（植物学专业论文）中华蚊母愈伤组织的诱导和显微观察.pdf

硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 中华蚊母属于国家二级濒危珍稀植物，常绿灌木，是一种具有很高观赏价值的 盆景，主要分布在长江流域。由于近些年对中华蚊母毫无节制的滥采滥挖，还有三 峡工程大江截流，使之数量大量减少。目前并没有人对中华蚊母进行愈伤诱导，本 文主要采用叶片进行愈伤组织的诱导。愈伤组织生长的最适温度是2 0 2 4 0 c 。一般在 接种9 天后，就会有愈伤组织的出现。在不添加任何激素的m s 培养基上没有诱导出 愈伤组织。发现单一激素诱导效果比较好的是1 2 m s + 6 b a 0 5 m g 1 ， 1 2 m s + 2 ，4 d o 0 1 。组合激素的诱导效果大部分都好于单一激素的作用，尤其以 1 2 m s + 6 - b a 0 5 + n a a 0 5 ，1 2 m s + 6 一b a o 5 + 2 ，4 - d o 4 ， 1 2 m s + n a a 0 1 + t d z 0 2 ， 1 2 m s + 2 ，4 d o 2 5 + k t 0 0 5 效果比较好，诱导率也很高，大多数可以达到1 0 0 。愈伤 组织生长状况良好，大部分为绿色，紧凑，旺盛，但是一般在生长三天后会分泌次 生代谢物，所以在接种的时候，预先用p v p 进行处理。生长三周后愈伤组织会褐化， 愈伤组织的寿命都不是很长，很容易死亡。这些应该是影响中华蚊母愈伤组织不能 分化的一些原因。 取中华蚊母的叶片，9 天，1 1 天，1 6 天，1 7 天，1 8 天，2 0 天，2 4 天，2 6 天，2 8 天，3 0 天生长的愈伤组织和完全愈伤组织，用f a a 固定。采用石蜡切片法，在显微 照相机下拍照，通过比较，发现是叶片中的栅栏组织和海绵组织诱导出愈伤组织， 大部分是海绵组织。但是并没有发现维管束参与愈伤组织的形成。 关键词：中华蚊母；激素；诱导率；栅栏组织；海绵组织 a b s t r a e t d i s t ) r l i u mc h i n e n s ed i e l sb e l o n g i n gt oc o u n t r yo ft h es e c o n dr a r ea n de n d a n g e r e d p l a n t s ，e v e r g r e e ns h r u b ，i sav e r yh i g ho r n a m e n t a lv a l u eo fb o n s a i ，m a i n l yi nt h ey a n g t z e r i v e rb a s i n i nr e c e n ty e a r sb e c a u s eo ft h ep e r s o ni sd i g g i n gd i s t y l i u mc h i n e n s ed i e l s 、历t hu n b r i d l e da n di n d i s c r e t i o n a r y , a n da l s or i v e rc l o s u r eo ft h et h r e eg o r g e sp r o j e c t , t h eb o t hr g a s o n sr e d u c et h ed i s t y l i u mc h i n e n s ed i e l sq u a n t i t y a tp r e s e n t , t h e r ew a sn o d i s t y l i u mc h i n e n s ed i e l st oc a l l u si n d u c t i o n , t h ep a p e rm a i n l yu s e st h el e a ft oc a l l u s i n d u c t i o n c a l l u sg r o w t ho ft h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s2 0 - 2 4 0 c g e n e r a l l y9d a y sa f t e r i n o c u l a t i o n , t h e mw i l lb et h ee m e r g e n c eo fc a l l u s a d dn o n eh o r m o n e si nt h em s m e d i u md i dn o ti n d u c ec a l l u s f o u n d i n gt h a tas i n g l eh o r m o n e i n d u c e de f f e c t sa r e r e l a t i v e l y b e t t e ro nl 2 m s + 6 - b a 0 5 m g a ，1 2 m s + 2 ，4 - d o 01 c o m b i n a t i o n o f h o r m o n e i n d u c e de f f e c t sa leb e t t e rt h a nm o s to ft h er o l eo fas i n g l eh o r m o n e , i n p a r t i c u l a r , t 0 1 2 m s + 6 一b a 0 5 + n a a 0 5 ，1 2 m s + 6 一b a 0 5 + 2 ，4 一d o 4 1 2 m s + n a a 0 1 + t d z 0 2 1 2 m s + 2 ，4 一d o 2 5 + k t 0 0 5e f f e c ti sb e t t e r , t h ei n d u c t i o nr a t e i sa l s ol l i g kt h e m a j o r i t yc a l lr e a c h10 0 c a l l u sg r o w t hi ng o o dc o n d i t i o n , m o s t l yg r e e n , c o m p a c t , v i g o r o u s ，b u tg e n e r a l l yt h r e ed a y sl a t e ra tt h eg r o w t hs e c r e t es e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，s oa t at i m ew h e ni sv a c c i n a t e d , ，p r e - p r o c e s s e du s i n gp v eg r o w t ha f t e rt h r e ew e e k sc a l l u s w i l lb eb r o w n i n g ，c a l l u sl i f ee x p e c t a n c yi sn o tv e r yl o n g ，i ti se a s yt od i e t h e s es h o u l d b et h er e a s o no ft h ed i s t y l i u mc h i n e m ed i e l sc a l l u st h a tc a n n o tb ed i f f e r e m i a t i o n t a k i n gd i s t ：) | 7 l i u mc h i n e n s ed i e l sl e a v e s ，9d a y s ，1 1d a y s ，1 6d a y s ，17d a y s ，18d a y s ， 2 0d a y s ，2 4d a y s ，2 6d a y s ，2 8d a y s ，3 0d a y so fc a l l u sg r o w t ha n dc a l l u sc o m p l e t e l y , w i t h f a af e d u s i n gp a r a f f i ns e c t i o nm e t h o d ，m i c r o c a m e r aa tt h ep h o t o ，b yc o m p a r i s o n , a r ef o u n di nl e a fp a l i s a d et i s s u ea n ds p o n g yt i s s u ei n d u c e dc a l l u s ，t h em a j o r i t ya r e s p o n g yt i s s u e b u tn o n eo f t h e mw e r ef o u n dt op a r t i c i p a t ei nv a s c u l a rf o r m a t i o no fc a l l u s k e y w o r d s ：d i s t y l i u mc h i n e n s ed i e l s ；h o r m o n e ；c a l l u si n d u c t i o nr a t e ；p a l i s a d e t i s s u e ；s p o n g yt i s s u e 硕士学位论文 m a s t e r 。st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相关权益。回童途塞握变压进卮! 旦坐生；旦二生；旦三生筮查l 导师蓉名：弱彳邳 日期四年乡月灿 ，l私“：n7 垒节一 签 一 师期 一 导日 一 双日 一、夏月一 抄 次仔年 一 缸衙吖 签 ： 样辄 一 作日 叉 菇日 、复月 巷“ 危卵 签 ：者期 作日 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 第一章综述 1 中华蚊母介绍和研究进展 1 1 中华蚊母介绍 中华蚊母( d i s t y l i u mc h i n e n s ef ，丹j ，d i e l s ) ) 是金缕梅科( h a m a m e l i d a c e a e ) 蚊 母属( d i s t y l u m ) 的常绿灌木，中华蚊母因其叶小枝密、自然树形优美而成为培植树 桩山水盆景方面的珍稀植物。中华蚊母在我国集中分布在三大区域：长江三峡、武 隆县芙蓉江和乌江流域。如今，生长在长江三峡的中华蚊母已因库区蓄水不存在了， 武隆县芙蓉江的蚊母也被淹没，乌江流域成了仅存的中华蚊母集中生长。其典型特 征如下：1 、生长在土少的乱石丛中或石壁段缝里，每年夏秋季河水上涨，蚊母被 淹没长达4 到5 个月之久，冬春露出水面，被誉为“两栖植物 生命力极强。2 、叶 片小，开红花，结籽，成熟后自然炸开，随波逐流，遇阻于石缝，水退，便落地生 根，故多见于生长在乱石夹缝中。叶片为蚊虫的寄生体，在叶面中间像绿豆一样突 起，幼虫极小，成熟后飞出，叶面中间便形成了空洞，但对整株植物的健康生长并 无丝毫影响，所以被称为“蚊母刀。三峡人俗称这种飞出来的小蚊虫为“默蚊子 。 是因为蚊子太小，太不引人注意了。夏季人们乘凉时，裸露部位如面部，手，脚等 处。常常被其无声地吸咬，本能的拍打后，只见手掌上布面小黑点儿。其形虽小， 毒性却很大，且瞬间产生剧痛，随之便出现红肿颗粒，人们无不深恶痛绝。3 、为 上等的盆景材料。三峡历来闭塞，贫穷，附近山民常常在岸边砍伐，晒干后打捆扛 回家，做煮饭用的烧火柴，俗称“水柴柯子 。被砍伐后的庄头，自然道劲苍古。 又因其四季常青，叶片小，病虫害少，且耐低温高热，又耐寒耐涝，易塑造，故成 型快，经济价值高口1 。可惜，随着库区水位升高，长江沿线的蚊母已永沉江底了， 唯有小三峡还有少许的蚊母在笑迎四方游客。1 9 8 1 年，湖北长阳高家堰镇有一位叫 夏少烈的农民看好中华蚊母那盘根错节的根蔸，苍老古拙的茎干，茂密重叠的枝叶 和天然片形的叶幕，即用以制作盆景，根艺，把它销售给宜昌，荆州，武汉等地的 盆景爱好者，一时不仅收入颇丰，夏少烈本人也受到中国农民日报和中央电视 台褒奖。自此以后，宜昌，荆州，武汉等地一些盆景，根艺爱好者争相到长阳高家 堰镇采购中华蚊母桩胚，继而，高家堰的农民却把出售中华蚊母当作致富发家的主 要门路，从而使高家堰镇的盆景根艺制作专业户如雨后春笋般的涌现出来。目前已 有3 5 0 余户成为闻名全国的盆景制作专业户。据不完全统计，高家堰镇每年行销到 全国各地的包括香港，澳门，台湾的中华蚊母桩胚( 包括半成品) 在四万件以上。 硕士擘位论文 m a s t e r st h e s i s 截至笔者完成本文时，高家堰镇现有桩胚( 包括半成品) 5 0 万盆，内中华蚊母就占 r 口1 7 5 4 瞄。 由于众多农户对中华蚊母无节制的采挖，丹水两岸的中华蚊母已濒临绝种。若 不对这种过度采挖行为加以限制，则珍稀的中华蚊母品种必将在中国大地消失。 中华蚊母是如此珍稀，令人感到遗憾的是在一些著录植物品种的专著中竟然找 不到它的条目! 笔者认为，中华蚊母是一种观赏价值极高的珍稀植物，它与杨梅蚊 母树，蚊母树，小叶蚊母( 树) ，齿叶屏边蚊母等大不相同，人们应当充分重视它， 珍惜它。 有人说，有蚊母的地方就是历年涨水的位置，因此称它为“绿色水位线”。也 有人说，蚊母是消落带的守护神，能将水利工程对生态环境的影响降至最小。“所 谓消落带，就是库区蓄水水位与防洪水位之间的落差区域。 向秀发解释，若不妥 善治理消落带，轻则垃圾、杂草、泥沙随水流走，影响旅游区景观；重则污染伴着 垃圾、杂草在高温下产生异臭，滋生病菌、蚊蝇，甚至成为第二年水污染源或造成 地质灾害。 中国科学院植物研究所客座教授刘正宇介绍：“中华蚊母是典型的消落带植 物，它水性很好，涨水时，即使被水没顶，也能在水下休眠数十天；水退后，它便 重新苏醒，尽情享受大水带来的充足养分。 据了解，中华蚊母作为生长在消落带 的灌木植物，它的根系较其他植物更发达，便更能抓牢土壤，且它更容易形成群落。 “虽然中华蚊母天性喜水，而且在一段时间内有在水中生存的能力，但若长时间 被水浸泡，蚊母终将无法生存。 向秀发介绍，乌江彭水电站终期蓄水即将进行， 如不抓紧抢救，一旦电站蓄水完成，库区内所有的中华蚊母将被2 9 3 米的水位高度 全部淹没。该物种在我国将再无集中生长带，濒临灭绝。 因三峡工程大江截流使中华蚊母这一宝贵的资源受到严重损失，。近年来，江 南一带对中华蚊母的价位及观赏性的认可，大量中华蚊母盆景流入江苏一带的盆景 批发市场，沭阳县周圈盆景长廊拥有量最大，已超过原产地的数量采挖的人越来 越多，须然采取措施，加以保护。应提倡人工培植，实践证明，是行之有效的。 最近，巫山林业科技人员对4 0 0 0 余株库区特有植物“中华蚊母 无性扦插苗 进行了调查：新根形成良好，平均长度达5 厘米以上，长势良好，上部新叶开始萌 发，成活率达8 5 ，这标志着“中华蚊母”无性系繁殖取得成功。中华蚊母人工无 性繁殖的成功，填补了库区特有植物“中华蚊母 无性繁殖的空白，对维护生物多 样性、彻底解决库区消落带绿化等方面具有十分重要的意义。 库区特有植物是在库区特殊生态系统条件下形成的特殊群落，其主要特点是生 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 长在库区消落带内，耐河水冲刷、浸泡，数量极少，随着三峡库区水位的上涨处于 濒危灭绝状态。为了维护库区生物多样性、进一步开发利用、解决消落带绿化的问 题，巫山县林业局于2 0 0 3 年二期水位淹没前，抢救搬迁中华蚊母1 6 万株、疏花 水柏枝2 万余株，建立了占地5 0 亩的三峡库区最大的中华蚊母和疏花水柏枝保护 基地，即渝东珍稀植物园。同时成立了“中华蚊母、疏花水柏枝无性繁殖及造林技 术研究课题小组 ，由林业主要负责人任组长，分管负责人任副组长，造林科、保 护科等科室主要负责人和技术骨干为成员，主要任务是开展无性繁殖技术研究，重 点对插条处理、苗圃基质、扦插时间、枝条部位进行对比试验，探索最佳繁殖方式， 为进一步开发利用积累经验。 目前，巫山县林业局正加大投入力度，积极引进资金、技术、人力，加快珍稀 植物保护、繁育、利用力度。计划在2 0 0 5 年人工繁殖中华蚊母2 万株，疏花水柏 枝1 5 万株，进行消落带绿化造林的试验，努力解决库区消落带绿化难的问题。 1 2 目前取得的研究成果 西南大学学报上发表的论文三峡库区抢救植物中华蚊母种子特性研究( 杨 丽，邓洪平等) 。文中讲述中华蚊母主要分布在长江三峡的两岸海拔1 5 0 m 以下消落 带的陡峭山坡上和石壁中，三峡水库建成后，库区将重新形成新的消涨带【3 4 1 ，中华 蚊母群落原来的生长环境将会全部被淹没，这必然导致中华蚊母原来种群的消失。 目前国内对中华蚊母的研究主要集中在这个几个方面：群落伴生维管植物【5 】，扦插繁 殖【6 】，群落土壤种子库7 一，水淹对中华蚊母根系、膜脂膜过氧化作用1 9 1 0 1 以及生理 生化特性的影响【】等等。这篇文章主要对中华蚊母种子的特性进行了研究，研究的 目的是为保护该物种种质资源、扩大种群数量、保护生物多样性等方面提供一些理 论上的依据。该论文得出的结论是：中华蚊母种子千粒的质量为2 3 0 3 3 9 ，平均长宽分 别为0 4 8 3 和0 2 3 6 e m ：种子含水率为9 9 0 9 7 ：种子吸水性和种皮通透性比较好：种子 最佳浸种时间为1 6 h - 2 0 h ，可以达到大于8 6 的活力百分数：p h = l1 和光照强度为 4 3 1 6 0 1 t m o l ( s m 2 ) ，浸种温度4 0 、培养温度为2 0 c t l 2 1 ，为最佳萌发条件。 四川林业科技上发表的论文淹水胁迫对中华蚊母生理生化特性的影响( 彭 秀，肖千文等) 。文中介绍中华蚊母是三峡库区特有的植物，主要分布在长江三峡海 拔2 0 0 m 以下( 这与杨丽，邓洪平等发表的论文有些出入) 江河沿岸( 集中在巫山境 内三峡和小三峡两岸) 的洪水线内，根系很发达能耐河水冲刷和浸泡，随着三峡库区 水位的上涨已处于濒危灭绝状态。目前，国内已有一些有关淹水胁迫对林木影响方 面的研究报道，但淹水胁迫对中华蚊母生理生化特性的影响这方面的文章还未见有 报道。本文主要研究在淹水胁迫下中华蚊母扦插苗叶片的超氧化物歧化酶( s o d ) 活 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 性、丙二醛含量( m d a ) 、相对电导率、可溶性糖含量和根系活力等的变化进行了研 究，希望能为中华蚊母的保护、利用和三峡库区消落带植被恢复及重建提供一些理 论依据。淹水胁迫的实质是无氧呼吸，无氧呼吸会使植物在根系积累大量的乙醇、 乙醛等有毒物质，使根系细胞膜脂过氧化作用加剧，超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化 氢酶( c a t ) 等保护酶系的活力下降，从而造成根系活力降低。因此，在淹水胁迫条件 下，维持较高的根系活力是树木抗淹能力强的一种标志，该论文得出的实验结果是， 中华蚊母根系活力随淹水胁迫时间的延长而降低，其根系活力在淹水胁迫1 8 d 后才 产生明显的变化，这可能说明中华蚊母能耐较长时间的水淹。 2 植物组织培养的研究进展 植物组织培养是在2 0 世纪初，以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术， 它是指利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原生质体等进行离体培养，使 其发育成完整的植株。它主要包括器官、茎尖分生组织、愈伤组织、细胞和原生质 体培养等，其中以愈伤组织培养最为常见，因为除茎尖分生组织培养和少数器官培 养外，其他类型的组织培养都要经历愈伤组织这一阶段才能产生再生植株。这一原 理主要是利用了植物细胞的全能性，也就是一个完整的植物细胞拥有形成一个完整 植株的所必需的全部遗传信息。根据这一特性，在植物的成熟细胞经历了脱分化后， 形成愈伤组织，再由愈伤组织形成完整的植株，这个过程叫做再分化【1 3 1 。这项技术已 在科研和生产上得到广泛应用，该技术具有加速育种、缩短繁殖过程，改良植物品 质，节省空间，减少劳动试验生产，不受自然条件限制等特点，且组培苗的体积小，便 于携带和资源交流。在推动农业现代化方面已有了巨大的经济，社会和生态效益，是 一项很有潜力的高新技术【1 4 1 。 2 1 植物组织培养技术的发展历程及现状 1 9 0 2 年，德国著名的植物学家h a n b e r l a n d t 根据细胞理论预言了细胞的全能性， 他认为每个细胞可以像胚胎细胞那样，会经过体细胞发育成一棵完整的植株，但由 于受当时的技术条件的局限，这种培养并没有在实验上获得成功，然而他所提出的 科学推断却吸引了许多科学家去进行探索。随后1 9 0 4 年，e h a r m i n g 培养了萝b 和辣 根属的一种植物的近成熟胚，这是由胚培养植物的第一篇论文：1 9 0 9 年，k u s t e r 将植 物的原生质体进行融合，但是融合产物并没有生存下来：1 9 0 8 年，s s i m o n 研究白杨的 嫩茎在组织培养中的发育过程，观察到有愈伤组织的出现和根、芽的分化：1 9 2 2 年 w k o t t 用加入复杂的有机物质并且经过稀释的k n o p 溶液培养豌豆和玉米的根尖，在 当时的条件下并没有发现细胞有形态发生的现象：l a i b a c h ( 1 9 2 5 ，1 9 2 9 ) 将由亚麻种 间杂交形成的幼胚在人工培养基上培养发育成成体，证明了在植物的远缘杂交中利 4 硕士学位论文 m a s l e r st h e s l s 用胚培养的可能性。1 9 3 3 年，我国科学家李继桐和沈同研究了银杏的胚培养并获得 了成功，采用的是在培养基加入了胚乳提取物：后来随着生长素的发现及其应用，人 们开始认识到b 族维生素对植物细胞生长的重要性，生长素开始被普遍采用：1 9 3 4 年，美国人w h i t e 由番茄根成功的建立了第一个无性生长系，使根的离体培养首次获 得了真正实际意义上的成功( 他采用的培养基含有无机盐、酵母提取液和蔗糖) ； 接着四年后，他又改进了以前的方法，用三种b 族维生素即吡多醇，硫胺素和烟酸取 代原来培养基中的酵母液，结果也获得了成功：与此同时法国的g a u t h e r e t ( 1 9 3 4 ) 在 培养山毛柳和黑杨等植物的形成层细胞时，发现在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的 k n o p 溶液中，这些形成层细胞可以连续增值几个月，但是在培养基中加入b 族维生素 和生长素i a a 后，山毛柳形成层组织的生长速度才会有显著的增加：g a u t h e r e t 和 w h i t e 发展的这些基本方法，奠定了植物组织培养的技术基础。随着植物组培技术的 提高，1 9 5 2 年m o r e l 和m a r t i n 首次诱导茎尖分生组织获得大丽花的无毒植株：1 9 5 5 年，m i l l e r 发现了激动素且它比腺嘌呤活性高3 万倍，他提出通过改变细胞分裂素和 生长素的比率能够调节植物的器官根和芽的形成：1 9 5 8 年，英国人s t e w a r d 和法国人 r e i n e r t 从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中培育出了完整的植株，这一实验对植物细 胞的全能性给予了科学的证实l l 别。 2 2 植物组织培养技术在实践生活中的应用 2 2 1 用于植物育种 这一技术已经被越来越广泛的用于扦插哪些很难生根的植物和引种材料少的 植物。除采用常规的器官像叶片等进行培养，也可以用花药进行植株育种，这种方 法较简单，对一些植物种来说易于诱导未成熟的花粉，可以进行大群体研究，而且 可以迅速而大量的产生单倍体，具有迅速获得纯合、选择效率高。排除杂种优势干 扰、突变体筛选、消除致死基因等优点，目前世界上已经有3 0 0 种植物成功得从花粉 中发育成植株。目前已在5 0 个科属用胚培养获得成功，它主要应用于胚的挽救、打 破种子休眠、克服珠心胚的干扰诱导胚状体及胚性愈伤组织、种子生活力快速检验 等方面，还可以用于克服远缘杂交中存在的自交不亲和性。体细胞杂交打破了物种 间的生殖隔离，获得了很多对人类有益的品种。目前，利用组织培养技术获得再生 植株的植物种类已经有1 3 0 科、近1 5 0 0 种【1 6 , 1 7 , 1 8 。 2 2 2 用于脱毒和离体快繁 获得脱毒和快速繁殖的植物材料是目前植物细胞组织培养应用最多最有效的 一个方面。世界上受病毒危害的植物有很多，园艺植物受病毒危害尤为严重，当植物 被病毒侵染后，就会出现生长迟缓、产量大幅度降低等危害。目前，脱毒和离体快 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 繁已经在马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、苹果、香蕉等多种作物上进行了大规模的应 用：离体培养的优点是时间短，材料来源单一，遗传背景一致，不受季节和地区的限 制，重复性好，故离体快速繁殖已经广泛应用于果树，中药材等的栽培。 2 2 3 在次生代谢产物生产中的应用 采用单细胞或细胞团在培养基上进行培养，这个方法在实验室里操作简单、重 复性好、群体大等，可以进行大规模培养，可以有效的生产各种天然化合物如生物 碱、蛋白质、糖类、药物、香料天然色素以及其他活性产物，已经成功的申请了专 利1 0 0 多项。例如可以将采用细胞培养生产出的蛋白质运用于饲料和食品方面，用 组织培养来人工合成药物或一些有效成分等研究正在不断深入，原生质体培养技术 现在已经扩展到包括夹竹桃科、五加科、龙胆科、葫芦科茄科、玄参科、伞形科、 天南星科和百合科，其中很多药用植物已经在进行大规模的工业化生产。 2 2 4 用于保存植物种质资源及其交换 长期以来人们想了很多方法来延长植物，果实，种子，块根、块茎、种球、鳞 茎的保存时间，曾经采用常温、低温、变温、低氧、充惰性气体等方法，这些方法 收到了一定程度的效果，但仍然存在许多问题。主要问题是代价高，占的空间大， 保存时间短，而且容易受周围环境条件的影响等等。植物组织培养结合超低温保存 技术，可以给植物的种质保存带来比较高的成功率。因为保存一个细胞所占的空间 仅为原来的几万分之一，而且在1 9 3 度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需 要年年更新或经常更新。世界环境的不断变化使许多种类的植物濒临灭绝，而且许 多种植物已经灭绝。如何挽救这些植物，还有许许多多动物的生命，已成为现在人 们很关注的一个问题。实践证明，采用组织培养的方法可以使一部分濒危的植物种 类的生命得到延续和保存，再结合超低温保存技术，就可以使这些植物得到几乎永 久性的保存。此外，用组织培养的方法保存大多数普通植物这些种质材料，也具有 十分重要的意义。一方面植物种质资源在不断的大量增加，另一方面一些珍贵濒危 的植物资源又日趋枯竭，造成保存耗资巨大，又导致有益基因不断丧失，利用组织培 养技术进行离体低温或冷冻保存，可大大节省人力，物力及土地，并可以挽救那些濒 危植物种、珍稀植物种。 2 2 5 采用花药和花粉培养获得单倍体植株、缩短育种年限 对花药和花粉进行组织培养可以获得单倍体植物，这大大缩短了育种时间，使 新品种的培育过程得到简化。 2 2 6 胚胎培养方面的应用 6 硕士学位论文 m 人s t e r s r h e s l s 在远亲杂交中，杂交后形成的胚珠在还没有发育成熟就停止生长，不能形成有 活力的种子，杂交不孕给远缘杂交带来了极大的困难。在1 9 2 5 年和1 9 2 9 年，l a i b a c h 采用胚培养技术培养出亚麻种间杂种胚，第一次成功的获得了杂种植物，这一结果 使远缘杂交不亲和成为了可能。这项技术到目前已经发展的相当成熟，可以说多数 植物的成熟或未成熟胚通过组织培养都可以获得成功。幼胚培养技术现在已经可以 使5 个细胞大小的极幼龄胚状结构发育成植株。但关于胚珠培养的研究不多，有关 单个胚珠培养尚存在许多问题，所以要进一步的进行研究。由于生理上和遗传上的 障碍使远缘杂交不能成功，可采用试管受精来克服这一问题，即在离体条件下培养 母本胚珠，使异种花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚再在试管中发育成完整植 株。用胚乳组织培养可获得三倍体植株，这为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途 径。三倍体加倍后可以得到六倍体，发育成多倍体品种。 2 2 7 细胞融合 通过原生质体的融合，可克服一些有性杂交不亲和性，获得体细胞杂种，从而 创造出新的优良品种。 2 2 8 培养细胞突变体的应用 培养细胞在不断分生状态中，很容易受培养条件和外加压力( 如射线、化学物 质) 的影响而产生诱变，可以从这些诱变的细胞中筛选出有用的突变体，再培育成 新品种。目前这种方法已经筛选出抗病、抗盐、高蛋白、高产等突变体，有些已经 成功的应用于生产【l 引。据有关专家预测，在未来1 0 年，市场对组培苗的需求量将以 7 , - - - , 8 的速度递增，这为植物组织培养快繁技术提供了广阔的市场。 2 2 9 在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用 组织培养技术已经成为植物科学研究中的常规方法，在此基础上，发展出一系 列的技术像遗传转化、突变体筛选、基因转移、d n a 直接导入技术已成为基因工程 的核心技术，组织培养也成为生物技术的重要组成部分。组织培养是生物工程的基 础和关键环节之一，并且它在农业生产中应用越来越广泛，发挥越来越重要的作用。 据有关专家预测，在未来1 0 年，市场对组培苗的需求量将以7 , - - 8 的速度递增，这为 植物组织培养快繁技术提供了广阔的市场【l 9 。 2 2 1 0 利用组织培养的材料作为植物生物反应器 中国的中草药是人类的宝贵财富，随着滥采滥挖，很多种类的中草药资源匮乏， 产量不足，濒于灭绝。如果能利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产这些中草 药，不再依赖于自然环境，不仅可以解决现有的困难，而且可以通过筛选高产有效 成分的细胞系，来提高其药用价值。例如用人工培养出的人参悬浮细胞，去生产人 7 硕士擘位论文 m 人s t e r st t t e s i s 参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用植物和组织细胞作为生物反应器，也可以 用于生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜来生产乙肝疫苗正 在实验进行中。 2 2 1 1 用于其它未知科学的研究 现代科学发展非常迅速，很多预想不到的事情都有可能随时发生，新发明、新 发现、新创造层出不穷。植物组织培养也具有许多尚未发掘出的潜力，说不定有一 天人们会在三角瓶内种出大南瓜等等。 总之，现在的植物组织培养技术仍然处于发展阶段，并没有达到它的高峰期， 很多机理人们还没有搞清楚，它的潜力并没有被完全发挥出来。相信在今后的几十 年内，组织培养在我国的农业、制药业、加工业等方面将会发挥更大的作用，创造 出更大的经济效益。 3 石蜡切片技术 最简单的切片技术是徒手切片法。随后切片法的渐渐改进，有各种各样的方法 产生，如石蜡切片法，火棉胶切片法，冰冻切片法等。不同的方法虽不同，但主要 的步骤大体相同。将主要过程概述如下： 3 1 固定 这是制备切片的第一步，步骤很简单，将一片组织浸没在一种固定液中，但在 选择标本和固定液时，有很多方面需要注意，不可轻率从事。我们需用一种固定液 就能完成杀生和固定这两个手续。固定的目的，主要在于保存组织中各细胞的形态 结构和生活时期的形态结构相似。要达到这个目的，必须对固定液的选择、固定材 料的性质和大小、固定的时间以及研究的目的等都要多加注意。 3 2 冲洗 用固定液固定一定时间后就需要冲洗。必须将组织中的固定液彻底洗净。固定 液的性质不同，冲洗的方法也不同。例如，水溶液常用清水和低度酒精来冲洗：酒 精溶液则用相同浓度的酒精冲洗。冲洗的时间，大约为1 2 - 2 4 d , 时，隔1 - 2 d x 时换一 次冲洗液，如果用的是水洗，最好用流水进行冲洗。 3 3 脱水 少数标本从水溶液中取出，直接进行封藏，进行暂时的检查外，大部分材料， 尤其是做永久标本保存的，必须从组织中除去水分，这个步骤叫做脱水。包埋在石 蜡中的材料，脱水很必要，因为这种包埋剂石蜡不会与水混合。由于酒精和水的亲 和力很强，所以常用作脱水剂。脱水过程必须慢慢进行，不管从水移入酒精，还是 8 硕士擘位论文 m a s t e r st l i e s l s 从酒精移入水中，都需要避免剧烈扩散现象的出现，从而保证标本不被损坏。由于 上述原因，在实验中需要配制一组酒精，逐渐的增大其浓度，如1 5 、3 5 、5 0 、 7 0 、8 3 、9 5 等，作为脱水剂。如果选取的材料很柔弱，酒精的分级就应该更接 近。 3 4 保存 在进行固定和冲洗之后，脱水到7 0 的酒精时，由于种种原因不能完成下面的 步骤，可在7 0 的酒精中停留过夜。到第二天可以继续进行实验。也可以在其中长 时间保存，直到需要做实验时为止。如果保存的时间很长大概在几个月以上，最好 保存在等量的甘油、蒸馏水和9 5 酒精混合液中。 3 5 染色 只有很少一部分固定剂会使固定的组织用肉眼就可以看到，大部分的组织需要 经染色后才能使观察到分化的情况。我们选用的染料，对被染的组织，会有选择作 用，某些部分染色效果很好，另外一些部分却没有染上颜色。这些情况一方面是因 为所用的固定剂不同导致的，另一方面是因为染料本身的化学性质( 酸性、中性和 碱性) 差异造成的。例如，有些染料可以染色细胞核，有些染料则能染色细胞质。 3 6 透明 大部分组织，虽然被做成了大约8 微米的切片，但仍然不会很透明，会严重影 响观察效果。故要在显微镜下观察的材料，一定要经过透明剂的处理后才可以观察 到我们需要的部位。透明剂必须既能与酒精混合，又能和石蜡融合，二甲苯同时具 有此种性质，故常常被用作透明剂。由于组织已被切成薄片，很容易透明，所以需 要透明的时间不长，几分钟就可以，一般是3 n 5 分钟。 3 7 封藏 当组织被透明后，接下来就是封藏，在封藏剂中保存起来，可以存放很长时间。 我们一般常用的封藏剂有树胶和甘油胶等。如果被封藏的材料是直接从水中或水溶 液中取出，则常常选用甘油胶作为封藏剂，如果是经过酒精的脱水，常常选用树胶 作为封藏剂【2 0 】。本文选用的是加拿大树胶。 4 研究的目的和意义 随着人们的滥采滥挖，再加上三峡大江截流工程，中华蚊母数量的大量减少， 中华蚊母作为一种很重要的盆景，在保护环境方面也有重要作用，所以找到合适的 方法来繁殖中华蚊母很有实际意义。 9 硕士学位论文 m 人s t e r 。st h e s i s 第二章中华蚊母愈伤组织的诱导 1 材料与方法 1 1 实验材料 实验所用中华蚊母材料由武汉市雄楚大道花卉市场购得( 树龄两年) ，购回后 放到温室( 室温是2 4 0 c 左右) 培养一个月。实验时取幼嫩叶片作为外植体。 1 2 培养条件 1 5 0 毫升的锥形瓶中装2 5 - 5 0 毫升的培养基。采用的是1 2 m s 培养基。含0 6 琼 脂，3 蔗糖，p h 5 8 ，高压灭菌1 2 1 0 c ，2 0 m i n 。培养温度是( 2 5 1 ) o c ，光照1 6h d ， 光强3 0 - 4 0 p a n 0 1 m 2 s 一。 1 3 实验方法 把叶片剪下，在自来水下洗干净，也可在洗衣粉水或者洗洁精水中浸泡十分钟， 在流水下冲洗一个或半个小时。在0 5 的p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮) 中浸泡2 0 m i n 。再 在流水下冲洗半个小时。接下来在无菌操作台上进行操作。把叶片在无菌水中冲洗 两次，在7 5 的无水乙醇中表面消毒2 2 秒，在无菌水中冲洗3 - - - 4 次，把叶片上残留 的酒精洗掉，转入0 1 的升汞中消毒8 1 0 分钟( 嫩的叶片消毒8 分钟，老点的消毒 l o 分钟。以免把叶片的组织细胞破坏掉) 。在无菌水中冲洗5 - 6 次。用消毒过的剪 刀把叶片剪成大约l c m x l 5 c m 的长方形。剪的时候，尽量把主叶脉和侧叶脉带上。 用灭菌滤纸吸干外殖体表面的水分，然后接种在附加有各种激素的m s 培养基上， 每个1 5 0 m l 的瓶子里接种四个外殖体。放进组织培养室。先在黑暗下培养l o 天，9 天 出现愈伤组织。然后在光下培养。在诱导愈伤组织的过程中，会分泌次生代谢产物， 故把m s 培养基中的大量元素减半，以后都叫做i 2 m s 培养基。所以从接种外殖体算 起，第三天就要更换新的培养基，以后每1 5 n 2 0 天更换一次培养基。2 0 天后接种在 增殖培养基上进行增殖。增值效果也不错。但是以后并没有出现芽和根的分化。生 长2 3 天后，愈伤组织开始出现褐化。2 0 天后，统计个培养基中愈伤组织的诱导率： 诱导率= ( 总的外殖体数一未诱导出愈伤外殖体数) 总的外殖体数，并求三次重复 的平均值，并观察愈伤组织的生长情况。每种处理5 - 1 0 个重复【2 1 1 。 2 结果与讨论 2 1 植物生长调节物质对中华蚊母愈伤组织的诱导效应 2 1 1 单一激素的诱导作用 i o 本实验选取t z t 、6 - b a 、k t 、n a a 、i b a 、i a a 、2 , 4 - d 这七种植物激素( 浓 度是m 鲫) 附加在1 ，2 m s 培养基中，用幼嫩的叶片作为外殖体接种。观察不同的植 物激素分别在不同的浓度下对中华蚊母愈伤组织的诱导效应，结果如下： 2 1 1 1 ：z t 的效应 z t 的诱导效应见杜状图1 a ，愈伤组织的照片1 b 和1 c ；1 0 0 一 ；9 0 - g = 8 0 ； 罢 一7 0 蒋 韭 瞄6 0i l i 1 0ol02【) 5125 图1 a ：z t 对愈伤组织诱导的效应 f i gi a ：e f f e c t o f z to n c a l l u s i n d u c t i o n 由圈l a 得知，不同浓度的z t 埘l 叶片外殖体的愈伤组织及其生长的作用，以 05 m 刚效果塌好，愈伤主要出现在外殖体的边缘和有叶脉的地方接种存05 m g l z t 培养基e 的愈伤组织长得比较多1 2 “。为同时观察到在05 r r i 鲫浓度的培养基中的愈伤 组织比较犬呈现绿色，且生长比较紧凑，但在愈伤边缘变红。在不添加激素的培 养基上无愈伤组织的出现。大于或者小于05 m 鲫的愈伤组织出现的较少且边缘变黄 和变黑，如图l b 和l c ，是生长4 0 天以后的愈伤组织，愈伤组织已经明显的变黑。以 上表格都是统计接种2 0 天愈伤组织的生长情况，这一项就在以后的表格中省略。 i | ii i i i 图2 b 和2 c ：生长在0 5 r a g 1 6 一b a 上生长2 0 天和4 0 天的愈伤 f i g2 ba n d2 c ：c a l l u sg r o w t h2 0d a y sa n d 4 0d a y s o n0 5 m 鲫6 - b a 2 】13 ：k t 的效应 k i t 对愈伤组织的效应见杜状图3 a ，愈伤组织的照片3 b 和3 c ( 】i j ( ) l1 1 ) ， nj ) 】! k t 的浓度t h ec o n c e n t r a t i o no fk t ( m g l l ) 图3 a ：k t 对于愈伤组织诱导率及生长势的影响 f i g 3 a = e f f e c to f k t o nc a l l u si n d u c t i o n 如翻3 a 所示。k t 对对叶愈伤组织的诱导也有一定作用，00 51 t l 鲫的浓度诱导率 最高，迭9 0 。愈伤组织生长紧凑，绿色【2 4 l 。其他浓度k t 的诱导效果都较差，诱导 的愈伤组织黄褐色，易褐化死亡( 图3 b 和3 c ) 。 圈3 b 和3 c ：生长在l0m g ，i k t 上生长4 0 天的愈伤 f i g3 ba n d3 c ：c a l l u sg r o w t h4 0d a y l o n go nlo m g lk t 一 j 涉匿 2 i1 4 ：n a a 的效应 n a a 的诱导效应见柱状图4 a 愈伤组织的照片4 b 和4 c i _ _ _ _ ili n0 100 50l05】23 n 的诛皮t h cc or l c c n t r a t i o no fn a a ( m g 图4 a ：n a z i 愈伤组织的诱导效应 f i g4 a ：e f f e c to f n a a o nc a l l u si n d u c t i o n 从图4 a 可知，n a a 各浓度对中华蚊母愈伤组织的诱导有一定的作用，其中 0l m g 门的n a a 浓度的诱导率较高，但形成的愈伤组织很容易褐化死亡( 图4 b 和 4 c ) 。 罔4 b 和4 c ：生长在00 1 m g i n a at 4 0 天的愈伤组织 f i g4 b a n d4 c ：c a l l u sg r o w t h 4 0d a y so n00 1 m l 酣n a a 帅鲫帅m 0 一乖)|o：；=unp u i # 抑蜷 21 1 5 ：2 , 4 -