（作物遗传育种专业论文）草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 摘要 草原龙胆( e u s t o m ag r a d i f l o r u m ) 属龙胆科一、二年生草本植物，原产于美洲中部 地区，直到近2 0 年草原龙胆才迅速发展起来。它具有色彩丰富，花朵美丽，花期长等 特点，作为切花新秀，越来越受到人们的喜爱，世界年销售额1 1 亿美元，列切花排名 第七位。但草原龙胆种子细小，育苗困难，所以建立其快速繁殖体系使其充分满足市场 的需要具有重要意义；同时由于常规育种的诸多弊端使得通过基因i - 程方法选育新品种 成为盛然的趋势。根据草原龙胆喜湿润不耐干旱的特点，本实验选择转入抗旱及抗盐碱 基因，使其具有更强的抗逆性，对提高其逆境中的成活率有较大的意义。 本文以草原龙胆不同部位作为外植体，通过对基本培养基类型，激素种类及浓度， 环境因素等方面的调控，对草原龙胆快速繁殖体系的建立做了较为细致的研究。同时本 论文还利用p 一葡萄糖甘酸酶( g u s ) 基因的瞬时表达和稳定表达的蓝斑数对农杆菌转化 草原龙胆植株的愈伤组织的影响因素进行研究比较分析后建立其较为适合的转化条 件。通过用带有抗旱基因和抗盐碱基因的根癌农杆菌转化草原龙胆愈伤组织，并分化出 植株。p c r 检测初步证明抗旱基因已整合到草原龙胆植株中。试验中获得的研究成果主 要有以下几个方面： 1 、对灭菌效果进行比较发现：7 0 酒精浸泡3 0 s 后，用0 1 f t g c l ：浸泡10 分钟可达到最 佳的灭菌效果，无污染率达到1 0 0 ，死亡率为2 ，根据部位的幼嫩程度可适当调 整。 2 、研究草原龙胆以茎段为外植体的丛生芽的诱导与增殖情况后发现，当基本培养基为 m b ( m s 大量+ b 5 微量+ b 5 有机+ f e 盐) ，激素种类和浓度分别为：i b a 2 o m g l ，6 - b a 0 5 m g l ，g a 2 0 m g l 时，丛生芽的诱导率、分蘖率最高。 3 、 研究不同激素6 一b a 、k t 、n a a 、i b a 不同浓度组合对草原龙胆愈伤组织发生的影响。 比较法现：不同种类和浓度的激素组合大部分能使外植体脱分化，产生不同质地的 愈伤组织，但当b a 的浓度为1 o m g l 时，形成的愈伤组织有一半成水浸状，玻璃化 较为严重，当其浓度减至0 5 m g l 时现象消除。 4 、研究不同培养基m s 、n 6 和不同激素n a a 、2 ，4 - d 组合对草原龙胆愈伤组织继代效果的 影响。结果发现，不同处理愈伤组织褐化率都较低，可正常生长，当选用m s 培养基， 2 ，4 一d 浓度为0 5 m g l ，n a a m a n 为零时，愈伤组织为淡黄色，质地较松软，增重最 快。 5 、不同激素6 - b a 、n a a 、k t 组合对愈伤组织分化的影响结果表明：p ；z m s 为基本培养基， 6 一b a 与k t 单独以0 5 m g l 浓度使用时，其分化出的苗正常、叶片浓绿、肥大，而当 吉林农业大学硕士学位论文草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 浓度超过1 0 m g l 时，幼苗的玻璃化现象严重。 6 、不同p h 值、光照强度及激素6 - b a 、z t 、及n a a 浓度对草原龙胆叶盘芽诱导的影响。研 究发现：当p h 值为6 3 ，光照强度为3 0 0 0 h z ，z t 、n a a 浓度分别为0 5 m g l 和0 1 m g l 时，叶盘芽分化率最高 7 、不同浓度的糖、无机盐、活性炭和琼脂及不同种类的生长素对草原龙胆试管苗生根 的影响。试验发现当培养基中蔗糖浓度为5 0 9 l ，无机盐为1 4 m s ，琼f j 目4 9 l ，不添 加活性炭时，幼苗的生根率最高。用较低浓度的i b a ( 1 m g l ) 诱导生根的小苗，根 直接着生于基部，淡绿色，较粗壮，有侧根生出。 8 、试管苗移栽成活率的研究比较法现，当消毒后的土壤以草炭土：蛭石为1 ：1 、光照 时间为1 2 h 、室内温度为2 2 、空气湿度为7 5 时，试管苗的移栽成活率最高，可达 9 0 以上。 9 、察分析不同盐梯度下，草原龙胆愈伤组织抗盐碱能力。比较结果表明，当盐浓度为 2 0 m m o l l 时，9 0 的愈伤组织都可以存活，但愈伤组织分化率及低，所以转化后的 愈伤组织筛选培养梯度设为5 m m 0 1 儿、1 0 m m o l l 、15 m m o l l 。 1 0 、在农杆菌侵染草原龙胆愈伤组织遗传转化的过程中，不同侵染时间对转化效率的影 响较为明显，b k c u s 染色的结果看，当侵染时间为5 分钟时，转化效率最高 1 1 、菌液浓度对草原龙胆愈伤组织遗传转化效率影响明显，当茵液浓度为o d 6 0 0 值为0 3 时，农杆菌侵染效率最高，菌液浓度为0 1 时，侵染效果明显下降，而当浓度0 d 值超 过0 5 时，愈伤组织死亡率提高。 12 、a s 浓度对农杆菌侵染草原龙胆愈伤组织进行遗传转化的过程中的作用研究结果表 明：侵染液中a s 浓度的变化对侵染效果的影响显著，当a s 浓度为1 0 0 p m o l l 时，愈伤 组织的转化效率最高，浓度较低或较高侵染率都随之降低 1 3 、共培养时间对草原龙胆愈伤组织遗传转化效果的影响研究表明，共培养时间在2 5 d 的范围内草原龙胆差异不显著，但共培养时间为3 d 侵染效果最好。 1 4 、在侵染后的愈伤组织分化过程中，表现出愈伤组织继代次数对分化效率的显著影响， 研究结果显示，当愈伤组织为初始愈伤组织时，h x - 4 k = 效率明显较高，当侵染所用的 愈伤组织已继代3 次或以上时，侵染后的愈伤组织分化率极低甚至不分化。 1 5 、对转基因植株进行质粒的提取，p c r 扩增后初步证明，抗旱及抗盐碱基因已初步整合 到草原龙胆植株中，并且p c r 的阳性率为4 9 。 关键词：草原龙胆愈伤组织快速繁殖农杆菌遗传转化g u s 宣苎查兰竺查堂堡主兰堡堡奎 兰堡垄里些垄鳌堕堡墨垄兰墨垫苎旦至壅 a b s t r a c t e u s t o m ag r a d i f l o r u mi sg e n t i a n a c e a eb i e n n i a lh e r b s ，b ep r o d u c e di nc e n t r a lr e g i o ni n a m e r i c aa tf i r s t 。j a p a ne d u c a t e dt h i sk i n do fp l a n tf i r s ti n1 9 3 5 ，e u s t o m ag r a d i f l o r u md i dn o t d e v e l o pq u i c k l yu n t i lb ec l o s et o2 0y e a r s i th a st h ec o l o ra b u n d a n t t h eb l o s s o mb e a u t ye t c c h a r a c t e r i s t i c s ，b et h ec u tn e wt a l e n tf l o w e r s ，b el i k e db yt h ep e o p l em o r ea n dm o r e ，t h ey e a r o f w o r l ds e l l st h es u m1 10 ，0 0 0 ，0 0 0 $ ，t h er o wc u tf l o w e r sr a n k st h es e v e n t h b u te u s t o m ag r a d i f l o r u ms e e di ss m a l l ，g r o w i n gu pd i f f i c u l t y , s ob u i l du pt h ed e m a n d t h a ti tb r e e d st h es y s t e mq u i c k l yt om a k ei tf u l lt os a t i s f yt h em a r k e tt oh a v et h ei m p o r t a n t m e a n i n g ； a tm es a m et i m eb e c a u s em a n yi r r e g u l a r i t i e st h a tn o r m a lr e g u l a t i o n sb r e e d i n gm a d e t h r o u g han e ws p e c i e so ft h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gm e t h o ds e e ds e l e c t i o nb e c a m ea l li n e v i t a b l e t r e n d d o n tb e a rt h ed r yc h a r a c t e r i s t i c sa c c o r d i n gt ot h ep l e a s e dw e t n e s so fe u s t o m a g r a d i f l o m m ，t h i se x p e r i m e n tc h o i c et u r n si n t ot h ea n t i - d r o u g h ta n dt h ea n t i s a l t a l k a l i g e n e s ，m a k i n gi th a v et h es t r o n g e ra n t i n e g a t i v e ，t or a i s ei t sa d v e r s ec i r c u m s t a n c e so f l i v et h e r a t ec o n t a i nb i g g e rm e a n i n g b e c a u s et h ev a l u eo ft h ef l o w e rm a i n l yi si ta p p r e c i a t e st h ev a l u e ，s ot u r nt h eg e n ef l o w e r c o m m e r c i a lw e r ee a s y , b u tn o tt h ee l e p h a n tf o o di ss ot h ep r e s s u r eo f t h es i t u a t i o ns o c i e t y a l l c o u n t r i e ss e i e n t i s t s e sw i l lm a k eu s eo ft h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gf l o w e rb r e e d i n gi n t h e i m p o r t a n tr e s e a r c hc a t e g o r y i ns e v e r e ly e a r so fa f t e r t i m e ，e s t i m a t es o m en a t i o n st ot u r nt h eg e n ef l o w e ri n d u s t r y , i no u r c o u n t r y , s c i e n c ea n dt e c h n o l o g yd e p a r t m e n th a da l r e a d yt u r nt h eg e n ef l o w e rt ol i s t a s8 6 3 r e s e a r c hi t e m si n2 0 0 2 a n do b t a i n e dt h eo u t s t a n d i n gr e s u l t 1 1 1 ef l o w e ra n t i g e n e t i ce n g i n e e r i n gi nt h er e s e a r c hr e s u l to f t h er e p o r tw a yw a sn o tm u c h t h er e s e a r c h e ro ft h ea u s t r a l i ad u c tt h ec o a tp r o t e i n ( c p ) g e n eo ft h ey e l l o ws p o tv i r u s i n t ot h ec a r n a t i o n , a c q u i r i n gt h et r a n s g e n i cp l a n t e u s t o m aw a sr e s e a r c h e dl e s s ，b u tc o n v e r tt h ee u s t o m ap l a n ta s p e c ti nt h ea g r i c u l t u r er o d b a c t e r i aa l m o s tb l a n k t h i st h e s i s p l a n t s t h eb o d yo u t s i d ew i t ht h ed i f f e r e n tp a r tc o n d u c ta n da c t i o n so f e u s t o m a ，c o m p a r ed i f f e r e n tm e d i a , t h eh o r m o n ec a t e g o r ya n dd e n s i t y , t h ee n v i r o n m e n t f a c t o r e t c e s t a b l i s h m e n to ft h es y s t e me u s t o m aq u i c k l yr e g e n e r a t et os t u d ym e t i c u l o u s l y a tt h es a m et i m et h i st h e s i ss t i l lm a k e su s eo ft h em o m e n to fg u sg e n eo fb - g l u c o s e t oe x p r e s st oh a r mt h eb u i l t u di n f l u e n c ef a c t o rt oc a r r yo nt h er e s e a r c hw i t hb l u es e v e r a l g r i c u l t u r e so fs p o tr o db a c t e r i ac o n v e r s i o ne u s t o m ap l a n to fs t a b l ee x p r e s s i o nm o r e a f t e ra n a l y s i sb u i l d su pi t sb e t t e rc o n v e r s i o nc o n d i t i o n a 硎c u l t u r er o db a c t e r i ac o n v e r s i o ne u s t o m at l l a tp a s s e st h ea n t i d r yg e n ea n dt h ea n t i s a l t a l k a l ig e n e sh a r m st h eo r g a n i z a t i o nm o r e ，a n dd i f f e r e n f i a t i o nap l a n t p c re x a m i n a t i o np r o v e dt h a tt h eg e n eh a da l r e a d yi n t e g r a t e dt h ep l a n t r e s e a r c hr e s u l tw e r e f o l l o w i n gf e wa s p e c t s e s ： 0 1 h g c l 2a n d3 n a c l os o a kt h ep l a n t3m i n s ，5m i n s ，1 0m i n s ，1 5r a i n st op u to u tt h e 1 1 1 吉林农业大学硕士学位论文 草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 g e r mr e s u l tc o m p a r i n gt h ed e t e c t i o n ：7 0 a l c o h o l s o a k3 0s e sa n d0 1 h g c l 2s o a k10 m i n u t e sw a st h eb e s tw a y , t h ef r e ef r o mp o l l u t i o nr a t ea t t a i n s10 0 t h ed e a t hr a t ei s2 w h e nt h eb a s i cm e d i ai sm b ，i b a 2 0 m g l ，6 0 5m g s lo fb a ，g a 2 0 m g l ，t h ei n d u c e m e n t m t ei st a l l e s t a m o n gt h e m ，t h ei b ah a stt h ef u n c t i o no fi n c r e a s i n gt h en u m b e ro ft i l l e r i n g w i t h i nt h es c o p eo fs m a l l i nt h e2 0m “l d e n s i t y t h ed i f f e r e n th o r m o n e d i f f e r e n td e n s i t yc o m b i n a t i o no f6 一b a ，k t , n a a ，i b aei n f l u e n c e o fo r g a n i z et h eo c c u r r e n c et ot h ee s t o m a t h ed i f r c r e n tf r o mt h eh o r m o n eo ft h ed e n s i t y c o m b i n et h eb i gp a r ta n dc a nm a k et h eo u t s i d ep l a n tt l l eb o d vt ot a k eo f rt od i v i d e c r e a t i o n q u a l i t yo fd i f f e r e n tc a t e g o r yh a r n l st h eo r g a n i z a t i o nm o r e ，b u tw h e nb ad e n s i t yi s1 0m g s l ， h a l fo ft h ec a l l u sf o r m a t i o nt h ew a t e ri m m e r s e s 。t h eg l a s st u r nm o r es e r i o u s ，w h i l eb e i n gi t s d e n s i t yt or e d u c et ot h e0 5m g s lt h ep h e n o m e n o nc a n c e l l a t i o n i ni n d u c ep r o c e s s ，t h ed e n s i t y o f6 b as h o u l d 1 0m g s l d e n s i t yo fk t 2 0m g s l w h e nt h ed e n s i t yo fn a ai sa0 2 m g s l ，m o r ec a l l u so c c u r r e n c er e s u l tb e s t a sar e s u l td i s c o v e rt h a tu s et h em s ，t h ed e n s i t yo f2 ，4 一d sa r e0 5m g l s ，t h ed e n s i t yo f n a ai sz e r o m o r ec a l i n sw a sy e l l o w , t h eq u a l i t yi sm o r e1 0 0 s ea n ds o f t i n c r e a s eh e a v ym o s t q u i c k ，i 敬em sa st h eb a s i cm e d i a t h ep hv a l u ea d j u s t st o6 0 b e i n g6一b a sa n dk t sa l o n e w i t ht h e0 5m e , ld e n s i t yu s a g e ，i td i v i d e st h es e e d l i n go fn o r m a l ，l e a f - ss l i c ei st h i c kg r e e n a n df a t t yb i g ，b u tw h e nd e n s i t yo v e r1 0m g s l ，t h eg l a s so f t h ey o u n gs p r o u tt u r n e ds e v e r i t y w h e n 血ep hi sw o r t ht o6 3 t h el i g h ts h i n e so nt h es t r e n g t ha s3 0 0 0h z d e n s i t yo f z t ，n a ad i s t i n g u i s h e sf o rt h e0 5m la n d0 1m g l ，l e a ft h ed i s hb u dd i v i d e st h er a t e t a l l e s t ，l o n gc e r t a i n l yb e s t i nt h ep r o c e s so ft h ea g r i c u l t u r em db a c t e r i ai n v a d ed y et h ee u s t o m am o r eh a r mo r g a n i z e i n h e r i tc o n v e r t t 1 1 ed i s s i m i l a r i t yi n v a d e st od y et i m et ot h ec o n v e r s i o nt h ei n f l u e n c eo ft h e e 氆c i e n c yi sm o r eo b v i o u s d y i n gf r o mt h eg u s o f a sar e s u l ts e e b et oi n v a d et od y et i m ea s 5m i n u t e s 。c o n v e gt h ee f f i c i e n c yt a l l e s t ，b et oi n v a d et od y et i m eo v e rt h e7n f i n s ，m o r eh a r m t oo r g a n i z et h ep o l l u t i o ns e v e r i t y ，e v e nc a n tb e c o m et ol i v e g e r m1 i q u i dd e n s i t yt ob ew o r t ht o0 5f o rt h eo d 6 0 0 t h ea g r i c u l t u r er o db a c t e r i ai n f e c t i o n t h ee f f i c i e n c yt a l l e s t t h eg e r ml i q u i dd e n s i t yi s0 1 i n f e c tr e s u l tt od e s c e n do b v i o u s l y , b u t w h e nt h ed e n s i t yo dv a l u eo v e r0 5 ，h a r m i n gt oo r g a n i z et h ed e a t hr a t ee x a l t a t i o nm o r e i tw a sp r o v e db yp c r a n a l y s i st h a tt h et a r g e tg e n eh a db e e ni n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m e o f r e g e n e r a t e dp l a n t s r a t eo fp c rt r a n s f o r m a t i o nw a s4 9 k e yw o r d s ：e u s t o m ag r a n d i f l o r u m c a l l u s a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o nt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yg u s 独创性声明 本人声明所驻交的学位论文足小人n ：岢! j i l i 指导1 、进行的州 究工作及耿衔的研究成 果。，据我所知，除r 艾i t 特别t f j i 以标注和致谢的地力外，论文中不包禽其他人已绎发农 或撰写过的研究成果，世不包岔为获搿j i i 林农业大学或其他教育机构的学位证。m m 使川 过的材利。与我吲一作的同志对本驯究所做的任何黄献均已花论文中作了f 刿确的说f p i 井表不谢意。 学位论文作者签名：圣坼k 1 ：砭 签字日期： 一一多年占月上牛c 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全r 解吉林农、大学何关保留、使剧学位论文的枷定，即吉林农、i t 大学自权 保尉并向国家有关部门或机构送交沦文的受印件和磁盘，允许论文被奁恻和借阅。本人授权吉林农 业大学可以将学位论文的全部或部分f q 容编入有关数据库进行检索，可以采用影【= ；、缩印或扫揣等 复制手段保存、札编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适刚奄授权书、 学位论文作者签名：矗打虹所艮 签字h 期 锄暾：穆弥 2 口口亨年月叫日 签字曰期：删年月 - t 学位论文作者毕业后去 可 工t ：单位： 通讯地址： 电话 邮编 吉林农业大学硕士学位论文草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 前言 l 、花卉产业的现状及发展趋势 花卉业被列为2 1 世纪最有发展前途的l o 大行业第2 位，是世界各国农业巾唯一不受农产品 配额限制的产业，被誉为“朝阳产业”。近1 0 多年来，世界花卉业以年平均2 5 的速度增长， 远远超过世界经济发展的平均速度，是世界上最具有活力的产业之一。 2 0 世纪5 0 年代初，世界花卉的贸易额不足3 0 亿美元，1 9 8 5 年发展为1 5 0 亿美元，1 9 9 0 年 为3 0 5 亿美元，1 9 9 2 年上升到1 0 0 0 亿美元，此后，以每年1 0 的速度递增，到2 0 世纪末，世界 花卉消费总额已近2 0 0 0 亿美元。目前国际花卉业的现状可以概括为：各国花卉生产有起有落， 生产格局出现新的调整。据不完全统计，全世界花卉栽培面积已达2 2 3 万公顷。其中亚太地 区花卉栽培面积最大，达1 3 4 万公顷；其次是欧洲，栽培面积达4 5 万公顷；美洲地区的栽培 有4 万公顷。花卉栽培面积比较大的l o 个国家依次是：中国、印度、只本、美国、荷兰、意 大利、泰国、英国、德国和墨西哥。 由于各地区花卉科研、生产、流通和消费水平不同，花卉业发展水平差别很大，发达国 家仍占有绝对优势地位。据不完全统计，1 9 9 4 年的鲜切花、切叶及盆花的世界贸易总额达4 2 3 亿美元。其中欧洲地区出口量最大，占世界贸易总量的6 7 ，美洲地区占1 9 ，亚太地区占 5 。花卉出口创汇额比较高的十个国家依次是：荷兰、哥伦比亚、丹麦、以色列、意大利、 哥斯达黎加、比利时、美国、泰国和肯尼亚。 花卉的消费与经济发展程度有着直接的关系，在经济比较发达的三个地区：欧共体、美 国、日本形成了三个花卉消费中心。这三个花卉消费中心进口的花卉占世界花卉贸易的9 9 ， 其中欧共体占主导地位，达8 0 ，美国占1 3 ，日本占6 。世界的花卉生产和花卉消费已形 成区域化布局。自然资源丰富、劳动力便宜、交通运输方便的国家和地区逐渐成为生产区域。 经济发达、有着良好花卉消费习惯的国家和地区逐渐成为消费区域。目前，荷兰的花卉9 3 出口到欧共体国家，哥伦比亚的花卉7 5 出口到美国，泰国生产的笳栽热带兰花则有7 8 销 往f i _ 1 本。 近年来伴随着世界花卉自由贸易的发展，世界花卉业的发展又有了明显的变化。其发展 趋势主要有以下五个方面： 第一，花卉生产由高成本的发达国家向低成本的不发达国家转移； 第二，随着国际贸易日趋自由化，花卉贸易将真正实现国际化、自出化； 第三，世界花卉生产和经营企业由独立经营向合作经营发展； 第四，国际花卉生产布局基本形成，世界各国纷纷走上特色道路，力争赢得更大的市场 份额： 吉林农业大学硕士学位论文草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 第五，亚洲市场潜力巨大，中国花卉消费市场成为商家必争之地。 1 1 国外花卉科研进展概况 ( 1 ) 育种成果显著，品种不断更新 随着现代花卉及园艺科技的发展，世界每年推出数以千计的花卉优良品种，种类繁多， 花色丰富，花形美观，抗逆性强，使世界花卉五彩缤纷、生机勃勃。如荷兰每年培育出数再 个室内观叶植物和球根花卉新品种。法国的梅昂月季中心，每年人工授粉l o 万朵花，培育出 的月季新品种几乎占世界的l 3 。 ( 2 ) 花卉基因工程发展较快，生物技术应用广泛 在抗病毒植物基因工程方面，特别是对无性繁殖的花卉仙客来、康乃馨、郁金香、白合 等研究明确了病毒的种类、症状，病毒的分离、检测等手段完备，配套脱毒技术先进；在花 色育种方面，美国科学家将从矮牵牛中分离获得的蓝色基因导入玫瑰，获得了世界上独一无 二的“蓝玫瑰”：日本通过基因工程培育出一种微型的土耳其风铃草，流行于花卉市场。他t 1 还利用生物技术大量繁殖蝴蝶兰，用一节带花芽的茎培育出2 3 万株兰花苗，获得了显著的 经济效益。 ( 3 ) 栽培设施技术先进，花卉产量高质量优 花卉生产强国荷兰是世界上拥有现代化温室最多的国家，温室都根据各种花卉所需温、 光、水、气、肥等要素装置设施，由电脑操作管理，达到了管理的高度自动化和现代化，植 株生长一致、健壮，产量高质量好，极大地提高了花卉商品竞争力。 1 2 国内花卉产业发展现状及趋势 自2 0 世纪8 0 年代初以来，中国的花卉业经历了前所未有的快速发展，栽培面积稳步增长。 1 9 9 2 年全国花卉总产值为1 2 亿元，1 9 9 4 翻了一番，达至1 j 3 8 亿人民币，花卉的出r j 创汇为2 0 0 0 万美元；1 9 9 6 年达到4 8 亿人民币，创汇1 3 亿美元；1 9 9 9 年花卉种植面积达9 1 万公顷，产值 1 1 5 亿元人民币，出口创汇1 亿美元。进入2 0 世纪9 0 年代以后，我国鲜切花消费和生产形成三 大消费区和三大生产区。鲜切花三大消费区是以北京为主的华北地区、以上海为主的华东地 区和以广州为主的华南地区，约占全国的8 0 。鲜切花三大生产区是云南、广东和上海，约 占全国的8 0 。n 2 0 世纪9 0 年代末期，由于花卉产销之间的结构性矛盾和季节性矛盾日益突 出，我国花卉业的发展逐步进入到一个稳步调整阶段，其特征是行业发展逐步实现了以下转 变： 第一，由数量增长型向质量效益型方向转变。我国花卉业的发展经历了从无到有、从少 到多，花卉市场从“皇帝女儿不愁嫁”的“卖方市场”到花卉企业到处寻找买主推销产品的“买方 市场”以后，目前行业竞争日趋激烈，产品质量的好坏在一定程度上决定着企业的生存和发 展。 吉林农业大学硕士学位论文草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 第二，由“小而全”的生产方式逐步向规模化、专业化方向转变。随着花卉业的不断发展， 花卉生产方式由过去的“小而全”逐步向规模化、专业化方向发展。 第三，由传统落后的经营方式逐步向现代化的流通方式转变。最近几年，网上交易、拍 卖、鲜花速递等现代化的花卉交易方式已经开始逐步进入花卉流通领域。 中国花卉业虽然起步较晚，但发展迅速，在新的历史时期已呈现出旺盛的发展势头， 并逐渐成为发展中国农村经济新的增长点，成为许多地区调整产业结构、振兴地方经济的支 柱产业之一。尽管目前中国花卉的生产和消费水平与发达国家相比尚存在着较大差距，但更 应该看到中国发展花卉业具有许多独特优势和条件，发展花卉业的前景无限，只要找出制约 发展的原因，并采取相应发展措旌，积极应对国际市场、国内市场的竞争、挑战，中国将最 终发展成为世界花卉生产大国、消费大国和出口大国。 2 草原龙胆的生物学特性及研究进展 草原龙胆( e u s t o m ag r a n d i f l o r u m ) 属龙胆科( g e n t i a n a c e a e ) 观赏植物，原产于北美洲。 花型美丽，花色丰富，茎杆叶片光洁动人，目前年销售量达一亿支，列切花排名第七位。草 原龙胆是目前切花生产上升速度最快，种苗的市场需求量极大的种类。但草原龙胆种子细小， 价格较贵，从发芽到正常生长有3 4 个月的停滞期，这段时期内又有大量幼苗死亡，导致育 苗困难。利用组织培养进行快速繁殖不但可以节省大量的资金，使草原龙胆的生长、发育避 免受到外界环境的影响，也可以把历代种子苗中花色、花瓣轮数受市场欢迎的品种保留下来， 并根据市场需求大批量生产，大大缩短了育苗周期，可以做到不受季节限制全年供茁，具有 重要意义。同时，将抗旱基因转入草原龙胆中，使喜湿润不耐干旱的草原龙胆具有更强的抗 逆性，对提高其逆境中的成活率有较大的意义。 草原龙胆又名洋桔梗，、二年生宿根草本花卉，茎直立，叶对生，灰绿色，卵圆至长 椭圆形，花冠钟状，花色有淡紫、粉红、深蓝、浅蓝、白色等，目i j i 已选育出重瓣和双色品 种。常见矮生品种有美人鱼( m e r m a i d ) 系列，株高1 5 2 0 c m ，花单瓣，花径6 - 8 c m ，花色 有粉红、紫、米色等，从播种到开花需1 2 0 天。蓝利萨( l i s a b l u e ) ，株高1 5 2 0 c m ，早生种， 花单瓣，深兰色，分株性强。红镜子( r e d e l a s s ) ，株高3 0 - 3 5 c m ，分株性好，花深红色，是 草原龙胆红花之最。重瓣伊格尔( d o u b l ee a g l e ) ，株高4 5 6 0 c m ，花茎7 c m ，花色多样。海 地( h e i d i ) 系列，株高5 0 6 0 c m ，早花种，花径8 c m ，花色有深蓝、粉、玫瑰红、黄、白、 蓝和双色等。埃克奥( e c h o ) ，株高5 5 c m ，花重瓣，花径8 9 c m ，花有蓝、粉白、双色等。 玛丽艾基( m a r i a e h i ) 株高5 0 8 0 c m ( 随季节变化) ，花径7 8 c m ，花色多样。 草原龙胆原产于美国内布拉斯加洲和得克萨斯州，喜温暖、湿润和阳光充足。生长适宜 温度为1 5 2 8 ，生长期夜间温度不低于1 2 。冬季温度在5 以下，叶丛成莲座状，不能 开花。也能短耐o 低温，生长期温度超过3 0 。c ，花期明显缩短。喜湿润环境，但过量的水 吉林农业大学硕士学位论文草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 分对根部生长不利，易受病害侵入。草原龙胆对光照反应比较敏感，长i i l 照对其生长及发育 均十分有益，有助于茎叶生长和花芽形成，一般以每天1 6 h 光照效果最好。草原龙脖需要肥 沃疏松的土壤，忌连作，盆栽用土需消毒，p h 以6 5 - 7 0 为宜。目前常用播种繁殖，以9 1 0 月或卜2 月室内盆播为宣种子细小，每克种子在2 2 0 0 0 2 2 5 0 0 粒，发芽率3 0 4 0 ，幼苗生长 很慢，成活率低，从播种到成花需1 5 0 1 8 0 天 荷兰的克萨克扎登( k s a h i n z a d e n ) 公司和基沃特布洛迈扎登( k i e f t b l o e m z a d e n ) 公司 为草原龙胆的育种和推广做了大量的工作，在欧洲各国的花店和家庭的窗台上到处可见。在 日本，世界著名的花卉种子公司坂田公司在草原龙胆育种方面取得了卓越的成就。1 9 8 2 年 推出重瓣的回音系列和单瓣的海地系列以后。草原龙胆的市场销售量剧增，至今日本仍是培 育草原龙胆新品种的大本营。除上述公司以外，英国的汤扑森摩根公司和以色列的海施蒂 尔( h i s h t i l ) 公司都在培育矮生的草原龙胆品神，使草原龙胆的发展前景更广阔。由于草 原龙胆的花型别致，花色清新妖媚，颇具现代感，能配合逐渐洋化的起居环境而大受人们喜 爱，其销售需求在日本、欧洲、美国和我国台湾等地急速上升，而我国内地还处于引种阶段， 没有形成规模。 在过去的十年里，草原龙胆的产量超过以往的十倍以上，这一新型花卉的崛起和近几年 来园艺技术的发展及其深入细致的研究是分不开的。基因技术的发展，使得草原龙胆在品种 不断改良下得到人们的关注和喜爱。在8 0 年代末和9 0 年代初期，国外科学家对草原龙胆的 茎作为外植体进行快繁研究。f u k a i s 等人在1 9 9 1 年对草原龙胆根部作为外植体进行了再 生研究。1 9 8 7 年s e m e u i k 等对茎段作为外植体进行了快繁研究。1 9 8 8 年，f u r u k a w a 等进行 了对叶作为外植体的快繁研究。同时，日本也以其敏锐的商业眼光看到了草原龙胆在未来几 十年迅速崛起的迹象，加大科研力度，先后培育了多个草原龙胆品种，坂田公司t 9 8 2 年推 出重瓣的回音系列( e c h o ) 和单瓣的海地系列( h e i d i ) 以后，草原龙胆一举成为世界切花 新秀，大有代替香石竹之势。 我国由于花卉产业的相对滞后，人们对花卉的喜爱又逐渐升温，一个沉睡着的市场正慢 馒苏醒，使得花卉育种及科研人员必须加快脚步适应市场。草原龙胆作为花卉的新生力量在 我国的研究并不广，研究程度也在相对较低的水平，我国科学家及华、温春秀等在1 9 9 6 年 对草原龙胆的茎段快繁做了研究；扬霞、徐康等1 9 9 7 年用项芽、侧芽、无芽茎段做了快繁 研究并取得了成功，之后鲜有对草原龙胆快繁的报道，可见，草原龙胆在我国内地的研究正 处于起步阶段，系统全面的研究有待进行。同时草原龙胆的转基因研究主要集中在花色育种 方面，而对于抗旱及抗盐碱基因导入的研究，国内外还未见报道。 4 吉林农业大学硕士学位论文草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究 3 花卉基因工程育种研究进展 3 1 花色改良 花色是光线照射到花瓣上穿透色素层时部分被吸收，部分被海绵组织反射折回，再度 通过色素层而进入我们眼帘所产生的色彩因此它与花瓣细胞中的色素种类，色素含量，花 瓣内部表面构造引起的物理性状等多种因素有关，同时花的成色作用还受以下因素的影 响：细胞内p h 值( 郑志亮，1 9 9 6 ；$ j 辉龙和范明任，1 9 9 8 ) ；分子堆积作用( m o l e c u l a rs t a c k i n g ) ； 螫合作用和花瓣表皮细胞的形状但花色素起主要作用花色素主要分为3 类：类黄酮素， 类胡萝b 素和甜菜素，其中最主要的色素是类黄酮素不同的花色素苷使花的颜色产生从 红色到紫色的变化 3 】 用基因工程的方法对花色素合成途径中的酶进行操作，即可达到改变花色的目的目 前已经明确了催化花色素生物合成关键步骤的酶及其控制基因( t a n a k ae ta l ，1 9 9 8 ) 其中 类黄酮生物合成的主要酶及基因包括苯基苯乙烯酮( 又称查尔酮) 合酶( c h a l c o n e s y n t h a s e ，c h s ) ，黄烷酮- 3 一羟化酶( f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e ，f 3 h ) ，类黄酮- 37 ，57 一羟化酶 ( f l a v o n o i d 37 ，57 - h y d r o x y l a s e ，f 3 5 7 h ) ，二氢黄酮醇还原酶( d i h y d r o f l a v o n o l 4 - r e d u c t a s e ，d f r ) 其中类黄酮3 ，57 羟化酶是合成蓝色的花翠素3 葡萄糖苷的关键酶 二氢黄酮醇还原酶是催化d i - 1 k ，d h q ( - - - - 氢栎皮黄酮) d h m ( 二氢杨梅黄酮) 分别形成花葵 素、花青素、花翠素的关键酶无色花色素在花色素合酶( a n t h o c y a n i d i ns y n t h a s e a n s ) 的 作用下产生有色花色素；类胡萝h 素生物合成的主要酶及基因包括g g p s 、p s y 、p s