（遗传学专业论文）胚胎早期发育过程中ctb和evt的基因表达谱研究.pdf

重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名 笾才趱a 期：趔：垒! 碰 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名 指导教师签名 日 期 莲才迢 上掣j 蛀 夕w p 弘e 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 a b p c d n a c r n a c t b d a b d d h 2 0 d e p c d n t p e b e c m e d t a e p e v t f b s h 2 0 2 h a i 1 h l a g i i r p k d a m m p 一9 m r n a p b s p c r 英汉缩略语名词对照 英文全称中文全称 a b s o r b a n c e 吸光度 b a s ep a i r 碱基对 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补脱氧核糖核酸 c o m p l e m e n t a r yr n a 互补核糖核酸 c y t o t r o p h o b l a s tc e l l s 细胞滋养层细胞 d i a m i n o b e n z i d i n e 二氨基联苯胺 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 d i e t h y lp u r o c a r b o n a t e二乙基焦碳酸盐 d e x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖三磷酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e x t r a c e l l u l a rm a t r i x 细胞外基质 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e p p e n d o r f 微量离心管 e x t r a v i l l o u st r o p h o b l a s tc e l l s 绒毛外滋养层细胞 f e t a lb a t t l es e r u m 胎牛血清 h y d r o g e np e r o x i d e 过氧化氢 h e p a t o c y t eg r o w t h f a c t o ra c t i v a t o r 肝细胞生长因子激活物 i n h i b i t o r - 1 抑制因子 h u m a nl e u k o c y t ea n t i g e ng 人白细胞抗原g h o r s c la d i s hp c r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 k i l o d a l t o n 千道尔顿 m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e9 基质金属蛋白酶9 m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 信使核糖核酸 p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶连反应 重庆医科大学硕士研究生学位论文 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t a s e - p o l y m e r a s ec h a i n 逆转录一聚合酶链式反 r e a c t i o n t b et r i s b o r a t ee l e t r o p h o r e s i s t a q t i m p 应 三羟甲基甲烷一硼酸 乙二胺四乙酸 t h e r m o sa q u a t i c u s ( d n ap o l y m e r a s e )耐热d n a 聚合酶 t i s s u ei n h i b i t o ro f m a t r i x 基质金属蛋白酶的组织 m e t a i l o p r o t e i n a s e1 抑制因子1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 胚胎早期发育过程中c t b 和e v t 的基因表达谱研究 摘要 目的 本实验运用不同浓度胰酶消化法分别消化正常妊娠8 1 2 周的人工 流产绒毛和蜕膜组织，分离得到纯度较高的细胞滋养层细胞( c t b ) $ n 绒 毛外滋养层细胞( e v t ) ：利用高通量的基因芯片技术制备c t b 和e v t 基因表达谱芯片，对比分析获取差异表达基因。同时，对c t b 的标志 物h a i 1 基因及其表达产物在绒毛组织中的表达规律进行了初步研究。 为探讨胚胎早期发育过程中滋养层细胞侵袭的基因网络调控机制提供 了实验基础和理论依据。 方法 1 、收集正常妊娠第8 1 2 周绒毛和蜕膜组织，胰酶消化法分离c t b 和e v t ，分析细胞纯度和活性。 2 、提取c t b 和e v t 的总r n a ，检测r n a 纯度和完整性。 3 、r n a 送公司制备基因芯片，并提取基因表达谱数据。 4 、分析数据，获取差异表达基因。 5 、选取两个差异表达基因m m p 一9 和t i m p 一1 ，r t - p c r 验证j 占片 结果可靠性。 6 、分析差异表达基因的生物学功能，并对基因进行分类检索。 7 、r t - p c r 和免疫组织化学法检测c t b 标志物h a i 一1 基因和蛋白 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 在绒毛组织中的动态表达。 结果 1 、运用不同浓度胰酶消化法消化绒毛和蜕膜组织，获得纯度较高 的c t b 和e v t 。 2 、r n a 纯度及完整性分析，a 2 6 0 ，2 s o 达到】9 2 1 ，2 8 sr r n a 和1 8 s r r n a 电泳条带清晰，亮度之比约为2 ：1 ，表明所抽提的r n a 达到实 验要求。 3 、建立了c t b 和e v t 的基因表达谱芯片，质控合格。r t - p c r 验证m m p 一9 和t i m p 一1 表达与芯片结果一致，证实芯片结果可信。 4 、芯片检测c t b 和e v t 基因表达谱，在全基因组5 4 6 7 5 个基因 ( 或e s t ) 中，共筛选到1 3 1 8 个差异表达基因( 或e s t ) ，占约2 4 ； 聚类分析结果显示上调基因8 1 3 个，下调基因5 0 5 个。所有差异表达 基因按g e n e o n t o l o t y 功能分类标准进行了功能检索分类。 5 、综合分析不同生物学功能类别的1 3 18 个差异表达基因( 或 e s t ) ，共检索到细胞外基质相关基因上调2 9 个、下调11 个；信号转 导相关基因上调8 7 个、下调5 3 个；转录调节相关基因上调8 0 个、下 调4 0 个；细胞生长维持相关基因上调4 1 个、下调15 个：代谢相关基 因上调9 5 个、下调3 6 个；凋亡相关基因上调1 7 个、下溯1 1 个；物 质转运相关基因上调1 0 4 个、下调4 7 个；细胞周期相关基因上调16 个、下调7 个；应激反应相关基因上调6 个、下调0 个；细胞防御反 应相关基因上调4 个、下调5 个；免疫应答相关基因上调6 9 个、下调 5 个；细胞黏附相关基因上调4 6 个、下调2 8 个；发育相关基因上调 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 5 8 个、下调2 1 个。此外，通过检索，我们发现有3 2 7 个基因尚无功能 描述，其中上调1 9 5 个、下调1 3 2 个。 6 、r t - p c r 测得h a l 一1 基因在绒毛组织中有表达，且其表达量随 妊娠周数增加而逐渐上调，在妊娠第6 周h a i 1 基因表达量极低，随 后表达量逐渐升高，至第9 周达高峰，且高峰持续至第1 0 周。免疫组 织化学法显示h a i 1 蛋白表达随妊娠周数增加呈递增趋势，与r t - p c r 结果吻合。 结论 1 、采用不同浓度胰酶消化、红细胞裂解和p e r c o l l 梯度离心等方法 成功分离c t b 和e v t ，这是对传统方法的改进，既方便实用，又可以 节约实验经费。 2 、建立了c t b 和e v t 的全基因组表达谱芯片，并获取差异表达 基因，其中某些基因是目前尚未报道生物学功能或在胚胎发育方面无 相关报道的新基因，同时，实验还印证了当前已经报道和胚胎发育相 关的基因。 3 、通过综合分析不同生物学功能类别的差异表达基因的表达变 化，提示滋养层细胞侵袭可能存在以下一些调节机制：细胞黏附和细 胞外基质相关基囚表达活跃，如m m p 一1 、m m p 一2 、m m p 一9 ，c a m i 等基因上调明显，表明这些基因参与了e v t 识别、黏附、并降解细胞 外基质，侵入血管内皮使母体血管重建，从而开启胎盘的血流供应这 一过程：免疫应答和细胞防御反应相关基因表达上调，参与母体对胎 儿的免疫“容受性”调节，使胎儿免受母体的免疫排斥；众多信号转 重庆医科大学硕士研究生学位论文 导通路和细胞周期调控相关基因发生改变，c a , 体趋势是使细胞向增殖 期转变，发生增殖和分化，有序地形成功能不同的组织和系统，以维 持) j 台j l 的早期发育；细胞生长维持和发育相关基因表达旺盛，以维持 胚胎细胞的生长发育和各系统器官的形成；物质转运和代谢相关基因 的上调数远多于其下调，为胚胎的早期发育及滋养细胞侵袭力的维持 提供了丰富的营养和良好的血供。 4 、r t - p c r 和免疫组织化学法获得了h a i l 基因和蛋白在胚胎早 期发育绒毛组织中的动态表达规律，其结果表明h a i 1 参与了胚胎早 期发育过程。 关键词：c t b ，e v t ，基因表达谱，h a l 。1 ，侵袭 重庆医科大学硕士研究生学位论文 g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e s a n a l y s i so fh u m a n c y t o t r o p h o b l a s t sc o m p a r e dt oe x t r a v i l l o u st r o p h o b l a s t si ne a r l yp r e g n a n t a b s t r a c t o b j e c t i v e t r o p h o b l a s tc e l l s i n v a s i o ni se s s e n t i a lf o rp l a c e n t a t i o na n de a r l y e m b r y od e v e l o p m e n t i nt h i ss t u d y ，w ea p p l i e dt w od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n t r y p s i nt od i g e s t v i l l o u sa n dd e c i d u af r o ma r t i f i c i a la b o r t i o no fn o r m a l p r e g n a n c y8w t o12w h i g h e rp u r l t yc y t o t r o p h o b l a s tc e l l s ( c t b ) a n d e x t r a v i l l o u st r o p h o b l a s tc e l l s ( e v t ) w e r ec o l l e c t e db yt h i sm e t h o d t h e n w ea p p l i e dg e n ec h i pm e t h o d st om a k eh i g h f l u xg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e s o fc t ba n de v t a n dc o m p a r e dd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ng e n e sw h i c hw o u l d h e l pu st or e v e a lg e n en e t w o r kr e g u l a t i o nm e c h a n i s mi ne a r l ye m b r y o d e v e l o p m e n t m e a n w h i l e ，t os u r v e yt h er o l eo fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r a c t i v a t o ri n h i b i t o rt y p e1 ( h a i 一1 ) g e n e ，w h i c he x p r e s s e do n l yi nc t bi n e a r l ) ，e m b r y od e v e l o p m e n t ，w es t u d i e dt h ee x p r e s s i o no fh a i 一1g c n ca n d i t sp r o t e i ni nv i l l o u st i s s u ea f t e re m b r y oi m p l a n t a t i o n m e t h o d s l 、c o l l e c t e dn o r m a lv i l l o u sa n dd e c i d u af r o m8wt o12w t h e 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 s a m p l e sw e r ed i g e s t e db yt r y p s i nt oc o l l e c tc t ba n de v t p u r i t ya n d a c t i v i t yo f s e p a r a t e dc e l l sw e r ed e t e c t e d 2 、e x t r a c t e dt o t a lr n af r o mv a l i d s e p a r a t e d c t ba n de v t r e s p e c t i v e l y t h e nr n ap u r i t ya n di n t e g r i t yw e r ed e t e c t e d 3 、g e n ec h i p h y b r i d i z a t i o n a n d g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e s d a t a e x t r a c t i o nw e r ep e r f o r m e di ns h a n g h a ib i o c h i pl i m i t e dc o m p a n y 4 、a n a l y s i s e dg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e sd a t aa n do b t a i n e dd i f f e r e n t i a e x p r e s s i o ng e n e s 5 、s e l e c t e dt w od i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ng e n e s ，m m p 一9a n dt i m p 1 ， a n dd e t e c t e dt h e i re x p r e s s i o nb yr t - p c rt oc o n f i r mc o n f i d e n c eo fg e n e c h i pd a t a 6 、a n a l y s i s e dd i f f e r e n tb i o l o g yf u n c t i o no ft h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n g e n e s 7 、b yr t - p c ra n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , d e t e c t e dt h eh a l 一1g e n e a n di t sp r o t e i ne x p r e s s i o ni nt h ev i l l o u st i s s u e s r e s u l t s 1 、h i g h e rp u r i t yc t ba n de v t w e r ec o l l e c t e db yt h et w od i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o nt r y p s i nd i g e s t i o nm e t h o d s 2 、t h er n a p u r i t ya n di n t e g r i t yw e r ei d e n t i f i e d t h e s er n aa 2 6 0 2 8 0 w e r eb e t w e e n1 9a n d2 1 2 8 s r r n aa n d18 s r r n ae l e t r o p h o r e s i s s t r i p w e r ev e r yc l e a r c o m p a r e dw i t ht w or r n a e l e t r o p h o r e s i ss t r i pb r i g h t n e s s ， 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 t h er a t i ow a sn e a r l y2 ：1 3 、t h eg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e s c h i p w a sf o u n d e d ，w h i c hq u a l i t y c o n t r o lw a su pt os t a n d a r d t h er e s u l to f v l l v i p 一9a n dt i m p 一1 g e n e e x p r e s s i o no b t a i n e db yr t - p c rw e r ec o i n c i d e n c ew i t ht h a tb yg e n ec h i p ，i t i n d i c a t e dt h a tg e n ec h i pd a t aw e r ec o n f i d e n c e 4 、1318d i f f e r e n t i a le x p r e s s e dg e n e s ( o re s t ) ，w h i c hw e r ea b o u t2 4 p e r c e n to fa l l5 4 6 7 5g e n e sw e r ef o u n di ng e n ee x p r e s s i o np r o f i l e so fc t b a n de v ts c r e e n e db ya f f y m e t r i xu 1 3 3p l u s 2 0 g e n ec l u s t e rs h o w e dt h a t t h e r ew e r e8l3g e n e su p r e g u l a t e da n d5 0 5g e n e sd o w n r e g u l a t e di nc t b a n de v tc h i p t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fa l lt h ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s e d g e n e s w e r e q u e r i e d a n dc l a s s i f i e d a c c o r d i n g t ot h es t a n d a r do f g e n e o n t o l o t y 5 、w ea n a l y s e dd i f f e r e n t b i o l o g y f u n c t i o no f1318d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o ng e n e s ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r e2 9u p r e g u l a t e dg e n e s a n d11 d o w n r e g u l a t e dg e n e s r e l a t e dt oe x t r a c e l l u l a r m a t r i x ，8 7 u p - r e g u l a t e dg e n e s a n d5 3 d o w n - - r e g u l a t e dg e n e s r e l a t e dt o s i g n a l t r a n s d u c t i o n 8 0u p r e g u l a t e dg e n e sa n d4 0 d o w n r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e d t o t r a n s c r i p t i o n ，4 1 u p r e g u l a t e dg e n e sa n d 15 d o w n r e g u l a t e dg e n e s r e l a t e dt oc e l l g r o w t h m a i n t e n a n c e ，9 5u p r e g u l a t e dg e n e s a n d 3 6 d o w n r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e dt om e t a b o l i s m ，17u p r e g u l a t e dg e n e sa n d1l d o w n r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e dt oa p o p t o s i s ，10 4u p r e g u l a t e dg e n e sa n d4 7 d o w n r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e dt ot r a n s p o r t i o n ，16u p r e g u l a t e dg e n e sa n d7 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 d o w n r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e dt oc e l lc y c l e ，6u p r e g u l a t e dg e n e sa n d0 d o w n r e g u l a t e dg e n e s r e l a t e dt o s t r e s s ，4u p r e g u l a t e dg e n e s a n d5 d o w n - r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e dt od e f e n s er e s p o n s e ，6 9u p r e g u l a t e dg e n e s a n d5 d o w n - r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e dt oi m m u n er e s p o n s e ，4 6u p r e g u l a t e d g e n e s a n d 2 8 d o w n r e g u l a t e dg e n e s r e l a t e dt oc e l l a d h e s i o n ，5 8 u p r e g u l a t e dg e n e sa n d2 1 d o w n r e g u l a t e dg e n e sr e l a t e dt od e v e l o p m e n t i nt h e s ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ng e n e s ，f u n c t i o no f 3 2 7g e n e sh a dn o tb e e n d e s c r i b e di ng e n e o n t o l o t y ( 1 9 5g e n e sw e r eu p r e g u l a t e da n d1 3 2g e n e s w e r ed o w n r e g u l a t e dr e s p e c t i v e l y ) a tp r e s e n t 6 、t h eh a l 1g e n ee x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di nv i l l o u st i s s u e s b y r t - p c r i t se x p r e s s i o nw a so ni n c r e a s ew i t ht h ep r e g n a n c yw e e ka d d e d t h eh a l 一1g e n ee x p r e s s i o nw a sv e r yl o wa tp r e g n a n t6 w f r o mp r e g n a n t 7 wt o9 w , t h e i re x p r e s s i o n sw e r ei n c r e a s e dg r a d u a l l ya n dr e a c h e dp i n n a c l e n9 w t h er e s u l to fh a i 一1 p r o t e i ne x p r e s s i o na l s os h o w e dt h es i m i l a r c o n c l u s i o nb yi m m u n o h i s t o c h e m i c a la n a l y s i s c o n e l u s i o n s 1 、a p p l i e dd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o nt r y p s i nd i g e s t i o n ，e r y t h r o c y t e d i s r u p t i o na n dp e r c o l l g r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n ，w es e p a r a t e dc t ba n de v t s u c c e s s f u l l y t h i si m p r o v e m e n tm e t h o dn o to n l yc o n v e n i e n t e d ，b u ta l s oc u t d o w ns t u d yc o s t 2 、w ef o u n d e dt h eg l o b eg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e sc h i po fc t ba n d 1 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 e vt ts o m eo ft h e1318d i f f e r e n t i a l e x p r e s s e dg e n e s ( o re s t ) h a dn o b i o l o g i c a lf u n c t i o nr e p o r to rn or e p o r tr e l a t e dt oe m b r y od e v e l o p m e n ta t p r e s e n t m e a n w h i l e ，s o m er e p o r t e de m b r y o d e v e l o p m e n t r e l a t e dg e n e s w e r ec o n f i r m e di nt h i ss t u d y 3 、w es u p p o s e ds o m e g e n e s f u n c t i o n m e c h a n i s m sr e l a t e dt o t r o p h o b l a s t si n v a s i o n t h eg e n e sr e l a t e dt oc e l la d h e s i o na n de x t r a c e l l u l a r m a t r i xf u n c t i o nw e r em o r ea c t i v e ，s u c ha s m n i p 1 ，i v l m p - 2 ，m m p 一9 i c a m 一1 t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e s eg e n e sp l a y e dv e r yi m p o r t a n tr o l e s i ne v tr e c o g n i t i o n ，a d h e s i o n ，d e g e n e r a t i o ni ne x t r a c e l l u l a rm a t r i x a n d i n v a s i o nt ob l o o dv e s s e le n d o t h e l i u m t h e g e n e s r e l a t e dt oi m m u n e r e s p o n s ea n dd e f e n s er e s p o n s ef u n c t i o nw e r ea f f l u e n t ，w h i c hp a r t i c i p a t e d i m m u n e p e r m i s s i v er e g u l a t i o n i n m o t h e r e m b r y oa n d m a d e e m b r y o a v o i d e di m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o nf r o mm o t h e r m a n yg e n e s r e l a t e dt o s i g n a l t r a n s d u c t i o na n dc e l l c y c l e r e g u l a t i o n f u n c t i o nw e r ec h a n g e d o b v i o u s l y , w h i c hm a d ec e l l sp r o l i f e r a t e da n dd i f f e r e n t i a t e di ne a r l ye m b r y o d e v e l o p m e n t t h eg e n e s r e l a t e dt oc e l l g r o w t h m a i n t e n a n c e a n d d e v e l o p m e n tf u n c t i o nw e r ep r o d u c t i v e s ot h a tt h e ym a i n t a i n e de m b r y o c e l l sg r o w t ha n df o r m e do l g a n sa n ds y s t e m s t h e u p 一1 e g u l a t e dg e n e s r e l a t e dt ot r a n s p o r t i o na n dm e t a b o l i s mf u n c t i o nw e r ef a rm o r et h a nt h e d o w n 。r e g u l a t e dg e n e ss ot h a ta f f l u e n tn u t r i t i o na n d b l o o ds u p p l yw e r e p r o v i d e dt ot r o p h o b l a s t si n v a s i o ni ne m b r y od e v e l o p m e n t 4 、h a i 一1g e n ea n di t sp r o t e i nd y n a m i ce x p r e s s i o np a t t e r ni np r e g n a n t 1 l 重庆医科大学硕士研究生学位论文 v i l l o u sw e r ea n a l y z e db yr t - p c r ，a n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi n d i c a t e d t h a th a i 1 m i g h tp l a y a n i m p o r t a n t r o l ei n e a r l y h u m a n e m b r y o d e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：c y t o t r o p h o b l a s t s ，e x t r a v i l l o u s t r o p h o b l a s t s ，g e n e e x p r e s s i o np r o f i l e s ，i n v a s i o n ，h a i 一1 1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 胚胎早期发育过程中c t b 和e v t 的基因表达谱研究 第一部分o t b 和e v t 的分离、基因芯片 的建立和基因信息分析 刖吾 滋养层细胞对子宫蜕膜的侵袭和恶性肿瘤细胞对临近组织的侵袭机制是现代 医学面临的待解之迷。二者的侵袭特性存在许多相似之处，侵袭过程所涉及的许 多分子基础和调节机制也基本相同，不同之处在于滋养层细胞表现出“有控性侵 袭”，而肿瘤细胞则表现出“无控性侵袭”。因此，二者研究成果的相互借鉴必 将推动各自相关领域研究的不断深入。近年来，大量研究证实了许多在肿瘤发生 发展中起重要作用的基因，在滋养层细胞侵袭过程中也起着十分重要的作用，如白 血病抑制因子、表皮生长因子和基质金属蛋白酶因子等。因此，从肿瘤学研究方 面所取得的某些成果，去探索胚胎早期发育过程中滋养层细胞侵袭的作用机制， 将有助于人类对生殖过程的更深入认识。 人胚泡着床发生在妊娠第4 5 周，随后滋养层细胞分裂、增殖，并可沿绒毛和 绒毛外两个方向分化，最终形成生物学特性明显不同的两种细胞：无侵袭能力的 细胞滋养层细胞( c y t o t r o p h o b l a s tc e i l s ，c t b ) 和有侵袭能力的绒毛外滋养层细 胞( e x t r a v i l l o u st r o p h o b l a s tc e i l s ，e v t ) 。随着胚胎发育的进程，e v t 侵袭性逐渐 n 。镐 n t “t o o r 嫩 h h h r n n ? 漫毳s 聋瓣粒 f i g 1 e x t r a 、i l l o u st r o p h o b l a s tc e l l sa n t o m i cs t r u c t u r e 1 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文 细胞游莽l 细胞绒毛j 癜养层细胞 融合l 。、；。增髓p ，! ；如，。；。 合体滋妻细胞 迁移土堙，嘶。 5 y n c y t n 丫”“。b l a li 功fu能nc：tio内n,刍泌en、do交cr换ine， 亍袭h y a 撕。i ：， i上 e x c h a n g e 巨细胞 血管内纲艘 g i a n tc e l le n 1 0 、。：i s c n i a l - e e l l 增强，于第9 - 1 2 周达高峰，并向子宫间质和螺旋动脉腔内侵袭性生长，形成固定 绒毛，为胎盘形成及胚胎早期发育分化创造条件即1 ( 图l ，图2 ) 。 e v t 的侵袭力主要体现在对细胞外基质的降解，其有控性侵袭对于正常妊娠 非常重要。然而，迄今为止，我们对人类e v t 侵入过程的调节机制了解甚少。为 什么会出现这种有控性侵袭呢? 这是国内外学者非常感兴趣的问题，也是一个多 凶素参与的非常复杂的生殖生理过程。近几年学者们从细胞因子、粘附分子及其 配基、免疫、激素等方面对胚泡着床进行了广泛而深入的研究，虽然获得了许多 新的信息，也发现了某些重要的分子参与了这一过程，女f f i l 2 、l i f 、e g f 、i c a m 、 c y c l i n s ，其中最重要的是具有侵袭能力的e v t 分泌的m m p 9 t i m p 1 对细胞外基质 的降解i “。但这种单一基医 研究模式显然刁i 能从整体上觯读e v t 获得侵袭能力这一 复杂而精细的基因表达调控网络机制，而且e v t 的侵袭行为必然涉及与其功能密 切相关的基因表达改变，如能量代谢基因、细胞增殖相关基因、免疫调节基因、 凋亡相关基因等，从而从整体上适应胚胎的生长发育。因此，这就需要借助一种 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 高通量分析技术来获取这一特定时期e v t 细胞侵袭所涉及的基因表达谱，而基因 芯片技术( g e n ec h i po rd n am i c r o a r r a y ) 为这一复杂生殖过程基因表达谱的创建 及分析提供了有效的手段口6 】。通过基因芯片技术获取c t b 和e v t 的基因表达谱， 并对其进行比较分析，以找出二者差异表达基因以及明显上调或下调的基因，探 索其功能特性，这对阐明e v t 侵袭作用的分子机制有重要意义。 基因芯片技术由于具有快速、高通量、并行分析等特点，近年来应用范围越 来越广泛，技术也越来越成熟。因此，我们借助这一高通量的基因表达分析技术 对原始滋养细胞分化而来的两种细胞( c t b 和e v t ) 的基因表达谱进行比较分析 有望筛选到某些在胚胎发育过程中尚未发现或未报道的基因，特别是一些f 言号通 路中的因子的发现，必将对胚胎早期发育网络调控模式的机制研究产生重大影响 这对于认识和诊治不孕症、习惯性流产以及研制开发特异性避孕疫苗乃至肿瘤的 抗转移治疗均具有十分重要的理论和实际意义。 1 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一章c t b 和e v t 的分离纯化 材料与方法 一、标本来源 选择重庆医科大学附属第一医院妇产科妊娠第8 - 12 周终止妊娠的正常人工流 产病人6 例( 选择第一次妊娠，且在无遗传病史、无产道及免疫系统异常等情况 下自愿终止妊娠，染色体核型正常的病人) ，收集绒毛和蜕膜组织( 标本收集均征 得病人知情同意，并知情标本的用途) 。 二、材料 1 主要仪器 n i k o nd 1 0 0 + a f - s n i k k o r1 7 - 3 5 m m l ：2 8 d 数码相机( n i k o n ) 、y j 一8 7 5 s a 超 净工作台( 苏州净化设备厂) 、- 2 0 。c 和8 0 c f 氏, 温冰箱( s a n y o ) 、b i o f u g e 2 2 r 台 式高速冷冻离一c , ol ( h e r a e u s ) 、h w s 2 0 电热水浴恒温箱( 江苏太仓市实验设厂) j a l0 0 3 电子天平( s a n o r i u s ) 、w g p 4 0 0 隔水式电热恒温培养箱( 重庆恒达实验仪 器厂) 、p c r 仪( b i o - r a d ) 、核酸电泳仪( b i o r a d ) 、g e ld o c2 0 0 0 t m 凝胶成像系 统( b i o r a d ) 、酶标仪( b i o r a d ) 、1 5 0 目和3 0 0 目不锈钢细胞筛( 重庆医疗器 械公司) 2 主要试剂 胰酶( p r o m e g a ) 、d m e m ( s i g m a ) 、d n a s ei ( s i g m a ) 、e d t a ( s i g m a ) 、 p e r c o l l ( s i g m a ) 、f b s ( h y c l o n e ) 公司、t r i s ( s i g m a ) 、硼酸( s i