（微生物学专业论文）γ聚谷氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化.pdf

河南人学2 0 1 0 届硕l ：研究生学位论文 摘要 丫一聚谷氨酸( 丫p g a ) 是由微生物合成的一种细胞外高分子多氨基酸聚合物，由谷氨酸 单体通过q 一氨基和1 ，一羧基缩合而成，是一种对人体和环境无毒害的生物相容性天然高分子物 质，在医药、食品和农业等领域具有广泛的应用前景。本文从1 ，- p g a 产生菌的筛选、鉴定、 诱变育种及液体发酵条件优化等方面进行了研究。主要研究结果如下： ( 1 ) 从豆豉中筛选出一株1 ，一聚谷氨酸产生菌h d ll ，经过细胞形态和生理生化实验鉴定 分析，确定为芽孢杆菌属，命名为b a c i l l u ss p h d l l 。该菌为革兰氏阳性菌，细胞大小为1 7 2 1l a i n 0 5 - 一0 8l a m ，产芽孢，最适生长温度为3 7 。 ( 2 ) 以b a c i l l u ss p h d il 为出发菌株，进行诱变育种研究。发现紫外线、硫酸二乙酯和 亚硝基胍对其有较好的诱变效应，选取各岗素正变率高的诱变条件设计多组复合诱变，快速、 高效地筛选出7 - p g a 高产菌株h d f 9 ，其y - p g a 产量达到1 0 7 2g l ，提高了5 6 3 ，且传 代稳定。 ( 3 ) 探索菌株h d f 9 的液体发酵：j ：艺条件，即对种龄、初始p h 、温度、接种量、摇瓶 装液量和摇床转速进行了研究。确定合适的培养条件为：种龄1 0h ，初始p h7 5 ，发酵温度 3 7 ，接种量3 ( v v ) ，装液量4 0m l 2 5 0m l ，摇床转速2 0 0r m i n ，振荡培养4 8h 。 ( 4 ) 探索菌株h d f 9 的液体发酵培养基成分。首先采用单凶素试验对碳源、氮源、谷 氨酸前体添加量、n a c i 、金属离子进行研究，接着对培养基主要成分进行正交设计，最后采 用响应面试验对发酵培养基进行更深入的优化。结果表明高产菌株h d f 9 为谷氨酸依赖性 菌，适宜的培养基配方为：葡萄糖6 0 0 3g l 、酵母膏8 1g l 、谷氨酸钠4 1 7g l 、k h 2 p 0 4 2 5 g l ，m g s 0 4 0 3 1g l 。优化后，1 ，- 聚谷氨酸的产量达到1 4 5 6g l ，提高了3 5 8 2 。 ( 5 ) 采用7l 发酵罐对菌株h d f 9 分批发酵和补料发酵生产7 - p g a 进行了初步研究。 结果表明，1 , - p g a 是菌株h d f 9 的次级代谢产物，菌株h d f 9 体内存在一、- p g a 降解酶，在 碳源不足时，1 , - p g a 易被分解，因此控制葡萄糖含量能延长稳定期，有利于) , - p g a 的合成； 发酵过程中泡沫很大，严重影响丫- p g a 的生产，消泡是利用发酵罐生产7 - p g a 的瓶颈。 关键词：r 聚谷氨酸筛选诱变发酵优化 y - 聚爷氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化 a b s t r a c t 7 - p o l y g l u t a m i ca c i d ( 丫一p g a ) i sa ne x t r a c e l l u l a rm a c r o m o l e c u l a rp e p t i d et h a tc o n s i s t so fd a n d l - g l u t a m i ca c i d st h r o u g h r - g l u t a m y lb o n d s y - p g ai sw a t e r - s o l u b l e ，b i o d e g r a d a b l e ，e d i b l ea n d n o n - t o x i ct o w a r dh u m a na n dt h ee n v i r o n m e n t s ot - p g aw i l lb ew i d e l yu s e di nm e d i c i n e ，f o o da n d a g r i c u l t u r ef i e l d s t h ep a p e rc o n c e n t r a t e so nt h es c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o nt h es t r a i n sp r o d u c i n g 7 - p g a ，t h eo p t i m i z a t i o no fm e d i u ma n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h es t r a i no fh d11p r o d u c i n g7 - p g aw a ss e l e c t e df r o ml o b s t e rs a u c e w i t ht h ec h a r a c t e r so f g r a m - p o s i t i v e ，t h ec e l l s i z eo f1 7 - 2 1t u n 0 5 - - 0 8p m ，h a v i n gs p o r e sa n dt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo f3 7 t h es t r a i no fh d 11w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u sa n dn a m e da sb a c i l l u ss p h d11b ym o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o na n a l y s i s 2 t h es c r e e n i n go fh i g hy i e l ds t r a i n sp r o d u c i n g7 - p g aw a ss t u d i e d b a c i l l u ss p h d llw a su s e d a so r i g i n a ls t r a i nf o r7 - p g a p r o d u c t i o n ，w h i c hw a st r e a t e dw i t hm u l t i - m u t a g e n i c i t yo fu l t r a v i o l e t , d i e t h y ls u l f a t e ，a n dn i t r o s o g u a n i d i n e b a c i l l u ss p h d f 9w a si s o l a t e d , a n dt h e7 - p g ay i e l d a t t a i n e d1 0 7 2g li n c r e a s i n gb y5 6 3 a n dt h em u t a n ts h o w e dg e n e t i cs t a b i l i t yd u r i n g1 0 g e n e r a t i o n 3 t h el i q u i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i nh d f 9w e r eo p t i m i z e db ys i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r e 私f o l l o w s ：i n i t i a lp h7 5 ，t e m p e r a t u r e3 7 ，s e e d a g e1 0h ，i n o c u l u m3 ( v ) ，4 0m lm e d i u mi n2 5 0m ls h a k ef l a s k ，r o t a t i o ns p e e do f2 0 0r m i n ， a n dc u l t u r et i m e4 8h 4 t h el i q u i df e r m e n t a t i o nm e d i u mo ft h es t r a i nh d - f 9w a ss t u d i e d f i r s t l y , t h es i n g l e - f a c t o r e x p e r i m e n t so fc a r b o n ，n i t r o g e n ，m o n o s o d i u mg l u t a m a t e ，n a c ia n dm e t a li o n sw e r ec a r r i e do u t , t h e nt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n to ft h em a i nc o m p o n e n t so ft h em e d i u mw a sd e s i g n e d f i n a l l y , t h e r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e dt od e e p l yo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es t r a i nh d f 9w a sg l u t a m a t e - d e p e n d e n tb a c t e r i a , a n dt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o n m e d i u mw e r e6 0 0 3g ，lg l u c o s e ，8 1g ly e a s t ，41 7g lm o n o s o d i u mg l u t a m a t e ，2 5g 几k h 2 p 0 4 ， i i 河南人学2 0 1 0 届硕f ：研究生学位论文 0 31 叽m g s 0 4 t h ef i n a ly i e l do f 丫- p g ar e a c h e d1 4 5 6g li n c r e a s i n gb y3 5 8 2 5 u s i n gt h es t r a i no fl i d f 9 ，t h eb a t c hc u l t u r ea n df e d - b a t c hc u l t u r ew a sp r e l i m i n a r i l ys t u d i e di n 7lf e r m e n t o r t h er e s u l t ss h o w e dt h a ty - p g ai ss e c o n d a r ym e t a b o l i t e y - p g aw o u l db eq u i c k l y d e g r a d e df o rl a c ko fc a r b o ns o u r c e ，y - p g ad e g r a d i n ge n z y m em a ye x i s t e di nt h es t r a i no fh d f 9 t h e r e f o rc o n t r o l l i n gt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni s i m p o r t a n tt o t h es y n t h e s i so fy - p g a t h e p r o d u c t i o no f1 , - p g aw a ss e r i o u s l ya f f e c t e db yl a r g ef o a m ，s od e f o a m i n gi st h ek e ys t e pi nt h e f e r m e n t a t i o no fy p g a k e yw o r d s ：y - p o l y g l u t a m i ca c i d ；s c r e e n ；m u t a g e n i c i t y ；f e r m e n t a t i o n ；o p t i m i z a t i o n i i i 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是 本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新酌见解。据我所知，除 文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学住或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位申请人( 学住论文作者) 釜名：j 臣卜 讪fo 年号琵l 弓b 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学窜核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家 图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文( 纸质文 本和电子文本) 以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手 段保存、汇编学位论文( 纸质文本和电子文本) 。 ( 涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书) 学位获得者( 学位论文作者) 签名：望至墟 2 0 卜年毛月f 砂曰 学位论文指导教师签名：瑶! 至 2 0年月 日 河南人学2 0 1 0 届硕i j 研究生学位论文 1 前言 1 1y - p g a 的结构 1 ，聚谷氨酸( 丫- p o l y g l u t a m i ca c i d ，以下简称t - p g a ) ，是由d 谷氨酸和l 谷氨酸单体之间 通过a 氨基和1 ，羧基形成肽键之后生成的同聚酰胺，通常由5 0 0 0 个左右的谷氨酸单体组成， 分子质量一般在1 0 0 1 0 0 0k d 。7 - p g a 的基本骨架呈直链纤维状，分子链上具有大量活性较高 的游离羧基在分子内部或分子间形成氢键，是一种水溶性和町生物降解的生物高分子物质1 1 - 2 。 聚谷氨酸町利用细菌产生或者化学合成。同化学合成的聚谷氨酸( a p g a ) 相比较，细菌 产生的聚谷氨酸依靠1 ，酰基结合，并且能被土壤细菌分泌的水解酶所分解，而化学合成的 a - p g a 尽管也能被土壤细菌分泌的水解酶所分解，但是分解速度慢，因此被列为环境污染的 原i 大】之【2 】，所以目前生物町降解的聚谷氨酸( r p g a ) 已越来越成为人们关注的焦点。 r p g a 和a - p g a 的结构式见图1 1 。 一1 j 一 一 一( 一i i 寸jjlli i n h 叭h 一。 一j ! j 上一丛一 l i l 仄 o 0 h 生物合成的p g a ( 丫p g a )化学合成的p g a ( a - p g a ) 图i - i 微生物合成和化学合成的聚谷氨酸的化学结构 f i g 1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so fp g ab ym i c r o b i o l o g i c a lf o r m a t i o na n dc h e m i c a ls y n t h e s i s 不同微生物合成t - p g a 的立体化学结构不同，已发现的7 - p g a 立体化学结构有三种：l 一 谷氨酸的均聚物( 1 ，l - p g a ) ，d 谷氨酸组成的均聚物( 丫- d p g a ) ，d 一型和l 型谷氨酸组成的 共聚物( 丫d l p g a ) 3 1 。 1 ，- 聚符氦酸高产菌株的选育及发酵条件的优化 1 2y - p g a 理化性质 根据酸碱滴定测定结果，游离型一、- p g a 的p k a = 2 2 3 ，与谷氨酸的a _ 羧基的p k a 值大体一 致：t - p g a 金属盐( n a 型) 的旋光度为7 0 ，平均分子量为1 2 3 x1 0 4 【4 弓】；利用t g a 和d s c 进 行热性质分析，得出其热分解温度为2 3 5 9 ，熔点为2 2 3 5 ，热分解物为茶褐色；对y - p g a 的可溶性溶剂研究表明：1 0g 的y - p g a 口溶于1 0 0m l 的_ - - 甲基亚矾、热的n ，n 二甲基甲酞 胺、n - 甲基- 2 一吡咯烷酮：y - p g a 酸水解后用g i t c 做诱导剂，用h p l c 进行分离，测得当产 量达到高峰的对数增殖后期时y - p g a 中d 谷氨酸和l 谷氨酸的比值稳定在d ：l = 6 0 ：4 0 6 1 。 y - p g a 的多分散性在2 5 之间，聚合度2 0 0 7 0 0 ，具有很好的成膜性、成纤维性、阻氧性、 可塑性、粘结性和重要的生物降解性、吸水性等。这些特性使y - p g a 具有增稠、乳化、凝胶、 保温、成膜、缓释、助溶和粘结等功甜7 1 。 1 3y - p g a 的应用 由于t - p g a 分子的侧链上有大量游离羧基、分子带有大量的负电荷，使其具有强吸水性、 具有大量的活性位点等特点，这些特点有利于它成为功能化材料，冈此7 - p g a 在医药、工业、 农业等领域有着广泛的应用前景。 1 3 1 在医药方面的应用 在医药领域，t - p g a 的应用较多。因其具有良好的生物亲和性和生物降解性，能提高药 物水溶性，提供药物缓释性、靶向性，降低药物毒副作用，从而提高药物疗效、扩火药物使用 范同，是一类理想的生物可降解型医药用高分子材料，可以作为药物的运载体、缓释剂、增溶 剂、赋形剂和疫苗的佐剂等 9 1 。 t - p g a 作为药物载体的研究主要集中在抗癌药物的载体方面，例如：多聚谷氨酸紫杉醇 ( p g - t x l ) 是通过谷氨酸多聚体和天然紫杉醇共价结合形成，它具有极好的水溶性，能够增强 紫杉醇( t x l ) 输送到肿瘤部位的能力，显示出了比紫杉醇更加显著的抗肿瘤活性【1 0 】；用y - p g a 作为药物载体形成的c d d p p g a 复合物具有更强的活性和稳定性，能有效抑制卵巢癌细胞的 生长 1 1 , 1 2 ；另外，在防治白血病的实验中，t - p g a 可用作阿霉素的载体，使忠白血病的小鼠存 2 河南人学2 0 1 0 届硕 ：研究生学位论文 活时间明显延长【1 3 14 1 。 1 3 2 在农业领域的应用 在农业领域， f - p g a 经过电子射线照射数秒钟后能够形成一种高倍吸水性树脂，这种树 脂具有无毒、无味、无色、透明、高吸水性和保水性等特点，将这种高吸水性树脂与上壤结合， 不仅可以改进十壤团粒，还能增强上壤的保湿、保肥性能，在改造荒山、秃岭、沙漠等办面有 很大的应用价值15 1 。y - p g a 吸水后呈凝胶状，可以作为种子的包衣材料，提高种子在干旱沙 地的发芽率1 6 j 。另外，在使用肥料、杀虫剂、除草剂、驱虫剂等药物时，n a 适量的 y - p g a 盐可以延长这些药物停留在作用对象表面上的时间，不易闪下雨而被冲刷掉1 7 】。 1 3 3 在食品领域的应用 i - p g a 作为生物人分子物质，在体内完全降解后生成谷氨酸单体而被人体吸收利用，没 有毒副作用，具有食品安全性，可作为食品防冻剂、增稠剂、保健食品等应用在食品行业中。 分子量低于2 0 0k d 的 y - p g a 的抗冻性能比目前公认的具有高抗冻活性的葡萄糖的抗冻性 能更好，可以广泛应用于对低温冷冻敏感的酶或培养物的冷冻保藏和食品加工领域1 8 】。在淀 粉类食品中添加y - p g a ，可有效防止食品老化、增强质地、有助于维持食品外形和延长保质 期【1 9 】。 t - p g a 可以作为各种食品的苦味掩盖剂和除涩剂，改善食品的味道和口感，能有效减 少或消除诸如氨基酸、奎宁、多肽、咖啡冈、矿物质等引起的酸味。7 - p g a 能够替代高钠调 味剂，为糖尿病忠者和高血缝忠者所用。另外，y - p g a 能够增加c a 2 + 的溶解度，促进c a 2 + 在肠道内的吸收；还叮以增强人体对维生素k 的吸收利用【2 1 】。 1 3 4 其他用途 ) - p g a 生物降解性能好，降解产物对环境和人类不产生任何危害，研究发现b 1 i c h e n i f o r m i s c c r c1 2 8 2 6 ，b s u b t i l ip y2 9 0 和b s u b t i l i si f o3 3 3 5 产生的1 , - p g a 还具有很高的絮凝活性，可 以应用于废水处理、饮用水的纯化和食品和发酵下业的下游t 艺f 弘2 5 1 。 7 - p g a 作为功能性物质在同收金属和减少环境污染方面的应用价值非常明显1 2 6 2 7 1 。丫- p g a 是阴离子物质，分子链上有人量的游离羧基，提供了阳离子结合的基团，可以结合金属离子 n i “、c u 2 + 、m n “、c r 3 + 等，以硅为基质的p g a 膜的金属吸附能力已经接近以纤维素为基质的 3 y - 聚铃氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化 膜，并且还有优异的酸溶稳定性。另外，y - p g a 具有良好的保湿效果，可作为皮肤润滑剂、 头发定型剂、保湿冈子等应用于化妆品中。 由此可见，y - p g a 是一种具有广泛研究价值和应用价值的生物合成多聚体，将产生很高 的经济效益和社会效益。近年来，关于t - p g a 的研究已引起人们的兴趣和重视，国内不少院 校的科研单位正在开展这方面的研究1 ：作，其新的应用领域将不断被开发出来。 1 4y - p g a 生物合成 1 4 1y p g a 生物合成机理 自从1 9 3 7 年i v a n o v i c ( 2 8 1 等人发现炭疽芽孢杆菌的细胞荚膜中含有? - p g a 以来，众多学者 相继开展了对y - p g a 的研究。t - p g a 分子由d 谷氨酸和l 谷氨酸两种构型的单体构成，且两 种单体存在着一定的比例，然而一般情况下在y - p g a 的发酵过程中并没有添加外源的d 谷氨 酸，故存在d 谷氨酸如何合成的问题。t r o y 等口9 1 研究发现y - p g a 的生物合成机制不同于蛋白 质、核酸等生物人分子，其合成不需要模板，属于非模板合成，在多种酶的作用下经过单体的 活化作用、消旋作用和聚合作用而形成。因不同的y - p g a 产生菌表现出对谷氨酸不| 一的营养 需求，可以推测不同的t - p g a 产生菌应该存在不i 一的生物合成途径。目前关于y - p g a 合成机 制至今还不是很清楚，主要集中在两方面：( 1 ) y - p g a 中d 谷氨酸如何合成的问题；( 2 ) 谷 氨酸在y - p g a 合成中的作用问题。 i 一t r a n s a r n i n a s e l g l u + p y r u v i ca c i d 7 - p g a p g as y n t h e t a s e 俚- k e t o g l u t a r i ca c i d + l a l a 卜镐e a - k e t o g l u t a r i ca c i d + d a l a d - t r a n s a m i n a s e d g l u + p y r u v i ca c i d 图1 - 2y - p g a 的生物合成途径 f i g 1 - 2p a t h w a yo f ? - p g ab i o s y n t h e s i s 4 河南人学2 0 1 0 届硕1 ：研究生学位论文 y - p g a 由l 谷氨酸和d 谷氨酸两种单体组成，故存在d 谷氨酸如何合成的问题。t h o r n e 3 0 】 推测d 谷氨酸来自d 转氨酶催化d 丙氨酸转氨而得到，t - p g a 生物合成的可能途径如图1 2 ， 但此途径仍有待探讨。一股细菌的细胞都具有丙氨酸消旋酶，细菌的细胞壁中含有d 丙氨酸， 细胞质中瞬间会有d 内氨酸存在。 微生物生产t - p g a 所需的谷氨酸来自菌体自身代谢产生或依赖外界环境提供。b s u b t i l i s i f 0 3 3 3 5 是研究最彻底的，- p g a 生产菌株，k u n i o k a 和g o t o 发现该菌株在含有l 谷氨酸、柠 檬酸和硫酸铵的培养基上可以合成人量的y - p g a 而没有副产品，在t - p g a 生产过程中培养基 中谷氨酸的浓度没有改变，推测是在y - p g a 的合成过程中产生的【3 1 。后来，k u n i o k a 又提出 t - p g a 主要是由甜酮戊二酸与氨合成的，前者由柠檬酸通过三羧酸循环产生。外源谷氨酸只 是作为 - p g a 合成的前体和活化剂，而不是t - p g a 合成的直接底物。实际上培养基中添加少 量的l - 谷氨酰胺而不是大量的l 谷氨酸也会产生人量的t - p g a ，这意味着以后对该菌是否谷 氨酸依赖型菌株有可能要重新分类。c h e n g i n 等发现有些生产菌株合成t - p g a 并不需要外源性 谷氨酸供给，是否是这些菌株在葡萄糖或柠檬酸等碳源代谢时，边合成谷氨酸边将其转化为产 物t - p g a ，需要进一步研究。 1 4 2y - p g a 生物合成相关基因 h a r a 等发现y - p g a 产生菌b a n t h r a c i s 和b s u b t i l i s ( n a t t o ) 与i - p g a 合成有关的基冈可能在 质粒上，随后m a k i n o 从b a n t h r a c i s 中克隆出了负责荚膜合成的基因c a p b c a ，c 印b c a 并不 在染色体上，而是存在于质粒p x 0 2 上。c a p b c a 编码c a p b 、c a p b 、c a p c 、c a p a 四个蛋白， 其中c a p b 编码c a p b 、c a p b ，是一个重迭基因。o n o d e r a 等发现在b s u b t i l i st a m - 4 中没有 质粒，编码t - p g a 聚合酶的基冈在染色体上。后来a s h i u c h i 等克隆了编码b s u b t i l i s 的t - p g a 合成酶系的基| 大1 簇，这个基冈簇含有三个基因，分别定义为p g s a ，p g s b ，p g s c ，这三个基阒 与c 印b c a 有同源性，很可能组成一个操纵子，定位在染色体上。a s h i u c h i 等将这三个基因的 某一个或者二个通过载体转入e c o l i 发现并不产w p g a ，当把p g s b c a 与质粒p t r c 9 9 a 连接构 建的重组质粒p p g s i 转xe c o l i ，或者把基阒g l r 与质粒p m w 2 1 9 连接构建的重组质粒p b s g r 3 与重组质粒p p g s i 一起转入e c o l i 时，结果如表l l 所示，实验结果说明：o p g s a ，p g s b ，p g s c 三个基闪对y - p g a 的产生缺一不可；基因g l r 不仅增加d - 对映异构体的含量，而且显著增 气 3 ：鲞堡茎墼壹主堕堡堕垄堕丝垄壁墨丛塑垡垡 加7 - p g a 的产量：m n 2 + 可催化7 - p g a 的产生，但并不改变7 - p g a 中g l u 的构型。 此外。u r u s h i b a t a 等从发酵人豆制品中分离出了菌株b s u b t i l i si f 0 1 6 4 4 9 ，从该菌株中克隆 了与7 - p g a 产生有关的基冈，该基因有四个开放阅读框，与b s u b t i l i s1 6 8 的y w s c 和y w t a b c 基因几乎相同，这四个基冈组成了一个操纵子，通过基闪缺失证明y w s c 和y w t a 为r - p g a 产 生所必需，并且提纯了y w s c h i s 蛋白，在a t p 和m n c l 2 存在的情况下以酰基磷酸为媒介， y w s c h i s 蛋白可将l 1 4 c 谷氨酸合成为1 4 c 标记的7 - p g a 。 表卜1ec o l i 重组菌产y p g a 及其对映异构体 t a b i l7 - p g ap r o d u c t i o nb ye c o i lc l o n e sa n ds t e r e o c h e m i s t r yo f t h e7 - p g a s 1 5 y - p g a 的合成方法 1 5 1 提取法 早期，日本生产7 - p g a 多采用提取法，用乙醇将纳豆( 一种日本的传统食品) 中的7 - p g a 分离提取出来。由于纳豆中所含的7 - p g a 浓度甚微，且有波动，因此提取 ：艺十分复杂，生 产成本甚高，难以大规模生产。 1 5 2 化学合成法 ( 1 ) 传统的肽合成法 传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，这个过程一般包括基团保护、反应物活化、 偶联和脱保护等，是肽类合成的重要方法，但合成路线长、副产物多、收率低，尤其是含2 0 个氨基酸以上的纯多肽合成。 ( 2 ) 二聚体缩聚法 由l g l u ，d g l u 及消旋体( d ，l g l u ) 反应生成a - 甲基谷氨酸，后者凝聚成谷氨酸二聚 6 河南人学2 0 1 0 届硕l 研究生学位论文 体后，再与浓缩剂l ，3 二甲氨丙基3 乙基碳亚二胺盐酸盐及1 羟苯基三吡咯水合物在n ，n 二 甲基甲酰胺中发生凝聚，获得产率为4 4 9 i 、相对分子质量为50 0 0 2 00 0 0 的聚谷氨 酸甲基酯，经碱性水解变成丫p g a 。 化学合成法生产y - p g a 过程复杂、难度很大，收率低，环境污染严重，工业应用价值不 大。但对于了解丫- p g a 的结构与功能的关系、分析 r - p g a 合成酶的反应机制以及发展y - p g a 实际应用的修饰技术等具有一定的理论和应用价值。 1 5 3 酶转化法 酶转化法生产y - p g a 是采用酶促反应，以谷氨酸为单体实现生物聚合，酶转化中关键的 酶为谷氨酰转肽酶( g t p ) ，它催化谷氨酰基转移到受体上，当供体和受体结合时发生自动转 肽。通过微生物酶转化法，利用酶的高效性和专一性，能得到高浓度产物，避免了合成途径中 复杂的反馈调节作用，并且基质组成简单，有利于产品的分离纯化。但通常情况下，谷氨酰转 肽酶在微生物菌体中含最和活力都比较低，且提取纯化工艺比较复杂，制约了酶转化法的广泛 应用。 1 5 4 微生物发酵法 1 9 4 2 年b o v a r n i c k 等人研究发现芽孢杆菌属细菌能在培养基中积累1 ，- p g a ，由此揭开了微 生物发酵法生产y - p g a 的研究历史。目前，利用微生物发酵法生产 r - p g a 一直是人们关注的 热点，相关研究十分活跃。同化学合成法及酶转化法相比，微生物发酵法生产丫- p g a 具有生 产过程容易控制、发酵产量稳定、提取率高、目标产物产量较高以及产物分子量适宜、环境友 好等优点，已逐步成为研究和生产 r - p g a 的主要方法和途径。然而，微生物发酵法也存在不 足之处，代谢途径复杂，调节方式多样，导致难以提高菌株的y - p g a 产率，发酵液中1 ，- p g a 的生成浓度较低，从而给产物的分离纯化带来困难，使生产成本较高。 1 6y - p g a 的生产菌株 据报道，目前发现的丫- p g a 生产菌大部分都是芽孢杆菌，根据合成丫- p g a 过程中是否需 要外源性谷氨酸将这些芽孢杆菌分为两类：( 1 ) 谷氨酸依赖型y - p g a 生产菌( 2 ) 谷氨酸非依 赖型丫- p g a 生产菌。表1 2 列出了研究较多的几种产丫- p g a 菌株的基本情况。 7 符氨酸依赖型菌 b j “b t i l i si f 0 3 3 3 5 【3 4 1 a s u b t i l i s ( n a t t o ) m r - 1 4 1 【3 习 b s u b t i l i sf - 2 0 l f 3 6 】 b 1 i c h e n i f o r m i s a t c c 9 9 4 5 a 1 3 卫 谷氨酸非依赖型菌 b s u b t i l i st a m - 4 ，。l 符氨酸3 0g l 甘油2 0g ，l 柠檬酸2 0g l ( n f l 4 ) 2 s 0 41 0g l 麦芽糖( 葡萄糖) 6 0 9 几 酱油7 0 叽 谷氨酸钠3 0 9 l 谷氨酸7 0g l 葡萄糖8 0 9 l 小牛肉汤2 0 叽 谷氨酸2 0 9 ，l 甘油8 0e j l 柠檬酸1 2g l n h 4 c i7 9 l 果糖7 5g ，l n h 4 c 1 1 8g ，l 3 7 2d 4 0 3 4d 3 7 4d 3 0 4d 3 0 4d 2 3 t 3 1 1 3 5 0 2 1 5 0 t 3 3 1 1 7 2 3 【蚓 2 0 【3 5 】 1 7 诱变育种 为了提高丫p g a 产量，通常对初筛得到的较高产量的出发菌株采用物理或化学的方法进 行诱变。丫p g a 的诱变育种可采用传统的物理或化学诱变手段，例如紫外线照射、激光诱变、 亚硝基胍诱变等。 国内外研究者进行高产菌种筛选和诱变育种，均取得了良好效果。m a d l a 和p r a s e n 5 a n 等【4 0 1 ，从温泉中筛选到了耐高温的发酵菌株b 口c 纪l 甜s f h p ，m o t o l e r a n tw 。9 。f t l 和k f 4 l 三株 8 河南大学2 0 1 0 届硕u ：研究生学位论文 菌，1 - p g a 发酵产量最高达5 4 4 5g l 5 8 0 8g l 。杨革等【4 1 】利用h e n e 激光诱变筛选得到 y - p g a 高产菌b a c i l l u sl i c h e n 扣r m i sw b l 3 ；徐艳萍等1 4 2 1 采用亚硝基胍和6 c o 诱变获得高产菌 株b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sc 9 ，其了- p g a 产量由9 4 4g l 提高到1 9 7 6g l ，提高了1 0 9 ，而且 传代稳定；索晨、梅乐等4 3 1 经6 0 c o y 射线诱变后分离筛选得到一株高产突变株b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i ss 1 6 ；陈咏竹【删采用多组复合诱变株混合发酵选育技术进行1 , - p g a 生产菌的诱变 育种，选育到了高产菌z 1 , - 5 0 ，y - p g a 最终产量为2 3 6 6 2g t , 。 1 8 y - p g a 的分离纯化 , - p g a 分子量大，粘度大，在p h7 左右带负电荷，在发酵液中比较稳定。从高粘度的发 酵液分离纯化y - p g a ，可用有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法。 1 8 1 膜分离沉淀法 膜分离沉淀法是j i n h w a n d o 4 5 1 提出的，主要分为两个步骤：第一步是从高粘度的培养液 中分离、- p g a ，第二步是通过超滤的办法浓缩溶液，减少沉降过程酒精的用量。超滤时要先 将发酵液的p h 值降低到3 ，在3 5 时，发酵液的粘度和细胞表面的电位分别降为原来的l 6 和l 3 ，发酵液离心所消耗的能量降为原来的1 7 ，通过中空纤维膜( m w c o5 0 00 0 0 ) 超滤使 y - p g a 的浓度由2 0e , l 提高到6 0g l ，将沉淀1 , - p g a 消耗的乙醇量降为原来的l 4 ，因而大大 地降低了成本。 国内有人选用截留分子量为l 万的有机膜，取超滤压力为o 0 6m p a 进行膜过滤，采取了 反复循环利用的办法取得了较好的提取效果。但存在着超滤时间短、膜空易堵塞、连续化程度 低的缺点，致使成果不能应用于工业化生产。 1 8 2 有机溶剂法和化学沉淀法 有机溶剂沉淀法是先采用离心或凝聚菌体的方法除去发酵液中的菌体，然后在上清液中加 入甲醇或乙醇，沉淀得到 t - p g a 粗品，经透析、冷冻干燥得到白色结晶。化学沉淀法是用饱 和c u s 0 4 、n a c i 溶液代替低级醇类盐析沉淀得到丫- p g a 。有机溶剂沉淀法步骤如图1 3 。 9 r 聚符氩酸高产菌株的选育及发酵条件的优化 上清液 细胞 i i 加入4 倍体积乙醇，2 0 0 0 0 r r a i n 离心1 0 r a i n i 去沉淀物，真空干燥 , - p g a 粗产品 i l 溶解存l o o 2 0 0 倍的蒸馏水中，2 5 0 0 0 r m i n 1 l 离一l s l o m i n 上清液 透析脱盐，真空干燥 y - p g a 纯品 图i - 3y p g a 的分离纯化过程 f i g 1 3s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n o f t p g a 1 9 立题的背景及意义 目前由于石油资源的储量有限以及人类社会对环保、经济町持续发展的要求，生物町降解 的新型高分子材料越来越受到人们的关注。化学合成的高分子材料在土壤中分解慢，被列为环 境污染的原因之一，而由自生物质加工而成的生物可降解高分子材料，不依赖于石油资源，不 会产生传统化学合成过程产生的固体废弃物问题。7 - p g a 是微生物产生的一种胞外氨基酸聚 合物，是一种水溶性可被生物降解的新型高分子材料，在医药、环保、食品、化工、化妆品等 领域具有广阔的应用前景。 国外对微生物发酵法生产y - p g a 研究较早，美国、日本、韩国等一些发达国家对t - p g a 制备和应用的研究十分活跃，并取得了较人的进展，很多相关工艺和技术已形成专利。日本味 之素株式会社和明治制果株式会社实现了t - p g a 的批量生产，已经开始出售y - p g a 产品，但 价格昂贵，约为3 0 0 0 元爪g 。台湾味精生产商昧丹国际也已成功研发出吸水效能极高的p g a ， 在越南投资建厂。c e l lt h e r a p e u t i c s 公司开发出聚谷氨酸一紫杉醇药物，由日本中外制药公司 开发和销售。 国内开展t - p g a 的研究比较晚，近几年来，一些院校科研单位开始对y - p g a 的产生菌的 1 0 河南人学2 0 1 0 届硕j j 研究生学位论文 筛选、诱变育种、发酵条件的优化、生物合成途径和机制以及分批发酵生产等进行了研究，取 得了较好的结果。我国南京t 业大学徐虹【4 6 1 教授带领的课题纰对发酵法生产7 - p g a 取得了一 定进展，他们通过自然筛选和诱变，获得了具有自主知识产权的菌株，结合产酶机理研究和发 酵条件的优化，使y - p g a 生成浓度达到3 0g l 以上，谷氨酸底物转化率达到8 0 ，生产速率 达到2 5g h 。但由于微生物发酵产量低，营养条件要求苛刻，生产成本过高，凶此目前在我国 还没有实现大规模工业生产。 1 1 0 本课题的研究内容 由于一般的y - p g a 产生菌的产量较低，所需发酵培养基成本较高，因此要能达到有较高 的利用价值，通常需要对产生菌进行高产突变株的选育和培养基的优化。本论文主要研究内容 如下： ( 1 ) 以产量作为筛选指标，从采集的多种样品中通过平板初筛和摇瓶复筛，筛选出能生 产y - p g a 的菌种并进行初步鉴定。 ( 2 ) 进行紫外线、微波、硫酸二乙酯、亚硝基胍单凶素诱变，探究各因素对y - p g a 产生 菌的诱变效应，选取正变率高的诱变条件进行多组复合诱变试验设计，选育y - p g a 高产突变 株。 ( 3 ) 以诱变选育的高产菌株为出发菌株，研究种龄、初始p h 、温度、接种量、摇瓶装液 量、摇床转速各因素对y - p g a 合成的影响，确定合适的y - p g a 生产培养条件。 ( 4 ) 确定诱变选育的高产菌株适宜的培养基配方。研究碳源、氮源、谷氨酸钠浓度、n a c i 、 金属离子对y - p g a 合成的影响，采用正交设计对发酵培养基主要成分进行优化，最后通过响 应面设计进行更深入的优化，确定合适的培养基配方。 ( 5 ) 通过发酵罐对诱变选育的高产菌株进行放人培养，找到培养过程中存在的主要问题， 为实现大规模生产提供依据。 1 ，聚符氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 实验材料 分离菌种材料：豆腐乳、酱萝卜条、豆酱、两瓜酱、酱菜、腊肠、豆豉