a c t io na n d d e t e r m in a t i o no f c h i o r o p h y l iain m a c r o a l g a e a b s t r a c t ； t h e d e v e l o p m e n to f m e t h o d sf o re x t r a c t i o na n dd e t e r m i n a t i o no f c h l o r o p h y l lai n m a c m a l g a e w e r er e v i e w e di nt h i st h e s i s m o r et h a n1 0m a c r o a l g a e sw e r ec o l l e c t e da t t h ec o a s to fq i n g d a of o rr e s e a r c ha n dd i r e c ti m m e r s i o na n dg r i n d i n gp r o c e d u r ew e r e u s e df o rt h ec o m p a r a t i v es t u d yo ft h ec h l o r o p h y l lae x t r a c t i o nm e t h o df o rm a c r o a l g a e w i t hd i f f e r e n ts o l v e n t s t h ee f f e c to fm o l e c u l a rs t r u c t u r eo f o r g a n i cs o l v e n t st ot h e e x t r a c t i o no f c h l o r o p h y l la i nm a c r o a l g a ew a s a n a l y z e db a s e do na b o v er e s u l t sa n da n e wm e t h o df o re x t r a c t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fc h l o r o p h y l lai nm a e m a l g a ew a s p r o v i d e d t h e d i f f e r e n c e so f p i g m e n tc o m p o s i t i o n s a n dc o n c e n t r a t i o n so f p h a e o p h y c e a e u n d a r i ap i n n a f i f i d aw i t hd i f f e r e n ts o l v e n t sa n de x 订a c f i o nm e t h o d s w a sa n a l y z e db yh p l ca n dt h er e s u l t so fh p l cw a sc o m p a r e dw i t l lt h o s eo f s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d s o m er e l a t i o n s h i p sw e r ef o u n db e t w e e nm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dc h l o r o p h y l la e x t r a c t i o ne f f e c to f o r g a n i cs o l v e n t sb a s e d o nt h ea n a l y s i so ft h er e s u l t so fi m m e r s i o n e x p e r i m e n t so fr e p r e s e n t a t i v em a c r o a l g a eo f3p h y l a ( c h o n d r u so c e l l a t u s ，u n d a r i a p i n n a t i f i d aa n du l v ap e r t u s a ) i n1 2s o l v e n t s t h ee x t r a c t i o ne f f e c to f s o l v e n tw i m s h o r tc a r b o nc h a i ni sb e a e rt h a nt h a tw i t hl o n gc a r b o nc h a i l la n dt h es o l v e n t sw i t h l i t t l eb r a n c h e si sb e t t e r 血a nt h a tw i t hm o r eb r a n c h e s i ns a n ek i n do fs o l v e n tt h e b e a e ro n ei st h eo n ew h i c hi ss y m m e t r i c a l ，w a t e r - s o l u b l ea n dh a sl i t t l ed i p o l em o m e n t t h es o l v e n t sw i t hf a m o y l ，c a r b o n y la n d h y d r o x y l f u n c t i o n g r o u p s a r e p r e f e r a b l e an e ws o l v e n t - n , n d i m e t h y l a c e t a m i d e ( d m a c ) - w a sf o u n da si ti sn o to n l y b e t t e rt h a n9 0 a c e t o n eb u ta l s ot h a nd m f t h et o x i c i t yo f d m a ci sf a rs m a l l e rt h a n t h a to f d m fa n dt h e i rp r i c ei sv e r yc l o s e t h ef o r m u l af o rc a l c u l a t i o no f c h l o r o p h y l la i nm a c r o a l g a ea n dp u r ec h l o r o p h y l las o l u t i o nw i t hd m a cw a so b t a i n e db yt h e c o m p a r a t i v ee x p e r i m e n t s o fm o l a re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n to f p u r ec h l o r o p h y l la n dw a s j i i v a l i d a t e dw i t h1 4 m a c r o a l g a e ： c h l o r o p h y t a ：c h l o r o p h y l la 9 0 a c e m e n a c e e t h a n o l t h f i s p s b a t h ec h o ar e s u l to ft h ei m m e r s i o no fe t h a n o li st h eh i 。g h e s ti na l li m m e r s i o n m e t h o d sa n dt h en e x ti st h ei m m e r s i o no f d m a c h o w e v e r , t h ee x t r a c t i o nr e s u l to f p o l a rp i g m e n t ( c h l e 2a n dc h l c 1 ) o fe t h a n o li sl e s st h a nt h a to fd m a c a n do t h e r s o l v e n t s ，i nt h es a t l l ew a yt h er e s u l t so fc h l c - 2a n dc h i c le s p e c i a l yc h l - c 2i na c ea n d 9 0 a c ea r cl o w e rt h a nt h a to fd m a ce i t h e r s od m a ci s 血eb e s ts o l v e n tf o r m a c r o a l g a ep i g m e n t se x f f a c t i o n t h e m a c r o a l g a e s o l u t i o ne x t r a c t e d b y d m a cw e r ed e t e n u i n e d b y s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o da n dh p l c m e t h o ds e p a r a t e l y , a n di ti ss h o w e dt h a tt h e r e s u l t s o f t h e s et w om e t h o d sa r es a m e k e yw o r d s ：m a c r o a l g a e ；c h l o r o p h y l la ；i m m e r s i o n ；g r i n d i n g ；n , n - d i m e t h y l a c e t a m i d e 月l j罱 叶绿素的含量是生物生长的重要指标，也是海洋生态调查中必不可少的调 查项目，测定海藻叶绿素的含量对海洋生态研究具有重要意义。 提取测定海水中浮游植物或大型海藻的叶绿素，目前广泛应用的方法是将 样品用9 0 丙酮研磨提取，提取液用分光光度法测定，然后用j e f f r e y 和h u m p h r e y 公式计算( j e f f x e y e ta 1 ，1 9 7 5 ) 。但该方法需要研磨，因而费时费力，精密度也较 差。另外一种方法是用9 0 丙酮浸泡并在4 c 冰箱中放置过夜或2 4 小时以提取 完全然后再测定，但是这样做往往不能满足大批量样品的快速准确分析的需要， 而且对于大多数大型海藻和细胞壁比较特殊的微藻，这种方法往往难以将叶绿素 提取完全。能不能找到一种快速将藻体中的叶绿素完全提取出来的溶剂，使得 叶绿素的提取无需研磨也不用放置过夜，同时还不造成叶绿素的提取损失成为 摆在研究者面前的一个课题。 jm o r a n 和s u z u k i 等报道用n ，n - 二甲基甲酰胺( d m f ) 提取测定海洋浮游 植物的叶绿素a ( m o r a n e ta 1 ，1 9 8 0 ；s u z u k ie ta 1 ，1 9 9 0 ) ，认为使用这种溶剂提取 测定海洋浮游植物的叶绿素a 的主要优点是可以直接将滤膜置于d m f 中浸提， 样品不需研磨，提取时间短，溶剂挥发损失小，且d m f 提取液与9 0 丙酮提取 液的吸收光谱相似，最大吸收峰处的摩尔消光系数近乎相等( 相差在3 内) ，因 此可直接用j e f f r e y 和h u m p h r e y 公式计算。于志刚等将这种溶剂用于大型海藻叶 绿素a 的测定，并与9 0 丙酮法进行比较。得出了相似的结论，并认为用d m f 浸泡提取法可以极大地简化和加速海藻叶绿素的提取测定步骤( 于志刚等， 1 9 9 7 ) 。但是d m f 相对丙酮有一个致命的缺陷是毒性太大。这和它本身的高渗 透性是相关的。这也是为什么d m f 具有这么多叶绿素提取上的优点，但仍然没 有取代丙酮的原因。能不能找到一种提取能力和d m f 相当，但毒性又比i ) m f 小的溶剂又成为摆在研究者面前的新课题。 本论文试图解决这一问题。与此同时，本文还将针对选定的溶剂对叶绿素 的提取能力的比较来探讨有机溶剂的分子结构( 官能团) 和提取能力之间的关系， 并结合高效液相色谱分析不同的有机溶剂对藻体中各种色素的提取差异性。 提取测定大型海藻叶绿素a 的新方法研究 1 文献综述 中国海洋大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 概述 叶绿素是存在于植物细胞中的一类极重要的绿色色素，是绿色植物和藻类 进行光合作用时吸收、转化和传递光能的主要物质。它是以一种色素一蛋白复 合体的形式存在于类囊体中，占植物鲜重的o 0 5 至o 2 0 ，占干重的0 5 左 右。其分子由四个毗咯环构成的卟啉环，一个镁原子，环戊酮和叶醇等构成， 不溶于水，溶于有机溶剂，主要吸收红光与蓝光。一般分为叶绿索a 、叶绿素 b 和叶绿素c 。叶绿素a 和叶绿素b 在结构上稍有差异，前者在侧键上为一c h 3 ， 而后者为一c h o ，其分子式分别为c 5 5 h 7 2 0 s n 4 m g 与c 5 5 h t 0 0 6 n 4 m g 。它们的结 构式如下： $ = 一c h 3 ，叶绿素a * 一c h o ，叶绿素b 图1 叶绿素a 和b 的结构式 叶绿素使植物和藻类等其它含叶绿素的有机体实现光合过程，是绝大部分 生物最终依赖的能接受光激发作用的特殊化学物质。阳光由叶绿素分子和一些 酶一起吸收，并把光能转化为a t p 形式的化学能。叶绿素将捕获的太阳能用于 驱动从二氧化碳和水合成糖，并释放所有生命不可缺少的物质氧气。加上附 属色素如类胡萝b 素可在其它波长吸收光，因此它们能以最大限度吸收光 f h a i n e s 2 0 0 0 ) 。叶绿素的光合过程可以由以下化学反应方程式表示： 2 提取测定大型海藻叶绿素a 的新方法研究 6 c 0 2 + 6 h ：0 型鳖c 6 1 - 1 , ：0 。+ 6 0 2 作为植物生理生化过程的参与者，辨别和测定叶绿素的分析方法己被科学 技术的许多领域所利用，如遗传学、植物营养、理论化学的某些方面、陆生和 海生作物的生长、药理、制药、食品技术和古生物学等( s m i t he ta 1 ，1 9 5 5 ) 。 由于海洋中的藻类和陆生植物一样，也是通过光合作用来使光能转变为化 学能并维持自身生长的，而水中可被利用的光能比陆地上少得多，要完成能量 的转移，必须增加参与光合作用的叶绿素的含量。所以，一般来说，海洋植物 中叶绿素和其它辅助色素的含量高于陆生植物。而海洋植物生长快、产量大， 故研究利用海洋植物来提取叶绿索对海洋资源的综合开发，天然色素的提取， 都具有非常重大和深远的意义( 张鸿发等，2 0 0 0 ；孙学军，1 9 9 4 ) 。 叶绿素的含量是生物生长的重要指标。植物叶片叶绿素含量与光合速率、 植物营养状况、植株生长速率等有一定的相关性。实验研究中常测定叶绿素含 量以表征植物生长状况，农业生产上也往往依据叶片颜色变化作为看苗诊断和 管理的重要指标。 近年来植物叶绿素含量还用于大气污染评价。在大气污染监控中，利用植 物生长指数、叶片叶绿素a 的含量进行生物监控，进而以此评价大气环境质量。 由于s 0 2 、n o x 等可渗入叶片，使叶绿体解体，破坏其生理机能。因此通过对 植物叶绿素进行监测，可以间接监测大气污染程度。 叶绿素是海洋生态调查中必不可少的调查项目，是反映浮游植物生物量乃 至初级生产力水平的最直接有效的指标。 浮游生物和海藻等活体生物的分布和数量可以反映该区域的生态状况。浮 游植物( 包括浮游藻类和细菌) 长期以来就被用作水质的指标生物，特别对于 大量水体及大面积水域而言，测定浮游植物的物种和数量，对水质评价有着更 为重要的实用意义。研究人员可以根据对浮游生物和海藻的总数和分布的了 解，就可以得出有关该海域水质状况、生物构成以及生态状况等信息，而叶绿 素是现场观测中必不可少的测量参数。 在浮游植物的过快生长和繁殖会导致灾难性的后果，底栖大型海藻也会受 影响。大型海藻的过量繁殖会导致本土物种迁移、生存环境的破坏，而且溶解 中国海洋大学硕士学位论文 氧过量和过快地消耗甚至会改变生物地球化学循环。因此测定大型海藻中的叶 绿素具有一定的现实意义。另外，测定大型海藻的叶绿素含量可以使养殖人士 及时掌握大型海藻的生长阶段、生长状况等养殖信息，对海藻养殖业也有一定 的意义。 1 2 叶绿素测定方法的发展 1 2 1 叶绿素提取方法 叶绿素测定的关键环节在于将叶绿素从细胞中有效地提取出来。总的来 说，提取方法主要分直接浸泡提取、研磨和超声波提取法等三种。 1 2 1 1 直接浸泡提取法 将样品直接放入有机溶剂中浸泡提取( 以下简称浸提法) 叶绿素，是最简 单、目前应用最广泛的提取方法之一。浸提液再使用分光光度法进行测定，此 方法适合处理大批量样品。使用不同的浸提剂，浸提时间、浸提温度以及浸提 效率也各不相同。因此如何选择溶剂在浸提法中就显得十分重要。 在浸提法中理想的溶剂应具备以下条件： 能够同时提取多种色素； 操作简单，提取效率高； 挥发性小，毒性低，对人体刺激性小； 色素在其中能长时间稳定存在； 价格不贵，易于获取。 目前所使用过的溶剂，很少能同时符合以上条件的，所以还应继续寻找优 秀的溶剂。下面是已经使用并作为浸提剂的溶剂： 1 丙酮( a c e t o n e ) 1 9 4 0 年，m a c k i r m e y 首先提出用丙酮做提取剂，并得出了叶绿素a 和b 的 消光系数( m a c k i r m e y , 1 9 4 0 ) 。1 9 4 1 年，m a e k i n n e y 用8 0 丙酮作溶剂提取燕麦 和锦葵中的叶绿素a 和b ，并得出从4 2 5 至6 8 0 n m 波长下的叶绿素a 和b 的消 光系数，认为6 6 3 n m 是叶绿素a 的最大吸收峰，6 4 5 n m 是叶绿素b 的最大吸收 峰( m a e k i m a e y , 1 9 4 1 ) 。1 9 4 9 年，a m o n 用8 0 的丙酮来提取菠菜苗的叶绿素并 4 提取测定大型海藻叶绿素a 的新方法研究 进行分光光度法的测定，他所使用的方法在国际上被广泛应用至今( a m o n ， 1 9 4 9 ) 。1 9 5 2 年，r i c h a r d 等用丙酮将样品浸泡了9 个小时得到叶绿素a 、b 和 c ( r i c h a r dc ta 1 ，1 9 5 2 ) 。1 9 6 0 年v e r n o n 用8 0 丙酮作溶剂用分光光度法测定叶 绿素a 、叶绿素b 和脱镁叶绿素a 、脱镁叶绿素b ，并得出了计算公式( v e r n o n ， 1 9 6 0 ) 。后来又经h u m p h r e y 和w o o t o n 在1 9 6 6 年证实9 0 丙酮是提取海洋浮游 植物中叶绿素的一种理想溶剂( h u m p h r e y e ta 1 ，1 9 6 6 ) 。1 9 6 6 年国际海洋研究科 学委员会( s c o r u n e s c o ，1 9 6 6 ) 推荐使用将样品浸泡于9 0 丙酮中低温过 夜浸提的方法。p a r s o n s 等人和其后的许多人都是用9 0 x ：j 酮提取色素( p a r s o n s e ta 1 ，1 9 6 3 ；p a r s o n s ，1 9 8 4 ) 。1 9 8 5 年i n s k e e p 等认为a i t i o n 的研究结果有误，在 8 0 丙酮中叶绿素a 和b 的最大吸收波长应分别为6 6 4 5 和6 4 7 n m ，而且对等 消光系数也进行了修正( i n s k e e p ，1 9 8 5 ) 。丙酮和9 0 0 丙酮作溶剂，测定叶绿素a 、 b 和c 的光谱数据已为众人所知，j e f f e r y 和h u m p h r e y 给出了计算叶绿素的光 谱经验公式，并为后人所证实( j e f f e r y e ta 1 ，1 9 7 5 ) 。到目前为止，以9 0 丙酮为 溶剂的方法仍然在广泛使用。 叶绿素的光学性质随溶剂中水分的增加而改变。1 9 6 0 年v e r n o n 将1 0 0 、 9 0 和8 0 丙酮的叶绿素谱图进行比较，认为随着水分的增加，叶绿素a 、b 的最大吸收波长由小向大移动( 叶绿素a 从6 6 2 移至6 6 5 m ，叶绿素b 从6 4 7 移至6 4 9 n m ) ，而且含水分样品比脱水样品更易提取色素( v e r n o n ，1 9 6 0 ) 。1 9 7 4 年j e f f e r y 建议先用1 0 0 丙酮提取叶绿素，进行光谱测定时再稀释成9 0 的丙 酮。但是丙酮易挥发、易燃的性质仍是使用时需要考虑的问题( j e f f e r y , 1 9 7 4 ) 。 2 甲醇( m e t l l a n 0 1 ) 虽然许多研究海洋和湖沼的科研人员仍在使用丙酮作为色素提取溶剂，但 丙酮在提取多种蓝藻和绿藻时不如用甲醇，而且甲醇提取浮游藻比丙酮更迅 速、更完全( s t e m n a n nn i e l s e n ，1 9 6 1 ；u n e s c o ，1 9 6 6 ；g o l t e r m a n ，1 9 6 9 ；m a k e r , 1 9 7 2 r a i ，1 9 7 3 ；r i a m m m ，1 9 7 6 ；s a n d j e n s e n ，1 9 7 6 ；s t a u f f e re ta 1 ，1 9 7 9 ；h o l m - h a n s e na n d r i e m a t l y l 1 9 8 0 ) 。但1 9 8 5 年b o w l e s 等和h a i n s 发现对某些淡水藻如蓝藻中的 铜绿微囊藻( m i c r o e y s i sa e r u g i n o s a ) 、鱼腥藻a n a b a e n ao s c i l l a r v i d e s ) ，绿藻小 球藻c h t o r e l l av u l g a r i s 和硅藻c y c l o t e l am e n e g h i n i a n a 来说，9 0 和l o o 甲醇 的提取效率低于1 0 0 丙酮或丙酮：甲醇= l ：l 的混合液。研究人员还发现不同溶 5 中国海洋大学硕士学位论文 剂对不同色素的提取效率有差异，而且没有一种复配试剂对所有色素都表现良 好0 3 0 w l e s e ta 1 ，1 9 8 5 ；h a i n s ，1 9 8 5 ) 。研究人员推荐使用丙酮：甲醇= 1 ：1 的混合液 或9 0 丙酮为提取溶剂处理样品。 以前认为叶绿素a 在甲醇中稳定性低于其在丙酮中，但1 9 9 9 年j e f f c r y 和 w r i g h t 在以甲醇提取定鞭金藻( p r y m n e s i o p h y t e ) 产物的研究中发现有近1 。5 的叶绿素以叶绿素盐、异构同晶体( a l l o m e r ) 和差向异构体的形式存在( j e f f e r y , i 9 9 9 ) ，在甲醇参与提取时绿素的活动中时绿素酶持续活动，生成时绿素甲基盐 ( b a r r e t te t a l ，1 9 7 1 ) 。正是甲醇使本来存在于原始样品中的叶绿素生成其甲基 取代物，从而对它们加以区分。 19 9 9 年z a p a a 和g a r r i d o 在研究色谱一致性时发现用甲醇提取极性色素 时，会产生更尖锐的色谱峰( z a p a t a , 1 9 9 9 ) 。 3 二甲基亚砜( d i m e t h y l s u l f o x i d e ，d m s o ) 1 9 7 9 年h i s c o x 和i s r a e l s t a m 用6 5 的d m s o 浸泡提取天竺葵、柠檬和豌 豆的叶片以及欧洲赤松松针的叶绿素，提取结果与9 0 丙酮研磨法相当，而且 叶绿素在d m s o 中可稳定5 天以上( h i s c o x e ta 1 ，1 9 7 9 ) 。由于此法操作简单， 溶剂浸透性强，此后有较多研究者对其进行研究。1 9 7 6 年s h o a l ；f 珏l i u m 的研 究表明从硅藻和蓝藻中提取叶绿索时，d m s o 与9 0 丙酮效果相当，但在提取 绿藻时d m s o 表现得就比9 0 丙酮优秀，对不同种的绿藻d m s o 提取效率比 9 0 丙酮高2 到6 0 倍( s h o a fe ta 1 ，t 9 7 6 ) 。1 9 8 0 年b u m i s o n 在光谱分析中发现 将样品在6 5 c d m s o 中浸泡后用9 0 丙酮淋洗的效果比9 0 丙酮研磨或只使 用d m s o 研磨的效果好得多，可以从s c e n e l e s m u s 和s e l e n a s t r u m 中多提取2 0 的叶绿素a ，而且d m s o 与9 0 丙酮研磨方法阃的偏差很d , ( b u m i s o n ，1 9 8 0 ) 。 当混合液用超声波处理后叶绿素含量会增加三分之( h e y w a r d ，1 9 9 1 ) 。 2 0 世纪8 0 年代此法在我国开始应用。1 9 8 4 年胡文玉等用d m s 0 6 5 。c 浸提 菠菜叶的叶绿素的光谱与9 0 丙酮提取液的结果基本一致，吸收峰完全相符， 与a i t i o n 法一样灵敏( 胡文玉等，1 9 8 4 ) 。但有人研究证明6 5 ( 2 叶绿素受高温破 坏使测量值偏低，而且d m s o 提取液与丙酮提取液的吸收光谱有差异，用丙 酮法公式计算叶绿素含量不妥( 陈福明，1 9 8 4 ；张宪政，1 9 8 6 ) 。由于d m s o 气味难闻，粘度大，温度低于1 9 易结晶，致使该法应用受限。 6 提取测定大型海藻叶绿素a 的新方法研究 4 n ，n 一二甲基甲酰胺( n ，n d i m e t h y l f o r m a m i d e ，d m f ) 1 9 6 8 年v o 呔和b i s h o p 发现甲醇只能提取藻类的部分叶绿素，并使用d m f 从好酸性微细藻c y a n i d i u m 中提取叶绿素( y o l k e ta 1 ，1 9 6 8 ) 。1 9 8 0 年m o r a n 将 d m f 用于黄瓜子叶叶绿素的提取，测定了叶绿素a 在d m f 中的光谱图及 6 6 4 5 r i m 处的消光系数，结果表明叶绿素能在d m f 中长期稳定存在，并且用 d m f 浸泡提取和研磨提取结果没有区 j j ( m o r a n ，1 9 8 0 ) 。研究者认为与9 0 丙酮 研磨法相比，即使样品叶绿素含量较低d m f 仍是一种提取效果非常出色的溶 剂。1 9 8 2 年m o r a n 测定了d m f 中的叶绿素a 、b 最大吸收波长的消光系数。 并给出了定量计算叶绿素a 、b 和总叶绿素的公式( m o r a n ，1 9 8 2 ) 。d m f 在提取 淡水浮游植物时与甲醇、丙酮d m s o 结果相似，但明显比9 0 丙酮高。d m f 提取海藻时不必研磨而且效果明显优于9 0 丙酮研磨法( m o r a ne ta l ，1 9 8 0 ； m o r a n ，1 9 8 2 ；s u z u k ie ta 1 ，1 9 8 6 ；s u z u k ie ta 1 ，1 9 9 0 ；i u s k e e pe ta 1 ，1 9 8 5 ；p o r r ae t a l ，1 9 8 9 ) 。1 9 9 0 年s u z u k i 和i s h i m a r u 以人工培养的藻和海洋浮游植物为提取 对象，将d m f 和丙酮在不同实验条件下的提取效果进行了全面的比较，为进 一步推广该方法做出了贡献( s u z u k ie t a l ，1 9 9 0 ) 。 1 9 9 1 年h e y w a r d 用分光光度法分析微藻色素d m f 提取液时，发现它在4 c 暗处可存放2 0 天，而叶绿素a 纯品在5 c 的d l v l f 溶剂中至少稳定1 个月 ( h c y w a r d ，1 9 9 1 ) 。这表明叶绿素在d m f 中性质稳定。另外薄层色谱实验证明 叶绿素的d m f 溶液在5 或一2 5 c 可以稳定至少2 4 天( s u z u k i e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 以上结果都是使用分光光度法进行分析得出的，目前为止未见用h p l c 法验证 以上结论的报道。1 9 9 8 年f t t r u y a 等用d m f 提取浮游植物色素并用h p l c 法 测试，证明d m f 在提取浮游植物色素方面是一种良好的试剂，但并未与丙酮 法进行比较( f u r u y a e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在国内于志刚等用d m f 提取测定大型海藻叶 绿素时，证明一般海藻只需暗处浸提2 h 即可完全提取，但刺松藻需稍加研磨。 而且同样浓度的d m f 提取液与9 0 丙酮提取液6 6 4 n m 处吸光值几乎相同( 相 差小于3 ) ，d m f 提取液可直接使用j e f f e r y 和h u m p h r e y 公式计算大型海藻 叶绿素a 含量( 于志刚等，1 9 9 7 ) 。 d m f 挥发性较丙酮低，刺激性和蒸汽压也较低，但毒性比丙酮大，对操 作人员危害较大。 中国海洋大学硕士学位论文 5 乙醇( e t h a n 0 1 ) 在迄今已知的色素提取溶剂中，乙醇是最安全的提取溶剂，但多数时间用 于提取淡水浮游植物的色素提取，对海洋浮游植物提取应用较少。1 9 7 8 年m o e d 和h a l l e y r a e f f 以及1 9 8 0 年n u s c h 研究表明乙醇与甲醇提取效率相似( m o e de t a 1 ，1 9 7 8 ；n u s c h ，1 9 8 0 ) ，但1 9 8 1 年a r v o l a 认为甲醇略优于乙醇( a r v o l a ，1 9 8 1 ) 。 1 9 8 4 年s a t t o r y 和g r o b b e l a a r 研究发现9 0 乙醇和加入沸腾的无水甲醇提取一 些淡水浮游植物叶绿素时效果明显优于丙酮和9 0 丙酮d m s o 等体积混合溶 液( s a r t o r y e ta 1 ，1 9 8 4 ) 。1 9 8 7 年j e s p e r s e n 和c h r i s t o f f e r s e n 在提取淡水浮游植物 色素时，发现室温浸提6 小时时乙醇的提取效率与甲醇相当，但提取大型海藻 时，需要更长时间甚至需要加热( j e s p e r s e n e ta 1 ，1 9 8 7 ) 。2 0 0 0 年陈宇炜等用 8 0 9 0 热乙醇于8 0 。c 水浴萃取淡水浮游植物并与l o r e n z e n 单色丙酮提取法 ( l o r e n z e n ，1 9 6 7 ) 进行比较，热乙醇法的测定结果明显高于丙酮法，而且标准 偏差也较低( 陈宇炜等，2 0 0 0 ) 。 6 乙醚( d i m e t h y l e t h e r ) 1 9 4 2 年c o m a r 以乙醚作色素提取后的稀释溶剂用分光光度法分别测定了 叶绿素a 和b ( c o m a r , 1 9 4 2 ) 。1 9 5 5 年s m i t h 和b e n i t e z 得出了乙醚为溶剂的叶 绿素a 和b 的光谱图，并得出分光光度法测定叶绿素a 和b 的计算公式，同时 还可以测定叶绿素c 、d 、e 和脱镁叶绿素a 、b 、c 、d 、e ，原叶绿素、细菌叶 绿素和细菌绿胶霉素( s m i t h e ta l ，1 9 5 5 ) 。后人将乙醚法称为s m i t h - b e n i t e z 法。但由于该法操作较丙酮法更为麻烦，难以完成大量样品的测定，所以一般 很少应用。 7 其它溶剂 d m s o 一丙酮：1 9 7 9 年s t a u f f e r 等认为d m s o 一丙酮的混合物更容易将叶绿 素从厚壁细胞中提取出来( s t a u f f e re ta 1 ，1 9 7 9 ) 。后来又有研究人员对其进行了 验证，而且证实d m s o 一丙酮混合液的消光系数和光谱与9 0 丙酮、d m f 相似 ( s p e z i a l ee ta 1 ，1 9 8 4 ；h a i n s ，1 9 8 5 ) 。1 9 9 2 年w e b b 等在分析a l b e r t a 的湖水时 用d m s o 一9 0 丙酮( v v _ 2 ：3 ) 作提取剂，同时使用d m f 、9 5 乙醇作提取剂 提取测定大型海藻叶绿素a 的新方法研究 分别用分光光度法和h p l c 进行测定，结果表明乙醇和d m s o 一丙酮适合提取 硅藻和蓝绿藻的叶绿素a ( w e b be ta 1 1 9 9 2 ) 。 乙醇- 丙酮；1 9 8 4 年陈福明等提出将丙酮、无水乙醇和蒸馏水按4 5 ：4 5 ：1 比例混合配成混合液，4 0 。c 黑暗条件下直接浸提样品，按照a t l o n 丙酮公式计算 叶绿素含量( 阵福明等，1 9 8 4 ；沈伟其，i 9 8 8 ) 。但该法提取时间较长，提取液不 稳定，受光易氧化从而使测定值偏低。1 9 8 5 年张宪政提出将丙酮和无水乙醇等 量混合直接提取样品，结果表明此法与丙酮法吸收光谱一致，可以使用a r n o n 公式进行计算( 张宪政，1 9 8 5 ) 。此法比前种混合液法稳定，不易受光氧化，后入 对此结果进行了验证( 王得贤等，1 9 9 4 ) 。此后有人按照丙酮和无水乙醇按照2 ： 1 的比例混合直接提取农作物叶片效果比用9 5 乙醇提取好( 刘秀丽等，1 9 9 9 ) 。 2 0 0 1 年洪法水等在提取菠菜叶的叶绿素时发现丙酮和乙醇等摩尔混合液浸提 比丙酮、乙醇单独浸提的效率略高，并进一步推测丙酮乙醇混合液提取叶绿素 存在协同效应，而且在两者等摩尔混合时效果最好。这种协同萃取效应的机理 有待进一步研究( 洪法水等，2 0 0 1 ) 。 氯仿一乙醇( v v = 2 ：1 ) ( b l i g h t e ta 1 ，1 9 5 9 ) 、氯仿、溶于氢氧化钠溶液( o 3 5 m ) 的吡啶( 2 1 m ) 、溶于8 5 甲醇的2 氢氧化钾和1 5 m m o l 联二亚硫酸钠溶液 ( p o 玎a ，t 9 9 0 ) 、以及溶予8 5 甲醇1 5 m m o l 联二亚硫酸钠溶液等作为色素提取 剂都曾被使用过，但由于自身的种种缺陷未能广泛应用。 1 2 1 2 研磨法 研磨法主要是通过研磨机械破碎植物细胞，使溶剂更易进入细胞提取色 素。 早期的研磨法是使用聚四氟乙烯小锤在玻璃的搅拌器中以5 0 0 r p i n 的转速 将藻类细胞捣碎，让溶剂浸入( s c o r - u n e s c o ，1 9 6 6 ) 。这种方法至今仍被广 泛使用。但这种方法也有缺点，首先锤与搅拌器之间的距离直接影响提取结果， 距离太小容易引起局部过热而且滤液不宜进入缝隙，提取效率低；其次转移过 程不可避免会引起遗漏而使操作者直接接触溶剂。为避免溶剂遗漏可能带来的 危险，操作者应注意保护眼睛和手，佩戴安全眼罩和手套。 较常使用的研磨法还有人工在玛瑙研钵中研磨( 于志刚等，1 9 9 7 ) 和在 2 0 r s 的玻璃珠搅拌器中研磨提取色素的方法( g i e s k e s e ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 9 中国海洋大学硕士学位论文 1 2 1 3 超声波提取法 超声波提取法主要是先通过超声波来破坏植物细胞，然后用溶剂提取色 素。 超声波在狭小的空间内可产生2 0 ，0 0 0 个大气压的压力，并可产生穿越几卜 微米的震动波，产生的瞬间高温可达1 0 ，0 0 0 k 。1 9 7 5 年a l l i g e r 使用超声波在溶 剂中形成破坏空穴使细胞破裂( a l l i g e r , 1 9 7 5 ) 。研究者发现超声仪的探针传输功 率为7 3 5 w c m 。时效果不如研磨法，丽当功率达到3 9 8w c m - 1 时效果优于研磨 法( c h a n ge ta t ，1 9 8 2 ；w r i g h te ta 1 ，1 9 8 4 ) 。如果总传输功率只有6 0w ，超声波 很少能穿透置入超声仪中的样品容器外壁进入溶液( s a r t o r y e ta 1 ，1 9 8 4 ) 。研究证 明传输功率大小很大程度上会影响提取时间的长短。使用大功率超声仪超声l o 分钟的操作会导致提取液温度上升和色素降解( s a r t o r y e ta 1 ，1 9 8 4 ) 。 虽然超声波法有定的优势，但由于设计和几何学不同的超声仪提取色素 效果不同，雨且换算相当复杂，所以难以广泛应用。 1 2 2 叶绿素测定方法 早在1 9 3 4 年d e l e a n o 和d i c k 就通过测定镁的重量来测定植物时绿素 f d e l e a n oe ta 1 ，1 9 3 4 ) 。1 9 4 8 年k o s k i 和s m i t h 用钛黄比色法测定叶绿素镁含量 的方法测定叶绿素( k o s k i e ta 1 ，1 9 4 8 ) 。后来，1 9 4 0 年p e t e r i n g 等提出用比色法测 定叶绿素a 和b 的总浓度，先测定一系列己知浓度的叶绿素溶液并作出曲线， 再将样品研磨、离心、过滤并用8 5 的丙酮稀释至1 0 0 m l 容量瓶的刻度，测定 后从曲线上直接得出样品叶绿素浓度( p e t e r i n ge ta 1 ，1 9 4 0 ) 。但此方法准确度较 低，而且不能分另测定叶绿素a 和b 。 1 9 4 1 年m a c k i n n e y 直接以8 0 丙酮为溶剂用分光光度法定量测定了叶绿素 a 和b ( m a c k i r m e y , 1 9 4 1 ) 。1 9 4 2 年c o m a r 以乙醚作溶剂用分光光度法分别测定 了叶绿素a 和b ( c o m a r , 1 9 4 2 ) 。1 9 5 5 年s m i t h 和b e n i t e z 分光光度法测定叶绿 素a 和b ，同时还可以测定其它叶绿素和其衍生物( s m t he ta 1 ，1 9 5 5 ) 。1 9 5 2 年r i c h a r d 和t h o m p s o n 首次将分光光度法用于海洋学的多色素的同时分析 ( r i c h a j de ta l ，1 9 5 2 ) 。1 9 6 3 年p a r s o n 和s t r i e k l a n d 认为r i c h a r d 和t h o m p s o n 的 结果有许多矛盾之处。i 并对叶绿素和类胡萝卜素数诗箕公式进舞了签订妒a r s o n 1 0 提取测定大型海藻叶绿素a 的新方法研究 e ta 1 ，1 9 6 3 ) 。由于此法操作方便、准确度高、可同时测定多种色素、便于处理 大量样品等优点，至今分光光度法还被广泛应用。 1 9 3 5 年z s c h e i l e 首次用荧光法得出于叶绿素a 和b 的荧光光谱曲线 ( z s c h e i l c ，1 9 3 5 ) 。1 9 4 1 年k a v a n a g h 用光电荧光色度计作荧光分析，并对叶绿 素进行了定量分折( k a v a n a g h ，1 9 4 1 ) 。与分光光度法相比，荧光法在测定浓溶液 时具有不必稀释直接测定的优势。在2 0 世纪6 0 年代，灵敏的荧光法得到了发 展( y e n t s c h 1 9 6 3 ) ，用于叶绿素a 和脱镁叶绿素以及活体浮游植物中的叶绿素 a 的测定。但2 0 0 1 年g i b b 等认为生物体的叶绿素b 、类胡萝p 素和浮游植物 在各生物生长过程中产生叶绿素a 降解产物对光谱产生干扰，使测定不准确 ( g i b be ta 1 2 0 0 1 ) 。 在2 0 世纪7 0 、8 0 年代薄层色谱分析发展的较为迅速，这使浮游植物的标 志色素可轻易分离，但是由于此项技术专业性太强、效率较低而没有被广泛应 用( j e f f e r y e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 随着高效液相色谱( h i 曲p e r f