（微生物学专业论文）油菜花粉的破壁方法及其多糖、黄酮提取纯化工艺研究.pdf

华中农业大学硕士学位论文 ，摘要 花粉是植物雄性配子体，存在于雄性花粉囊内，不仅具有低脂肪、高蛋白的 特点，而且含有人体生存所需的多种营养物质，素有“微型营养库”之称，在国 际上被誉为“完全营养品”，尤其是其中多糖、黄酮两类化合物。在增强机体免 疫力、降血脂、抗肿瘤、抗氧化等方面都有显著的功效。本实验以油菜花粉为原 料，研究了其破壁方法及多糖、黄酮两种活性物质的提取与纯化工艺。研究结果 表明： ( 1 ) 采用酶解与超声波相结合的方法对油菜花粉进行破壁处理，具体步骤为： 1 9 花粉与1 0 m l 混合酶液配成1 0 的花粉溶液，其中果胶酶酶活约6 0 0 u ，纤维 素酶酶活约4 5 0 u ，于4 5 1 2 ，p h 4 5 的条件下酶解1 2 h ，再用超声波破碎仪在4 0 0 w 条件下处理1 0 m i n ，破壁率最终可达约9 0 以上。 ( 2 ) 采用水提法对油菜花粉多糖进行提取的最佳条件为：在9 0 。c 水浴条件下， 按1 ：8 的固液比提取2 h ，并重复操作一次。按最佳条件分别对破壁与未破壁花粉 进行提取，多糖得率分别为1 6 3 1 和1 2 5 6 ，前者是后者的1 3 倍。采用t c a 法去蛋白和1 0 倍乙醇沉淀后，粗多糖中多糖含量约2 0 。再经乙醇分级，得到 三个级分，分别为p p a 、p p b 、p p c ，s e p h a d e x g - 2 0 0 柱层析显示p p a 为非均一 多糖，p p b 和p p c 为均一多糖。 ( 3 ) 采用乙醇提取法对油菜花粉黄酮提取的最佳条件为：在9 5 水浴条件下， 按1 ：3 5 的固液比提取2 h 。在最优条件下，对破壁与未破壁花粉进行提取，黄酮 得率分别为3 1 6 7 和2 1 0 3 ，前者是后者的1 5 倍。干燥后粗提物中黄酮的含 量为1 8 6 ，经大孔吸附树脂d m 1 3 0 纯化后黄酮含量可提高到6 0 5 。 关键词：油菜花粉；多糖；黄酮；提取：纯化 华中农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o l l e ni st h em a l eg a m e t o p h y t eo fg y m n o s p e r ma n da n g i o s p e r m i t sn o to n l y l o wf a ta n dh i g hp r o t e i n , b u ta l s oc o n t a i n sm a n yk i n d so fn u t r i e n tw h i c ha r en e c e s s a r y t oh u m a n b o d y i ti sw e l lk n o w n a san a t u r a ln u t r i t i o n 、h e a l t hf o o da n d “p e d e c tf o o d ” t h ea n t i t u m o ra c t i v i t yo fp o l l e nh a da t t r a c t e dm o r ea t t e n t i o ni nf o o d , b i o c h e m i c a l l a n dm e d i c a lf i e l d s u s i n gr a p ep o l l e na st h er a wm a t e r i a li nt h i sr e s e a r c h ，t h e m e t h o df o rb r e a k i n gw a l la n df o r e x t r a c t i n ga n dp u r i f y i n gp o l y s a c o h a r i d e sa n d f l a v o n o i d sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w ： ( 1 ) t h ew a l lw a sb r o k e nb ye n z y m o l y s i sa n ds u p e r s o n i c 1 9p o l l e nw i t h l o m l m i x e de n z y m es o l u t i o n s i nw h i c hp e c t o l y t i ca c t i v i t y6 0 0 ua n dc e l l u l o s ea c t i v i t y 4 5 0 u t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e ：e n z y m o l y s i sa t4 5 a n d p h 4 5f o r2 h o u r sa n d t h e ns u p e r s o n i ca t4 0 0 wf o r1 0 m i n t h ew a l l - b r o k e ne f f i c i e n c yc a nr e a c ha b o v e9 0 ( 2 ) t h ep o l y s a c c h a r i d e so fr a p ep o l l e nw e r ee x t r a c t e dw i t hw a t e r t h eo p t i m u m c o n d i t i o n so fe x t r a c t i o nw e r e1 ：8s o l i d - l i q n i dr a t i oa t9 0 f o r2h o u r sb y2 t h n e s t h e e x t r a c t i o np e r c e n to fp o l y s a c c h a r i d e sf i x m lw a l l - b r o k e np o l l e nw a s1 6 3 1 ，w h i c h w a s3 0 m o r et h a nu n b r o k e np o l l e n a f t e rd e p r o t e i n i z a t i o na n ds e d i m e n t a t i o n , t h e c o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d e sc a nr e a c h2 0 w eg o tt h e r ef i a c t i o n sa f t e rt h ea l c o h o l ： p p a 、p p ba n dp p c i ts h o w st h a tt h ep p ba n dp p ca r eh o m o g e n e o u sp o l y s a c c h a r i d e s t h r o u g hs e p h a d e xg - 2 0 0 ，b u tp p a i sn o th o m o g e n e o u sp o l y s a c c h a r i d e s ( 3 ) t h et l a v o n o i d so fr a p ep o l l e nw e r ee x t r a c t e dw i t he t h a n o l ，a n dt h ee x t r a c t i o n w a sp u r i f i e dw i t hm a c r o p o r o n sa d s o r p t i o nr e s i n t h eo p t i m u mc o n d i t i o no f e x t r a c t i o nw e r e9 5 e t h a n o la n d1 ：3 5s o l i d - l i q u i dr a t i oa t9 5 f o r2h o u r s t h e e x t r a c t i o np e r c e n to ff l a v o n o i d sf r o mw a l l - b r o k e np o l l e nw a s3 1 6 7 ，w h i c hw a s 5 0 6 m o r et h a nu n b r o k e np o l l e n d m - 1 3 0w a ss e l e c t e da st h eo p t i m u mr e s i no f8 t y p e so fm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n w h e nt h er e s i nw a sl o a d c dw i t h1 6 7 8 m g e x w a c t i o na n dd e s o r b e dw i t h5 0 m l5 0 e t h a n 0 1 t h ec o n t e n to ff l a v o n o i d sc o u l dr e a c h 6 0 5 k e yw o r d s ：r a p ep o l l e n ；p o l y s a c c h a r i d e s ；f l a v o n o i d s ；e x t r a c t i o n ；p u r i f y 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 名 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同x - 作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生挠是哆 帆泗了年占月；多日 蝴黼始彤撇名磐当呼 签名日期：a 叩年5 月f 易日签名日期：西，刁年多月，5 日 华中农业大学硕士学位论文 1 前言 1 1 花粉及其破壁方法 1 1 1 花粉概述 花粉是植物雄性配予体，存在于雄性花粉囊内，不仅具有低脂肪、高蛋白的特 点，而且含有人体生存所需的多种营养物质，素有“微型营养库”之称，在国际上 被誉为“完全营养品”( h e s l o p h a r r i s o n ，1 9 7 5 ) 。由于花粉经蜜蜂采集，故也常 称为“蜂花粉”。2 0 世纪8 0 年代，国际上掀起了一股花粉研究的热潮。通过2 0 多年 的努力，我国在花粉学基础理论和应用研究上都取得了显著的成绩。至今，已了解 了国内常见花粉的物质组成和营养价值，证实了其药用及保健功效，还开发了不少 以花粉为原料的保健品、药品和化妆品。 1 1 2 花粉的营养成分 花粉的营养成分非常丰富，至今已发现2 0 0 多种，主要有以下几类： ( 1 ) 蛋白质和氨基酸蜂花粉中的蛋白质含量很丰富，而且组成蛋白质的各种氨基酸 的比例也较合理，种类也比较齐全，共1 8 种，其中也包括人体必需的8 种氨基酸， 总氨基酸的含量在1 5 - 2 0 。 ( 2 ) 脂类蜂花粉中脂类含量为1 7 ，包括7 种饱和脂肪酸和1 4 种不饱和脂肪酸， 饱和脂肪酸占脂肪总量的2 5 2 3 ，不饱和脂肪酸占6 4 5 2 。 ( 3 ) 碳水化合物蜂花粉中糖类约占干物质的1 3 ，含量为1 8 2 3 ，有单糖、低聚糖 和多糖，尤其是多糖，具有很好的抑制肿瘤，抗衰老，提高集体免疫力功能的 活性。 ( 4 ) 维生素蜂花粉中维生素含量虽然很少，但种类十分齐全，都是维持人体正常生 理功能所必需的一类化合物。 ( 5 ) 微量元素蜂花粉中的微量元素多达1 4 多种，有钾、钠、钙、镁、锌、铜、铁， 锰、硒、镍、铬、钴等，人体1 4 种必需的微量元素在蜂花粉中都存在，其中钾 的含量最高。 ( 6 ) 酶类蜂花粉中含有8 0 多种酶，主要为还原酶、转化酶、淀粉酶、碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶、胃蛋白酶和脂酶等。 ( 7 ) 黄酮类化合物花粉中含的黄酮类化合物平均值为1 7 5 6 。 华中农业大学硕士学位论文 ( 8 ) 胡萝h 素、核酸、生长素等。 蜂花粉由于营养丰富，除具有保健作用之外，还具有多种特殊疗效。国内外续 断科学家对花粉在心血管病、前列腺炎、糖尿病、护肝、神经系统、造血功能、抗 衰老、抑制肿瘤、抗辐射、提高免疫功能、调节内分泌、美容等方面的药理、病理 与疗效进行了深入探讨，蜂花粉在上述方面均有很好的治疗效果( 王开发，1 9 9 9 ) 。 1 - 1 3 花粉的形状、大小与结构 花粉粒具有许多不同的形状，大多数为近球形。花粉粒的直径最小的只有1 0 9 m ， 个别大的有2 0 0 9 m ，一般在4 0 - 5 0 # m 之间。 花粉粒由花粉壁、萌发孔和原生质三部分构成。萌发孔为花粉萌发时，萌发管 伸出的地方( k r o h a n d k n u i m a n ，1 9 8 2 ；h e s l o p h a l t i s o l l ，1 9 8 7 ) 。花粉壁又称孢壁， 可分为内壁和外壁，内壁是孢壁最里面的一层，光滑、薄而有弹性，其主要成分为 纤维素、果胶质、半纤维素、蛋白质等。外壁是孢壁中结构较复杂的一层，耐酸、 耐碱、耐温、耐压，在地层中能完好的保存下来，成为孢粉学家研究化石孢粉的主 要对象。外壁较厚，硬而缺乏弹性，有几层。内层由2 - 3 层薄层组成，中间是基层， 最外面是含有脂类物质的脂外层。外壁外层又可分为两层，即柱状层和覆盖层。外 层通常有萌发孔或沟缝，为外壁最薄的地方。外壁的主要成分是孢粉素，该物质具 有物理、化学和酶的抗性作用( 王俊丽，1 9 9 7 ) 。 1 1 4 花粉破壁方法的研究现状 由于花粉具有异常坚韧孢壁结构，影响了花粉营养成分的吸收利用，也阻止了 提取时营养物质的释放，因此花粉的破壁就显得尤为重要。目前有关花粉破壁方法 的报道可分为3 类，即物理方法、酶解方法和微生物发酵的方法。 ( 1 ) 物理方法 常见的物理方法包括超声波、温差、高压气流等。 超声波破壁法是利用超声波的空化作用产生的气泡进行强烈振动，其振动力克 服了花粉粒外膜与花粉体之间的结合力，起到了扯裂的作用。李道平等( 1 9 9 2 ) 研 究表明：花粉加入4 0 6 0 的软水，搅拌均匀，浸渍2 3 h ，超声波发生器功率5 0 0 w ， 在温度3 0 - 7 0 时进行超声波处理1 0 2 0 r a i n ，破壁率可达7 5 。 温差法是根据细胞内的胞内水在低温下结成冰，而在骤然的升温条件下来不及 与细胞壁同时融胀，容易引起胞内的冰刺破花粉细胞壁，从而达到破壁的目的。将 2 华中农业大学碗士学位论文 花粉灭菌后，置于1 0 c 冰箱内存放2 4 h 以上，迅速投入8 0 的热水中搅拌，迅速冷 却至4 0 - 5 0 c ，并在恒温连续搅拌提取8 - 1 0 h ，过滤，滤液减压浓缩可得到高营养的 花粉提取液，提取率达7 2 3 ( 苗前等，1 9 9 7 ) 。 高压气流法即为高压气流粉碎破壁法，在高压气流粉碎机中，使花粉细小粉粒 随着超音速强气流旋转撞击在高强度的环状陶瓷圈上，致使花粉破碎，破壁率达 9 5 。9 9 。虽然报道的破壁率较高，但该法要求用含水量不高于4 的干燥花粉，湿 度一旦大时会产生一定的弹性，起了撞击中的缓冲作用，结果常常影响破壁率( 吕耀 奎和蔡力创，1 9 8 9 ) 。 ( 2 ) 酶解方法 酶解法主要是利用复合酶制剂进行破壁处理，卢挺( 2 0 0 2 ) 采用复合酶对青藏 高原油菜蜂花粉进行破壁研究，结果表明：在花粉浓度2 ，酶制剂添加量( 相对于 花粉量) 1 5 ，p h 值3 2 3 4 ，反应温度4 8 5 0 ，反应时间( 1 2 1 ) h 时，破壁率可达9 0 以上。杨晓萍( 2 0 0 4 a ) 用复合酶液( 含0 0 3 纤维素酶、0 0 3 果胶酶、0 0 3 蛋白酶) ， 在p h 3 0 条件下，3 7 处理3 h ，破壁率可达至1 9 2 8 6 。 ( 3 ) 微生物发酵方法 用于发酵破壁法的微生物主要有酵母、曲霉以及一些食用菌类。李柏勋等( 2 0 0 3 ) 用高糖酵母对油菜花粉溶液进行发酵，通过工艺优化，破壁率最高可达9 2 3 5 。宛 涛等( 1 9 9 7 ) 采用蒜汁酶解、黑曲霉发酵和直接发酵法破壁，并对3 种方法进行了比 较，结果表明：黑曲霉发酵法次于蒜汁酶解，但优于直接发酵。尚德静等( 1 9 9 6 ) 人利用灵芝菌、金针菇、香菇、猴头菌等食用菌深层发酵对花粉破壁进行了尝试， 结果表明：4 种食用菌都能使花粉破壁，破壁率在6 0 8 0 之间，其中灵芝茵破壁效 果最好。 在3 种常见的花粉破壁方法中，物理方法工艺简单，但对机械设备要求高( 例如 高压装置、低温冰箱等) ，而且机械能消耗大，生产成本较高，破壁率也相对较低 ( 唐维和张星海，2 0 0 3 ) ；另外，高压等剧烈处理过程对营养物质立体结构和生物 活性还会有影响( 吴懿平，2 0 0 3 ) 。酶解法反应条件温和，对营养物质活性影响较 小，但由于复合酶制剂使用量大，例如卢挺采用复合酶对青藏高原油菜蜂花粉进行 破壁处理时，酶制剂添加量使用量达到1 5 ( 相对于花粉量) ，而酶制剂成本高，因 此酶解法生产成本也较高，不适于工业化大规模的生产。而利用微生物破壁法，微 生物往往会耗用花粉中的营养物质，并生成一些新物质，给进一步的营养物质的分 华中农业大学硕士学位论文 离纯化增加困难。因此，探索一种能最大程度保留花粉营养成分的破壁方法，并且 经济实用，工业化可行性高，是花粉利用工作的首要环节，也是现代花粉研究的热 门内容。 1 2 多糖类化合物 1 2 1 多糖类化合物概述 多糖一般指存在于自然界的醛糖和( 或) 酮糖通过糖苷键连在一起的多聚物， 一般将少于2 0 个糖基的糖链称为寡糖，多于2 0 个糖基的糖链则称为多糖，其分子量 通常在数万至数百万，多糖纯品实质是一定分子量范围的均一组分，它的分子量只 代表相似链长的平均分配。多糖作为具有重要生理功能的生物大分子，能参与生命 过程的许多方面，往往具有降血脂、抗肿瘤、增强人体免疫力的作用( 姚新生，1 9 8 8 ) 。 1 2 2 多糖的分类 按构成多糖的糖基的化学结构种类来分，有同型和异型多糖两大类。所谓同型 多糖是指多糖化学结构中的糖苷基单体只有一种，是以不同的糖苷键连接而成的多 糖，其中绝大部分是p h d 葡萄糖构成的葡聚糖。所谓异型多糖也称杂多糖，是指由 两种以上的不同的糖苷基单体构成的多糖，其中又有中性多糖和酸性多糖之分。中 性多糖是由两种以上不含有机酸的不同的糖苷单体构成的聚合物；酸性多糖在组成 成分和结构上要比中性多糖复杂，除了含两种以上的糖苷单体外，还有一种或两种 以上的糖醛酸单体，因而酸性多糖的结构复杂多样。 1 2 3 多糖化合物的提取与纯化方法 多糖的提取大多数采用不同温度的水、稀碱稀酸溶液制取，现在用酶促法提取 的也比较多。如果用稀酸稀碱提取，提取时间宜短，温度不要超过5 0 c ，以避免糖 苷键的断裂，破坏多糖结构( 张惟杰，1 9 9 4 ) 。 由于大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可以用有机溶剂来沉淀多糖。 常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，一般p h 值7 0 在左右，反复溶解与醇析，得到粗多糖。 除去粗多糖中的蛋白质，常用三氯乙酸法、s e v a g e 法、蛋白酶法或其结合法； 含有色素的粗多糖可用活性炭吸附、离子交换树脂处理或双氧水脱色；无机离子、 低聚糖等小分子可通过透析去除。 多糖的分级方法很多，有季铵盐沉淀法、盐析法、分级沉淀法、离子交换分级 4 华中农业大学硕士学位论文 法、超滤分级法、凝胶层析法等( 徐任生，1 9 9 3 ) 。 多糖纯度分析的方法也比较多，有电泳法( 滤纸电泳、玻璃纤维纸电泳、醋酸 纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等) 、层析法( 纸层析、葡聚糖凝胶柱层析等) 、 高效凝胶渗透色谱法等( 郭亚贞等，2 0 0 0 ) 。 1 2 4 花粉多糖研究现状 花粉多糖具有多方面的生物活性，它能影响人体的网状内皮系统、巨噬细胞、 淋巴细胞、白细胞以及r n a 、d n a 、蛋白质的合成，抗体的生成，c a m p 和c g m p 含量，补体的生成以及对干扰素的诱生作用。( s c h l i i p m a n ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。花粉多糖通 过增强机体免疫力而在抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗肝炎、抗结核等方面具有独特 的作用( 王开发，2 0 0 4 ) 。耿越等( 2 0 0 1 ) 研究了玉米花粉多糖的免疫学作用，结果 表明：玉米花粉多糖p p m 可以促进小白鼠非特异性的细胞免疫和特异性的体液免疫。 陆明等( 2 0 0 2 ) 对花粉、花粉多糖、灵芝孢子抑制肿瘤的作用进行了对比，多糖组 的抑制作用最为明显，无论在瘤细胞和瘤重上都明显小于对照组，孢子组作用次之， 花粉的抑制效果最差。 为使花粉多糖得到有效利用，许多研究者在探索分离纯化方法方面作了研究。 如杨晓萍等( 2 0 0 4 b ) 对油菜花粉多糖提取工艺进行了优化，得到水溶性多糖提取率 为1 4 5 0 。任金山等( 1 9 9 0 ) 对油菜花粉多糖的分离纯化及单糖组成进行了研究， 分离出5 种多糖组分，分别为p - a ，p b ，p c ，p - d ，p e ，其中前三者为中性多糖， 后两者为酸性多糖。另外，李道荣等( 2 0 0 2 ) 、任平等( 2 0 0 4 ) 、何余堂等( 2 0 0 5 ) 分别多蒲黄、石榴和玉米花粉多糖提取进行了研究，实验表明：在6 0 c 一舳之间， 控制合适的固液比，花粉多糖有较高的提取率。 1 3 黄酮类化合物 1 3 1 黄酮类化合物概述 黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一种多酚类化合物，数量之多列天然酚类 化合物之首，大多具有颜色。( 周荣汉，1 9 8 5 ) 现代医学研究表明，黄酮类化合物具 有降低心肌耗氧量，增加冠脉和脑血管流量、软化血管、降血糖、血脂等作用，同 时它还是一种天然的抗氧化剂，具有清除人体中自由基、抗衰老、增加机体免疫力 的生理活性( 雍技等，2 0 0 5 ) 。 在1 9 5 2 年以前，黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 主要指基本母核为2 苯基色原酮的一 华中农业大学硕士学位论文 系列化合物。目前黄酮类化合物是泛指两个苯环( a 与b ) 通过三个碳原子相互连接 而成的一系列化合物，基本碳架为( 肖崇厚，1 9 9 4 ) ： 联玲职艘l i t 1 3 2 黄酮类化合物的结构与分类 根据中央三碳环的氧化程度、b 环连接位置( 2 - 或3 位) 以及三碳链是否构成环 状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分为：黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄 酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查耳酮、二氢查耳酮、花色素、黄烷- 3 醇、黄烷- 3 - 4 二醇、双苯毗酮、噢哝( 姚新生，1 9 8 8 ) 。 天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由糖的种类、数量、连接位置及连 接方式不同，可以组成各种各样的黄酮苷类( 黄酮苷是指由糖类通过还原性基团与 黄酮部分缩合而成的化合物，黄酮苷元是指苷脱去糖基的黄酮部分) 。组成黄酮苷的 糖类主要有( 肖崇厚，1 9 9 4 ) ： 单糖类：d 葡萄糖，d 半乳糖，d 木糖，l - r 李糖，i ，阿拉伯糖，d - 葡萄糖醛 酸等。 双糖类：槐糖，龙胆二糖，芸香糖，新橙皮糖等。 三糖类：龙胆三糖，槐三糖等 酰化糖类；2 一乙酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖等。 黄酮苷中糖连接位置与苷元的结构类型相关。如黄酮醇常形成3 - 、7 、4 单糖苷， 或3 ，4 - 及7 ，4 双糖苷等。 除0 糖苷外，天然黄酮类化合物中还发现有c 糖苷，如葛根黄素、葛根黄素， 木糖苷，为中药葛根中的扩张冠状脉血管的有效成分( 万素英等，1 9 9 8 ) 。 1 3 3 黄酮类化合物的性状与溶解性 黄酮类化合物多为结晶性固体，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末，一般情况， 黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄一黄色，查耳酮为黄一橙黄色，而二氢黄酮、及二氢 黄酮醇不显色，异黄酮类显微黄色，花色素及其苷元的颜色随p h 不同而改变，一般 显红0 h 8 5 ) 。 6 华中农业大学硕士学位论文 一般苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及 稀碱水溶液中；黄酮苷一般易溶于水、甲酵、乙醇等强极性溶液中，而且糖链越长， 水溶度越大( 姚新生，1 9 8 8 ) 。 1 3 4 黄酮类化合物的提取方法 黄酮类化合物的提取，主要是根据被提取物的性质及伴随的杂质来选择合适的 提取溶剂，苷类和极性较大的苷元，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或 某些极性较大的混合溶剂 例如甲醇水( 1 ：1 ) 进行提取。大多数的苷元宣用极性较 小的溶剂，如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等来提取，多甲氧基黄酮类苷元，甚至可以用 苯来提取常见的有以下几种方法： ( 1 ) 有机溶剂萃取法 甲醇或乙醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，一般选取合适浓度的溶剂，提 取次数为2 4 次，可用加热抽提法和冷浸法。现在一些研究者为了提高所得产物的收 率，还采用了外加物理场的方法，如超滤法( 陈运中等，1 9 9 9 ) ，微波提取法( 王自军 等，2 0 0 5 ) ，超声波提取法( 赵兵等，1 9 9 9 ) 等，从而提高提取效率，缩短提取时间以 及减少有机溶剂对环境的污染。 ( 2 ) 热水提取法 热水仅限于提取苷类，例如从槐花米中提取芦丁。但由于热水提取出的杂质较 多，故不常使用。 ( 3 ) 碱性水或碱性稀醇提取法 由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水( 如碳酸钠、氢养化纳、氢 养化钙水溶液) 或碱性稀醇( 如5 0 7 醇) 浸出。用碱性溶剂提取时，所用的碱浓 度不宣过高，以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物母核。当有邻二酚羟基对，应 加硼酸保护。 ( 4 ) 超临界c 0 2 萃取法 超临界c 0 2 萃取技术( s u p e r c r i f i c a lf 1 l l i de x t r a c t i o n ，简称s f e ) 是利用超临界状 态下的c 0 2 流体，从混合物中有选择的溶解其中的某些组分，然后通过减压升温将 其分离的一种技术。同传统的溶剂提取相比，它具有显著的产品回收率和纯度，改 进了产品质量、降低能耗等优点( 张德权和胡晓丹，2 0 0 5 ) 。 由于超临界c 0 2 是一种非极性溶剂，适合于亲脂性且相对分子量较小的物质的 7 华中农业大学硕士学位论文 萃取，而对极性较强的物质( 如黄酮类化合物) ，则需加入适宜的夹带剂，以调节溶 剂的极性，提高溶剂的溶解能力。常用的夹带剂有甲醇、乙醇、丙酮等。高荫榆等 ( 2 0 0 2 ) 对蜂胶黄酮类化合物超临界萃取工艺研究表明，在萃取压力2 5 m p a 、乙醇 浓度9 5 、固液比6 ：1 、萃取温度5 0 、萃取时间4 h 、流体流速3 5 k g h 是效果最佳， 且萃取物纯净、色泽金黄、纯度高，但同时也表明，相对醇提工艺，超临界方法黄 酮得率较低。 1 3 5 黄酮类化合物的纯化方法 ( 1 ) 溶剂萃取法 用水或不同浓度的醇提取得到的浸出成分复杂，往往不能直接析出黄酮类化合 物，需尽量蒸去溶剂，使成为糖浆状或浓水液。然后用不同极性的溶剂相继萃取， 可能使苷和苷元分离( 或使极性与非极性苷元分离) 。例如先用乙醚从浓水液中萃取 苷元，再用乙酸乙酯反复萃取苷。 ( 2 ) 铅盐沉淀法 在乙醇或甲醇的提取液中加入饱和的中性乙酸铅溶液，可使具有邻二酚羟基或 羧基的黄酮类化合物沉淀析出。如果所含的黄酮类化合物不具有上述结构，则加中 性乙酸铅发生的沉淀为杂质，过滤除去。再向滤液中加碱式乙酸铅，可是其它黄酮 类化合物沉淀析出。 ( 3 ) 柱层析法 柱层析分离技术是当前广泛采用的分离纯化方法，常用的柱填充剂有聚酰胺、 硅胶、氧化铝、葡聚糖凝胶、大孔树脂等。 大孔吸附树脂是2 0 世纪6 0 年代发展起来的有机高聚物吸附剂，具有很好的大孔 网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择性的吸附有机物， 其吸附作用是通过表面吸附、表面电荷或形成氢键来完成的。它具有物理化学稳定 性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用 周期长、节省费用等诸多优点，所以广泛用于黄酮类物质的提取。 1 3 6 花粉黄酮研究现状 l e w i s 最早报导从花粉提取出类黄酮，以后日本的久道周次和德国的威尔曼等 都先后报导对多种花粉含黄酮类检测的结果( 王开发，2 0 0 4 ) 。花粉中的黄酮多以糖 苷的形式存在，即一个糖的半缩醛羟基与苷元结合，非糖部分叫糖苷配体或配糖体， 8 华中农业大学硕士学位论文 在葡萄苷酶的作用下生成，d 葡萄糖是最常见的结合糖，d 半乳糖和l 鼠李糖也常 见( 孙丽萍。2 0 0 5 ) 。目前从花粉中发现的黄酮类化合物有：木解皮酮、山奈酚、杨 梅黄酮、木犀黄素、异鼠李素、原花青素、二氢山奈酚、柚( = 苷) 配基、芹菜( 苷) 配 基等( 王开发，2 0 0 4 ) 。 目前国内有关花粉黄酮的研究较少，仅在含量测定和药理功能方面，有少数的 报道，如魏永生等( 2 0 0 5 ) 分别采用h p l c 法和比色法对青海油菜蜂花粉黄酮类化合 物含量进行了研究，结果发现h p l c 法测定的含量为3 1 9 4 ，比色法测定的含量为 3 7 0 ；以及玉米花粉黄酮对s d 大鼠降血脂作用( 王开发和支崇远，2 0 0 2 ) 、对清除 自由基( 王开发等，2 0 0 1 ) 的作用和油菜花粉黄酮清除羟基自由基方面的作用( 石 玉平等，2 0 0 4 ) 。 总之，花粉黄酮的保健功效已得到逐步的证实，但现阶段国内外对花粉黄酮的 研究还较少，很多内容需要迸一步的探索与开发。随着人们对花粉黄酮物质的保健 功效进一步认识，有关花粉黄酮的研究势必成为花粉研究的热点。 1 4 花粉产品的开发流通现状 从2 0 世纪8 哞代开始，花粉产品开始进入市场。截止2 0 0 0 年，经卫生部正式获 准的花粉保健品有2 9 种，如：舒仲花粉精( 西安舒伟花粉有限公司) 、国珍牌松花粉 ( 烟台新时代天然营养品公司) 、新田花粉胶囊( 武汉新田保健品公司) ，花颜花粉 ( 深圳太太药业有限公司) 等。获准字号的花粉药品7 种，如前列康胶囊( 浙江宏达 药业有限公司) 、可瑞牌花粉片( 安徽可瑞药业公司) ，以及进口的“舍尼通”花粉 片和复方“消渴丸”等。在化妆品方面的产品有上海宝润堂的花粉菁华养颜霜、花 粉赋活洗面奶，甘肃天水的花粉营养霜、花粉沐浴露等。 目前，在市场上流通的花粉产品仅有报批产品的二分之一左右，随着时间流逝 有近一半的产品销声匿迹了，而且新产品的开发也越来越少。究其原因，这些产品 大多数是由原花粉经粗加工而生产而成，缺少必要的破壁过程，人们在服用或使用 过后未能得到明显的效果，因此馒慢地失去了竞争力。 近些年来，人们逐渐认识到这个问题，相应研制了一些破壁花粉的产品。如中 国林业科学研究院松花粉研究开发中心采用超低温气流破壁技术生产的亚林破壁松 花粉粉剂、片剂、软胶囊，上海如来福生物科技有限公司采用低温气流对撞破壁技 术生产的如来福松花粉片、胶囊。但由于低温气流破壁技术成本高，这些产品售价 华中农业大学硕士学位论文 也很高。常见花粉的平均零售价为1 0 元1 0 0 9 ，破壁产品的平均零售价都在1 8 0 元l o o g 左右，无疑昂贵的价格也让消费者望而却步。 当前市场上的花粉产品有原花粉产品和破壁花粉产品两类，但都因各自的局限 性而未得到广泛的应用。因此探索新技术，更合理利用花粉资源仍然需要进一步研 究。 1 5 研究方法与目的 花粉营养成分丰富，在抗衰老、抑制肿瘤、抗辐射、提高免疫功能、调节内分 泌等方面都有显著疗效。我国花粉资源丰富，花粉年产量约2 0 0 0 吨，居世界首位一 但花粉的利用技术还比较有限，花粉的资源优势没有真正显现出来。 花粉破壁是花粉利用的首要前提。目前花粉的破壁研究的报道较多，但没有比 较系统的研究，已有的几种方法运用到工业化生产时往往成本过高。 对于花粉活性物质( 多糖和黄酮) ，有少量报道，但尚无完整的提取纯化工艺流 程，尤其是花粉黄酮，内容多集中在含量测定与成分分析方面，有关其提取纯化工 艺则鲜有报道，更缺少可行的工业化生产方法。 近年来，花粉已开发作为饲料添加剂，由于其具有营养和动物保健双重功能， 具有替代饲用抗生素的重要前景而倍受关注。花粉饲料添加剂一般是原花粉，加之 原花粉利用率低，花粉饲料添加剂高的使用成本极大的限制了市场需要。 基于以上几个方面，本研究以油菜花粉为实验对象，采用微生物酶解与超声波 破碎相结合的方法对花粉进行破壁处理，并在此基础对多糖、黄酮进行提取与纯化， 以期为饲料添加剂的研制、食品与保健品的开发以及油菜花粉资源的利用提供科学 理论依据。 1 0 华中农业大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 材料 本实验采用武汉扬子江蜂产品公司提供的油菜花粉作为原料。 2 1 1 主要仪器与试剂 仪器：h h 4 数显恒温水浴锅( 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司) ；7 5 2 紫外光 栅分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ；j y 9 2 h d 型超声波细胞破碎仪( 宁 波新芝生物科技股份有限公司) ；旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) ； h a m - s 0 - 0 1 ( 0 2 ) 型超临界萃取装置( 南通市华安超临界萃取有限公司) ，t d l - 5 离心 机( 上海安亭科学仪器厂) ；真空冷冻干燥机( 美国v i r t i sc o m p a n yi n c ) 试剂：芦丁( 中国医药生物制品检定所) ；常见试剂均为a r 级：d a - 2 0 1 、d m 3 0 1 、 d s - 4 0 1 、d m 1 3 0 、d 1 4 0 0 、n k a i i 、n k a - 9 、s 8 型大孔吸附树脂由天津市海光化 工有限公司提供； 2 1 2 菌株 黑曲霉i - i s 和里氏木霉l 6 0 由华中农业大学发酵工程实验室保藏。 2 1 3 培养基 ( 1 ) 麸皮培养基 麸皮l o o g ，k i - 1 2 p 0 4 0 5 9 ，( 、l r h 4 ) 2 s 0 4 0 5 9 ，t w e 圯n 8 00 3 9 ，料水比为1 ：1 1 。 ( 2 ) 稻草粉麸皮培养基 稻草粉6 0 9 ，麸皮4 0 9 ，k h 2 p 0 4 0 0 5 9 , c a c l 2 0 0 5 9 , ( m 1 4 h s 0 4 1 8 9 ，n a c l o 1 9 ，料 水比为1 ：2 。 2 2 花粉的破壁方法 根据花粉细胞壁物质结构，选取产果胶酶的黑曲霉与产纤维素酶的木霉进行固 态发酵产酶，利用酶液对花粉细胞进行酶解，从而达到破壁的效果。再结合超声波 破碎，使其达到较高的破壁率。 2 2 1 破壁花粉形态及破壁率的计算 下图中，图1 为完好的油菜花粉细胞( 1 0 x 1 0 0 显微摄影) ，当花粉经破壁处理 后，在显微镜下呈现不同的形态( 图2 7 ) ： 华中农业大学硕士学位论文 ( 1 ) 花粉壁自萌发孔处裂开，内容物自萌发孔处溢出( 图2 ) ； c 2 ) 花粉壁除萌发孔处外，还有其它部分也有破解，内容物自萌发孔和其它破裂处 溢出( 图3 ) ： ( 3 ) 花粉壁完全分解为数块残片，内容物全部溢出( 图4 ) ； f 由正交试验极差分析可知，影响油菜花粉黄酮提取的主次顺序依次为温度、时 间、固液比。利用s a s9 0 软件对数据进行方差分析，其中a 因素温度和b 因素时间 的p 值均小于0 0 5 ，是显著的，即温度和时间是影响花粉黄酮提取的重要因素。根据 正交试验结果，油菜花粉黄酮提取的最佳组合为a 3 8 2 q ，即在9 5 水浴条件下，按 1 ：3 5 的固液比提取2 h 。按最优条件对破壁与未破壁花粉进行提取，黄酮得率分别为 3 1 6 7 和2 1 0 3 ，其中破壁花粉粗提物中黄酮的含量为1 8 6 。 3 3 5 大孔树脂的筛选 提取得到的粗黄酮通过大孔树脂处理得到纯化，下面是对大孔树脂的性能和动 力学特征进行筛选。 表88 种大孔树脂性能比较 t a b l e 8c o m p a r i s o no fc a p a b i l i t yo fe i g h tt y p e so fm a c r o p o r o u sr e s i n 华中农业大学硕士学位论文 由表中数据可知，d a - 2 0 1 、d s - 4 0 1 、d m - 1 3 0 、d 1 4 0 0 、s - 8 都具有较大的吸附 率，而s 8 的解吸率很小，可以排除。下面通过吸附动力学研究，对d a - 2 0 1 、d s 4 0 1 、 d m 1 3 0 、d 1 4 0 0 四种树脂做进一步筛选。 0 4 5 0 4 0 3 5 0 3 吸光值。雹 0 1 5 o 1 0 0 5 o lz3456。7 时间( h ) 图3 04 种大孔树脂吸附动力学曲线 f i 9 3 0 a d s o r p t i o n d y n a m i c s 棚r v e o f f o u r t y p e s o f m a c r o p o r o u sr e s i n 由上图可以看出，在吸附3 h 后，d m - 1 3 0 基本达到饱和，而其它3 种均在7 h 后才达到饱和，即d m 1 3 0 在短时间内吸附速率较大，放选用d m 1 3 0 型大孔树脂 作为纯化花粉黄酮的树脂。 3 3 6 上样量的确定 在上样浓度一定的情况下，树脂吸附能力会随上样体积的不断增加而趋近饱和。 由图5 可见，当上样浓度为o s 3 9 m g m l ，收集到2 0 r a l 时，吸光值变化不再明显， 即树脂对黄酮的吸附能力减弱，故上样量控制在1 6 7 8 m g 。 0 4 0 3 5 0 3 0 2 5 吸光值o 2 o 1 5 0 1 0 0 5 0 ，o2 4 68l o 1 21 4 1 61 82 0 2 22 42 62 8 体积( m i ) 图3 1 上样量的确定 f i 9 3 1r e s u l to fo p t i m i z i n gl o a d e da m o u n t 华中农业大学硕士学位论文 3 3 7 洗脱液浓度的确定 在一定范围内，洗脱剂浓度越高，解吸出的黄酮量势必越多，但随之解吸出杂 质的量也越多。由图6 可见，当乙醇浓度达到5 0 以上时，吸光值变化趋于平缓， 即洗脱出黄酮的量变化不大，故选用5 0 的乙醇作为洗脱液。 0 2 0 1 8 吸光值0 1 6 o 1 4 0 1 2 o 1 嘣2 嘿4 溉6 假8 假 1 乙醇浓度 图3 2 不同体积分数乙醇的洗脱效果 f i 9 3 2e f f e c to fd e s o r p t i o na b o u te t h a n o lo fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n 3 3 8 洗脱曲线及洗脱体积的确定 01 02 03 04 05 06 0 7 0 8 09 0 体积( d ) 图3 3 洗脱曲线 野驴3e i u t i o nc u r v e 由洗脱曲线可知，当洗脱体积达至0 5 0 m l 后，黄酮已基本被洗脱，故洗脱体积控 制在5 0 m l 。收集前5 0 m l 洗脱液，浓缩干燥后黄酮纯度提高n 6 0 5 。 3 4 超临界c 0 2 萃取花粉中有效成分 在对萃取压力、萃取温度、夹带剂浓度、夹带剂体积、流体流量分别做单因素 7 6 5 4 3 2 1 o 酮量d 黄含b 华中农业大学硕士学位论文 分析时，得到以下结果： ( 1 ) 实验条件( 如压力、流量等) 很难达到稳定状态，总处于不断起伏中，且起伏 的幅度较大。特别是萃取压力，常常降低后就不再上升； ( 2 ) 无论采用何种条件，分离得到的萃取液始终远远少于萃取前加入的夹带剂体积； ( 3 ) 萃取液浓缩并干燥后得到的萃取物很少( 1 2 9 ) ，且并不随萃取条件的改变而有 规律的变化； ( 4 ) 将萃取物分别溶于蒸馏水和乙醇，检测多糖和黄酮的含量，发现几乎不能检测 到上述两种物质，偶尔能检测到但含量极低； ( 5 ) 将能检测到少量物质的实验条件进行重复实验，不能得到前一次的结果。 超临界c 0 2 萃取花粉中多糖、黄酮的实验未达到预期的效果，究其原因，可能 有以下几个方面： ( 1 ) 目标产物在有夹带剂的状况下仍然难以溶于超临界c o ：气流中 ( 2 ) 大量提取物质滞留粘附于仪器管道中，使得萃取物减少。 ( 3 ) 由于花粉的状态容易与和夹带剂混合后形成大小不等的团状，从而减少了超临 界c o ：流体以及夹带剂与花粉颗粒的接触面积，造成目标物质难以分离。 由以上实验结果及分析可以初步推断：采用超临界c 0 2 萃取花粉中多糖、黄酮 的方法是不可取的。 华中农业大学硕士学位论文 4 小结与讨论 4 1 小结 本实验通过对油菜花粉破壁方法的研究，提出了一套成本低，具有工业化可行 性的方案，另外通过对花粉活性物质多糖、黄酮的提取研究，提出了完整的提取纯 化工艺，为产品的工业化生产奠定了基础。 ( 1 ) 经过花粉的破壁方法的研究，得到以下油菜花粉破壁的最佳条件：1 9 花粉与 l o m l 混合酶液配成1 0 的花粉溶液，其中果胶酶酶活约6 0 0 u ，纤维素酶酶活约 4 5 0 u ，于4 5 c ，p h 4 5 的条件下酶解1 2 h