（有机化学专业论文）面包酵母催化还原2烷基444三氯2丁烯醛的研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文 i 摘 要 生物转化由于其温和的反应条件及高度的手性选择性而成为合成手性化合物的 有效途径。近年来，越来越多的科学家投身于这一研究领域。最近，我们组利用面包 酵母对2- 烷基- 2- 己烯醛进行生物催化还原，获得了非常高的产率和大于99% e.e.值， 这一工作极大激起了我们继续研究面包酵母催化还原脂肪族丙烯醛类化合物的兴趣。 本文研究了在面包酵母完整细胞催化下， 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛的生物催化 还原反应。首先通过三氯乙醛与丙醛、正丁醛的交叉缩合反应合成了羟醛缩合产物， 然后将其脱水得到2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛，之后对这种a, - 不饱和醛的面包酵母 催化不对称还原反应进行了系统的研究。 在系统考察了体系的ph值、 氢源、 反应时间、 反应介质等多个因素对反应产物2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 1- 丁醇的产率及e.e.值的影响之后， 发现酵母对2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛催化还原的速度较快，而且反应介质对面包酵 母催化还原结果也有非常大的影响。通过引入水- 石油醚两相反应体系，我们得到了2- 乙基- 4,4,4- 三氯- 1- 丁醇面包酵母转化的最好结果，产率为85%，e.e.值达99%以上。 同时，在实验过程中观察到 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛能快速由 e 型完全转换为 z 型。反应介质和 - 取代烷基对构型转换速率有很大的影响，其中 - 取代基团越小， 构型转换速率也越快。 关键词： 面包酵母；不对称还原；2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛； 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 1- 丁醇；两相体系；单向异构化 华中科技大学硕士学位论文 ii abstract due to its inherent advantages such as the mild reaction conditions and high stereoselectivity, biotransformation has become an efficient way for preparing chiral compounds. in recent years, more and more researchers are devoting themselves into this field. the success of our previous work on the bioreduction of 2- ethylhex- 2- enal, a substrate without an 3- aryl group, arouse our interest to further investigate the bioreduction of other aliphatic acroleins. in this thesis，the baker s yeast (whole cell) mediated asymmetric reduction of 2- alkyl- 4,4,4- trichloro- 2- butenals was studied. 2- alkyl- 4,4,4- trichloro- 2- butenals was obtained via dehydration of the aldol products prepared through direct cross- aldol reactions of chloral with aliphatic aldehydes at first. the asymmetric bioreduction of this a, - unsaturated aldehyde was next studied in detail. effects of ph values, reaction mediums, and the reaction time on the yields and the e.e. values of products 2- alkyl- 4,4,4- trichloro- 1- butanol were evaluated. a high yield of 2- ethyl- 4,4,4- trichloro- 1- butanol (85%) with excellent enantioselectivity (99%) was afforded in the water- petroleum ether biphasic system. meanwhile, an unexpected and interesting one- way isomerization of 2- alkyl- 4,4,4- trichloro- 2- butenals was observed in this work. the substituents at the - sites have a marked effect on its isomerization rate. keywords: baker s yeast, asymmetric bioreduction, 2- alkyl- 4,4,4- trichloro- 2- butenals, 2- alkyl- 4,4,4- trichloro- 1- butanol, biphasic system, one- way isomerization 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做 出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本 声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华中科技大学硕士学位论文 1 1 绪 论 1.1 引言 手性是自然界的普遍特征，手性化合物结构独特，在生命过程中发挥着不可代替 的作用，因此手性合成成为当代有机化学中极为重要且富有活力的研究领域。生物催 化反应具有高度的化学、区域和对应体选择性，当生物催化技术进入传统的有机合成 领域后, 在原料来源、能源消耗、经济效益、环境保护等方面带来了根本性的变化。 生物催化的手性合成作为一个多学科交叉的研究领域，吸引了众多有机化学家、生物 化学家和微生物学家从事该领域的研究1。 1.2 手性研究的意义 术语“手性”(chiral)一词源于古希腊语的?e? (cheir)，是“手”的意思，由我们 的左手和右手是不能重合的的事实而来，它是三维物体的基本属性。如果一个物体不 能与其镜像重合，该物体就被称为手性物体，那些和它们的镜像不等同的化合物则称 为手性化合物。在漫长的化学演化过程中，地球上出现了无数手性化合物。构成生命 体的有机分子蛋白质、多糖、核酸和酶等2，无论在种类上还是在数量上，绝大 多数是手性分子。生命体系有极强的手性识别能力，不同构型的立体异构体往往在活 性、代谢过程及毒性方面表现出很大的甚至极不相同的生理效应3，例如：(s)- (- )- 布 洛芬的药理作用证明比其(r)型的高160倍4；镇静剂反应停酰胺呱啶酮(thalidomide)最 初以外消旋体出售，而最后人们却发现s- 构型的酰胺呱啶酮竟有强的致畸活性，会导 致胎儿缺臂少腿5，为此人类付出了血的代价。因此有必要获得单一空间结构的光学 纯化合物。 华中科技大学硕士学位论文 2 1.3 手性纯化合物的制备方法 到目前为止，制备手性化合物的方法主要有三大类，即从天然产物中提取手性化 合物、拆分法和不对称合成法。从天然产物中提取获得的手性化合物无论在种类还是 数量上都很有限，在现实工业中很少使用提取的方法。现在研究和应用比较多的是拆 分法和不对称合成法。 1.3.1 拆分法 对由一般方法得到的消旋体进行拆分，分别得到两个不同的异构体。通常其中一 个异构体只能废弃或者设法将其转化，虽然如此，由于拆分方法的成熟，在很多手性 化合物生产中仍多有应用6。拆分法又可分为物理拆分法、化学拆分法和生物拆分法。 物理拆分法主要是指消旋化合物通过直接结晶法拆分。早在1858年，法国科学家 pasteur借助放大镜，用镊子成功地分离了酒石酸铵盐的两种对映异构体的晶体。随着科 技发展，物理拆分法又出现了手性溶剂拆分法7、接种晶体析解法 8 、色谱拆分法9- 12、 手性膜拆分法等13。 化学拆分法主要是将外消旋体中两种对映异构体转化为非对映异构体，然后利用 非对映体之间物理性质和化学性质的不同将两者分开。化学拆分法主要分为成盐拆分 法、包结拆分法14和组合拆分法15。像磷霉素(fosfornycin)、甲矾霉素(thiamphenicol)、 氯霉素(chloramphenicol)在药物生产上主要是通过成盐拆分法进行分离的。 生物催化手性拆分是以酶或微生物选择性催化外消旋体底物中某个对映体优先 反应, 再利用其与未反应对映体的物理化学性能差异达到拆分目的。酶多由l- 氨基酸 组成, 其活性中心构成一个不对称环境, 利于对外消旋体的识别, 催化反应产物的 对映体过量百分率(e.e.)可达100%。 因此, 在手性化合物合成过程中, 用酶法拆分外消 旋体是理想的选择16。酶拆分的最大产率是50%，这是由于酶只能有效作用于一种对映 异构体。酶催化拆分常见的反应类型有水解反应17、氧化还原反应18- 19、转移裂合反应 20- 21等。像如moreno等利用固定化脂肪酶(candida cylindracea lipase 简称ccl) 催化萘 普生乙酯不对称水解得到95%的(s)- 萘普生。 某些水解酶甚至可以催化环氧化物22、 腈23、 酰胺24的水解。 华中科技大学硕士学位论文 3 1.3.2 不对称合成法 不对称合成就是使化学反应在人为的不对称环境中进行，以求最大限度地得到具 有所需立体化学构型的产物。自19世纪fischer开创不对称合成领域以来, 不对称反应 技术得到迅速发展, 不对称合成技术的发展可分为4个阶段： 手性源不对称合成(chiral pool)；手性助剂不对称合成(chiral auxiliary)；手性试剂不对称合成(chiral reagent )； 不对称催化合成(asymmetric catalysis)。不对称合成技术在社会发展的不同阶段均对 人类进步作出了巨大贡献。 通过手性源的方法合成手性化合物，需要从光学活性的起始物出发。通常是指利 用天然的手性化合物作为原料，再改造成为目标分子的方法和途径。例如，以葡萄糖 为原料合成抗癌物质番荔枝内酯25。 手性助剂的不对称合成是指在反应过程中利用手性试剂的诱导作用合成手性化 合物，然后再将手性试剂部分除去。例如，谢宝汉等人首先利用手性二醇与3- 甲基环 十五烯- 2- 酮形成手性缩酮，接着在催化剂的催化下不对称加氢，然后脱去手性二醇， 即可高立体选择性地制得(r)- 3- 甲基环十五烷酮(r)- (- )- 麝香酮)26。 通过手性试剂合成手性化合物是指产物手性的获得是由光学活性的手性试剂来 实现的。例如，不对称硼氢化就是由光学活性的硼氢试剂进行反应。h. c. brown发展 了几种光学活性的硼氢化试剂，都能使产物获得很高的e.e.值。 不对称催化方法应是获取单一构型手性化合物最有前景的方法。2001年，诺贝尔 化学奖授给了在不对称催化反应中做出杰出贡献的三位科学家。knowles和noyori由 于他们在不对称催化氢化的工作而获奖27，他们的方法在治疗帕金森症药(l- dopa) 和抗炎药(levofloxacin) 及半合成抗生素(cabapenem) 类中得到应用。 sharpless则因不 对称催化氧化方法而得奖28，该方法在 - 阻断剂的生产中也得到应用。目前，不对称 催化主要包括包括生物催化和化学催化。 1.4 手性醇的制备方法 手性醇是重要的手性化合物，很多天然有机化合物和具有生理活性的化合物都含 华中科技大学硕士学位论文 4 有手性醇的结构。具有特定功能基团的手性醇是合成手性药物和其它手性化学品的重 要中间体。 例如， r- 4- 氯- 3- 羟- 丁酸乙酯可以合成l- 肉碱29， l- 肉碱被称为 “类维生素” 的营养素，参与人体的许多代谢过程，是体内脂肪氧化代谢的必需物质。d- a- 羟基- , - 二甲基- ?- 丁内酯(d- pantoyl lactone)可以用来合成d- 泛酸钙(d- pantothenic acid)30， d- 泛酸钙在饲料工业中作为维生素类药物，是辅酶a的组成部分，能调节蛋白质、碳 水化合物及脂肪的代谢，保持皮肤和粘膜，改善毛发(或羽毛)色泽以及预防疾病的发 生，特别是对家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成和分解，泛酸钙是必不 可少的。 二十一世纪是手性药物大发展的世纪, 手性醇合成方法的成熟与改进对手性药物 的合成具有积极的促进作用。目前单一构型的手性醇的获得方法主要有拆分法和手性 合成法。 1.4.1 拆分法获得手性醇 很多手性醇是由非手性化合物经过一系列化学方法合成，最后得到的产物为消旋 体。这些旋光不同的异构体化学性质虽然相同，但生理活性和药理作用却相差甚远， 因此，分离出单一有效异构体是必要的。 1959年，luttringhaus和berrer利用手性溶剂拆分法，以(+)- 酒石酸异丙酯作溶剂成 功拆分了化合物1 的外消旋体(figure 1.1)31。但这种方法需要寻找特殊的手性溶剂， 且适于拆分的外消旋体混合物的范围相当狭窄，故实际工业生产的意义不大。 c h h c oh oh 1 图1.1 1,2- 二苯基- 1,2- 乙二醇 figure 1.1 1,2- diphenylethane- 1,2- diol sharpless环氧化反应是一种通用的标准的实验室方法，它具有对映选择性和催化 性的本质。 sharpless反应在本质上有利于产生l, 2- anti产物。 当使用外消旋的烯丙醇时， 对映体之一反应较快，因此就导致一个有速度差异的过程，可用于烯丙基仲醇的动力 学拆分(scheme 1.1)32。此方法的反应组分都很廉价而且已商品化，虽然r取代基是不 华中科技大学硕士学位论文 5 利的，但对于大多数烯丙醇反应都能成功，通常e.e.大于95%。 rr oh rr oh rr oh o t- buooh ti(opri)4, (- )- dipt + rr oh rr oh rr oh o t- buooh ti(opri)4, (+)- dipt + scheme 1.1 随着组合化学在药物先导化合物筛选中的作用日益显著，人们开始将组合化学方 法引入手性拆分剂的设计和筛选之中。1998年，荷兰化学家h. wynberg教授首次将组 合化学方法应用于化学拆分中，他们设计了一系列芳香环取代的衍生物组成不同的拆 分剂家族 15 。研究表明，以 d- 酒 石 酸(figure1.2, 2)和 dbta(figure1.2, 3)、 dtta(figure1.2, 4)的组合可以成功地对手性药物沙丁胺醇(figure1.2, 5)的消旋体进行 规模拆分，并以高达70%收率制得了符合药物质量标准的(r)- 左旋沙丁胺醇的盐酸盐 (e.e.值99%)33。 oh co2hho2c ho 2 (2s, 3s)- d- 酒石酸 o co2hho2c o oo rr 3 r=h, (2s, 3s)- d- dbta 4 r=me, (2s, 3s)- d- tbta oh ho h n oh 5 (r)- 沙丁胺醇 图1.2 拆分剂和(r)- 左旋沙丁胺醇 figure 1.2 resolution reagents and (r)- salbutamol 生物法也可以对手性醇进行拆分。serra、stefano等用脂肪酶(lipase)对薄荷醇 (scheme 1.2, 6)的外消旋体进行拆分34，结果表明脂肪酶具有很高的对映体选择性 (enantioselectivity)(scheme 1.2)。 vorloya、 sandra等用从假丝酵母微生物(canida microbe) 获得的lip1(属于脂肪酸酶)，对酯化的薄荷酯进行水解拆分，得到e.e.大于99%的l- 薄 荷醇。 华中科技大学硕士学位论文 6 oh 6 menthol ( )- 6 oh + oacoh (+)- 6 (- )- 6 (i)lipase, vinyl acetate t- butylmethylether; (ii) koh, meoh scheme 1.2 1.4.2 手性合成法获得手性醇 手性醇的不对称合成中最常见的就是手性仲醇的不对称合成。在手性配体存在 下，烷基金属对羰基化合物的亲核加成受到广泛研究。noyori在1986年首次报道了高 对映选择性烷基化反应。 在2 mol%(- )- daib存在下， 用二乙基锌处理苯甲醛， 以98% e.e. 值得到(s)- 醇(scheme 1.3)。自从发现在氨基醇存在下二烷基锌对醛的加成以来，已经 发展了许多新的配体。例如，手性氨基硫醇和氨基二硫化物比手性氨基醇更有利于与 二乙基锌形成络合物或具有张力结构的衍生物，似乎能产生更好的进行不对称诱导。 此外，醛的不对称氰醇化也能够合成具有手性的仲醇35。 cho +et2zn (- )- daib h ho et 产率97%, e.e. 98% scheme 1.3 醛醇缩合反应是构建具有手性仲醇的最简单的方法。对醛醇缩合不对称反应的控 制主要有底物控制、试剂控制、手性催化剂控制及双不对称反应。最近，龚跃法教授 和张方林在这方面做了大量的研究，发现利用六氢吡啶或l- 脯氨酰胺作催化剂，能够 催化三氯乙醛与脂肪醛在室温下进行交叉醛醇缩合，产率高达95%，e.e.也达到 88%(scheme 1.4)36。 华中科技大学硕士学位论文 7 r o + ccl3cho catalyst (30 mol%) r.t. cl3c o r oh r=et, me, i- pr, pent scheme 1.4 shibasaki通过硝基烷烃对羰基的亲核加成，即herry反应，合成了具有手性的2- 硝基烷醇37，它们是合成硝基烯烃、2- 氨基醇和2- 硝基酮的有用中间体(scheme 1.5)。 cho +ch3no2 10 mol% cat. no2 oh scheme 1.5 通过环氧化合物的不对称开环也可以得到手性仲醇。shibasaki发现一种含有两个 手性binol配体的镓络合物(scheme 1.6, 7)可以催化环氧化合物高对映选择性开环38 (scheme 1.6)。 o (r)- 7, t- bush 0.4 nm ms,toluene,r.t. oh sbut 80%产率, 97% e.e. o o ga o o li 7 scheme 1.6 羰基化合物的不对称还原是获取手性醇最简单的途径，但是羰基的催化氢化还原 要考虑其他化学选择性的问题，其他共存的不饱和官能团如c=c也有可能会发生氢化 反应。zhang用pennphos(scheme 1.7, 8)配位的铑络合物为催化剂，成功地进行了芳基 烷基酮的高对映选择性氢化(scheme 1.7)，并且发现弱碱能加速简单酮的rh催化氢化 华中科技大学硕士学位论文 8 反应39。 p p r r r me pennphos 8, r=me, pri o rh(cod)cl22 lutidine, meoh, 24h,20 pennphos 8 oh scheme 1.7 无效对映体转化法也可以将消旋体中那些利用价值不高的构型转换为很有利用 价值的构型或化合物，这样能使资源得到更合理的利用。例如，可以将l- 对- 甲磺酰基 苯丝氨酸乙酯(scheme 1.8, 9)无效对应中间体转换为有用的甲砜霉素(scheme 1.8, 10) (scheme 1.8)。 meo2s co2c2h5 oh nh2 1) rcocl 2) meona 3) kbh4 meo2s oh no r hcl meo2s oh oh nh2 meo2s oh oh nhcochcl2 r=ph或chcl2 9 10 scheme 1.8 生物还原法也是合成手性仲醇的好方法，生物催化由于其环境友好特性及高度立 体选择性越来越受人们的关注。ramesh n. patel及其合作者发现，4- 氟- 2- 溴苯乙酮的 羰基可以被candida, hansenula和pichia类酵母还原，转化率大于99%，e.e.值也非常高 华中科技大学硕士学位论文 9 (99%)40 (scheme 1.9)。 fbr o microorganisms fbr oh ketone (s)- alcohol scheme 1.9 许多生物活性的天然产物含有季碳原子，通过碳亲核试剂对酮的加成来不对称合 成叔醇近来越来越受到关注。 ramn用樟脑磺酰胺- 钛醇盐衍生物催化二甲基锌和二乙 基锌对潜手性酮的对映选择性加成，生成相应的醇，其对映体比值高达94.5:5.541 (scheme 1.10)。 phr o 11 (20%), znr2 toluene,ti(opri)4 phr hor n h o2 s oh h 11 scheme 1.10 酰亚胺化合物12和13 (figure 1.3)，又称为evans试剂，可从相应的噁唑烷衍生得 到。它是不对称烷基化或醛醇缩合反应有效的手性辅剂，其c- 4上的取代基决定了反 应的立体选择性(scheme 1.11)，因此，通过选择不同的手性辅剂12和13，可以控制烷 基化产物的立体化学结果。这种方法已广泛应用于多种化合物的合成，例如合成a- 取 代的手性伯醇42 (scheme 1.12)。 no o r o no o r o ph 12 13 44 图1.3 evans试剂 figure 1.3 evans reagents 华中科技大学硕士学位论文 10 no o r o 4 ei+ 主 次 xc o r ei xc o r ei scheme 1.11 no o r2 o r1 lialh4或 libh4 80%- 90% r2 oh r1 scheme 1.12 不对称催化氢化含有丙烯基的伯醇也可以得到具有手性的伯醇。 例如， rh- binap 络合物可以高对映选择性的催化各种官能团的潜手性烯烃的氢化。以它为催化剂，催 化化合物14 (scheme 1.13)的不对称氢化，可以得到具有手性的脂肪伯醇15 (scheme 1.13)，此手性脂肪伯醇是维生素e和k的侧链部分43。 oh rh- (r)- binap oh r rr 1415 scheme 1.13 2003年yujiro hayashi以脯氨酸为催化剂，通过mannich反应合成了 - 取代的手性 伯醇，其产率和e.e.值都相当高(产率高达90%，e.e.为98%)，但是条件要求相当苛刻， 需要- 2044 (scheme 1.14)。 华中科技大学硕士学位论文 11 cho + ome nh2 + me h o 10 mol% l- proline nmp,20h nabh4 meoh ome hn roh scheme 1.14 早在1979年，fuganti就利用生物催化还原a, - 不饱和醛，得到了 - 取代的手性伯 醇45 (scheme 1.15)，但是反应中出现了许多副产物。 cho ph=8.5 ch2oh scheme 1.15 1.5 面包酵母在手性合成中的应用 面包酵母(baker s yeast简写by)是生物催化中常用的一种微生物， 属酿酒酵母菌种 (saccharomyces cerevisiae)。早在19世纪初，人们就利用酵母细胞作为生物催化剂。面 包酵母来源广泛, 成本低, 使用方便, 无需特殊设备, 可在普通实验室中进行生物催化 反应。面包酵母中含有脱氢酶、酯酶、丙酮酸脱羧酶及烯醇酸(酯)还原酶等多种酶类, 参与多种不对称化学反应, 可将其分为还原反应、水解反应及转移裂合反应进行讨论。 1.5.1 还原反应 面包酵母可以还原 c=c 键、c=o 键及叠氮等。 1) 对c=c键的还原 面包酵母可以催化还原a, - 不饱和醛酮， stefano servi及其合作者在这方面进行了 深入了研究。面包酵母在还原a, - 不饱和醛酮时(scheme 1.16)， 其r取代基大多为芳香 基，底物a, - 不饱和醛可以被还原为饱和醇，e.e.可以达到99%以上，产率最高只有 48%，同时也有不饱和醇和不饱和二醇产生46。 华中科技大学硕士学位论文 12 r cho r r ch2oh r r ch2oh r r r oh oh + + a r=ph, r=h b r=ph, r=br c r=ph, r=ch3 d r=2- furyl, r=ch3 by scheme 1.16 最近，有研究表明，当a, - 不饱和醛中的r基为脂肪族时，其c=c依然可以被面 包酵母还原47，饱和醇产率达到91%，e.e.值大于99%。同时，此反应中产生的不饱和 醇也能继续被还原为饱和醇，转化率高达93%，e.e.值为88% (scheme 1.17)。 cho by ch2ohch2oh ch2oh by ch2oh + scheme 1.17 畜群霉素可以通过面包酵母还原a, - 不饱和酯2,4,4- 三氯- 2- 丁烯酸甲酯中的 双键来合成，而且研究发现双键构型对还原结果有很大影响，(e)型底物能够被还原为 r型饱和酯，产率为65%，e.e.值最高可达92%，而(z)型底物则主要被还原为s- 型饱和 酯，产率为60%，e.e.值高达98%48 (scheme 1.18)。 cl co2me cl cl clco2me clcl (e) r by cl co2me cl cl clco2me clcl (z) s by scheme 1.18 华中科技大学硕士学位论文 13 硝基烯烃中的碳碳双键也可以被面包酵母还原，如下面的反应(scheme 1.19)，产 率为50%，e.e.值高达98% 49。 c6h5 h3cno2 h c6h5 ch2no2 hch3 by scheme 1.19 1,3- 共轭二烯也可以被面包酵母还原(scheme 1.20)， 且仅a, - 双键被还原， 得到e.e. 值大于99%的手性醇50。 oh bakers yeast oh scheme 1.20 2) 对醛、酮 c=o 键的还原 简单脂肪族酮或芳香族酮被面包酵母还原时，遵循prelog规则，产生相应的(s)- 型醇，产物具有较高的光学纯度(figure 1.4)。多数长链酮不能被面包酵母还原, 只有长 链甲基酮才能被面包酵母催化还原51。醛羰基比酮羰基更容易被还原, - 羰基醛在面 包酵母的还原作用下, 通常情况下是醛羰基被还原, 并且在a- 位形成(s)- 构型的手性中 心, 此外，面包酵母还可以用于 - 二酮、a- , - 酮酸酯以及带有硝基、氟、硫和杂环等 功能基的酮类化合物的还原52。 r1r2 o si- 面 re- 面 h从re- 面进攻 图1.4 面包酵母催化还原c=o figure 1.4 reduction of c=o bond mediated by baker s yeast 3) 叠氮基的还原 在用化学酶法合成吡咯2, 1- b间二氮杂萘酮的过程中, 用酵母还原具有叠氮基的 华中科技大学硕士学位论文 14 化合物得到相应的胺(scheme 1.21), 产率仅为20% 53。 r1 r2n3 n o (ch2)n o byr1 r2nh2 n o (ch2) n o scheme 1.21 1.5.2 水解反应 冻干面包酵母中的脂酶可有效地催化拆分外消旋体乙酸- 1- 炔- 3- 酯54和外消旋泛 解酰内酯的乙酸酯55, 并可有效地抑制副反应(scheme 1.22)。 r oac by r oh + r oac o o oac by o o oh o o oac + scheme 1.22 1.5.3 转移和裂合反应 1) 转移反应 葡萄糖与面包酵母共同培养时, 可将乙酰基转移到芳香醛上56。在形成安息香结 构中间体之后, 继续被还原成邻二醇, 生成物具有立体选择性。此反应可用于合成单糖, 但合成收率低而且后处理繁复。 2- 脱氧单糖的合成中就利用了这步反应(scheme 1.23)。 ph h r cho by ph h r oh oh ch3 scheme 1.23 2) c=c双键的加水反应 华中科技大学硕士学位论文 15 面包酵母能催化取代巴豆醛衍生物中c=c双键的加水反应和醛基的还原反应57 (scheme 1.24)。该反应需要含有苄氧基或苯甲酰氧基化合物的诱导58。 o x phcho by o x phch2oh oh scheme 1.24 1.5.4 反应介质的选择 一般的生化反应都在水相中进行，而传统的催化合成手性化合物的反应都是在有 机相中进行。近年来，微生物活细胞在有机介质中的生物催化作用己引起关注，相关 报道增多，研究主要集中在两个方面：一是考察有机试剂对微生物或酶的毒害作用， 以选择好的有机试剂，提高生物催化的反应效率；二是通过筛选微生物和酶，改造底 物结构，改变反应条件以及添加有机试剂控制和提高反应的选择性。许多具有商业意 义的化合物，往往水溶性差或不溶于水，而利用酶或微生物催化这些有机物转化己经 证明具有很好的潜力。有机介质中(或水- 有机溶剂两相反应体系)的生物催化反应研 究，虽有很大进展，但至今尚未被广泛使用。但利用有机试剂提高底物溶解性，以最 终提高单位体积产率，具有可行性。国外已有成功的工业化生产例子。jorge等人巧妙 的设计了一种称为“ multiphase/ extractive membrane”的反应器使酶在水溶性差的有机 质中反应，提高了底物和酶的接触程度，降低了产物对酶反应的抑制性，使酶反应器 的生产性和可操作性能有很大提高，并已成功的用于治疗高血压和心绞痛的硫单草酮 的中间体的生产，实验室规模己达144 m259。目前由于有机介质中酶催化反应存在诸 如辅酶再生等问题，完整细胞作为催化剂在有机试剂或水相中的催化反应已成为研究 热点。 有机溶剂体系可以分为几类：水- 有机溶剂(可溶于水)两相体系、单一有机溶剂体 系60。有人进一步将其分为： 1)含有小于20% (v/v)有机溶剂水溶液体系； 2)含有大于20% (v/v)有机溶剂体系； 3)水- 有机溶剂、有机溶剂- 水、水- 有机溶剂- 水； 华中科技大学硕士学位论文 16 4)单一有机溶剂体系。严格意义上讲绝对不含水的有机反应体系有机介质的催化 反应61。 由于对于一般的生物催化剂而言，水，尤其一定量的结合水对于其发生催化反应 是必需的，因此，水的存在对生物催化反应体系是很重要的。 1.6 本论文的研究内容和意义 - 烷基手性伯醇是一种非常重要的精细化工产品和药物中间体。从前面的内容可 以看出，其生物制备方法产率均不高 46，通过化学方法若要得到光学纯度较高的产 物，则需要在- 10- 20甚至更低温度下反应44，这样的条件要求比较苛刻。因此, 有必要寻找一种能够制备出高光学纯度 - 烷基手性伯醇并且条件要求温和的方法。 - 烷基- ?- 丁内酯(?- butyrolactone)是一种用途很广泛的精细化学品, 它是诸如环丙 沙星, 氟哌啶醇, 脑复康, 维生素 b1, 聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)等的原料, 但目前合成方 法有限。三氯甲基是一个非常有用的基团，它水解后可以成酸，这样可以在分子中引 入许多其他的基团，像酯基、酰基等，因此 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 1- 丁醇也将是合成 - 烷 基- ?- 丁内酯的很好的一种前体。本文计划以三氯乙醛和脂肪醛为原料，合成 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛，再经过生物还原制备 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 1- 丁醇。 由于酵母类微生物对 c=o 键及 c=c 键具有一定的还原能力， 并具有立体选择性， 本文拟利用市售面包酵母这种常见生物催化剂，以 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛为底物 直接合成 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 1- 丁醇。为了取得理想的产率及 e.e.值，本文准备对反应 体系 ph 值、反应时间、反应介质等多个可能影响酵母还原反应的因素进行系统的研 究，寻找出最佳反应条件，对此方法今后的实际应用提供指导。 华中科技大学硕士学位论文 17 2 实验部分 2.1 底物合成及检测方法 2.1.1 主要实验试剂及仪器 表 2.1 实验试剂 table 2.1 the main chemical reagents 实验药品 规格 产地 正丁醛 ar 武汉市江北化学试剂有限公司 丙醛 cp 中国医药集团上海化学试剂公司 三氯乙醛 ar 中国医药集团上海化学试剂公司 二氯甲烷 ar 天津市博迪化工有限公司 六氢吡啶 ar 国药集团化学试剂有限公司 苯 ar 国药集团化学试剂有限公司 对甲苯磺酸 ar 国药集团化学试剂有限公司 碳酸钾 ar 天津博迪化工有限公司 无水硫酸钠 ar 天津博迪化工有限公司 甲醇 ar 武汉联碱厂 硼氢化钾 ar 上海振兴化工一厂 乙醚 ar 天津博迪化工有限公司 无水硫酸镁 ar 天津博迪化工有限公司 表 2.2 实验仪器 table 2.2 the main instruments and equipments 仪器 型号 生产厂商 磁力搅拌器 78- 1 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 旋转蒸发器 re- 52a 上海亚荣生化仪器厂 气相色谱仪 gc 9790 浙江温岭福立分析仪器有限公司 红外光谱仪 equinox 55 瑞士 bruker 公司 核磁检测仪 bruker av400 瑞士 bruker 公司 华中科技大学硕士学位论文 18 2.1.2 2- 烷基- 3- 羟基- 4,4,4- 三氯丁醛的合成 cl3ccho + r o piperidine ocl3c oh r a: r=ch3, b: r=c2h5 scheme 2.1 参照文献36的方法合成羟醛。向 500 ml 圆底烧瓶中加入新蒸三氯乙醛 8.3 ml (0.085 mol)和干燥的二氯甲烷 85 ml，再加入六氢吡啶 2.52 ml (0.026 mol，为反应物 物质的量的 30%)，搅拌均匀。将干燥过的二氯甲烷 85 ml 加入到新蒸丙醛 6.3 ml (0.088 mol)中配成溶液，然后将该混合溶液经恒压滴液漏斗慢慢的加入到 500 ml 圆 底烧瓶中，控制滴速在 1 d/s，冰水浴，保持反应温度在 0，反应 24 h。反应结束后， 用旋转蒸发器减压蒸除溶剂及少量未反应完的原料，即得到 2- 甲基- 3- 羟基- 4,4,4- 三氯 丁醛粗产物。产物经红外光谱仪检测。 2- 乙基- 3- 羟基- 4,4,4- 三氯丁醛采用相同的方法合成，产物经红外光谱仪检测。 2.1.3 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛的合成 ocl3c oh r pts o cl3c r a: r=ch3, b: r=c2h5 scheme 2.2 参照相关文献的方法62， 将 2- 甲基- 3- 羟基- 4,4,4- 三氯丁醛粗产物和对甲苯磺酸(10 mol%)置于苯溶液(1.6 l/mol product)中回流 10 h后，冷却至室温，向反应液中加入适 量 k2co3，然后用饱和食盐水洗涤。干燥，浓缩，于 7 mmhg下蒸馏得到带有特殊香 味的淡黄色液体，即为 2- 甲基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛(1a)，bp 91，通入氮气密封避光 保存，产率为 62%。产物经红外光谱仪和核磁检测仪检测鉴定。 2- 乙基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛(1b)采用相同的方法合成，bp 100 (7 mmhg)，产率 67%。产物经红外光谱仪和核磁检测仪检测鉴定。 华中科技大学硕士学位论文 19 2.1.4 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醇的合成 a: r=ch3，b: r=c2h5 cl3c r oh cl3c r o nabh4 ch3oh scheme 2.3 取 50 ml 单口烧瓶，于烧瓶内将 100 mg (0.53 mmol) 2- 甲基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛 溶于 10 ml 甲醇，室温下磁力搅拌，一次性加入硼氢化钾 20 mg (0.37 mmol)，加入完 毕后继续搅拌 30 min，加入10 ml 蒸馏水中止反应。用水泵减压在旋转蒸发仪上除去 甲醇，控制浴温在 30左右。用 15 ml 乙醚分三次萃取，合并有机相，用无水硫酸 镁干燥 4 h， 再利用旋转蒸发仪除去乙醚， 即得到产物 2- 甲基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醇(4a)， 避光保存待用，产率为 90%。产物经核磁检测仪检测鉴定。 2- 乙基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醇(4b)采用相同的方法合成，产率为 92%。产物经核磁 检测仪检测鉴定。 2.2 干面包酵母催化还原 2- 烷基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛 2.2.1 主要实验试剂及仪器 表 2.3 实验试剂 table 2.3 the main chemical reagents 实验药品 规格 产地 磷酸二氢钠 ar 天津市化学试剂三厂 磷酸氢二钠 ar 河南焦作市化工三厂 无水硫酸钠 ar 天津博迪化工有限公司 吐温 8 0 ar 天津市化学试剂三厂 葡萄糖 ar 天津市博迪化工有限公司 石油醚 ar 国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯 ar 国药集团化学试剂有限公司 华中科技大学硕士学位论文 20 pbs 缓冲溶液的配制 分别称取 15.6 g nah2po4 2h2o 和 35.8 g na2hpo4 12h2o 溶于 500 ml 蒸馏水中， 即得浓度为 0.2 mol/l 的 nah2po4 (a)和 na2hpo4 (b)溶液。 表 2.4 pbs 缓冲溶液的配制 table 2.4 pbs buffer ph 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 a (ml) 87.7 68.5 39.0 16.0 5.3 b (ml) 12.3 31.5 61.0 84.0 94.7 按上表所示，将 a、b 按比例混合，即得到浓度为 0.2 mol/l 的磷酸盐缓冲溶液 (pbs)。将此0.2 mol/l的磷酸缓冲溶液稀释一倍，即得到相应 ph 下 0.1 mol/l的磷酸 缓冲溶液。 表 2.5 实验仪器 table 2.5 the main instruments and equipments 仪器 型号 生产厂商 旋转蒸发器 re- 52a 上海亚荣生化仪器厂 气相色谱仪 gc 9790 浙江温岭福立分析仪器有限公司 高速台式离心机 tgl- 16c 上海安亭科学仪器厂 数显水浴恒温振荡器 sha- c 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 核磁检测仪 bruker av400 瑞士 bruker 公司 2.2.2 反应体系 ph 值的调节 取 5 个 100 ml 锥形瓶编号为 1- 5，加入 25 ml 0.1 mol/l ph 分别为 6.0、6.5、 7.0、7.5、8.0 的磷酸盐缓冲液，然后加入 2.0 g 安琪高活性干酵母，并加入 60 mg底 物 2- 甲基- 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛(1a)，氮气保护，磨口塞封口，置入恒温振荡器于 30 下进行反应，恒温振荡器转速为 140 rpm，反应时间为 24 h。反应结束后取出，于 3500 rpm离心 20 min，用 25 ml 乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥 过夜，浓缩后经硅胶柱色谱去除杂质(以乙酸乙酯为洗脱剂)。将产物进行气相色谱分 析(普通极性柱和手性柱)，并通过核磁检测仪对产物进行鉴定。 在实验较优的 ph 值下，采用相同的实验条件和检测方法考察面包酵母对2- 甲基 华中科技大学硕士学位论文 21 - 4,4,4- 三氯- 2- 丁烯醛(1b)的还原情况。 普通极性色谱条件为： 色谱柱：ae peg- 20m 30 m0.25 mm film thickness 0.33 m 柱温： step0: temp= 80 time=3 min step1: rate=20 temp=180 time= 60 min 进样口温度：250 检测器温度：250 气体流速：燃气(h2) 30 ml/min.；助燃气(air) 300 ml/min.；载气(n2) 30 m