（植物病理学专业论文）嗜热真菌thermomyces+lanuginosus丝苏氨酸蛋白激酶的基因克隆和序列分析.pdf

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2 7 0 组成了类似激酶区域。经过p h d 预测，我们可知此序列形成 的主要功能域可以形成5 个螺旋和5 个1 3 折叠。通过s w i s s - - p d b v i e w e r 程序观察到预测的蛋白质3 d 结构3 个螺旋，1 个b 折叠和3 个b s 妇n d 。 通过对e d n a 的c 端的级结构进行预测，发现其保守的功能区域 具有和激酶类似的特征：丫 关键词：蛋白激酶，r t - p c r ，zl a n u g i n o s u s ，c d n a ，生物信息学 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a 1 1l i v i n gc e l l sm u s tc o n s t a n t l yb ei n t e r f e r e db ya l lk i n d so ff a c t o r sd u r i n g t h e i rl i r ec y c l eo fp r o l i f e r a t i o n ，d i f i e r e n t i a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n dd e a t h t h e s e f a c t o r si n c l u d en o to n l yt h ei n t e r c e l l u l a rh o r m o n e sb u ta l s oe x t r a c e l l u l a rl i g h t t e m p e r a t u r ea n dw a t e rs oo n a 1 1t h e s er e q u e s tt h ee e l lt or e c o g n i z ea n dr e c e i v e t h e s es i g n a lf a c t o r sc o r r e c t l ya n dr e s p o n dt ot h e ma ss o o na sp u s s i b l et o c o n t r o lt h ec o u r s e so fp r o g r e s s i o na n dc e l l u l a ra c t i v i t i e s i nt h i sw a y , t h e r e c e i v e r sl i e i nt h em e m b r a n eo ft h ee e l lr e c o g n i z i n gt h ee x t e m a ll i g a n d t h e n t h ee x t e m a ls i g n a l sa r et r a n s d u c t e di n t ot h en u c l e o l u st or e g u l a t et h eg e n e e x p r e s s i o na n de r m y m ea c t i v i t yl e a d i n gt ot h ee e l ir e s p o n s e w ec a nc o n c l u d e m a t s i g n a l t r a n s d u c t i o np l a y sa n i m p o r t a n tr o l e i nt h e p r o c e s s e so f e n v i r o n m e n t - e e l l i n t e r a c t i o n al o to f s t u d i e sh a v er e s u l t e dt h a tk i n a s e sa n dp h o s p h a t a s e sa r el i k e l yt ob e i m p o r t a n tm e d i a t o r so fs i g n a lt r a n s d u c t i o n t h r o u 曲p b o s p h r y l a t i o na n d d e p h o s p h o r y l a t i o n ，t h ea c t i v i t ya n ds t r u c t u r eo fp r o t e i nc h a n g e d e x t e r n a l s i g n a la r et r a n s d u c t e di n t ot h ec e l ln u c l e o l u sb yt h es i g n a lc a s c a d e p r o t e i n k i n a s em e d i a t e d p h o s p h o r y l a t i o nr e g u l a t e sp r o t e i nf u n c t i o n ，m e m b r a n e c h a n n e l sa n dp u m p sa n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sb yw h i c hc h a n g e dt h eg e n e e x p r e s s i o n i n d i a ns c i e n t i s tr a yf o u n di n1 9 9 4t h a tt h r e em e m b r a n ep r o t e i n s t h e yi s o l a t e d f r o mp s e u d o m o n a ss y r i n g a ew h i c hw e r ep h o s p h o r y l a t e di n r e s p o n s et ot e m p e r a t u r ec h a n g e sa n dr e s u l t e dt h a to n eo ft h e s ep r o t e i n sw a s p o s s i b l y ah i s t i d i n e k i n a s e t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u si s ak i n d o f h e a t - e n d u r a b l ef u n g u sw h i c hc a nl i v en o r m a l l ya ta b o u t5 0 i no r d e rt op r o b e t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo ft h ec h a r a c t e r i s t i c so fh e a t e n d u r a t i o nw eh a v e b e e nt r y i n gt oc l o n et h eg e n eo fa p r o t e i nk i n a s ea n dl o o k i n gf o r t h em o l e c u l e s u p s t r e a ma n dd o w n s t r e a mo fi t u s i n gr t - p c r 。o n e1 2 4 3 b pc d n af r a g m e n t w a so b t a i n e d 3s e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec l o n e dc d n ao fz l a n u g i n o s u sw a ss i m i l a r t ot h a to f f i s s i o ny e a s tp r o t e i nk i n a s ed s k c o m p a r i s o nr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh o m o g e n e i t yo ft h e3 d e d u c e da m i n o a c i d sw a sa b o v e6 0 s i xc o n s e r v a t i v ea m i n oa c i ds u b d o m a i n sw h i c hm o s t s e r t h rp r o t e i nk i n a s ec o n t a i nc a nb ef o u n di nt h ed e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c e c o m p a r i s o no ft h en e c l e o t i d es e q u e n c er e s u l t e d t h a tt h e h o m o g e n e i t yi sn o th i g h ( 10 ) h o m o g e n e i t yd o m a i n si s a ss h o r ta s4 0 n t h o w e v e r w ec a nf i n dt h a tg c o ft h ec d n ai sh i g h e r ( a b o u t5 6 ) w h i c h s h o w e da no r g a n i s ms p e c i f i c i t y l o o k i n gi n t ot h ep r e f e r e n c ec o d o n so f7 = l a n u g i n o s u s ，w ef o u n dt h ea v e r a g ev a l u eo fg c i sa b o u t5 3 w es u r m i s e t h a ts u c ha h i g hg c v a l t l em a yb ei m p o r t a n tf a c t o rf o rt i f f sk i n do ff u n g u st o 3 嗜热真菌t h e r m o m y c e s l a n u g i n o s u s 丝，苏氩酸岱白激酶的巷闻克隆及序列分析 l i v en o r m a l l ya ta b o u t5 0 w et r i e dt oo b t a i nt h e5 - e n do ft h ec d n ab v 5 r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o n o fc d n ae n d s ) u n f o r t u n a t e l y ，d u et ot h e c o m p l e x i t yo f5 r a c ea n du s eo fas i n g l eg e n e - s p e c i f i cp r i m e r ( w i t ht h e a n c h o rp r i m e r ) ，t h el e n g t ho f5 - e n df r a g m e n tw ee a i m a t e di st o ol o n gt ob e c a p t u r e d w ef a i l e dt oi s o l a t et h e5 - e n d so ft h ee d n a s o u t h e r nb l o ta n a l y s i s s h o w e dt h a tz l a n u g i n o s u sg e n o m em a yc o n t a i no n eh o m o l o g yo ft h ec d n a f r a g m e n t b i o i n f o r m a t i c si sp u s h e da h e a d q u i c k l yb e c a u s eo ft h ei n t e m e t d e v e l o p m e n t u s i n gt h ei n t e m e ti n f o r m a t i o nt oe x p l o r et h ed i s t i n c t i o no fl i r e b e c o m e so n em a j o rr e s e a r c hf i e l d h u m a ng e n o m ep r o j e c tw a sc a r r i e do u ta n d b r o u g h tr a p i dg r o w t ht ob i o i n f o r m a t i o n 。a i lt h e s em a k ei tp o s s i b l et ou s e b i o i n f o r m a t i o nf o rg e n ec l o n i n g ，s e q u e n c ea n a l y s i sa n dp r o t e i nf u n c t i o n p r e d i c t i o n w bu s e dt h eb i o i n f o r m a t i o ni ni n t e m e tt op r e d i c tt h et r a n s m e m b a n e d o m a i n ，s e c o n d a r ys t r u c t u r ea n d3 ds t r u c t u r ef o rt h ed e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c eo f t h ec d n af r a g m e n t k e y w o r d s ：p r o t e i n k i n a s e ，r t - p c r , z l a n u g i n o s u s e d n a , b i o i n f o r m a t i c s 4 山东农业人学顾上学位论文 中英文缩略词 英文名称中文名称 a t p b s a c d n a d n t p d m s o d t t e d l _ a g l y c e r o l i p t g p n k s d s t d t t d s 1 _ a e t b e x g a l 腺茁三磷酸 牛血清白蛋白 互补d n a 脱氧核萤酸 二甲基亚矾 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 甘油 异丙基硫代一口- d 半乳糖营 多核营酸激酶 十二烷基磺酸钠 末端脱氧核首酸转移酶 三( 羟甲基) 氮基甲烷 t n s 一乙酸一e d 。r a t n s 一硼酸一e d t a 5 - - 溴一4 一氯一3 一吲哚一b d 一、l ! 乳糖廿= 5 山东农业大学硕上学位论史 第一章引言 1 蛋白激酶概述 1 1 蛋白激酶在细胞信号转导中的作用和意义 生物细胞在整个生长发育过程中，受到各种因素的影响，其中既有内 在因素如激素，也有外在因素如光线、气温、水分等。这就要求细胞能够 正确的辨别和接受各种信息并做出反应，以便确保其正常的生长和发育。 在此过程中，细胞通过表面受体接受外部信号配体，然后把相应的信号传 递到有关的细胞内部，调节基因的表达或酶活性，从而使细胞作出相应的 反应。由此可见，信号转导是外界同生物体或生物体细胞问的信息传递的 重要手段。 蛋白质磷酸化是指由蛋白激酶催化腺苷三磷酸a r p 或鸟苷三磷酸 g t p 的y 磷酸基转移到底物蛋白质分子氨基酸残基上的过程。关于细胞 生长、分化、代谢、增殖、癌变调控的分子机理的研究是当代生物化学和 分子生物学发展最迅速的领域之一。这些问题部与生物细胞信号分子在细 胞内的传递有关。许多研究证实，生物信号在细胞内传递的基本和主要方 式是蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质可逆磷酸化。蛋白激酶作为重要 的信号分子，在细胞周期调控、细胞的分化、衰老和凋亡中的作用逐渐被 广大学者所认识和接受。美国生物化学和分子生物学家k r e b s 和f i s c h e r 两人于1 9 5 9 年纯化了第一个磷酸化酶激酶，并提出了“可逆蛋白质磷酸 化作用”的理论。随着分子生物学技术的发展和日臻完善，大量的蛋白激 酶被发现，数百个蛋白激酶的基因被分离和克隆。1 9 9 2 年诺贝尔生理或 医学奖授予了提出“蛋白质可逆磷酸化”理论的k r e b s 和f i s c h e r 两位科 学家。2 0 0 1 年，由于发现了细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶和细胞周期蛋 白基因及提出了细胞周期的分子调控机制，h a m v e l l 、n u r s e 和h u n t 三人 被授予诺贝尔生理或医学奖。 蛋白激酶作为胞内信使的直接或问接靶酶，通过磷酸化和去磷酸化其 他酶类或蛋白质的特异氨基酸贱基激活信号传导链，或明1 7 基因表达或改 7 嗜热真菌t h e r m o m y c e s l a n u g i n o s u s 丝，苏氨酸蛋白激酶的堆l 问兜隆及序列分折 变酶的活性将外部信号传到细胞核。细胞利用位于膜表面的蛋白受体识别 并和信号配体结合，蛋白激酶的活性被激活，通过磷酸化靶蛋白上的特殊 氨基酸残基，使靶蛋白发生结构变化，从而激活下游蛋白激酶的活性，将 信号传导到细胞内部。有些蛋白激酶就是膜上受体，同时具有配体( 信号) 结合结构域，跨膜结构域和催化功能结构域。由于蛋白激酶的底物既可以 是代谢酶类，也可能是细胞骨架蛋白，甚至是转录因子，因此，蛋白激酶 催化的磷酸化作用既可以直接通过对酶的磷酸化修饰而改变酶活性，又可 以间接通过修饰转录因子而激活或抑制基因的表达，使细胞对外来信号作 出反应。同其他的调节方式相比，蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化在信号 转导中的作用有以下几个鲜明的特点：1 ) 蛋白激酶通过蛋白质磷酸化作 用将外部信号级联放大。因为它是以酶调节反应为基础，所以即使是很微 弱的外部信号也可通过一系列的反应得到充分放大，在这样的一个级联途 径中，前一个反应的产物是后一个反应的催化剂，每修饰一次就产生一次 放大作用。2 ) 信号转导的复杂性在一定程度体现在多个蛋白激酶参与了 蛋白质的磷酸化，这些蛋白激酶位于信号转导线路的交叉点上并且相互作 用( c r o s s t a l k ) ，因而构成了信号转导的网络。3 ) 信号分子在细胞内的寿 命短暂性和信号转导的相对持久性的矛盾。一般说来，通过蛋白质的磷酸 化，可使细胞对外界信号作出既迅速又持久的反应，酶被磷酸化后被激活， 去磷酸化后往往没有活性。通过控制细胞内被磷酸化后的活性酶的量，而 控制信号的传递，虽然细胞内信号分子寿命很短暂，但激酶一旦被激活， 其活性就可以通过自身磷酸化等方式保存，被磷酸化的蛋白质可以保持更 长时间的磷酸化效应，直到被蛋白磷酸酶脱掉磷酸根为止。 蛋白质的磷酸化作用除了调节酶的活性外几乎涉及了细胞所有的生 理过程，从磷蛋自在胚胎发育中的营养作用，到细胞的生殖发育、分裂分 化的调控、基因的表达，甚至癌变等都有磷酸化作用的参与。其调节对象 包括酶、激酶、离子泵、运输蛋白、收缩蛋白、调节蛋白及各种受体( m a r t i n ， 1 9 9 9 ) 。 1 2 蛋白激酶的分类研究 蛋白质磷酸化作为一种共价调节酶活性的机制是5 0 年代由f i s c h e r 等 8 山东农业大学硕_ 上学位论文 阐明的，h a n k s 等对于不同生物来源的蛋白激酶进行研究以后认为蛋白激 酶家族是一个非常大的超级家族，不同的蛋白激酶催化区具有相当高的保 守性( h a n k s ，1 9 8 8 ) 。 目前有两种重要的分类方法。第一种是根据底物蛋白质被磷酸化的氨 基酸残基的种类可以将蛋白激酶分成两大类型。一类是丝氨酸苏氨酸蛋 白激酶，这类蛋白激酶催化底物蛋白质的丝氨酸苏氨酸残基进行磷酸化， 已知的蛋白激酶大多数属于这类。另一类就是酪氨酸型，动物细胞中发现 的蛋白激酶多数属于此类。随着更多的蛋白激酶从高等植物、真菌、果蝇 和人上发现，有些蛋白激酶不但可以对丝氨酸苏氨酸残基进行磷酸化还 可以对酪氨酸进行磷酸化( k u m a r ，1 9 9 7 ) ；也有对底物蛋白特异的组氨酸 残基进行磷酸化的组氨酸蛋白激酶的出现( c h a n g ，1 9 9 3 ；h u g h e s ，1 9 9 4 ) 。 另外，在动物和酵母中还发现了作用于d n a 的蛋白激酶，有人认为这些 蛋白激酶可以在d n a 受到损伤的情况下被激活参与d n a 的修复 ( w o o d g e t t ，1 9 9 3 ) a 第二种根据激酶活性的启动是否依赖于调节物质将蛋白激酶分成信 使依赖型蛋白激酶和非信使依赖型蛋白激酶，如表1 1 。其中信使依赖型 又可以分成两个亚类，即依赖环核苷酸、磷脂或调节因子型和激素或生长 因子依赖型。还没有发现非信使依赖型蛋白激酶的活性受细胞内信使或其 他调节因子的影响，但并非意味着这类蛋白激酶的活性不被调节或在细胞 代谢调节中占次要地位。 1 3 蛋白激酶的共同特征 蛋白激酶的研究在过去的一个世纪得到迅速发展。目前为止，各种生 物体已知的蛋白激酶已超过5 0 0 种，更多的蛋白激酶及基因征被分离和研 究， 估计在哺乳动物细胞中全基因组的1 3 的基因可能编码蛋白激 酶，总数有近于种。对酵母基因组进行计算机序列分析发现，在大约全部 6 0 0 0 个基因中，有1 1 3 个基因可能编码蛋白激酶。尽管对于这些基因的 功能、互作分子( i n t e r a c t i n gp a r t n e r s ) 、作用机制等了解的不是很清楚， 但毫无疑问，这么大量的蛋白激酶基因在细胞正常生理活动中起着重要的 9 嘈热真菌t h e r m o m y c e s l a n u g i n o s u s 丝，苏氰艘蛋白激酶的基因克隆及序列分折 表1 1 ：生物体细胞的蛋白激酶的分类 t a b l e l 1 ：c l a s s i f i c a t i o no f p r o t e i nk i n a s e s 作用。已知的这些蛋白激酶虽然在亚基结构组成、细胞定位以及对靶蛋白 的识别和自身被激活的机制上有着很大不同，但是一级结构和某些生化特 征仍然有很大的相似性。对真核生物的蛋白激酶的催化区进行研究发现有 相当大的保守性，如图1 1 。 1 3 1 蛋白激酶一级结构的特征 h a n k s 等( 1 9 8 8 ) 在对蛋白激酶家族6 5 个成员的健化区的氨基酸序列进 行比较后发现，蛋白激酶胜化区山2 5 0 3 0 0 个氮整酸钱壁组成，大小约 1 0 耙j * jh o m os a p i e n s s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e x e n o p u sl a e v i s c i y p h o n e c t r i ap a r a s i t i c a 怕生 7 m i 哪氰垡腋j ：川级结阳的川似陆。 f i g l1 ：a l i g n m e n to fp r o t e i nk i n s a s e sa m i n oa c i d ss e q u e n c eo f11 0 1 1 1 0 ，s p o m b c x e n o p t l si l l l dc l j p h o n c c h i a p l r a e 0 r p e r ex 譬 s k s h m 0 e mr-；s s a s d i e f 0r；r l w l s 0 r d h k e r d k a r l嚣錾 s t f e k 5；嚣般 c l s 0 s a 口s ， g s r q t n y k l m g p g r h i r p g m e s p p t f s p p g a t a i n h a a t d p p s a 0 a s t 0 n r s d g l r 5 l r 0 0 g s s 0 e p g r p h a i ； n 5 p a p p ； s 0 a a s t f t a p p s e p g g 0 i r h k n h c a s e r s p h p = k r k m z g p 0 g m u 0 f h l 0 v i a i a 1 s ，d 1 h h r h n h a； c t c c t c t 鐾h ： n g h l e e y e s s l v i v i i t k g r e g n l f n e d d t 0 d d v s a d l a e k e i v l h r e e： f g h g h v d e r k d d c 0 d d g k l l 1 0 e d= 三x f f f d t a s l r e p n s l v r 0 r 口v l z t r n i k e r 0 s l p 0 d t p e 口v t d e p l e d e k h h a c c：j c s 1 1 5 1 l 0 1 l p ：u p ：!：p p j s s a s ng n i u o o o n u o o o o o p h p h p p z；z h p h o、i op 0 1 p i o i o 0 1 p i y m h、n；r n m n h y n；vn n h y e一：o o r - o e；o o o o h x s；l s c c h x s 0 ；x s c c h x s c c h x s c 一匿一 瓣沮一 c c l 垂。*垂。嚣嚣 重戬臣h譬 t l m t g g a g 0 s 0 k y y 0 g i雷。o，。 垂b饕 戮一匪融蹴垂。潍一瓣 d k r：；v 0 0 s tm泪。垂重扎并 y ： 臻：置： 并一 。警一 臻一 日矗i睫i匾，疆曩-羞o n y y s nvj o鬈譬嚣玉。 ，_ - j r1_一：r t k d c a a t k p ； ；o m思曩o： 霎霪。口雷雷曩；：i ci：；ii：；ii 1， 嗜热真菌t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s 丝，苏氯酸蛋白激酶的璀凼克降及序列分析 为3 0 k d a 。催化区在蛋白质多肽链上的位置并不固定，大多数单亚基激酶 的催化区往往位于c 末端，n 端可能起调节作用。催化区保守性不是绝对 的，由1 1 个主要的保守亚区( s u b d o m a i n ) 组成，保守亚区之间往往被保 守程度较低的插入片断或沟( g a p s ) 所隔开。保守区对于催化作用十分重 要，非( 低) 保守区可能形成l o o p 结构，以便使得保守区域相互靠近， 并发挥作用。 亚区i 是一个富含甘氨酸的区域，位于催化区氨基末端，往往由 g i y - x g i y - x x g l y 组成。亚区i i 具有一个高度保守的l y s 残基，位于距 离亚区l 最后一个g l y 残基下游1 4 2 3 个氨基酸残基的位置，可能直接 参与磷酸转移反应，也有人认为和转移质子有关( k a m p sa n ds e r o n ， 1 9 8 6 ) 。 亚区至组成催化区域的中心，这个区域高度保守。亚区中的保 守氨基酸a s p 和a s n 及中a s p p h e g l y 序列是与a t p 结合所必须的。 亚区中共有序列a s n p r o g l u 通常是蛋白激酶催化亚基关键的特征氨基 酸。对于丝氨酸、苏氨酸酪氨酸蛋白激酶来说，它们的亚区和亚区 都有各自不同的保守氨基酸。据研究，这些特征氨基酸在蛋白激酶正确地 识别具有羟基的氨基酸时起决定作用。丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的亚区 共有序列是a s p l e u k s p r o g l u a s n ( d l k p e n ) ，而亚区共有序列是 g l y t h r s e r - x x t y r p h e x a l a - p r o g l u ；对酪氨酸蛋白激酶来说，亚区 的共有序列可能为 a s p l e u a r g a l a a l a a s n 或者 a s p l e u a l a - a l a a r g a s n ，但大多是后者，前者多见于脊椎动物的s r c 蛋 白激酶亚家族成员中。 亚区的共有序列是 p r o i l e v a ! 一l y s a r g t r p t h r m e t a l a p r o g l u 。亚区和亚区中这些底物 专化性有关的氨基酸序列可用来设计简并的多聚核苷酸探针，通过筛选 c d n a 文库，来鉴定或分离新的丝氨酸苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶基因。 对于i i i 、i v 、v 、i x 、x 、x i j l 个保，j ：亚区的研究相对滞后。目i h ， 对其功能还不很清楚。有研究发现，i x 亚区有两个保守的氨基酸残基a s p 和g l y ，亚区【i i 中的g l u 和亚区x l t p 的a r g 部是高度保守的，亚区x l 中的 a r g 位于催化区的c 末端不远处，对脊椎动物v - - s r c 蛋白激酶此处的a r g 山东农业大学顸l 学位论文 进行缺失突变后发现，突变体对温度的敏感程度大大提高，其结果和将 a r g 氨基酸残基突变为g l u 氨基酸残基相似。 1 3 2 蛋白激酶的生化特征 几乎所有的蛋白激酶都可以进行自身磷酸化作用，即某种激酶可以利 用自身作为底物，这种作用发生在酶分子中间，即两个酶分子可以互相磷 酸化，也可以发生在分子内部，即一个酶分子的催化部位可磷酸化同一分 子的其他部分。最近研究发现，自身磷酸化是蛋白激酶活性调节方式之一。 t a y l o r 等发现，磷酸化后的激酶活性升高，c a m p 依赖型蛋白激酶的自身 磷酸化可以影响其调节亚基与c a m p 的结合与解离。胰岛素受体本身具有 蛋白激酶的功能，自身磷酸化后，其活性不再依赖胰岛素( t a y l o r ，1 9 8 9 ) 。 多数蛋白激酶底物特异性并非是绝对的。种蛋白质作为几种蛋白激 酶的底物和一种蛋白激酶有多种底物的情况也是很常见的。一般情况下， 各种激酶都有自己的最适底物。底物磷酸化往往发生在靶蛋白的特异氨基 酸残基上，主要有丝氨酸、苏氨酸，有些还可以磷酸化酪氨酸，组氨酸、 赖氨酸等。 1 4 蛋白激酶的调控机制 1 4 1 蛋白激酶对靶底物的调控方式 直接调节 这类被蛋白激酶调控的对象一般位于信号传导的终端，它们往往是一 些关键性调节酶或者重要的功能蛋白，从细胞外信号的接受、传导到细胞 反应的产生，经历的时间较短，无活性的蛋白质或酶一旦被蛋白激酶磷酸 化修饰即具有活性，就可以使细胞迅速对外界刺激作出反应，比如糖分解 代谢中p k a 通过激活糖原磷酸化酶激酶使之下游的糖原磷酸化酶磷酸 化，使其从无活性的b 形式转变为有活性的a 的形式，最终将糖原磷酸化， 使其终端葡萄糖基脱落，生成i p 一葡萄糖。与此同时，p k a 可以使糖原 合成酶磷酸化，但是这个磷酸化却使糖原合成酶活性降低，糖原合成受阻。 另外，激酶对于脂肪水解、细胞分泌和肌肉收缩等的调节也属于这种调解 方式。 1 3 嗜热真菌t h e r r n o m y c e sl a n u g i n o s u s 丝，苏氨艘蛋白激酶的甚i 对克降及序列分析 问接调节 这类调节方式往往通过使转录因子或蛋白质合成的有关因子磷酸化 来调节基因活性，然后由基因表达产物问接产生深刻的影响。同直接调节 产生的迅速的短期效应相比，这类调节产生的一般是长期效应，比如细胞 分裂、分化等。对转录水平的调控包括：a 对转录因子核转位作用的调节， 其中既包括磷酸化后的正调节也包括磷酸化后的负调节，正调节具体是通 过转录因子磷酸化后其分子中的核转位信号结构域变构或暴露而使该转 录因子易于进入核内而起始基因的转录；负调节与此相反，磷酸化的转录 因子不能进入细胞核内而位于细胞质，其相应目标基因的转录被关闭。b 对转录因子与d n a 结合活性的调节，也包括磷酸化后的正调节与负调节 两类，即通过磷酸化转录因子d n a 结合域( d b d ) 从而激活或抑制转录 因子的d n a 结合活性。c 对转录因子转录活性的直接调节，即通过磷酸 化转录激活结构域( t a d ) 而调节基因转录，一般是正调控。转录后的磷 酸化调控现研究比较清楚的主要是在翻译水平的调控，即通过磷酸化翻译 起始因子从而提高或降低蛋白质的合成水平。 1 4 2 蛋白激酶活性的激活和抑制 蛋白激酶活性受到诸多因素的影响，蛋白激酶自身磷酸化反应是蛋白 激酶激活活性的重要方式之一。除此以外，蛋白激酶受到各种来自外部信 号的刺激和调节作用。由于某些蛋白激酶结构上具有外部信号结构域，当 被外部信号如激素、胁迫、光线、温度等刺激后蛋白激酶活性被激活。蛋 白激酶位于信号传导网络的连接点上，激酶的活性受到上级反应产物的调 节。过量的蛋白激酶活性往往对于细胞分裂增嬗、癌变等有诱导作用。有 研究表明，p k c 激酶在细胞内的过量表达是糖代谢受阻的主要原因之一， 在这类细胞早d a g 的含量明显上升，导致p k c 激酶活性增强，糖代谢酶 类被磷酸化( 徐勇，2 0 0 1 ) 。人类老年性痴呆症可能病因是i p 3 的代谢积 累p k c 激酶活性上升，导致诱导细胞微管蛋白形成因子t a u 蛋白发生过 量磷酸化，脑细胞信号传导障碍衍致( 李翠凤，2 0 0 0 ) 。 2 真菌蛋白激酶的研究现状 2 1 蛋白激酶在真菌信号传导中的作用 1 4 山东农业人学顶l ：学位论文 真菌的诸多基本细胞过程如细胞周期、转录、交配等都和蛋白质的磷 酸化作用密切相关。蛋白质磷酸化和真菌的信号传导的关系可能分为以下 三种： l ：参与细胞对外部信号的反应。这些信号包括交配因子，激素，光，物 理刺激，寄主植物组织，生长和分化因子等。 2 ：参与了细胞分裂过程中d n a 的合成和减数分裂调节。 3 ：参与了真菌对营养和环境胁迫的反应过程。 和其他真核生物一样，丝状真菌蛋白激酶的分离和功能特征的研究取 得了很大进展。目前，对于丝状真菌蛋白激酶的研究主要集中在以下三个 方面：1 ) 蛋白激酶和真菌的生长发育、侵染性有关的性征建成之间的关 系2 ) 蛋白激酶对于真菌细胞周期的调节作用3 ) 蛋白激酶和丝状真菌的 致病性关系的研究。 2 2 丝状真菌蛋白激酶的种类及研究现状 对于真菌的蛋白激酶的分类和命名有不同的规则，可以根据底物、突 变体表现型等，也可以根据底物被磷酸化的特异氨基酸残基来划分。根据 被磷酸化的氨基酸残基来分则至少可以将真菌的蛋白激酶分为五类：双 组分组氨酸蛋白激酶，组氨酸蛋白激酶，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶， 酪氨酸蛋白激酶，双特异性蛋白激酶。生物体细胞中的磷酸化反应大 多数是由丝氨酸苏氨酸蛋白激酶柬完成的，酪氨酸蛋白激酶占很小的比 例，不到0 1 ( m a r t i n ，1 9 9 9 ) 。 双组分组氨酸蛋白激酶是组氨酸蛋白激酶复合体，包括两个组氨酸蛋 白激酶分子，一个作为识别子( r e c e i v e r ) ，另一个作为接受子( a c c e p t o r ) 。 这两个激酶可能位于同一条肽链上的不同区域，也可能是独立的蛋白质。 当识别子的特异组氨酸残基被磷酸化后，识别子被激活，引起接受子的特 异的天冬氮酸贱基被磷酸化，复合体 。具有激酶活性。以自舶研究认为这 类蛋白激酶只存在于原核生物中，最近在真核生物如真菌：y e a s t ( o t aa n d v e r s h a v s k y 1 9 9 3 ：m a e d ae ta 1 t1 9 9 4 ) ，c a n d m aa l h i c a n s ( a l e xe ta 1 ， 1 9 9 8 ) n e u r o s p o r a ( a l e xe ta 1 ，1 9 9 6 ：s c h u m a c h e re ta 1 ，1 9 9 7 ) ，及高等 嗜热真菌t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s 丝，苏氩陵_ f f f 白激酶的基闭克降发序列分折 植物拟南芥上都有发现。 组氨酸蛋白激酶对靶蛋白的组氨酸侧链进行磷酸化，从而改变蛋白质 的构象。这类蛋白激酶主要存在于哺乳动物中，h u a n g ( 1 9 9 1 ) 等从酿酒酵 母中也分离并纯化了一个组氨酸蛋白激酶，分子量为3 2 k d a ，可以催化蛋 白n 端的磷酸化反应。但是，目前尚没有丝状真菌组氨酸蛋白激酶的报道。 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶和双特异性蛋白激酶组成 了真核生物蛋白激酶超家族( h a n k sa n dh u n t e r ，1 9 9 5 ) 。对裂殖酵母全基 因组进行序列分析后发现，这种生物缺少编码酪氨酸蛋白激酶的基因。目 前也没有丝状真菌酪氨酸蛋白激酶的报道。双特异性蛋白激酶在信号传导 途径与细胞的生长、分化有重要的作用，它可能位于细胞的质膜内面、细 胞质或细胞核中，对靶蛋白的酪氨酸残基和丝氨酸苏氨酸残基进行磷酸 化。双特异性蛋白激酶与另两类蛋白激酶一样，包括很多种酶，例如与细 胞周期调控有关的w e e l 和m i m l c d r l ，与细胞癌变有关的依赖双股r n a 的蛋白激酶t i k 以及与细胞生长有关的m a p k 激酶和具有基因转录调节 作用的s t y 蛋白激酶等( g o l d ，1 9 8 9 ；缪德年，2 0 0 2 ：童坦军，1 9 9 4 ) 。 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶组成了丝状真菌信号传导网络，在真菌细胞的 细胞周期调控、转录作用、及交配等生理过程中起重要作用，可能是真菌 分化和发育以及致病性有关的形态建成等信号传导的重要的调节因子 ( m a r t i n ，1 9 9 9 ) 。目前，已经从真菌上分离得到了很多蛋白激酶基因， 如表1 2 。 2 2 1c a m p 依赖性蛋白激酶p k a c a m p 依赖性蛋白激酶( p i c a )