（环境科学专业论文）水样中新霉素残留分析方法的建立及其在动物性样品分析中的应用.pdf

摘要 全中低残留检测的需要。 3 )阴离子交换色谱脉冲安培检测法在鸡血清新霉素残留分析中的应用 采用三氯乙酸沉淀蛋白，弱阳离子交换固相萃取柱富集净化处理血清 样品，同样运用本研究建立的分析方法检测血清中新霉素的残留。在牛奶 样品预处理方法的基础上，优化净化前溶液的p h 值，并改进淋洗条件， 实验得到血清中新霉素的回收率在5 3 9 0 0 , - - 8 0 6 之间，三次以上平行测定 的r s d 均小于1 0 o 。测定血清中新霉素残留的线性范围为5 0 5 5 0 5 n g m l ，相关系数为0 9 9 5 l ( n - 4 ) 。 模拟实际禽类养殖过程，以个体口服法连续给健康幼鸡喂食新霉素 1 4d ，采集并分析停药后鸡血清样品，结果发现，停药第l 天鸡血清新霉 素的残留水平较高，浓度为1 7 9 9 1 4 6n g m l ( n _ 3 ，r s d = 8 1 ) ；第3 天新霉素只能定性检出；第5 、7 、9 、1 1 和1 4 天则无法检出。 关键词：新霉素；畜禽养殖；残留分析；阴离子交换色谱；脉冲安培检测器； 水体：牛奶；血清样品。 a b s t r a c t a b s t r a c t n e o m y c i ni sab r o a ds p e c t r u m ，e f f i c i e n t l yb a c t e r i c i d a la m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c ， w h i c hi sw i d e l yu s e di nt h et r e a t m e n to fb a c t e r i a li n f e c t i o n sa n da n i m a ld i s e a s e s t h eu s eo fn e o m y c i no nal a r g es c a l ea sat h e r a p e u t i ca g e n tg i v e sr i s et od r u g r e s i d u e si ne d i b l ep r o d u c t so fa n i m a l s ，w h i c hc a l la d v e r s e l ya f f e c tt h ep u b l i ch e a l t h a n de n v i r o n m e n t a ls a f e t y t h e r e f o r e ，r e s i d u ea n a l y s i sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h e f o o ds a f e t ym o n i t o r i n ga n dm a n a g e m e n t i nt h i sd i s s e r t a t i o n , t h em e t h o do fh i g h p e r f o r m a n c ea n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( h p a e ) c o u p l e dw i t hp u l s e d a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ( p a d ) h a db e e nd e v e l o p e da n da p p l i e dt o t h e d e t e r m i n a t i o no fn e o m y c i ni nw a t e r , m i l ka n ds e r u ms a m p l e s t h ed e t a i l i n f o r m a t i o ni sa sf o l l o w s ： 1 ) e s t a b l i s h m e n to fa n a l y t i c a lm e t h o df o rn e o m y c i ni nw a t e rs a m p l e s as i m p l e ，f a s ta n dr e l i a b l em e t h o du s i n gh i 曲p e r f o r m a n c ea n i o n c h r o m a t o g r a p h yw i t hp u l s e da m p e r o m e t r i cd e t e c t i o nh a db e e nd e v e l o p e df o r t h ea n a l y s i so fn e o m y c i ni nw a t e rs a m p l e s t h ei n f l u e n c eo fc o n c e n t r a t i o na n d p ho ft h em o b i l ep h a s eo nt h es e p a r a t i o na n dd e t e c t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h e e l u t i o na n ds e p a r a t i o nw e r ec a r r i e do u tw i t ha ni s o e r a t i cm o b i l ep h a s e c o n t a i n i n g 10m m o l ln a o h a q u a d r u p l e p o t e n t i a lw a v e f o r mu s e df o rt h e d e t e c t i o nw a so p t i m i z e d t h ed e t e c t i o nl i m i to fn e o m y c i nw a sd o w nt o2 7 n g m l t h el i n e a r i t yo fn e o m y c i nc a l i b r a t i o nc u r v er a n g e df r o m5 0 0t o5 0 5 n g m lw i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 9 7 t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) f o rn e o m y c i nd e t e r m i n a t i o nw a s4 o ( n = 1 1 ) t h i sm e t h o dw h i c h a v o i d sf o r m a t i o no fi o n p a i r c o m p o u n d si nr p h p l ca n dd e r i v a t i z a t i o n p r o c e d u r ei nt h ed e t e c t i o n ，i sq u i c k ，h i g hs e n s i t i v ea n dr e p r o d u c i b l e u s i n gt h ep r o p o s e dm e t h o d , n e o m y c i nc o n c e n t r a t i o ni ns e v e r a lw a t e r s a m p l e ss p i k e dw i t hn e o m y c i na n dan e o m y c i ns u l f a t e e a rd r o pw e r e d e t e r m i n e d t h er e c o v e r i e so fn e o m y c i na tac o n c e n t r a t i o no f5 0 0n g m li n i i i a b s t r a c t s p i k e dw a t e rs a m p l e sw e r ea p p r o x i m a t e l y7 0 0 2 ) a p p l i c a t i o no fa n a l y t i c a lm e t h o do nt h ed e t e r m i n a t i o no fn e o m y c i n r e s i d u ei nm i l k m i l kw a s d e p r o t e i n a t e dw i t ht r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，a n dt h e nc l e a n e du pw i t h aw e a kc a t i o n e x c h a n g ec a r t r i d g e n e o m y c i nr e s i d u ei nm i l kw a sa l s oa n a l y z e d u s i n gh p a e p a d t h e i n f l u e n c eo fv a r i o u sp a r a m e t e r so n c l e a n u p o f n e o m y c i n i n m i l k , i n c l u d i n g t h ec o n c e n t r a t i o no ft r i c h l o r o a c e t i c a c i d ， c e n t r i f u g a t i o ns p e e d ，t h ef l o wr a t ea n dt h ec o n c e n 跏i o no fe l u e n t , w e r e i n v e s t i g a t e d t h ea v e r a g er e c o v e r i e so fn e o m y c i ni nm i l kr a n g e df r o m5 0 3 t o7 6 9 t h el i n e a rc a l i b r a t i o nc u r v er a n g e df r o m10 0t o8 0 0n e g r r l lw i t h c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 9 3 t h ep r o p o s e dm e t h o di s s i m p l e ，r e l i a b l e ， o r g a n i cs o l v e n tf r e ea n de s p e c i a l l ys u i t a b l ef o ra n a l y s i so fl o w l e v e ln e o m y c i n r e s i d u ei nm i l k 3 ) a p p l i c a t i o no fa n a l y t i c a lm e t h o do nt h ed e t e r m i n a t i o no fn e o m y c i n r e s i d u ei ns e r u m t h es i m i l a rm e t h o dw i t hd e p r o t e i n a t i o nu s i n gt r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，a n d c l e a n - u pu s i n gaw e a kc a t i o n - e x c h a n g ec a r t r i d g ew a sa p p l i e dt os a m p l e p r e t r e a t m e n t o f s e r u m n e o m y c i n r e s i d u ei ns e r u mw a sd e t e c t e dw i t h h p a e p a d t h ei n f l u e n c eo fp ho nr e t e n t i o no fn e o m y c i ni nt h ec a r t r i d g ew a s i n v e s t i g a t e da n dw a s h i n gp r o c e d u r eo fs o l i d p h a s ee x t r a i o nw a so p t i m i z e d t h ea v e r a g er e c o v e r i e so fn e o m y c i ni ns e r u mr a n g e df r o m5 3 9 t o8 0 6 ， w i t hr s db e l o w10 o t h el i n e a rc a l i b r a t i o nc l l r v er a n g e df r o m5 0 5t o5 0 5 n e r n lw i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to fo 9 9 51 ac h i c k e n - b r e e d i n ge x p e r i m e n tw a sc a r r i e do nb yf e e d i n gn e o m y c i n s u l f a t et oc h i c k e nf o r14d a y s n e o m y c i nr e s i d u e si nc h i c k e ns e r u mw e r e s t u d i e di nd i f f e r e n tp e r i o d so fb r e e d i n g t h er e s u l t ss h o wt h a tn e o m y c i n c o n c e n t r a t i o ni ns e r u mo nt h ef i r s td a ya f t e rf e e d i n gi s17 9 9 - ：1 4 6n e r r l l ( n = 3 ，r s d = 8 1 ) a n d o i lt h et h i r dd a yn e o m y c i nr e s i d u ec a nn o tb eq u a n t i f i e d i v a b s t r a c t f i v ed a y sl a t e r , n e o m y c i nc o n c e n t r a t i o ni sl o w e rt h a nt h ed e t e c t i o nl i m i t k e y w o r d s ：n e o m y c i n ；a n i m a lb r e e d i n g ；r e s i d u ea n a l y s i s ；h i g hp e r f o r m a n c e a n i o nc h r o m a t o g r a p h y ( i - r p a e ) ；p u l s e da m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ( p a d ) ；w a t e r s a m p l e s ；m i l k ；s e r u m v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文 中以明确方式标明本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责 任 声明人( 签名) ：t g 磊弋 d 年7 月7e 12,o o7 辱7 具- ) 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门 大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版 和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文 进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版口保密的学位论文 在解密后适用本规定 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名：官d 太 导师签名壤糸冷 日期：汐力年7 月 7 e 1 日期：伽7 年7 月7 日 第1 章绪论 第1 章绪论 抗生素是由细菌、真菌等微生物在代谢过程中产生的对其他微生物具有 杀灭或抑制作用的一类物质，除由微生物直接提取外，还可用人工合成及部 分人工合成的方法制造而得。抗生素在水产养殖和畜禽生产上起重要作用， 它作为抗感染药物或饲料添加剂，可防治动物疾病、降低死亡率和促进生长。 目前应用的抗生素品种繁多，按其化学结构可分为青霉素类、头孢菌素类、 氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、林可酰胺类、多肽类等。 然而，长期和广泛地应用抗生素易导致病原菌产生耐药性，且食品中的药物 残留也会对人体健康和环境产生负面影响。因此，实行对动物性食品中抗生 素残留的监控，成为最基本并直接控制抗生素残留的手段。 1 1 新霉素的应用及残留 新霉素( n e o m y c i n ) 是由链霉菌属弗氏链霉菌( s t r e p t o m y c e s f r a d i a e ) 经 发酵培养产生的一类广谱抗生素。新霉素属于氨基糖苷类抗生素，具有抗菌 活力强、作用范围广等特点，是治疗畜禽细菌性肠炎的首选药物。此外，新 霉素还被广泛应用于治疗养殖动物的乳腺炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、 外伤感染、足腐烂等疾病；在畜牧养殖中，新霉素作为饲料添加药物可预防 由细菌感染引起的早期损伤和肠炎，提高饲料利用率，促进畜禽生长。 1 1 1 氨基糖苷类抗生素的结构及其特点 氨基糖苷类抗生素( a m i n o g l y e o s i d ea n t i b i o t i c s ，a g s ) 是由微生物产生或 经半合成制取的一类由氨基糖( 或中性糖) 与氨基环醇以苷键相结合的易溶于 水的碱性抗生素【l 】，其基本结构如图1 1 所示。 第1 章绪论 o h c h j c h j 图1 1 氨基糖苷类抗生素的基本结构( 以庆大霉素为例) f i g 1 - 1b a s i ca m i n o g l y c o s i d es t r u c t u r e ( s h o w na sg e n t a m i c i n ) 根据其抗菌特性及结构特点，氨基糖苷类抗生素可分为三大类【2 】：以卡那 霉素为代表的第一代氨基糖苷类抗生素，包括新霉素、巴龙霉素、链霉素和 核糖霉素等，其结构特点是完全羟基化的氨基糖与氨基环醇相结合，不抗绿 脓杆菌；第二类以庆大霉素为代表，结构中均含有脱氧氨基糖并具有抗绿脓 杆菌的特点，其它品种还包括妥布霉素、西索米星和小诺霉素等；第三类则 是l - n 一( 2 d o s ) 取代的半合成衍生物( 2 一羟基4 氨基丁酰基或乙基取代物) ， 包括阿米卡星、阿贝卡星、萘替米星和依替米星等。这类a g s 兼有母体的抗菌 活性，且耳毒性和肾毒性小，具备抗耐药性。如按照氨基环醇的结构，a g s 又可以分为新霉素族、卡那霉素族、庆大霉素族和链霉素族，见表1 1 。 2 第1 章绪论 表1 - 1 氨基糖苷类抗生素的结构特点和分类 t a b 1 - 1c h a r a c t e r i s t i c sa n dc l a s s i f i c a t i o no fa m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s 图1 2 列出了新霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、托普霉素等几种常 用a g s 的结构【3 1 ，a g s 结构中不含共轭双键，仅具有弱的末端吸收( 低于2 3 0 r i m ) ，但含有较多的活性或极性基团，如氨基、胍基、羟基、醛基等，可供衍 生化和电化学检测。此外，a g s 含有多个氨基，属于碱性化合物；易溶于水， 在水溶液中通常带正电荷，铵基( - n h 3 + ) 的p k a 值在7 8 8 之间，且a g s 在酸、 碱或加热条件下均能较为稳定地存在【l 】。 3 第1 章绪论 n e o m y c i nb n e o m y c i nc p a r o m o m y 宅j n i p a r o m o m y c i ni i r 窜 r 3 n h r r 舻 一 n h 2c h i q h z n h ： h o h c l i p o hh r 1 t n h 2 r - o h h c h 一心 h c h h 2 p n m m 蜘r t r 2r i c ， c 慵 c 2 c i c 撕 c h h h c h h h h c h 3 h c h s h c h 3 h h h y 、 产n h h n h 科茴粤h h c h i s t r e p t o m y c i n r - c li o d i l l ) f d r o s & e p t o m y c i nr c h 删 k a n a m y c i na k a n a m y c i nb k a n a m y c i nc 翻蚺，悖m y c i n d i b 馆c i n i l m i k a c i n a r b e k a c 妯 粥r ir r 0 o ho h n h o ho h n h = o ho h o h h h0 1 4 n i l a h hh n h 2 h o h0 ho h n h 2i n h 2 hh n h 2j 图1 2 常见氨基糖苷类抗生素的结构3 i o h h 人小n h 2 o f i g 1 - 2s t r u c t u r e so fs o m ei m p o r t a n ta m i n o g l y c o s i d e s l 3 i a g s 的抗菌原理主要表现在对细菌核糖体的作用，它能够引起t r n a 错误 翻译m r n a 上的密码子，从而抑制细菌蛋白质的合成。它对于许多革兰氏阳性 4 h 嘞吩叱心 a n n n n 第1 章绪论 茵、阴性菌及结核菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌等，具有较好的 抗菌性能。当应用于畜禽养殖业时，新霉素以其在抗菌谱、耐药性、治疗肠 道疾病及口服和外用安全性等方面的优异性，成为a g s 中最具代表性的抗生素 之一。 1 1 2 新霉素残留对人体和环境的危害 耳毒性和肾毒性是a g s 共同的毒副作用。其中，a g s 的肾毒性大小与其游 离氨基的数目有关，药物所含的游离氨基的数目愈多，其肾毒性愈大【4 】。在常 用的a g s 中，链霉素只含2 个游离氨基，庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星等结 构中含有4 个游离氨基，而新霉素则含有6 个游离氨基，故肾毒害较大。据临 床研究【4 】，常用a g s 的肾毒性大小排列依次为：新霉素、托普霉素、庆大霉素、 卡那霉素、链霉素。 新霉素会选择性地破坏耳前庭及耳蜗感觉细胞，能够在肾皮质上积蓄， 损害近端肾曲小管。据报道，新霉素对肾脏的损害在停药后一般可恢复，而 对耳蜗和前庭的损害却是永久的，听力功能受损的发生率高达2 0 3 0 5 1 。 新霉素可使人体产生过敏反应。人类经常食用含有新霉素残留的食品， 会导致体内正常菌群失去平衡，不利于身体健康。而且体内细菌易产生耐药 性，当人体发病时，往往由于耐药性菌株的存在而使治疗失败，甚至因用药 无效而导致病情恶化。特别是当新霉素过敏反应者食用后，可能引发过敏性 休克，严重的还可致命。另外，新霉素还可使人产生恶心、呕吐、食欲不振 等胃肠道不良反应。 养殖动物用药后，a g s 多以原形代谢物的形式随粪、尿等排泄物排出。动 物粪便通常施于土壤表层，抗生素残留则随地表径流进入水体环境，或者通 过土壤渗透进入地下水系统，造成环境中残留量增加。而这些兽药排入环境 后仍然具有活性，会对土壤微生物、水生生物及昆虫等造成影响【6 】。 正因为新霉素应用范围广、残毒性大及对生态环境的负面影响，畜禽产 品中新霉素的残留日益引起人们的广泛关注。 5 第l 章绪论 1 1 3 新霉素的残留问题 杨军等人川于1 9 9 4 年对上市鲜猪肉和白条鸡中的抗生素残留，用微生物滤 纸片法进行了检测，结果发现猪和鸡肾脏中药物残留率分别达5 0 和6 0 ，而 且主要是青霉素和氨基糖苷类药物的残留，残留量最高达0 6 g m l 。 1 9 9 8 年间，王春奕等人8 1 对上市肉鸡和鸡蛋中抗生素残留进行检测。采购 1 2 只市售肉鸡肝脏和1 0 只市售鲜鸡蛋，在鸡蛋中检出链霉素类药物残留，最 高残留量为0 7m g k g ，超过欧盟公布的鸡蛋中最高允许残留量0 5m g k g 的标 准。 另据李书云等人报道【外，2 0 0 1 年柳州市市场上鸡产品中抗生素残留较高 ( 鸡肉的阳性率为8 1 5 4 ，鸡肾脏的阳性率为8 8 6 4 ) ，上市猪肉抗生索残留 的阳性率也达2 0 5 ，实验结果表明生物组织中含有青霉素和氨基糖苷类药物 的残留。 曹雨辰等人【1 川于2 0 0 5 年从成都市几家市场选购了6 种1 5 个供试动物源性 食品，包括牛肉、猪肉、鸡肝脏和鸡肾脏等，利用微生物方法检测其中新霉 素残留，其中有9 个样品检测出新霉素残留，浓度在4 5 0i _ t g m l 之间。 此外，市场上销售的鲜牛奶中抗生素残留的检出也时有报道。吴国娟等 人【l l 】于2 0 0 2 年对北京市销售的纯牛奶中抗菌药物残留的情况进行调查，分析 随机采购的5 0 份牛奶，阳性率达3 0 ，个别奶样中链霉素残留高达3 1 8 8 n g m l 。 由此可见，新霉素等a g s 在动物食品内的残留问题相当严重，药物残留不 仅危害人体健康，也给我国经济发展带来不利影响。为保障人类健康和维护 社会稳定，控制抗生素在畜禽产品中的残留刻不容缓。 1 1 4 动物性食品中新霉素残留的控制 发达国家很早就开始关注动物性食品中的兽药残留问题。联合国粮农组 织( f a o ) 和世界卫生组织( w h 0 ) 早在1 9 6 9 年就提出，应对各种动物性食 品中的抗生素残留制定标准，并且通过食品法典规定了抗生素的每日安 全摄人量( a d i ) 和最高残留限量( i ) 。其中，新霉素在各种动物产品中最 高残留限量规定见表1 2 t 1 2 1 。 6 第1 章绪论 表1 - 2f a o w h o 规定的新霉素最高残留限量m g k g ) t a b 1 - 2f a o w h or e g u l a t i o no fm a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( m r l s ) f o r n e o m y c i ni nd i f f e r e n ta n i m a ls p e c i e sa n dt a r g e tt i s s u e s 自1 9 9 0 年起，欧盟陆续对动物性食品中各种兽药产品的最高残留限量作 出规定，对于新霉素的规定见表1 3 t 13 1 。美国则建立了以联邦和各州法律为基 础的食品安全体系，在美国食品和药品管理局( f d a ) 的监控管理下，限定 国内生产和进口肉、禽产品中的兽药残留。其中，f d a 规定牛奶中新霉素的 浓度不许超过1 5 0n g m l t l 4 1 。 表l - 3 欧盟规定的动物性食品中新霉素的最高残留限量( t t g k g ) t a b 1 - 3e u r o p e a nc o m m i s s i o nr e g u l a t i o no fm a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( m r l s ) f o rn e o m y c i ni nd i f f e r e n tt a r g e tt i s s u e s 残留部位mri，s 肌肉 脂肪 肝脏 肾脏 牛奶( p g l ) 鸡蛋 5 0 0 5 0 0 5 0 0 5 0 0 0 1 5 0 0 5 0 0 日本为保证进口食品及其相关产品的安全性，于1 9 4 7 年即制定食品卫生 7 第1 章绪论 法，此后进行多次了修订。从2 0 0 6 年5 月2 9 日开始，日本针对进口农产品的 新规定食品中残留农业化学品肯定列表制度付诸实施。这项制度涉及了 所有农业化学品( 农药、兽药及饲料添加剂) 的管理，范围之广、对药物残留 控制标准之严前所未有，对新霉素在食品中的残留限制见表1 4 【1 5 】。 表1 4 日本“肯定列表制度一规定动物性食品中新霉素的最高残留限量 ( m g k g ) t a b 1 - 4j a p a n e s er e g u l a t i o no fm a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( m r l s ) f o r n e o m y c i n i nd i f f e r e n ta n i m a ls p e c i e sa n d t a r g e tt i s s u e s 我国农业部1 9 9 7 年发布了“动物性食品中兽药最高残留限量”( 表1 5 ) 【1 6 1 ， 并于2 0 0 2 年对其进行修订，严格规定了各种兽药的使用范围及残留限量。1 9 9 9 年，农业部和国家质量监督检验检疫总局还制定了中华人民共和国动物及 动物源食品中残留物质监控计划，加大对抗生素使用的限制。 8 第1 章绪论 表1 5 我国已批准的动物性食品中新霉素最高残留限量( m g k g ) t a b 1 - 5c h i n e s em a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( m r l s ) f o r n e o m y c i ni n d i f f e r e n ta n i m a ls p e c i e sa n d t a r g e tt i s s u e s 1 2 新霉素的测定方法 针对目前动物性食品中新霉素残留的限量规定，新霉素的残留分析方法 主要有微生物测定法、化学分析法和免疫分析法。 1 2 1 微生物测定法 微生物测定法是根据抗生素对微生物的生理机能和代谢的抑制作用，定 性或定量确定样品中抗微生物药物残留的方法。 农业部于2 0 0 1 年1 1 月1 日发布农牧发 2 0 0 1 1 3 8 号文，规定了l o 种动物源食 品中兽药残留的检测方法f 1 刀。其中方法九介绍了用p h 为8 的磷酸盐缓冲溶液萃 取，加热、离心除去蛋白质，再以表皮葡萄球菌为测试菌测定新霉素的微生 物学琼脂扩散法。通过测量3 2 3 5 下培养1 8 2 0h 后琼脂培养基上抑菌圈的 直径，定量测定新霉素残留量，该方法在鸡肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的检 测限均为5 0 0g g k g 。 王苏华等人【1 8 】同样用磷酸盐缓冲液作为提取剂，以表皮葡萄球菌2 6 0 6 9 为测试菌，采用微生物学琼脂扩散法测定供试鸡蛋样品中新霉素残留量。在 3 7 、1 8 2 0h 的培养条件下，方法的最低检测限为0 0 7 5p g m l ，鸡蛋中的 9 第1 章绪论 最低检测限为o 2 5p g 儋，定量限为0 5g g g 。沈川等人【1 9 】还将此法应用于鸡组 织新霉素的测定，取得较好的效果。肌肉、肝脏和肾脏组织中新霉素检测限 可达o 5 o 7 5 “g 组织，培养温度为3 3 ，培养时间为2 0 h 。 虽然微生物法费用低、易开展，但因其分析时间长、操作复杂且检测结 果准确度较低等缺点，以灵敏准确、简便快速的化学分析法代替微生物法进 行残留分析，成为研究趋势【2 们。 1 2 2 化学分析法 化学分析法利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应性能测定其含 量，包括高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法以及与 质谱的联用技术等。化学分析法能对抗生素进行准确可靠的定性、定量分析， 灵敏度较高。 1 2 2 1 高效液相色谱法 由于新霉素水溶性好、极性强、分子量大，高效液相色谱( h p l c ) 法较多 地运用在新霉素的残留分析中。应用反相h p l c 分析时，常常需要在流动相 中加入离子对试剂2 1 砣9 】，如七氟丁酸【2 2 1 、樟脑磺酸【2 3 】、戊烷磺酸 2 4 , 2 5 1 和辛烷 磺酣2 触9 1 等，以改善新霉素在反相键合色谱柱上的分配情况；也可于反相柱 分离前将新霉素衍生化，使其极性降低，以改善分配特性。常用的柱前衍生 化试剂有邻苯二甲醛( o p a ) 【3 0 1 、芴甲氧羰酰氯( f m o c c i ) 3 1 3 4 、2 , 4 二硝 基氟苯( d n f b ) 【3 习以及苯氰酸( p i c ) 【3 6 1 。 表1 - 6 总结了离子对色谱法测定新霉素的色谱条件。针对用于反相h p l c 分析的c 1 8 色谱柱，甲醇水溶液 2 2 , 3 0 1 及乙腈水溶液【3 1 3 3 3 5 3 q 是常见的流动相 选择。f l o r e n c e 等人【2 3 1 报道在p h2 2 的e d t a 盐酸溶液与甲醇组成的流动相 中添加樟脑磺酸，可分离新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素及双氢链霉素。 按9 0 ：1 0 ( v v ) 混合的乙腈一水溶液作为流动相，可分离萘替米星、紫苏霉素 和新霉素3 1 1 ，以8 5 ：1 5 ( v v ) 的乙腈一水溶液为流动相，则可分离庆大霉素和 新霉素3 2 1 。此外，有报道将含有一定量硫酸钠和辛烷磺酸的磷酸缓冲液 ( p h = 3 0 ) 用作反相h p l c 的流动相【2 9 1 ，分离市售新霉素药品中新霉素及 其它杂质。 1 0 第1 章绪论 表l - 6 离子对高效液相色谱法测定氨基糖苷类抗生素 t a b 1 - 6d e t e r m i n a t i o no fa m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c sb yi o n - p a i rl i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 亲水色谱( h i l i c ) 类似于正相色谱( n p l c ) ，适合于分析亲水性化合物。 由于h i l i c 的极性流动相能在键合两性离子的硅胶固定相表面形成一层亲水 相，被分析物质可在其上进行分配，因此也被成功应用于分离庆大霉素、卡 那霉素、新霉素、巴龙霉素、托普霉素等多种a g s 抗生素 3 7 , 3 8 。 离子交换色谱是分析溶液中以离子状态存在的a g s 的常用方法。目前大 多数研究者均在强碱性的阴离子交换色谱柱上分离新霉素及其它a g s 如妥布 霉素、西梭霉素等。研列3 1 1 表明，仅以小于1 0m m o l l 的稀碱溶液为流动 相，无需加入其它试剂，即可根据不同a g s 的分子质量以及结构中氨基的含 量，达到分离的目的。利用a g s 含有的多个氨基，y a n g 等人 4 z l 以阳离子交换 11 第1 章绪论 色谱法，分离包括丁胺卡那霉素、卡那霉素、新霉素、托普霉素、庆大霉素、 壮观霉素、核糖霉素在内的多种a g s 抗生素，获得较好的分离度。 1 2 2 2 薄层色谱法 k r z e k 等人h 3 1 在硅胶t l c 薄层板上，以甲醇一正丁醇一2 5 ( v v ) 氨水氯仿 ( 1 4 ：4 ：9 ：1 2 ，v m v v ) 为流动相，运用薄层色谱法分离新霉素、多粘菌素等抗生 素，不同抗生素的比移值( r f ) 差别大，分离效果较好。m e d i n a 和u n r u h t 删也 建立了可用于分析动物血浆或血清样品中庆大霉素、新霉素、壮观霉素、潮 霉素和链霉素残留的t l c 法。同样采用硅胶t l c 薄层板，以丙酮甲醇一9 9 9 ( v v ) 氨水( 1 ：1 ：1 ，v v ) 为流动相完成分离过程。r o e t s 等人1 4 5 1 在硅胶平板上 分离新霉素的两种异构体b 和c ，流动相为甲醇2 0 ( w v ) 氯化钠( 1 5 ：8 5 ，v v ) 溶液。t l c 法不需要复杂的仪器和高技术条件即可分离多种a g s ，可用于确 证微生物法的测定结果。 1 2 2 3 其他分离方法 毛细管电泳也是分离新霉素及其杂质的有效手段。s r i s o m 等人p 6 1 用5 0t t r n 内径的石英毛细管，两端加上6k v 电压，以含有4 羟基苯基乙酰胺和十四烷 基三甲基溴化铵的1 5m m o l l 磷酸缓冲液( p h = 5 0 ) 为分离介质，分离新霉素和 多粘菌素，在2 8 0n l n 处以紫外检测器定量检测。 理论上，将a g s 的氨基和羟基进行三甲基硅烷化处理，消除极性，即可用 气相色谱法分离检测。p r e u 等人4 刀成功地运用气相色谱法分离卡那霉素和庆 大霉素的对应衍生物，但未见应用于新霉素分析的报道。 1 2 2 4 检测方法 由于新霉素的结构中缺少生色基团，紫外分光光度法的直接检测灵敏度低 3 6 1 ，而利用流动相中添加发色团离子的间接检测法【4 6 1 ，检测限和定量限也仅 为3 7 肛g m l 和1 2 5 “g m l 。因此必须对新霉素进行衍生化反应才能用紫外或荧 光检测器进行低浓度检测。据报道【3 5 】，新霉素可与2 ，4 硝基氟苯( d n f b ) 反 应，于3 6 5n l n 处检测。此法测定滴耳液中新霉素的含量，线性范围为2 5 1 6 7 p g m l 。新霉素还可与茚三酮显色剂作用，在波长为5 5 0n m 处检测【4 3 】。2 疏基 1 2 第1 章绪论 乙醇( m m a ) 和邻苯二甲醛( o p a ) 【2 1 芦甾】、芴甲氧羰酰氯( f m o c 。c i ) 【3 1 1 、 荧光胺【棚、4 氯7 硝基2 ，l ，3 苯并氧杂恶二唑【4 5 1 均是新霉素检测中常用的荧光 衍生化试剂。 以o p a 为荧光试剂，柱后衍生法检测牛奶中的新霉素，检测限可达0 1 5 m g l t m ；测定血浆和尿样中新霉素，定量浓度可分别达o 2 5 和1 0 肛卧n l 【2 1 】； 若结合m m a 共同衍生，测定动物组织中新霉素，定量限可达5 0n g g ( 肌肉和 脂肪) 或1 0 0n g g ( 肝脏和肾脏) 1 2 3 。以f m o c c l 为荧光衍生剂，对滴眼液中 新霉素含量的最低检测浓度为o 5l l g m l 3 2 1 ；对于肉汤培养基和血浆中新霉素 的检测定量范围可达0 1 1 0p g m l 3 l 】；而当应用于实际动物组织样品( 肌肉、 肝脏和肾脏) 的残留分析时，新霉素检测限和定量限分别为0 1 0m g k g 组织和 0 2 0m g l ( g 组织【3 3 川。 衍生法虽具备较高的灵敏度，但复杂的预处理步骤给大批量样品检测带来 困难。y 锄g 等【4 2 】建立了一种间接测定丁胺卡那霉素、卡那霉素、新霉素、托 普霉素、庆大霉素、壮观霉素等多种a g s 的方法。该法基于a g s 可以替换铜l 色氨酸络合物中的l 色氨酸，而l 色氨酸具有荧光性质，当a g s 与c u 结合后荧 光将消失，若a g s 存在，替换出的l 色氨酸可使荧光强度增加，从而间接测定 体系中a g s 的量。但此法对于新霉素的检测限仅为1 1 8p g m l 。 质谱以其较强的定性能力和检测准确性，成为常用的新霉素检测方法之一 3 7 , 3 8 , 4 8 。h e l l e r 等人翰采用l c e s i m s 和l c m s m s 的方法定量分析检测牛奶 中庆大霉素与新霉素。该法分析牛奶中新霉素，检测限可达到l on g m l 。另 有报道用e s i m s 同时测定牛奶和尿样中庆大霉素、新霉素和链霉素d g l ，新霉 素在牛奶样品中的检测限为o 3 4p g l ，在尿样中检测限为0 2 3p g l 。 由于新霉素的氨基和羟基易氧化，脉冲安培检测法( p a d ) 2 6 - 2 9 , 3 叫检测 新霉素具有选择性好、灵敏度高等特点，与其它检测方法相比有较大的优势。 碱性介质中，以金电极为工作电极，a g a g c l 电极为参比，不锈钢或钛电极为 辅助电极，在脉冲型电压作用下，新霉素在电极表面发生氧化还原反应，可 被灵敏检测。运用图1 3 ( a ) 所示脉冲波形1 3 9 , 4 1 1 ，对于2 0i t l 分析体积中新霉素的 检测限和定量限分别为0 2 1p m o l ( 6 4 5n g m l ) 和o 7 2p m o l ( 2 2 1n g m l ) ； 而运用图1 3 ( b ) 所示波形【4 0 1 ，新霉素检测限最低可达5n g m l 。 1 3 第1 章绪论 2 l 之 掣0 脚 1 2 o 2 0 0 4 0 0 6 0 0 时间m s ( a ) 暑 脚 02 0 0 4 0 06 0 0 8 0 0 1 0 0 0 时间r m c o ) 图1 - 3 用于新霉素检测的脉冲安培法的电位波形 f i