（农药学专业论文）chiralpak+ash柱在四种农药手性拆分上的应用研究.pdf

甘肃农业大学2 0 1 0 届硕 学何论文 a b s t r a c t c h i r a l i t yi so n eo ft h ee s s e n t i a la t t r i b u t e so fn a t u r e t h ep h y s i c a lp r o p e r t i e so f m e l t i n gp o i n t b o i l i n gp o i n t r e l a t i v ed e n s i t y r e f r a c t i v ei n d e x t h es o l u b i l i t yi ns o l v e n t a n ds p e c t r ao fc h i r a le n a n t i o m e r sa r et h es a m e b u td u et ot h ed i f f e r e n te f f e c t so f p h y s i c a lp r o p e r t i e sf o rt h ep o l a r i z e dl i g h t t h e ya r eo fo p p o s i t ed i r e c t i o n sw i t ht h e s a m er o t a t i o nc a p a c i t y a l t h o u g ht h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fe n a n t i o m e r s a r ea l m o s ti d e n t i c a l b i o c h e m i c a la n dp h a r m a c o l o g i c a le f f e c t sa r eo f t e nd i f f e r e n t g e n e r a l l ys p e a k i n g c h i r a ln e u t r a la n dp h y s i o l o g i c a la c t i v i t yc o m p o u n d si so f t e n e f f e c t i v eb u ti t se n a n t i o m e rm e r e l yi n v a l i d c h i r a lp e s t i c i d e sw i t hm a r k e ds p e c i f i c i t y o ft h r e e d i m e n s i o n a lh a v en e a r l yi d e n t i c a lp h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s b u t i t sb i o a c t i v i t y t o x i c i t y m e t a b o l i s m r e s i d u e sa r eo fg r e a td i f f e r e n c e s h o w e v e r m o s t c h i r a lp e s t i c i d e sa r ep r o d u c t e da n de m p l o i e di nt h ef o r mo fr a c e m e t h ei n v a l i do r i n e f f i c i e n ti s o m e r sn o to n l yr e d u c e st h ep e s t i c i d ee f f e c t b u ta l s ob r o u g h tt h e e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n ds oo n t h e r e f o r e e s t a b l i s h i n g e f f e c t i v e s e p a r a t i n g a n d a n a l y s i s i n gm e t h o d so fe h i r a lp a l y sas i g n i f i c a n tr o l eo nt h ed e t e c t i o no fc h i r a l p e s t i c i d e sq u a l i t y c o n d u c t i n gt h eu s i n go fp e s t i c i d e s s a v i n gt h er e l e v a n tm a t e r i a l s a v o i d i n gp o l l u t i o no f t h ee n v i r o n m e n t h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c m e t h o dw a sp r o v e dt ob et h e m o s tc o n v e n i e n t r e u s a b l ea n dw i d e l yu s e dm e t h o di na l lt h ee h i r a ls e p a r a t i o n t e c h n o l o g i e s a n do n eo f t h ee a s i e s ta n dm o s te f f e c t i v em e t h o d si se h i r a ls t a t i o n a r y p h a s eh p l c c s p h p l c a tp r e s e n t m o r e t h a n10 0h p l ch a v eb e e n c o m m e r c i a l i z e d t h e r e f o r e t h es t u d yo nc h i r a lr e s o l u t i o ni np e s t i c i d ee f f e c ti so f e x t e n s i v es i g n i f i c a n c e t h ed a i c e lc h i r a l p a ka s hc o l u m nf o r t h ec h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e u n d e rh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nc o n d i t i o n s s e v e r a lc h i r a lp e s t i c i d e s t r i a d i m e n o l t e b u c o n a z o l e d i n i c o n a z o l e l a m b d a c y h a l o t h r i n c o u l db ea n a l y s i s e d a n dp r e p a r a t e da n db ed i r e c t l ys p l i t e d c h i r a l p a ka s hd i r e c t l ys p l i t e de h i r a l p e s t i c i d e so ft r i a z o l ea n dp y r e t h r o i d sf o rt h ef i r s tt i m e t h i sp a p e rd e s i g n e das c r e e n i n gm e t h o d so fs e p a r a t i n gc o n d i t i o n f i r s t l y a c c o r d i n g i i 3 洲0 叭0 一 0洲4 洲7 洲y 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕i 学位论文 t ot h eh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c m o b i l ep h a s em o d i f i e r v a r i e t i e sa n d c o n t e n t s s e c o n d l y a c c o r d i n g t op r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t a lr e s u l t s o b t a i n e dt h ec o n t e n to fb e s ts p l i t i n gc o n d i t i o n su n d e rt h em o d i f i e re n v i r o n m e n t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tu n d e rt h ec o n d i t i o n so fr o o mt e m p e r a t u r ea n dv e l o c i t yo f0 5 m l m i n t h eo p t i m a lc o n d i t i o no fc h i r a l p a ka s hc o l u m ns t u d y i n gs e p a r a t i o n s h o wt h a t n o r m a lh e x a n e a l c o h o l 9 5 5f o rt r i a d i m e n o l s e p a r a t i n gd e g r e ei s2 0 0 n o r m a lh e x a n e i s o p r o p a n o l 9 0 10f o rt e b u c o n a z o l e s e p a r a t i n gd e g r e ei s1 41 n o r m a lh e x a n e i s o p r o p a n o l 9 0 10f o rd i n i c o n a z o l e s e p a r a t i n gd e g r e ei s2 7 6 n o r m a lh e x a n e i s o p r o p a n o l 9 0 10f o rl a m b d a c y h a l o t h r i n s e p a r a t i n gd e g r e ei s 1 8 1 k e y w o r d s h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c h i r a lr e s o l u t i o n p e s t i c i d e i i i l 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕 j 学位论文 目录 摘要 i a b s t r a c t i i 目录 i v 第一章文献综述 1 1 1 手性分离的目的和意义 1 1 2 手性分离方法 3 1 3 手性拆分方法 3 1 3 1 结晶拆分法 4 1 3 2 化学拆分法 4 1 3 3 动态动力学拆分 4 1 3 4 微生物酶拆分法 5 1 3 5 色谱拆分法 5 1 3 5 1 高效液相色谱法 6 1 3 5 2 气相色谱法 6 1 3 5 3 毛细管电泳拆分法 7 1 3 5 4 超临界流体色谱拆分方法 7 1 3 5 5 模拟移动床色谱 8 1 3 5 6 分子印迹技术 8 1 3 5 7 手性配体交换色谱法 8 1 3 5 8 膜分离技术 9 1 3 5 9 萃取拆分技术 1 0 1 4 高效液相色谱手性固定相法及其在药物检测分析中的应用 1 0 1 4 1 高效液相色谱手性固定相法简介 1 0 1 4 2 手性固定相的类型 1 1 1 4 2 1p i k l e 型c s p 11 1 4 2 2 手性聚合物固定相 1 2 1 4 2 3 环糊精类手性固定相 1 2 1 4 2 4 大环抗生素手性固定相 1 3 1 4 2 5 蛋白质手性固定相 1 4 1 4 2 6 配体交换手性固定相 1 4 1 4 2 7 冠醚手性固定相 1 5 1 4 2 8 分子印迹手性固定相 15 i v 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕t j 学位论文 1 4 2 9 多糖类手性固定相 l6 1 5 各种手性固定相的比较 1 8 1 6 常见农药手性固定相拆分方法 18 1 7 论文设计思路 1 9 第二章四种手性农药的高效液相色谱拆分实验 2 2 2 1 材料与方法 2 2 2 1 1 实验材料 2 2 2 1 2 仪器与试剂 2 2 2 1 3 色谱条件及色谱计算 2 2 2 2 结果与分析 2 3 2 2 1 流动相组成对样品拆分的影响 2 3 2 2 2 醇的种类对样品拆分的影响 2 5 2 2 3 本章小结 2 6 第三章顺式高效氯氟氰菊酯对映体对菜青虫的防效实验 2 9 3 1 材料与方法 2 9 3 1 1 实验药品 2 9 3 1 2 实验用水 2 9 3 1 3 实验对象 2 9 3 1 4 实验容器和仪器 2 9 3 1 5 实验设计 3 0 3 1 6 调查统计 3 0 3 1 7 防效计算 3 0 3 2 结果与分析 3 0 3 3 本章小结 3 1 第四章结论与展望 3 2 4 1 结论 3 2 4 2 创新点 3 2 4 3 展望 3 3 参考文献 3 4 致谢 4 1 作者简介 4 2 导师简介 4 3 独创性声明 4 4 n 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕i j 学位论文 第一章文献综述 1 1 手性分离的目的和意义 一个物体若于自身镜象不能叠合 就叫做具有手性 c h i r a l i t y 互为镜象的 两种构型的异构体叫做对映体 c n a n t i o m c r 对映体中所有原子的连接顺序相同 而原子在空间中的排列方式不同他们之间互为实物与镜像的关系 l 对映体化合 物由于分子中存在不对称因素 不能互相重合 很象人的左右手 它们看起来非 常相似 但是不完全相同 因此这类不能重合的分子又叫做手性分子 对映体的 熔点 沸点 相对密度 折光率 在一般溶剂中的溶解度 以及光谱图等物理性 质都相同 但由于他们对偏振光的作用不同 因而他们的旋光能力相同 但方向 相反 等量对映异构体的混合物没有光学活性 成为外消旋体 对映体的存在是 自然界中的一种普遍现象 对映现象在有机化学 药物化学以及生物化学等领域 大为常见 手性是自然界的本质属性之一 几乎所有的生物大分子 如蛋白质 多糖 核酸和酶等 几乎全是手性的 这些小分子在体内往往具有重要生理功能 尽管一对对映体的结构和物理性质是如此的相似 但是对映体的药效和活性 却截然不同 一般地说 含有手性中性并具有生理活性的化合物往往是一种异构 体有效而它的对映体作用很小 甚至完全没有药效或者具有相反的药效 2 手性 药物 c h i r a ld r u g 是指药物分子结构中引入手性中心后 得到的一对互为实物 与镜像的对映异构体 这些对映异构体的理化性质基本相似 仅仅是旋光性有所 差别 分别被命名为r 型 右旋 或s 型 左旋 外消旋 对于手性药物 其 构型不同它们的生理活性和毒性也不同 药物分子必须与受体分子几何结构匹 配 才能起到应有的药效 在手性药物未被人们认识以前 欧洲一些医生曾给孕妇服用没有经过拆分的 消旋体药物作为镇痛药或止咳药 很多孕妇服用后 生出了无头或缺腿的先天畸 形儿 仅仅4 年时间 世界范围内诞生了1 2 万多名畸形的 海豹婴儿 这就是 被称为 反应停 的惨剧 后来经过研究发现 反应停的r 体有镇静作用 但是 s 对映体对胚胎有很强的致畸作用 3 训 又如l 多巴1 是治疗帕金森的良药 但它 的对映体却有严重的毒性作用 正是有了这些教训 所以现在的药物在研制成功 后 都要经过严格的生物活性和毒性试验 以避免其中所含的另一种手性分子对 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕 j 学位论文 人体的危害 很明显 研究手性化合物对于科学研究以及人类的健康有着重要意 义 对手性的研究 在造就工业奇迹的同时 也启发了我们对地球生命 甚至宇 宙起源的重新认识 因此 国际分析化学界对大量具有生理活性和其它化学 物 理性能的光学异构体的分析产生了浓厚的兴趣 5 7 1 1 9 9 2 年美国食品药品管理局 f d a 规定 今后凡研制不对称中心的药物 必须给出手性分离结果 并给出单一对映体的药效 欧洲共同体也采取了相应的 措施 受此规定的影响 世界上单一对映体手性药物销售额逐年递增 在全球药 物市场中所占的比例也越来越大 手性物质分离也已成为热门的研究课题 据 f r o s t s u l l i i a n 调查估计 2 0 0 2 年全世界手性产品的收入为7 0 亿美元 2 0 0 4 年 底全球单一对映体化合物的销售额为8 5 7 亿美元 预计到2 0 0 9 年底将达到1 4 9 4 亿美元 年增长率为1 1 4 8 1 0 1 随着生物工程和生物科学的发展 手性拆分和测定引起了人们的普遍关注 提供疗效高 毒副作用小的光学纯农药成为现代药物研究的重要内容 尽管对映 体间物理化学性质几乎完全相同 但它们的生化和药理作用却往往不同 这是因 为生物本身内部的核酸 蛋白质及多糖都具有与其功能相适应的结构 它们常常 对一化合物的对映体表现出不同的响应 表现出不同的药理和药代特性 因此 对映体的拆分与识别对于生命科学和药物化学研究以及人类的健康具有十分重 要的意义 对于杀虫剂 杀菌剂 昆虫性信息素 植物生长调节剂 食品添加剂 香料 等精细化工产品 其分子的光学异构体也表现出不同的生理活性 手性农药在生 物活性方面具有显著的立体特异性 拟除虫菊酯中不同异构体间的活性差异已是 熟知的例子 如杀虫剂高氰戊菊酯 其四个异构体之一是强力杀虫剂 另外三个 则对植物有毒 目前商品化的农药中 大约有四分之一具有手性中心 对映异构 体虽然具有几乎完全相同的物理化学性质 但是其生物活性 毒性 代谢 残留 等行为往往差别较大 但是 绝大部分手性农药仍以外消旋体的形式生产和使用 无效或低效异构体不仅降低了药效 也带来了环境污染等副效应 因此建立有效 的对映体分离分析方法对监测手性农药质量 指导相关农药的使用 节省原料 避免环境污染都具有重要意义 1 1 近年来 随着手性技术的发展 有关光学活性农药的研究目前已经成为农药 甘肃农q k 大学2 0 1 0 届硕卜学位论文 化学领域的热门话题 要研究农药各单一光学异构体与活性关系 测定外消旋农 药中有效体与无效体的比例 以及在生物降解实验中对有效体进行监控 都要求 对手性农药外消旋体进行分离分析 在所有手性分离技术当中 高效液相色谱法 h p l c 被证明是最便利 可重复使用并且应用广泛的方法 相当部分的h p l c 法都使用了手性选择器作为手性固定相 而当前 手性固定相已经有数百种 这 其中有超过1 1 0 种已经商业化了 1 5 高效液相色谱手性固定相法直接制备分离对 应异构体被认为是同时获得两种光学纯的单一对映异构体的十分有效的方法 该 法具有直接 快速 有效 简单 适用拆分各种结构的对映异构体 在药物的初 测阶段这种方法特别的省时 省去了间接色谱分离衍生的麻烦 1 d 1 7 1 手性农药 的光学异构体的色谱分离一般可以分为直接拆分法和间接拆分法 直接拆分法因 其简便易行而备受研究者注意 直接拆分法是通过一个具有光学活性的环境即手 性流动相或手性固定相 c h i r a ts t a t i o n a r yp h a s ec s p 其中以c s p 最为常用 在手性分离方法中 高效液相手性固定相法是最重要的一种 在众多高效液相色 谱手性固定相中 多糖类手性固定相应用最广泛 手性识别能力最强 1 8 之0 1 1 2 手性分离方法 目前获得单一手性化合物的方法有3 种 手性源合成法 以手性物质为原料 合成其他手性化合物 不对称催化合成法 是在催化剂或酶的作用下合成得到 单一对映体化合物的方法 外消旋体手性拆分法 是在拆分剂的作用下 利用 物理化学或生物方法将外消旋体拆分成两个对映体 其中不对称合成法是近2 0 年来发展最迅速 最有成就的方法 但经典的手性拆分时至今日仍是一种基本的 常用方法 1 3 手性拆分方法 外消旋体的手性拆分法是一种经典的分离方法 在工业生产中已有1 0 0 多年 的历史 最早进行手性化合物拆分的是1 8 4 8 年p a s t e u r 在显微镜下将酒石酸的钾铵 盐晶体的两个对映异构体进行分离 它使人们认识到化合物手性和拆分方法 手 性拆分法操作简便 实用性强 重现性好 是制备光学活性化合物及药物的最广 泛的应用方法 手性化合物的拆分给外消旋混合物制造了一个不对称的环境 使 两个对映异构体能够分离开来 手性拆分又可分为结晶拆分法 动力学拆分法 生物拆分法和色谱拆分法等几种方法 气 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕f 学位论文 1 3 1 结晶拆分法 结晶法拆分包括直接结晶法拆分 d i r e c tc r y s t a l l i z a t i o nr e s o l u t i o n 和非对映异 构体拆分 d i a s t e r e o m e rc r y s t a l l i z a t i o nr e s o l u t i o n 口 直接结晶法是利用化合物的旋光异构体在一定的温度下 较外消旋体的溶解 度小 易拆分的性质 在外消旋体的溶液中加入异构体中的一种 或两种 旋光 异构体作为晶种 诱导与晶种相同的异构体优先 分别 析出 从而达到分离的 目的 这种直接结晶的拆分方法仅适用于外消旋混合物 其应用几率不到1 0 非对映体结晶法适用于拆分外消旋化合物 利用天然旋光纯手性拆分试剂与 消旋化合物通过分子间作用力的相互作用 生成一对非对映体 由于二者的物理 性质不同 因此可以用结晶 蒸馏或色谱法将它们分开 结晶诱导的不对称转化 使光学纯异构体的理论收率超过5 0 成为可能 近年出现了化学拆分法等新技 术 是对非对映异构体拆分的有效补充 1 3 2 化学拆分法 化学拆分法应用非常广 它是在手性试剂的存在下 外消旋体和手性试剂作 用 转变成非对映异构体 由于生成非对映异构体的活化能不同 反应速度就不 同 利用不足量的手性试剂与外消旋体作用 反应速度快的对映体优先完成反应 而剩下反应慢的对映异构体 从而达到拆分的目的 化学拆分法更适于酸或碱的 外消旋体的拆分 拆分酸时 常用的旋光性碱主要是生物碱 如 奎宁 马钱 子碱等 拆分碱时 常用的旋光性酸是酒石酸 樟脑一b 磺酸等 拆分既非酸又 非碱的外消旋体时 可以设法在分子中引入酸性基团 然后按拆分酸的方法拆之 1 3 3 动态动力学拆分 经典动力学拆分的原理在于两个对映体与某一手性试剂的作用 中间体是一 对非对映异构体 反应速度一般存在差异 利用它们反应的动力学差异 从而达 到拆分的目的 通过经典动力学得到的光学纯产物的最大产率为5 0 多数情况 下 有一个异构体是没用的 这将浪费一半的原料 因此 为了克服以上缺点 人们开始采用动态动力学拆分方法经典的动力学拆分与底物消旋化相结合的方 法即为动态动力学拆分 d y n a m i ck i n e t i cr e s o l u t i o n 2 2 经典动力学拆分的缺点 是最大理论产率仅为5 0 而动态动力学拆分的理论产率可以达到1 0 0 底物 4 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕i j 学位论文 消旋化有化学法消旋和酶法消旋 酶法较化学法副反应少 产率高 条件温和 而且无毒 易降解 具有环境友好性 因此更适合工业化生产 2 3 1 理论上产率可 达到1 0 0 洛曲非班 1 0 t r a f i b a n 2 0 是一个正在进行i i i 期临床研究的非肽类糖蛋 白拮抗剂 可用于抑制血小板聚集 利用酶法可实现其关键中间体s b 2 3 5 3 4 9 的 动态动力学拆分 使用念珠菌属南极洲脂酶b c a n d i d aa n t a r c t i c a l i p a s eb 以离 子液体 b m i m p f 6 为溶剂 得到 s 酸 e e 值大于9 9 5 2 4 1 1 3 4 微生物酶拆分法 酶作为一种特殊的催化剂正日益受到人们的重视 从生物体系到非生物体系 的酶催化 从酶的固定化到非水相酶反应 酶的应用研究正日益广泛 大部分药 物水溶性差 所以利用非水相酶反应对手性药物进行动态动力学拆分 进而获得 单一立体异构体的拆分技术在近几年内有了很大的发展 酶具有高度立体专一 性 在一定条件下 某些微生物酶只能催化外消旋体中的一个对映体 发生反应 而成为不同的化合物 从而分离两个对映体 酶催化反应条件温和 操作简便 又不污染环境 单一对映体的得率可以达到1 0 0 酶催化立体选择性强 反应 条件温和 操作简便 副反应少 产率高 成本低 且不会造成环境污染 这些 都使得用酶拆分外消旋体成为理想的选择 2 5 2 6 随着酶固定化 多相反应器等新 技术的日趋成熟 越来越多的酶已用于外消旋体的拆分 2 7 1 徐刚等 2 8 1 通过对不同来源酶的筛选 找到了n o v o z y m4 3 5 b l a l c a l i g e n e ss p 两 种选择性较好的酶 有效拆分制备了 s 2 氯 1 一 2 噻吩 乙醇 产率为4 8 6 值为9 8 5 酶法拆分外消旋体在实验室制备和工业生产中都己取得长足的进步 但是仍 然有其局限性 比如菌种筛选困难 酶制剂不易保存 产物后处理工作量大 以 及通常只能得到一种对映体等缺点 尽管如此 利用微生物进行手性药物的合成 及对映体的拆分仍是当前研究热点 1 3 5 色谱拆分法 色谱法是目前手性药物分析和分离中应用最广最有效的方法之一 主要应用 分为两类 分析级水平和制备级水平 用于分析领域的色谱拆分法包括气相色谱 g c 高效液相色谱 h p l c 超临界流体色谱 s u p e r c r i t i c a lf l u i d c h r o m a t o g r a p h y s f c 毛细管电泳 c e 等 在制备领域中 高效液相色谱的 s 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕卜学位论文 曼i i iii l l 篡 应用较为广泛 另外 在工业化生产中比较成熟 比较前沿的是模拟移动床 s i m u l a t e c t m o v i n gb e d s m b 技术 1 3 5 1 高效液相色谱法 近年来 高效液相色谱法也逐渐成为手性拆分的一种重要方法 它采用手性 物质作为固定相 对于手性固定相 c s p s 要求应用性广 柱效高 稳定性好 高效液相色谱法在手性药物拆分中的应用是最广泛的 是药物质量控制 立体选 择性的药理学和毒理学研究的重要手段 h p l c 分离药物对映体的方法可分为间 接法和直接法 间接法又称为手性试剂衍生化法 是利用手性药物对映体混合物在预处理 中进行柱前衍生化 形成一对非对映异构体 根据其理化性质上的差异 使用非 手性柱得以分离 该法分离效果好 分离条件简便 一般的非手性柱可满足要求 但需要高纯度的衍生试剂 操作比较麻烦 要求使用高纯度的手性衍生化试剂 且该试剂对两种对映体的衍生化效率应相同 故应用范围有刚2 9 1 直接法应用范围较广 其优点是在分离前不需要进行衍生化反应 而且对分 离机制的解释显示出优越性 因此得到迅速发展 成为手性拆分最有效的工具之 一 直接法可分为手性固定相法 c s p 和手性流动相添加剂法 c m p a 直接 拆分法中的c m p a 法是在流动相中加入手性添加剂 利用非手性固定相h p l c 进 行拆分 手性添加剂主要有手性诱导吸附剂和手性离子对试剂 而c s p 法是把手 性化合物键合或涂敷到载体表面 对映体样品由于与键合或涂敷的手性分子形成 非对映异构体络合物的结合能力有差别而达到拆分目的 3 0 高效液相色谱手性 固定相法拆分手性药物是现今最常用的方法 应用于高效液相色谱的手性固定相 发展异常迅速 目前已开发的商品化手性固定相有多糖类 蛋白类 环湖精类 冠醚类等 其中多糖类衍生物手性识别能力强 方法也较成熟 3 1 3 2 1 h p l c 法用于对映体药物的拆分 具有多种途径 各具特色 可相互补充 但距离大规模工业化生产还有相当大的距离 1 3 5 2 气相色谱法 气相色谱在分离手性对映体时 通过选择合适的吸附剂作为固定相 使之选 择性地吸附外消旋体中的一种异构体而达到分离手性化合物的目的 研究表明 手性固定相与异构体之间的作用有氢键作用 偶极结合作用及3 点作用 气相色 6 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕l 学位论文 谱具有简单 灵敏 速度快 重复性和精度高等特点 对于可挥发的热稳定手性 分子 它表现出了明显的优势 但是 它毕竟存在着一些固有的局限性 比如 要求被分离的样品是挥发性的 温度相对比较高 容易引起手性固定相的消旋 要实现制备比较困难 1 3 5 3 毛细管电泳拆分法 毛细管电泳是以高压电场为驱动力 以毛细管为通道和载体 利用样品各组 分之间迁移率和分配行为的差异而实现分离的 c e 进行手性拆分不是基于电泳 分离的原理 而是依靠色谱原理 构建手性分离的环境 使对映异构体与手性选 择剂作用 它兼有高压电泳的高速 高分辨率及h p l c 的高效率等优点 目前已 经广泛运用于手性药物的研究领域 刘秋英等 3 3 采用二元手性选择剂体系 以8 m m o l l 羟甲基氨基甲烷和1 0m m o l l 柠檬酸为电泳运行液 快速准确地测定手 性药物酚苄明两种异构体的含量 应用于市售盐酸酚苄明片剂中酚苄明对映体的 分离检测 取得满意的结果 c e 技术不仅在药物分析和测定上有很大的进步 还 在分离理论 人工智能优化分离参数 毛细管电泳结合动力学和力学等理论研究 方面有很大的发展 3 4 1 m u z i k a 等 3 5 1 采用实验设计和人工神经网相结合的方法 优化了三乙醇胺铬酸盐的缓冲液 对高浓度氯离子的溶液中含有的硫酸盐进行了 测定 1 3 5 4 超临界流体色谱拆分方法 超临界流体色谱拆分方法 s f c 的制备拆分方法是从2 0 世纪8 0 年代中期迅速 发展起来的一项拆分技术 该方法是一种流动相温度 压力均高于或略低于临界 点的色谱技术 所用流动相有c 0 2 n 2 0 n h 3 n c 4 h 1 0 其中c 0 2 最为常用 采 用超临界状态的二氧化碳做流动相 具有分析时间短 柱平衡快 操作条件易变 换 粘度小 扩散系数大 密度高等特点 具有强的溶解能力 可以迅速将产物 洗出 且适于分离难挥发和热稳定性差的物质 3 6 1 在手性分离方面 与高效液相 色谱 气相色谱 毛细管电泳仪和质谱仪等相互补充 因其具有独特的优越性 将成为超临界c 0 2 萃取技术发展的必然趋判3 7 1 2 0 0 5 年 m e t t l e r 公司推出了具有 比较高制备规模的设备b e r g e rs f cm u l t i g r a mi i i 该设备应用2 5c m 直径的柱 子 达5 0 2 0 0m l m i n 的流速 比高效液相色谱装置要快5 1 0 倍 3 8 益康唑 e c o n a z o l e 贝康唑 b e c l i c o n a z o l e 联苯康唑 b i f o n a z o l e 等抗真菌药物的分离即是 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕 学位论文 通过s f c 实现的 1 3 5 5 模拟移动床色谱 模拟移动床色谱 s m b 技术是b r o u g h t o n 在1 9 6 1 年的一个专利中提出来了 它吸取了固定床和移动床工艺各自优点设计而成的 它以层析为单元 引入化工 中的逆流 回流等机制 通过周期性开启 关闭进出口阀门来切换进料与出料管 线的位置 来模拟固定相吸附剂的相对运动 从而实现固定相吸附剂与流动相液 体的逆流接触移动 它保持了移动床连续操作 分离效果好的优点 又避免了固 体真正逆流的困难 从而提高了分离效率 现在已被国际上公认为规模制备拆分 手性药物的最有效手段 3 9 危风等 删以八根5c m x l 0c m 多糖类纤维素三苯基氨 基甲酸酯 t p c c 涂敷型手性固定相色谱柱 以乙醇 正己烷为流动相 拆分了手 性药物奥美拉唑 ee 值达9 6 以上 回收率大于9 5 年产量8 2 5k g 但是这种 技术有着投资高的缺点 如何获得高效 低价的手性固定相是s m b 法能够广泛 使用的关键 1 3 5 6 分子印迹技术 分子印迹技术 m i t 是模拟天然抗原 抗体作用原理制备对模板分子具有预 定选择性的分子印迹聚合物的技术 4 1 1 首先将具有适当功能基的功能单体与模 板分子结合形成分子复合物 其次选择适当的交联剂将功能单体相互交联起来形 成聚合物 从而使功能单体上的功能基在空间排列和定向固定 最后通过一定方 法脱去模板分子 这样就在高分子聚合物中留下与模板分子在空间结构上完全匹 配 并含有与模板分子专一结合的功能基的三维空穴 这些空穴可以选择性地重 新与模板分子结合 即对模板分子具有专一性识别作用 该技术具有有效 操作 简单 易于产业化等优点 已越来越受到人们的关注 利用该技术 以 s 一萘普生为模板 4 乙烯基吡啶和双甲基丙烯酸亚乙酯共 聚制备了非共价型烙印分子作为h p l c 手性固定相 以四氢呋喃 正庚烷 冰醋酸 体积l 2 5 0 2 5 0 1 作为流动相 成功地从外消旋体中将烙印分子分离出来 当载样量为2 0 烬时 分离因子 a 为1 2 6 拆分因子 r s 为0 6 9 1 3 5 7 手性配体交换色谱法 手性配体交换色谱法中手性配体和金属离子是决定手性化合物分离选择性 的根本因素 可通过采用流动相添加法和固定相涂渍法对手性化合物对映体进行 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕f 学位论文 曼曼璺曼量量量曩量舅曼鼍奠罾置蔓 量置量曼吕曼鼍曼曼量曼皇皇皇曼皇曼舅曼曼曼 曼曼舅曼鼍量鼍曼鼍量鼍曼蔓曼量曼罾鼍i i i i 鼍 分离 马桂娟 龚波林 阎超仁以单分散亲水性聚合物为基质 在配体交换模式 下 固定相对1 2 种d l 氨基酸对映体进行了良好的拆分 1 3 5 8 膜分离技术 膜分离是一种近几年刚发展的节能技术 从连续性和能量有效的观点出发 通过手性膜拆分对映体是非常吸引人的 关于外消旋体的膜分离已有某些报道 如采用手性冠醚膜 环糊精载体膜 分子印迹聚合物膜 多聚糖膜 中空纤维素 膜 聚丙烯膜以及各种液膜等 膜手性拆分法由含有消旋混合物的流入相 膜及接收相组成 膜相与流入相 及接收相不相溶 流入相中消旋药物在渗透压或其他外力如压力 电压 p h 梯 度的驱动下进入膜相 在膜相中载体选择性作用下 使其中一种对映体通过膜相 进入接收相 根据膜分离和手性拆分的要求 用于手性药物拆分的膜需具备以下 的特征 4 2 较高对映体选择性 膜通量要大 通量及选择性应稳定 膜拆分的本质是实现对两种对映异构体的选择性转运 依据其转运方式可分 为手性液膜拆分 1 i q u i d m e m b r a n e b a s e ds e p a r a t i o n 和手性固膜拆分 s o l i d m e m b r a n e b a s e ds e p a r a t i o n 两类 手性液膜拆分的机理是将具有手性识 别功能的物质溶解在一定溶剂中制成有机相液膜 以膜两侧浓度差为动力 外消 旋体有选择地从高浓相向低浓相迁移 由于液膜对两种异构体的选择性差异使二 者迁移速率不同 即迁移较快的一种异构体在低浓相中得到富集 从而达到手性 分离目的 固膜拆分则利用膜内外自身的手性位点对两种异构体亲和力的差异 在压力差 浓度差或电势差等推动力下造成两种异构体的选择性通过 进而实现 拆分的目的 根据手性拆分的要求 所用的拆分膜应具有较高的对映体选择性 较大的膜通量 且选择性及通量应稳定 1 9 7 9 年 n e w e o m b 等 4 3 1 首先报道了一种液体膜拆分的方法 在这种液膜体系 中 手性分子 主体 与外消旋体 客体 结合 通过氯仿载体从一水溶液至另一水 溶液中再释放出来 这种w 型装置能够同时连续地将外消旋体拆分为2 个对映体 得到的旋光纯度为7 0 9 0 1 9 8 7 年 m m s 仃0 n g 等 删报道了另一种液膜拆分对 映体的方法 他们采用水基质液体膜拆分有机分子 首次采用环糊精作为膜载体 分子 分离疏水性的异构体 对 士 s 一 1 二茂铁基乙基 苯硫酚等外消旋体进行了 拆分 9 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕 学位沦文 1 3 5 9 萃取拆分技术 与传统的萃取分离不同 萃取拆分技术 e x t r a c t i v es e p a r a t i o n 是将传统的溶 剂萃取技术应用于外消旋体的拆分 与传统萃取分离不同的是 除待拆分的外消 旋体外 两互相接触的液相至少有一相含有旋光性的手性选择体 萃取过程中 手性选择体依靠极化 诱导和氢键等多种分子间作用力或配位键与对映体生成两 种非对映体 这两种非对映体具有不同的理化特性 存在一定的自由能差 从而 将外消旋体分开 从理论上讲 只要两个对映异构体的分离因数大于1 在足够 多的级数下 即可实现拆分 目前至少存在配位萃取拆分体系 亲和萃取拆分体 系以及形成非对映体异构体萃取拆分体系等3 种萃取拆分体系 萃取拆分技术具 有生产能力大 分离效果好 回收率高 设备简单 易实现自动化与连续化等优 点 萃取过程一般在常温 常压下进行 阎建辉等 研究了布洛芬对映体在含有疏水性 广酒石酸酯的1 2 二氯乙烷 溶液及甲醇水溶液两相中的萃取分配行为 结果发现l 酒石酸酯对布洛芬i i 对映 体的萃取能力要大于对布洛芬i 对映体的萃取能力 1 4 高效液相色谱手性固定相法及其在药物检测分析中的应用 1 4 1 高效液相色谱手性固定相法简介 从7 0 年代开始 特别是近些年来 h p l c 在手性研究中取得了令人瞩目的 进展 已成为测定光学纯度和获得纯光学异构体十分有效的方法 h p l c 可在常 温下进行 不会发生被分离溶质高温构型变化或破坏生物活性 柱容量高 具有 发展成为实验室和工业规模对映体制备分离技术的巨大潜力 h p l c 在拆分对映 体时通常有3 种方法 一是利用手性试剂与被拆分物进行衍生化反应生成非对映 异构体 从而可被传统的非手性h p l c 所拆分 二是在流动相中加入手性添加 剂 利用非手性固定相h p l c 进行拆分 三是利用手性固定相的h p l c 进行拆 分 其中 最简便和最有效的方法是高效液相色谱手性固定相法 c s p h p l c 4 6 o 手性固定相 c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e c s p 是通过物理吸附或者化学键合的方 法把手性化合物键合到固相载体如全多孔硅胶上 手性固定相色谱的优势在于 1 可用于多种外消旋体的拆分 2 可以同时高收率地得到两种高旋光纯度的对 映体 3 可以拆分一些特殊的外消旋体 如不能衍生化或易消旋的化合物 具 1 0 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕十学位论文 有特殊手性结构如螺旋或螺旋桨构象的化合物 4 可实现大量制备 可用于制 备性分离 特别适用于极性强 热稳定性差的手性药物的分析 4 7 4 9 1 c s p h p l c 法之所以能拆分对映体 是因为在c s p 与外消旋体相互作用 时 其中一个对映体与c s p 生成不稳定的短暂的对映体复合物 造成在柱淋洗 时保留时间不同 从而达到拆分的目的 各种不同的手性固定相具有不同的分离 模式 从理论上讲 不管选择何种固定相 分离何种对映体 手性分离或手性识 别都必须同时有三个相互作用点 这些作用中至少有一个依赖立体化学 该原理 1 9 5 2 年首次i 扫d a l g l e i s h 提出 称 三点作用原理 用图1 可以说明 笸 图1 三点作用原理 f i g u r e1t h r e ea c t i o np r i n c i p l e 将手性材料固定在硅胶表面 其中含有a b c 三个作用点 与溶质的一个 对映体相应的三个点a b c 作用 而与另一对映体则无c c 作用力 如果c c 作用力不等于c d 作用力 则该外消旋体就有可能被拆分 三点作用 的作用 力可以是氢键 偶极作用 范德华力 包合作用以及立体阻碍等 1 4 2 手性固定相的类型 自第一根手性色谱柱开始至今已经有2 0 余年的历史 现在用于色谱分离的 手性固定相已经被大量研究 已有1 0 0 多种液相色谱固定相被商品化 目前所研 究的高效液相色谱手性固定相根据其化学类型可分为9 大类 1 刷型 手性 定相 b r u s ht y p ec s p t 删 2 手性聚合物固定相 p o l y m e rc s p 3 环糊精类手 性固定相 c y c l o d e x t r i n sc s p t 5 1 4 大环抗生素手性固定相 m a c r o c y c l i ca n t i b i o t i c s c s p 5 2 5 蛋白质手性固定相 p m t e i nc s p t 5 3 6 配体交换手性固定相 蚓 7 冠醚手性固定相 g r o w ne t h e rc s p 5 5 8 分子印迹手性固定相 m o l e c u l a r i m p r i n t i n gc s p 9 多糖类手性固定相 1 4 2 1p i l d e 型c s p 刷型手性固定相也称p i k l e 型是目前使用量大 适用面广 对手性识别机理 揭示较深的一类重要c s p 这类固定相研究主要贡献应归功于美国i l l i n o i s 大学 1 l 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕 学位论文 的p i r k l ewh 研究组 故称p i r k l e 型手性固定相 因其结构特点也常称刷型手性 固定相 刷型手性固定具有独特的优点 1 经久耐用 共价键的存在使得硅胶上 的键合物不易流失 可承受过载的样品量 可使用强溶剂进行洗脱 柱子可完全 再生以及可适用于超临界流体色谱等 2 高色谱性能 基质上手性有机分子的 键合密度大 可承受较大的进样量而不改变固定相的性能 3 宽线性范围 从