（发育生物学专业论文）激素调节拟南芥离体花序发育的研究.pdf

英文缩写 2 , 4 - d 6 - b a k 嗫吣二啜 b p c 对订v 3 5 s c d n a d d h 2 0 d e p c d m s o d n a m 唧 e b e d t a g u s l 诅 i p t g k a n l b m m i r t m s n a o a c n o s 英文名称 英文缩略表 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n l x y a c e t i a c i d 6 - b e n z y l a d e n i n e a v i a nm y e l o b l a s t o s i sv i r u sr e v e r s e t r a n s c r i p t i o u a s e b a s ep a i r 3 5 sp r o m o t e ro fc a u l i f l o w e rm o s o i c v i r u s c o m p l e m e n t a r yd n a d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i m e t h y ls u l p h o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e t 址d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 1 3 - g l u c u r o n i d a s e i n d o l e - 3 - a c e t i ca c i d i s o p r o p y l t h i o - d - d g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n l u d a - b e r t a n im e d i u m m o l o n e y - m u r i n el e u k e m i av i r u s m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m s o d i u l na c e t a t e n o p a l i n es y n t h a s e 中文名称 2 ，4 二氯苯氧乙酸 6 苄基腺嘌呤 禽成髓细胞病毒逆 转录酶 碱基对 花椰菜花叶病毒 3 5 s 互补d n a 重蒸水 焦碳酸二乙脂 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷 脂 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 p 葡萄糖苷酸酶 3 吲哚乙酸 异丙基p d 硫代半 乳糖苷 卡那霉素 l b 培养基 鼠白反转录酶 m s 培养基 醋酸钠 胭脂碱合成酶。 p b p c r r n a r t - p c r s d s 瞄s t w e e n 2 0 x - 鲥 p z t p h o s p h a t eb u f f e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e t r i s h y d r y x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e p o l y o x y e t h e n e 2 0 - s y l a t a n m o n o l a u r a t e 5 一b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 - i n d o l y l p - d - g a l a e t o s i d e y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u m z e a t i n 新霉素磷酸转移酶 h 磷酸缓冲液 聚合酶链式反应 核糖核酸 反转录p c r 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷 聚氧乙烯山梨糖醇 酐单月桂酸酯 5 溴- 4 氯3 吲哚1 3 d 半乳糖苷， y e p 培养基 玉米素 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出 重要贡献得个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责 任由本人承担。 ， 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸 质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大 学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论 文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 目 山东农业大学硕士学位论文 甚葺 3 c 多种信号均参与植物由营养生长到生殖生长的转变。在这个转变过程 中，植物激素起着非常重要的调控作用。为了研究激素调节拟南芥离体花 序发育的机制，首先建立了拟南芥离体花序再生系统。以拟南芥雌蕊为外 植体，在含有6 - b a 、2 ，4 - d 的培养基上诱导愈伤组织的形成，大约2 5 天 后将愈伤组织转至含有z e a t i n 和l 认的培养基中诱导离体花序的产生。 花序再生频率约为6 0 。 利用半定量r t - p c r 方法，对花序发育相关基因的表达进行了分析。 发现愈伤组织转至分化培养基后，同源异型基因a p l 、a p 3 、a g 、凹k t f l j 、唧s 、c v 1 、c l i 3 和s t m 的表达先后受到诱导，而t f l 2 和a p 2 基因的表达则没有明显变化。 利用p t f l i ：g u s 和p l f e ：g u s 转基因植株为材料，分析了t f l l 和 脚吖在离体花序发育过程中表达的组织特异性。发现t f l l 基因主要在具 有花序轴特征的细胞，以及成熟再生花序的花序轴中表达，而即v 基因 主要在即将产生花原基的区域表达，随后在成熟再生花序的花原基中表 达。 由于w u s 和c l i l 3 基因的表达影响拟南芥植株中花序的发育，因此 对离体花序发育过程中该两个基因的表达模式进行了分析。研究结果显 示，在离体花序形成早期，首先检测到w u s 基因在愈伤组织内部的一群 细胞中表达，称之为组织中心。随后在组织中心上方表面1 3 层细胞中 检测到干细胞特征决定基因c l v 3 的表达。随着花序原基的继续发育，两 基因的表达均逐渐集中于花序分生组织中。利用可诱导的反义基因表达策 略，抑制w u s 基因表达，离体再生花序形成受到抑制。研究结果表明组 织中心的细胞先于干细胞形成，w u s 基因在此过程中起重要作用。 花序的诱导需要生长素。在花序诱导过程中添加生长素极性运输抑制 剂，不仅破坏了生长素的极性分布，还抑制了w u s 基因的表达，最终不 能产生离体花序。说明生长素的极性运输为干细胞形成及离体花序发育所 激素调节拟南芥离体花序发育的研究 必须。 本研究结果表明，激素不仅诱导组织中心细胞及干细胞的形成，而且 启动花序特征基因的表达，最终决定花序原基及花原基的产生，进而发育 形成成熟的离体花序结构。 关键词：愈伤组织花序再生激素干细胞拟南芥 2 山东农业大学硕士学位论文 a n a l y s i so fh o r m o n e - r e g u l a t e dr e g e n e r a t e d i n f l o r e s c e n c ed e v e l o p m e n ti na r a b i d o p s i s a b s t r a c t v a r i o u ss i g n a l sc a nb ei n v o l v e di nt h et r a n s i t i o nf r o mv e g e t a t i v eg r o w t h t or e p r o d u c t i v eg r o w t hi np l a n t p l a n th o r m o n e sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h i s p r o c e s s t os t u d yt h ed e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s mo fh o r m o n e - r e g u l a t e d r e g e n e r a t e di n f l o r e s c e n c e ，w e e s t a b l i s h e dar e g e n e r a t i o n s y s t e m o f a r a b i d o p s i si n f l o r e s c e n c ei n d u c e db yc y t o k i n i na n da u x i ni nv i t r o i nt h i s r e g e n e r a t i o ns y s t e m ，p i s t i lw a su s e da se x p l a n tt oi n d u c et h ef o r m a t i o no f c a l l u s ，a n dt h e nt h ec a l l u sw a st r a n s f e r r e dt oa n o t h e rk i n d o fm e d i af o r i n f l o r e s c e n c ei n d u c t i o n n ef r e q u e n c yo fi n f l o r e s c e n c e r e g e n e r a t i o nw a s a b o u t 6 0 s e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt od e t e r m i n et h e e x p r e s s i o np a t t e r n so fg e n e si n v o l v e d i ni n f l o r e s c e n c ed e v e l o p m e n t 田k r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fa p l ，a p 3 ，a g ，t f l l ，l f y ，w u sa n d c l 阿w a si n d u c e da f t e rc a l l u sw a st r a n s f e r r e dt ot h em e d i af o ri n f l o r e s c e n c e i n d u c t i o n i nc o n t r a s t , t h ee x p r e s s i o no f a p 2a n dt f l 2w a sc o n s t i t u t i v ed u r i n g i n f l o r e s c e n c er e g e n e r a t i o n h e e x p r e s s i o np a t t e r n s o ft f l la n dl f yd u r i n gi n f l o r e s c e n c e r e g e n e r a t i o nw e r ea n a l y z e db yu s i n gp l f y ：g u sa n dp t f l l ：g u st r a n s g e n i c p l a n t s w ef o u n dt h a tt f l le x p r e s s i o nm a i n l yl o c a t e di n t h ec e l l s w i t h i n f l o r e s c e n c em e r i s t e mi d e n t i t ya n di nt h em a t u r er e g e n e r a t e di n f l o r e s c e n c e a n dt h ee x p r e s s i o no fl f yw a sf o u n di nt h ec a l l u sc e l l sd i f f e r e n t i a t i n gt o f l o r a lp r i m o r d i u ma n di nt h em a t u r er e g e n e r a t e di n f l o r e s c e n c e c lv 3a n dw u sg e n e sw e r ei n v o l v e di n r e g u l a t i n g i n f l o r e s c e n c e d e v e l o p m e n ti np l a n t s ，s ot h ee x p r e s s i o np a a e r n so fc l v 3a n dw u s d u r i n gt h e r e g e n e r a t i o no fi n f l o r e s c e n c ew e r ed e t e r m i n e d r n l er e s u l t si n d i c a t e dt h a tw u s 3 激素调节拟南芥离体花序发育的研究 w a sf i r s t l ye x p r e s s e di na g r o u po fc e l l sl o c a t e di nt h ei n n e ro fc a l l u s ，n a m e di t o r g a n i z a t i o nc e n t e r , a n dt h e n ，t h ee x p r e s s i o no fc l v 3w a sd e t e c t e di nt h ec e l l s o fl a y e r1 - 3a b o v et h e o r g a n i z a t i o nc e n t e r w i t ht h ed e v e l o p m e n to f i n f l o r e s c e n c ep r i m o r d i u m , t h ee x p r e s s i o no fc l v 3a n dw u sw a sf o c u s e di n t h ei n f l o r e s c e n c em e r i s t e m a f t e rt h ee x p r e s s i o no fw u sw a si n h i b i t e db y a n t i - g e n es t r a t e g y , t h er e g e n e r a t i o no fi n f l o r e s c e n c ew a sr e d u c e do b v i o u s l y t h u s ，t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ee x p r e s s i o no fw u s , e a r l i e rt h a nt h a to f c z 乃i se s s e n t i a lf o rt h ei n f l o r e s c e n c ef o r m a t i o n t h eg e n e r a t i o no fs t e mc e l lw a si n h i b i t e da f t e rt h ep o l a rt r a n s p o r t a t i o no f a u x i nw a si n t e r r u p t e d b ya d d i n gn p a ，a ni n h i b i t o r o fa u x i n p o l a r t r a n s p o r t a t i o n ，i nm e d i a a n dt h e 丘e q u e n c yo fi n f l o r e s c e n c e sf o r m a t i o nw a s r e d u c e ds i g n i f i c a n t l ya f t e ra d d i n gn p a t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ta u x i np o l a r t r a n s p o r t a t i o n i s v e r yi m p o r t a n t f o r t h eg e n e r a t i o no fs t e mc e l la n d i n f l o r e s c e n c ef o r m a t i o n nv i t r o t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a ti n f l o r e s c e n c ea n df l o r a lm e r i s t e mi d e n t i t y g e n e sa r e i n d u c e dd u r i n gt h er e g e n e r a t i o no fi n f l o r e s c e n c e f u r t h e rs t u d y i n d i c a t e st h a to r g a n i z i n gc e n t e rc e l la n ds t e mc e l lf o r m a t i o ni sn e c e s s a r yf o r t h er e g e n e r a t e di n f l o r e s c e n c ed e v e l o p m e n t k e y w o r d s ：c a l l u s ；i n f l o r e s c e n c e ；h o r m o n e s ；s t e mc e l l ；a r a b i d o p s i s t h a l i a n a 4 m 东农业大学硕士学位论文 1 前言 拟南芥的生活周期 拟南芥的整个生活周期可以分为胚胎发生( e m b r y o g e n e s i s ) 和胚后器 官发生( p o s t e m b r y o l co r g a n o g e n e s l s ) 两个阶段，后者又以开花为界分为 营养生长( v e g e t a t i v eg r o w t h ) 和生殖生长( r e p r o d u c t i v eg r o w t h ) 两个阶 段。在以上的生活周期中存在三个发育上的转变( 如图1 i ) 。第一个转变 是种子萌发过程，这个过程是由胚胎发育到胚后发育的转变。萌发之后， 小苗经历一个营养生长的过程，这个阶段的各种内部环境不能导致成花。 在营养生长阶段，小苗从种初期的营养生长状态转变到成熟的营养生长 状态。第三个主要的转变是成花转变，是从成熟的营养生长阶段转变到生 殖生长阶段。植物体的营养状况、植物激素等内部信号以及日照长度、光 质、温度等外部信号都能影响植物发育转变的发生时间( i s a b e la n d c m o l i n e 2 0 0 6 ) 。 图i - i 植物生活周期中发育上的转变 f i gi 1d e v e l o p m e n t a l _ f r a n s j r i o n sd u r i n g t h ep l a n t l i f ec y c l e ( is a b e la n dc a r o l i n e ，2 0 0 6 1 植物地上部分来自于苗端分生组织( s h o o t a p i c a l m e r i s t e m ，s a m ) 激豢调节拟南芥离体花序发育的研究 的分裂、分化和生长。在升花植物的营养生长阶段，苗端分生组织主要产 生蔓和叶原基。在向生殖生长转变的过程中，苗端分生组织转变为花序分 生组织，在花序分生组织的侧翼产生花分生组织。花分生组织产生花器官 的各个原基，原基发育成萼片、花瓣、雄蕊、心皮。 顶端分区学说认为苗端分生组织可以分为中心区( c e n t r a lz o n e ) 、周 边区( p e r i p h e m lz o n e ) 以及肋状区( r b z o n e ) ( 图1 - 2 ) 。根据原套_ 原体 学说，苗端分生组织具有典型的三层细胞分别称为l i 、l 2 , 和l 3 。l 1 年, d l 2 层细胞属于原套，主要进行垂周分裂从而保持各自的世代独立性 ( a n d r e wa n dj u s t i n ，1 9 9 7 ) ( 图1 2 ) 。在拟南芥和其它植株的苗端分生 组织中，干细胞特化为顶端中心区的最外面的三层细胞。干细胞能够自我 更新，其分裂后产生两部分细胞，一部分仍然保留在中心区保持多潜能性； 另一部分细胞随着干细胞的分裂离开中心区到达分生组织的周边区在此 区域内细胞保持较快的分裂速度，维持一定的细胞总量，并分化成为新的 器官原基，从而产生植物体的地上部分。由此可见，干细胞是苗端分生组 织中细胞的源泉，也是分生组织中唯一更新着的稳定结构( d o e m e r , 2 0 0 0 ) 。 豳i - 2 苗端分生组织的结构。 f i gl - 2s t r u c t u r eo f as h o o ta p i m l m e r i g i e m 山东农业大学硕士学位论文 1 1 1 拟南芥的营养生长 1 1 1 1 营养生长阶段干细胞的维持 营养生长阶段的苗端分生组织能在植物营养生长过程中连续产生器 官，因此维持中心区干细胞群的大小是至关重要的( l o n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 当前的研究认为营养生长阶段干细胞的维持主要由彤泌c 施l ( 朋谘) 和c 别v a t a ( c l 之间的调控网络所控制。 拟南芥中c l v l 和c l v 3 基因在苗端分生组织顶端中心附近的几层细 胞中表达，具维持苗端分生组织的功能( 图1 3 ) 。c l v l 基因编码一个受 体蛋白激酶，表达区域是在翮谘基因之上。c l v 3 在分生组织中心区域的 外三层细胞中表达，编码一个分子量约9 k d 的分泌型蛋白( f l e t c h e re ta 1 ， 1 9 9 9 ) ，该蛋白能够在细胞之间移动，在苗端分生组织第三层细胞处与 c l v l 结合( r o j oe ta 1 ，2 0 0 2 ；l e n h a r da n dl a u x ，2 0 0 3 ) 。c l v s 突变后，植 株顶端表现出膨大的分生组织、多个心皮等现象。 i 翮弼在干细胞组织中心表达( 图1 3 ) ，原位杂交结果显示，野生型 拟南芥的苗端及花序分生组织中，聊晒基因只在自顶端数第三层细胞之下 的组织中心区域表达( m a y e re ta 1 ，1 9 9 8 ) ，在花分生组织中聊粥在第二 层细胞下部的区域表达。有研究表明，册晒在c l 啪上游发挥作用，决定 c l 嘲表达，一旦形嬲功能丧失，不论下游基因正常与否，都表现出w i g s 突变体的表型，同时c l v 3 可以被w u s 激活，是w u s 的下游基因。 苗端分生组织是由不同类型的细胞精确排列而成的结构，这种精确性 是由研吣和c z 基因的之间的反馈调节来完成。如果野生型植株中干细 胞标志基因c l v 3 连续不断地表达，必将引起干细胞的过剩，事实上c l v 3 的表达水平是通过反馈抑制其激活子一阪愿的表达区域来得到控制的( 图 1 - 3 ) 。干细胞组织中心表达w u s ，促进干细胞的产生，而由干细胞所表 达的c l v 3 蛋白可以通过细胞间隙移动到干细胞组织中心的周边，与c l v l 结合后限定朋臁达区域的膨大( b r a n de ta 1 ，2 0 0 0 ；s c h o o f e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 这种精确的调控环是在不同的细胞内同时发生的两个过程，从而可以保证 7 激素调节拟南芥离体花卑艟育的研究 了苗端分生组织的稳定。 a 漆 削i - 3 于虬南芥营养生长阶段苗端分生组织的结构应干绷胞维持机理( g r o s s h d i 明dl 鲫k 2 0 0 1 2 0 0 3 ) f 1 - 3s t r u c t u r eo fas h o o ta p i c a l m e r i s t e ma n d m e c h a n i s mo f s t e mc e l l m a l n e i nv e g e t a t l v c g r o w t h ( g r o s s h d ta t dl a u x2 0 0 12 0 0 3 ) 此外，s h o o tm e r i s t e m l e s s ( s t m ) 基困可在整个分生组织区域 表达，其主要功能是抑制分生组织中细胞的分化，保证分生组织内细胞的 增殖，保证苗端分生组织有足够数量的细胞发育成为器官原基。a n d r e w 和j u s t i n ( 1 9 9 7 ) 发现，s 7 附基因能够通过抑, 市g a s y m m e t r i cl e a v e s l ( a s l ) 基因( 在叶原基中表达) 的表达而维持分生组织细胞的未分化状 态，证实了s 触因抑制细胞分化的功能。 在苗端分生组织中w u s ；和s t m 有着明显不同的分工。l e n h a r d 等 ( 2 0 0 2 ) 研究发现，s 删不能互补吣缺失产生的表型w u s 却够部分 互补s 7 m 缺失产生的表型。表明分生组织内w u s - i i s t m 的功能在某种程 度上是互相独立的( b r a n de ta 1 ，2 0 0 2 ) 。但是，o a l l o i s 等( 2 0 0 2 ) 研究发 现v u s 与s ，m 共同持续表达时可在抑制细胞分化方面表现一定的协同性 詹i 、 瓣 山东农业大学硕士学位论文 ( l e n h a r de ta 1 ，2 0 0 2 ) 。b r a n d 等( 2 0 0 2 ) 研究也发现胚胎中w u s 是c l v 3 的唯一激活因子，而在胚胎以外的组织中，w u s 和s t m 协同激活c l v 3 的 - l 表达。 1 1 1 2 营养生长阶段器官原基的起始 茎的总体结构是由胚发育过程中形成的苗端分生组织和胚后发育形 成的腋生分生组织决定的。苗端分生组织肋状区细胞的分裂和分化形成主 茎，决定了植物的主轴，而腋生分生组织则控制植物的分枝结构( 杜黎明 等，2 0 0 8 ) 。 营养生长阶段的苗端分生组织中干细胞所产生的子细胞进入分生组 织周边区，进一步产生叶原基。叶原基的起始受到多个基因的调控，如： s t m , y a b b y 和彳跚等( v e i t , 2 0 0 4 ) 。 野生型拟南芥中，k n o x 家族成员s t m , 其m r n a 在球形胚中期开 始表达。在胚胎发育阶段，s t m 主要在即将形成胚的苗端分生组织的细胞 中表达( l o n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) ：在植株中，s t m 在苗端分生组织中心区及周 边区表达，具有维持苗端分生组织中央区细胞处于未分化状态的作用。 3 5 s ：s 肼转基因植株体形矮小，不能产生正常的叶片( w i l l i 锄s ，1 9 9 8 ) 。 k n o x 家族的另一成员k n o t t e d l ( 似”) 基因在苗端分生组织的周边 区表达。在烟草和拟南芥中过量表达鼢忸”基因可导致叶片形成分生组 织；3 5 s ：k n a t l 转基因植株的叶片呈裂片状向上翻卷，具有异位的托叶 及分生组织( l i n c o l ne ta 1 ，1 9 9 4 ；c h u c ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 。金鱼草的 p h a n t a s t i c ( p 剧) 是植物中第一个被研究的的与叶片极性分化有关 的基因( w a i t e se ta 1 ，1 9 9 8 ；w a i t e sa n dh u d s o n , 1 9 9 5 ) ，它在叶原基发育的 各个阶段都有表达，但不在苗端分生组织中表达。在p h a n 突变体中，叶 的近轴面出现了远轴面的特征，形成针状叶。p h a n 编码了一个m y b 家 族的转录因子，它可能是通过调节一系列相关基因的转录来调控近远轴 面的分化。p h a n 在拟南芥的同源基因是a s y m m y t r i c l e a v e s l ( 么肼) ( b y m e e ta 1 ，2 0 0 0 ；s u ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。突变体a s l 和p h a n 的叶子形状有许 多相似之处，但不产生近远轴极性分化的异常( x ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 9 激素调节拟南芥离体花序发育的研究 a s y m m y t r i c 施4 v e s 2 ( a s l ) 在植物的子叶、莲座叶、根、茎及花器官 等器官中均有表达，表明其表达贯穿于于植物发育的整个过程( l i ne ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。3 5 s ：a s 2 转基因拟南芥植株的子叶、叶片向近轴面卷曲，叶肉组 织近远轴极性发生变化，维管束发育异常。a s 2 突变体侧生器官的极性并 不发生变化。a s l a s 2 双突变体也没有出现极性异常的表型 ( s e r r a n o - c a r t a g e n ae ta 1 ，19 9 9 ；b y m ee ta 1 ，2 0 0 0 ；o r ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。y a b b y 基因家族参与了调控叶背腹极性发育，它们在决定侧生器官远轴面特征 分化方面起重要作用。y a b b y 家族基因的突变影响叶片腹面属性，即在叶 片腹面表现叶片背面的细胞属性，但其表型一般都比较弱而且通常只局限 于特定的器官，可能的原因是各基因之间存在功能冗余。拗船y 基因的表 达刚开始时遍布整个叶原基；后来在叶器官的背面表达，这种表达模式与 它的功能相一致。 叶原基从苗端分生组织的周边区起始，同时伴随着彳肼和a s 2 基因 和k n o x l 类基因表达的下调。在叶片近轴面表达的p h a b u l o s a ( 阳b ) 基因接受来自苗端的信号，从而抑制y a b b y 和k a n a d l 基因的表达。p h b 又受到m i r l 6 5 和m i r l 6 6 的负调控。s t m 基因通过抑制在叶原基中特异 表达的么田基因阻止细胞进入分化状态( b y m e e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在s t m 突变 体中，彳田在分生组织中异位表达，引起分生组织变小。相反，受s t m 调节的k n a t l 在分生组织的表达能够抑制彳甜的表达。在a s l 突变体中， k n a t l 在分生组织中异位表达，使叶具有苗端的特征( b y m ee ta 1 ，2 0 0 0 ； o r ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。与w u s 基因类似，s t m , a 肼以及k n a t l 都是编码转 录因子的基因。 此外高的生长素浓度有利于叶原基的起始，生长素的作用是下调 c u p s h a p e dc o t y l e d o n s ( c u c ) 以及剧d z ，的表达。而k n o x l 蛋白 质又能够抑制生长素的运输，因此就形成了生长素和k n o x l 之间的反馈 调节。 r e i r t h a r d t 等( 2 0 0 5 ) 发现，植物形成叶序的种类与各原基吸收生长 素的能力是相关的，如果只有最新产生的原基吸收生长素，就会形成轮生 的叶序；如果各原基对生长素都有吸收，而且与原基产生的时间成正相关， 则会形成螺旋生长的叶序：如果原基对生长素的吸收力是相同的，则会形 1 0 山东农业大学硕士学位论文 成对生的叶序。 1 1 2 拟南芥的生殖生长 1 1 2 1 生殖生长阶段干细胞的维持 拟南芥由营养生长向生殖生长转变后，苗端分生组织转变为花序分生 组织( i n f l o r e s c e n c em e r i s t e m ) ，在花序分生组织的周围产生花分生组织 ( f l o r a lm e r i s t e m ) ，花分生组织进一步产生四轮花器官。 在花序分生组织中仍然存在朋皤和皿玢之间的反馈调节机制来调节 干细胞分裂与分化之间的动态平衡。而在花分生组织中，由于花分生组织 的有限性，必须存在一种表达时空性强的基因，对w u s 的表达进行调控。 研究发现w u s 基因的表达在花发育至第2 、3 期时水平最高、第6 期终止 ( s c h o o f c ta 1 ，2 0 0 0 ；s m y t he ta 1 ，1 9 9 0 ) 。而作为第三、四轮器官特征基 因帆g 么朋p 嬲( 么g ) 在第3 期花的雄蕊和心皮的前体细胞中开始表达， 第6 期时，雄蕊和心皮原基出现，a g 表达水平达到高峰( s i e b u r t ha n d m e y e r o w i t z , 1 9 9 7 ) 。进一步研究发现了翮卿彳g 之间的调控关系，即在 花中w u s 蛋白质可以与花特征决定蛋白质l e a f y ( l f y ) 共同作用以激 活花中, b a g 的表达。在花发育的后期，a g 抑制w u s 的表达，从而形成花 分生组织生长发育所必须的一个反馈调节环( l e n h a r de ta 1 ，2 0 0 1 ； l o h m a n ne ta 1 2 0 0 1 ) 。 1 1 2 2 拟南芥生殖器官的发育 1 1 2 2 1 拟南芥的成花转变 植物种子从萌发开始经过一段时间的营养生长达到“成熟态 ，营养 型的苗端分生组织处于“成熟态 即进入成花诱导期。此时期内，植物能 感受一定的外界因子，在一定条件的诱导下，营养型的苗端分生组织属性 逐渐改变，成为花序分生组织( m c n e l l i sa n dd e n g ，1 9 9 5 ；p i d k o w i c he ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。 激素调节拟南芥离体花序发育的研究 成花诱导过程受到多种因素调控( b e m i e re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 首先是环境因素，主要包括光和温度等。植物个体可在不同部位感受 不同的外界因子，说明植物体对不同外界因子存在不同的遗传机理。相应 基因发生突变，会使植物对外界因子的感受能力发生改变，从而影响花序 发育的时间。 光是影响植物成花的主要的环境因子，可为光合作用提供能量，并且 能够触发光形态建成。光强、光质、光周期都能影响植物生长发育。已知 的光受体( p h o t o r e c e p t o r ) 有4 种( s u n ge ta 1 ，19 9 2 ；t e r z a g h ie ta 1 ，19 9 5 ) ， 即光敏素、蓝光受体( 隐花色素) 、u v 2 a 受体、u v 2 b 受体。接受光诱 导的器官是绿色叶片( 包括子叶) 和绿色叶鞘，而最终的响应器官是苗端 分生组织。拟南芥可通过光受体感应光周期和光质的变化，光敏色素基因 p h t y o c h r o m e ( 删- p h y e ) 编码的蛋白质对红光和远红光进行响应， 隐花色素基因c r y p t o c h r o m e ( c 尺玎、c r 妇) 编码的蛋白质则对紫外 光和蓝光起响应。这些光受体接收的光信号启动由e a r l yf l o w e r i n g 3 ( e l f 3 ) 、t i 删g0 fc a be x p r e s s i o n l ( t o c1 ) 、i ，a t ee l o n g a t e d h y p o c o t y ( l h y ) 、c 汜a d i a nc l o c ka s s o c u ( r e d1 ( c c a l ) 、 f l a v i nb i n d i n gk e l c hr e p e a tf b o x l ( f k f1 ) 、z e i t l u p e ( z t l ) 协同作用调节的振荡器( o s c i l l a t o r ) ，激活下游基因g i g a n t e a ( 口) 的表 达( f o w l e re ta 1 ，1 9 9 9 ；p a r ke ta 1 ，1 9 9 9 ) ，a 基因控制c o n s t a n s ( c d ) 基因的表达，而c o 紧接着激活开花途径的整合因子f l o w e r i n gl o c u s t ( f t 、 都s u p p r e s s o ro fo y e r e x p r e s s i o no fc o n s 工a n s ( s o c l 、) 基因，最终导致了花分生组织特征决定基因a p e t a l a l ( a p l ) 和l e a f y ( 脚v ) 的激活，进而促进成花转变( b o s se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 温度对开花的作用主要是低温春化作用。低温处理引起植物体内部多 种代谢途径与代谢顺序的改变，所产生的内环境启动植物成花。与光周期 不同，春化作用的接受位点为苗端分生组织，通过春化作用，可能使植物 在光周期条件下产生“成花素 ( f l o r i g e n ) 或者改变苗端分生组织对“开 花刺激物”的敏感性，其所产生的内环境启动植物成花。春化作用受遗传 控制。拟南芥如果不经过春化处理则开花延迟，如果低温处理4 8 周以后 则开花提前( m i c h a e l sa n da m a s i n o ，2 0 0 0 ) 。春化途径涉及v e r n a l i z a t i o n 1 2 山东农业大学硕士学位论文 ( v r n l 、v r n 2 、v i n 3 ) 等基因对成花转变的抑制因子f l o w e r i n g l o c u sc ( f l c ) 的负调节，从而促进开花。除f l c 基因外，a g l 2 4 可能 是春化途径的另一个作用对象，该基因受春化的正调控，且这种正调控作 用是独立于凡c 基因起作用的。春化具有剂量效应，低温处理时间越长， 促进开花时间提前的效应越明显( b o s se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 其次是一些内部因素。主要包括发育阶段、营养状态、激素水平、基 因表达等。植物叶片可以感知日照长度信号，并且可以诱导“成花素”的 出现，这种信号可以从韧皮部移动到苗端分生组织。在苗端分生组织处， “成花素 能够引起基因表达的改变，一系列基因的表达能够使苗端分生 组织形成花。对拟南芥开花的分子机理研究认为，c i 形门在日照长度促进 开花过程中起重要作用。f r a n z i s k a 等( 2 0 0 8 ) 认为f t 蛋白质是“成花素 的主要部分。此外，植物激素g a s 可以促进开花。当长日照促进开花途径 不起作用时，g a s 是促进植物开花的重要因子。外源施3 r i g a 可以使拟南 芥提前开花，内源g a 含量的降低使拟南芥在长日照条件下延迟开花，在 短日照条件下则不能开花( b 1 a z q u e ze ta 1 ，1 9 9 8 ) 。过量表达编码参与g a 生物合成的g a 2 0 氧化酶的基因的植物无论在长日照条件或短日照条件 下均表现出早开花的表型( b o s se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。g a 参与的成花途径中的一 个重要基因是开花途径整合因子l f y , g a 可能通过增加乙f 啪表达水平促 进开花( b l 元z q u e ze ta 1 ，1 9 9 8 ) 。此外，s o c l 、用r 也可能受g a 途径的调控。 植物体还通过兕c 、t e r m i n a lf l o w r e j ( t f l j 人s h o r tv e g e t a t i v e p h a s e ( s 阡) 、刚r r 叩e a t l 2 ( t o e i 2 ) 等成花抑制因子抑制植物 体的成花转变。 1 1 2 2 2 拟南芥花器官的发育 植物在完成成花转变之后，花序分生组织的侧翼逐步形成花分生组 织，进一步产生各种花器官原基。在这些发育过程中花序分生组织特征决 定基因和花分生组织特征决定基因起关键作用。 花序分生组织特征决定基因如t e r m i n a lf l o w e r s ，( t f l l ) 决定 无限的花序分生组织( b r a d l e ye ta 1 ，1 9 9 6 ，1 9 9 7 ) 。在正常情况下，拟南芥 激素调节拟南芥离体花序发育的研究 的花序为无限花序，而在卯突变体中，花序分生组织发育成单花，造成