（分析化学专业论文）分子对接方法应用于蛋白质多肽蛋白质三体体系研究.pdf

摘要 摘要 分子对接方法目前已经成为研究分子间作用关系的重要方法，蛋白质配体 小分子对接方法经过多年的发展已经广泛应用于实际研究中，近年来蛋白质蛋 白质对接的方法也取得了一定的突破【l j 。 目前学者除了对大分子与小分子化合物的对接方法进行了深入研究之外， 已将分子对接方法发展到了蛋白质与多肽、蛋白质与蛋白质体系中，但目前大 多数对分子对接的应用还主要集中于两分子间的对接( 一个受体、一个配体) 。 然而在真实的生命活动中，蛋白质的生物功能几乎都是在多个蛋白、多肽分子 共存的体系中发挥作用的，目前流行的分子对接方法还没有是专门设计用来研 究三体或多体蛋白质体系同时对接的。由于研究三体间相互作用，将会极大地 增加搜索空间，甚至无法找到全局最优，因此必须研究适当的策略，通过增加 适当限制条件和辅助手段，用已有对接程序实现对三体体系的准确计算。 本文第一部分工作主要考查了蛋白质一多肽蛋白质三体体系的特点，提出了 基于两体对接方法，采取新的策略，从而适用于三体体系同时对接的新思路， 并最终成功地实现了绿豆胰蛋白酶抑制剂( m b t i ) 与其两种受体蛋白酶体系的 重新构造。本文对三体体系的研究工作的主体思想是“分而治之” ( d i v i d e a n d c o n q u e r ) ，也就是将三体体系分成几个两两间有相互作用的二体体 系，之后采用“屏蔽”和“分割”两种策略，将已有天然晶体复合物结构的m b t i 与 两个革登热病毒蛋白酶n s 3 组成的体系成功地重新构造出来。这两种策略的提 出都是为避免三体对接计算中无法找到全局最优而增加的限制和辅助。 屏蔽策略就是针对绿豆胰蛋白酶抑制剂的双活性位点的特殊结构，将它一 端的一个活性位点先用一个受体蛋白通过对接与之预对接，即先将一个活性位 点屏蔽掉，之后将另一个受体蛋白对接到m b t i 第二的活性位点形成了三体体 系的雏形，最后，将第一个受体蛋白从体系中去掉之后，再以分子对接方法重 新将其加到体系中来，这样通过对接方法完成了对已知三体体系的重造。 分割策略就是依据已解析出来的绿豆胰蛋白酶抑制剂的两个活性片断长链 晶体结构，将两条多肽长链( 2 1 肽l y s 活性片断和2 5 肽a r g 片断) 分别与两个 受体蛋白进行对接。然后，再依据两个片断与受体对接正确的相对位置，通过 摘要 旋转位移方法将体系中其他的残基、原子重新接合到体系当中，得出准确和可 信的对接三体复合物构象。依据这种策略，结果中的三体体系构象是否准确的 关键在于：两个多肽长链与受体蛋白对接结果的准确性。我们课题组所发展出 来的t p s o d o c k 和改进a u t o d o c k 两种对接方法，对于这种多肽蛋白质体系对 接已经验证是具有非常高的准确率。这样就保证了对于三体体系对接结果的正 确性。 本文的第二部分主要基于对于前体蛋白加工酶f u r i n 特性和生物功能的研 究，并成功地将绿豆胰蛋白酶抑制剂( m b t i ) 设计和改造为f t t r i n 抑制剂。目前 发现，许多有生物活性的蛋白质与多肽是由它们的前体通过前体蛋白加工酶的 加工水解而获得最终活性的。f u r i n 作为第一个被发现和研究最为深入的哺乳动 物前体加工酶广泛存在于体内，与许多相关疾病和病原体感染有密切关系。f u r i n 的抑制剂有两类：短肽类抑制剂和蛋白质类抑制剂。属于丝氨酸蛋白酶抑制剂 b o w m a n b i r k 家族的绿豆胰蛋白酶抑制剂，由于其第一个活性中心的l y s 2 0 及 a r 9 4 7 符合前体蛋白加工酶底物的基本要求，具有可能改造为f u r i n 抑制剂的潜 能。而本文所设计的f u r i n 抑制剂也是从多肽和蛋白质类这两个方面来进行： 首先，本文以p d b ( p r o t e i nd a t ab a n k ，p d b ) 数据库己发表的m b t i 的l y s 活性多肽长链晶体结构为基础，采用定点突变的方法得到一系列多肽序列，并 通过同源建模得到了这一系列f u r i n 短肽类抑制的三维结构。将这些短肽抑制剂 与f u r i n 蛋白进行对接的结果加以分析，发现在抑制剂与f u r i n 发生作用时，带正 电的碱性残基侧链能否深入到f u r i n 三个活性残基( s e r 3 6 8 一h i s l 9 4 一a s p l 5 3 ) 所组 成的孔穴，是决定抑制剂能否发挥抑制作用的关键因素。之后对各条抑制剂对 f u r i n 的抑制常数飚的生物学实验结果有力地支持了本文所发现的规律。 其次，本文将第一部分获得的分子对接方法应用于三体体系对接的策略， 应用于到将m b t i 设计成为能同时抑制两个f u r i n 蛋白的双效蛋白质类抑制剂， 基于f u r i n 蛋白自身的特点，利用m b t i 活性多肽l y s 片断对f u r i n 抑制作用，采 取分割策略，成功地通过d o c k i n g 方法得了m b t i 和f u r i n 三体的复合物，为将 双活性位点的m b t i 发展成为高效、专一的f u r i n 抑制剂打下了坚实的基础。 关键词：分子对接，蛋白质多肽蛋白质体系，三体对接，绿豆胰蛋白酶抑制剂，前体蛋 白加工酶，f u r i n 抑制剂 i i a b s t r a c t a b s t r a c t m o l e c u l ed o c k i n gi st oe v a l u a t et h eb i n d i n ga b i l a n dp r e d i c tt h ec o m p l e x s t r i l c t u r ew i t ht h ek n o w n3 ds t r u c t u r e so ft w om o l e c u l e s i nm a n ye a s e s ，a b i o m o l e c u l ew i t hl o w e s tf r e ee n e r g yi sc o n s i d e r e dt ob ei nas t a b i l es t a t ea c c o r d i n g t ot h et h e r m o d y n a m i cp r i n c i p l e s s ot h ep u r p o s eo fm o l e c u l ed o c k i n gi st og e tt h e c o n f o r m a t i o ni nt h el o w e s tf r e ee n e r g ys t a t e r e c e n t l y , s c i e n t i s t s h a se x t e n d e dt h e r a n g e o fm o l e c u l e d o c k i n g f r o m p r o t e i n l i g a n dt op r o t e i n p r o t e i no rp r o t e i n p e p t i d e t m sk i n do fr e s e a r c h ，h o w e v e r , a l m o s to nt w ob o d ys y s t e m ，o n er e c e p t o ra n do n el i g a n d ：s m a l lm o l e c u l e ，p e p t i d eo r p r o t e i n s e v e r a lb i o l o g i s t sh a sf o u n ds o m ei n t e r e s t i n gf e a t u r e s ：t h e r ea r em a n y t w o d o m a i ni n h i b i t o r s ，w h i c hc o u l di n h i b i tt w om o l e c u l e ss i m u l t a n e o u s l ya n d i n d e p e n d e n t l y , f o re x a m p l e ，h u m a ng r o 叭hh o r m o n e ，h g ha n di t st w or e c e p t o r s b u t t h e r ei sn od o c k i n gp r o g r a mh a sb e e nd e s i g n e df o rs u c ht h r e e b o d yp r o t e i n - p e p t i d e s y s t e m w h i l ea p p l y i n gt h et w o - b o d yd o c k i n ga l g o r i t h mi n t ot h et h r e e b o d ys y s t e m ， t h e r ew o u l db es u c hah u g es e a r c hs p a c et h a tt h es e a r c h i n ga l g o r i t h me v e nc a n tf i n d t h eg l o b a lb e s tc o n s t r u c t i o nl i g a n d t h e r e f o r e ，s o m ep r o p e rs t r a t e g i e sh a v et ob e d e v e l o p e d ，w i t hw h i c hw ec a na p p l yt h eg e n e r a ld o c k i n gp r o g r a mt ot h et h r e e - b o d y s y s t e mi nc e r t a i nr e s t r i c t e dc o n d i t i o n so ra s s i s t e dm e a n s i nt h ef i r s t p a r to ft h i sd i s s e r t a t i o n ，w e d i ds o m er e s e a r c hw o r ko ns u c h p r o t e i n - - p e p t i d e - p r o t e i ns y s t e m ： a t w o - b o d y s y s t e mp r o g r a m ( a u t o d o c k o r t p s o d o c k ) m e t h o dh a sb e e ne x t e n d e dt oar e a s s e m b l e dt h r e e b o d ys y s t e ms u c ha s m b t ia n dt w on s 3p r o t e i nr e c e p t o r s f o rt h i s s y s t e m ，w eh a v ea d a p t e dg e n e r a l a p p r o a c h t oe x a n qi na t w o - b o d ys y s t e m t o t h r e e - - b o d ys y s t e mv i a a d i v i d e a n d c o n q u e rp r o t o c 0 1 w ed e v e l o p e dt w os t r a t e g i e s ：s h i e l d i n gp r o t o c o la n d d i v i d i n g o f fp r o t o c 0 1 b o t hs t r a t e g i e sa r et os e a r c ht h eg l o b a lb e s tc o n s t r u c t i o n st h a t r e a c t e dw i t hi t sr e c e p t o r so fe a c ha c t i v es i t es t r u c t u r ef r e ef r o ma n yi n f l u e n c e so ft h e o t h e r s i i i a b s t r a c t i nt h es e c o n dp a r to ft h i sp a p e r , w es t u d i e dt h ec h a r a c t e ra n db i o l o g i c a lf u n c t i o n o ff u r i n ，p r o p r o t e i nc o n v e r t a s e s ( p c s ) ，d e s i g n e da n dd e v e l o p e dm b t it ot h ei n h i b i t o r o ff u r i nb o t hi nf o r mo fp e p t i d ea n dp r o t e i n m a n yb i o l o g i c a l l y a c t i v e p r o t e i n s a n dp e p t i d e sa r eo f t e n g e n e r a t e db y i n t r a c e l l u l a rl i m i t e dp r o t e o l y s i so fi n a c t i v ep r e c u r s o r s t h e s ep r e c u r s o rc o n v e r t a s e s a r e k e yr e g u l a t o r s i nm a n yp r o c e s s e sw i t hp h y s i o l o g i c a l l ya n dp a t h o l o g i c a l l y i m p o r t a n c e a st h ef i r s t l yf o u n da n dt h eb e s ts t u d i e dp ci nm a m m a l i a ，f u r i ni s u b i q u i t o u si na l lt i s s u ea n de e l l l i n e se x a m i n e da n dc l o s e l yr e l e v a n tt om a n yd i s e a s e s a n dp a t h o g e n e s i s of a r , t h em a j o r i t yo ft h ek n o w ns p e c i f i ci n h i b i t o r so ff u r i n ，e x c e p t f o rs e v e r a ls y n t h e s i z e ds h o r tp e p t i d e s ，a r ep r o t e i n d e r i v e di n h i b i t o r st h a th a db e e n m o d i f i e db yp r o t e i ne n g i n e e r i n g t h em u n gb e a nt r y p s i ni n h i b i t o r ( m b t i ) ，w h i c h b e l o n g st ob o w m a n - b i r kf a m i l yo fs e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r , h a sp o t e n t i a l t ob e e n g i n e e r e dt oap o t e n ti n h i b i t o r , b e c a u s et h el y s 2 0a n da r 9 4 7p o s i t i o ni ni f sf i r s tl y s a c t i v ed o m a i ns a t i s f yt h eb a s i cr e q u i r e m e n to fs u b s t r a t eo fp c s a b o v ea l l ，w ec h a n g e dt h es e q u e n c eo ft h em b t il y sp e p t i d ec h a i ni ns e v e r a l s p e c i f i c a l l yp o s i t i o n s ，a n dg o tas e r i e s o fp e p t i d ei n h i b i t o r st of u r i nt h r o u g h h o m o l o g o u sm o d e l i n g a f t e rd o c k i n gt h e mt of u r i n ，w ef o u n ds o m ei n t e r e s t i n g p i e c e so f r u l ei nr e s u l t s a n dt h e s er u l eh a sb e e nv a l i d a t e db yb i o l o g i c a le x p e r i m e n t s a l r e a d y i nt h el i g h to ft h e s er u l e s ，w ea p p l i e dt h et h r e e - b o d yd o c k i n gm e t h o di n t ot h e f u r i n m b t i f u r i ns y s t e m ，a n da s s e m b l e dt h et h r e e b o d yc o m p l e x a t i o nb yd o c k i n g ， w h i c hi sv e r yi m p o r t a n tt od e v e l o pm b t ia st h es p e c i a la n de f f i c i e n ti n h i b i t o rt o f u r i n k e yw o r d s ：m o l e c u l ed o c k i n g ，p r o t e i n p e p t i d e - - p r o t e i n ，t h r e e - b o d ys y s t e md o c k i n g ，m u n g b e a nt r y p s i n si n h i b i t o r , p r o p r o t e i nc o n v e r t a s e ，f u r i ni n h i b i t o r 学位论文版权使用授权书 本入完全了解同济大学关于收集、保存、使糟学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校夜权按有关援定岛国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：刍1 存瓠 、 寸_ 7 年o j 月枷秘 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学垃论文作者签名： 年咫匿年月 疆 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：台f 寺髭 7 年 p 弓月加日 第1 章前言 第1 章前言 1 1 研究蛋白质多肽相互作用与识别的背景和意义 随着人类基因组计划的进行，大量基因被发现和定位，基因的功能问题将 成为今后研究的热点。大多数基因的表达都是通过相应的蛋白质来实现的，因 此要认识基因的功能，必然要研究基因所表达的蛋白质。蛋白质的功能往往体 现在与其他蛋白质、生物酶、多肽、核酸等的相互作用之中。细胞各种重要的 生理过程，如信号转导、细胞对外界环境及内部环境变化的反应等，都是以蛋 白质问或蛋白质多肽间的相互作用为纽带而进行的。近年来，蛋白质问相互作 用的研究得到普遍的重视，逐渐形成了一个具有挑战性的研究领域一蛋白质组 学( p r o t e o m i c s ? 【2 朋。 蛋白质组学是在人类基因组计划研究发展的基础上形成的新兴学科，主要 是在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律。人类细胞中的全部基 因称为基因组，由全套基因组编码控制的蛋白质则相应地被称为蛋白质组。由 于生物功能的主要实现者是蛋白质，而蛋白质又有自身特有的活动规律，所以 仅仅从基因的角度来研究生命现象是不够的。人体内真正发挥作用的是蛋白质， 蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，恩格斯曾在反杜林论中指出：生 命是蛋白体的存在形式。 在细胞中，蛋白质问和蛋白质与多肽之间的相互作用是许多生理过程所起 作用所依赖的机制，也是病理过程发展的原因1 4 ，”l 。蛋白质与多肽之间的作用受 不同的环境条件和细胞机制控制，例如温度、p h 、离子强度、酶等【7 s ，9 】。生物 学中的许多现象，如基因的复制、转录、翻译和遗传密码的分析与破译以及细 胞周期调控、信号转导、免疫反应和中间代谢等，均受蛋白质间相互作用的调 控。有些蛋白质由多个亚单位组成，它们之间的相互作用就显得更为重要。有 些蛋白质结合紧密，而有些蛋白质只有短暂的相互作用。然而不论哪种情况， 它们均控制着大量的细胞活动事件，譬如：细胞的增殖、分化和凋亡。蛋白质 问的相互作用可改变细胞内蛋白质的动力学特征( 如底物结合特征、催化活性 等) ，也可产生新自勺结合位点，改变蛋白质与配体作用的特异性，还可使其它蛋 7 第1 章前言 白质失活或复活以调控基因表达。因此，只有使蛋白质问相互作用顺利进行， 细胞正常的生命活动才有保障。 1 2 计算机辅助药物设计 新药的研制是一件耗费巨大而且效率低下的工作，迫切需要应用新的理论 方法和新的技术加以改进。药物设计就是在这种社会需求的强大推动下逐渐发 展起来的，它是药物研究过程中的一个重要阶段。传统的药物设计从总体上讲， 具有很大的盲目性，缺乏成熟完善的发现途径。随着计算机技术、计算化学、 分子生物学和药物化学的发展，药物发现进入了理性阶段，出现了理性药物设 计( r a t i o n a ld r u gd e s i g n ) 。从h a n s c h 和f u j i t a 经典定量构效关系方法【l o 】起，计 算机辅助药物设计( c o m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i g n ，c a d d ) 已经有三十多年的历史 了。近年来，随着分子生物学和结构生物学的发展，许多具有药理作用的生物 大分子的三维结构已经被测定，在此同时，计算机科学也得到了长足的进步， 不但发展了用于大规模并行计算的超级计算机，而且图形工作站和个人计算机 也有巨大的发展。在此基础上，科研工作者也发展了用于化学和生物学研究的 各种功能先进的计算方法。因此，计算机辅助药物设计方法呈现了突飞猛进之 势，已从原来的理论研究发展成为一门实用型的学科，许多经过计算机设计的 或计算机参与设计的药物已经上市或进入了临床研究。计算机辅助药物设计已 经和传统的药物设计一样，成为了药物设计中最重要的手段之一。因此，近年 来应用各种理论计算方法和分子模拟技术，进行计算机辅助药物设计，已成为 国际上十分活跃的研究领域【l l 】。 蛋白质蛋白质相互作用与识别的研究是分子生物学领域的重要课题。由于 实验测定蛋白质复合物结构的困难，目前，通过计算机模拟来预测分子间结合 模式的对接方法受到了很大的关注【l ”。 1 3 分子对接 计算机辅助药物设计的方法大体可以分为基于小分子的药物设计方法、基 于受体结构的药物设计方法和计算机组合化学方法。随着x 射线以及核磁共振 等技术的发展，越来越多的生物大分子的三维结构被测定出来，所以基于受体 第1 章前言 结构的药物设计也就更具有现实意义。 分子对接是基于受体结构药物设计 中的一类重要方法( g a 图1 1 所示) ，是全 新药物设计( d en o v od e s i g n ) 的主要手段 【1 3 1 ，也是进行大规模虚拟筛选的重要途 径。对接时将小分子配体放置于受体的活 性位点处，并寻找其合理的取向和构象。 通过分子对接可以从已有化合物分子库 筛选出有希望的苗头( h i t ) 化合物，节 省了许多合成操作。分子对接的过程就是 寻找配体与受体结合的活性位点处低能 构象的过程，搜索算法和评分函数是分子 对接中两个不可分割的重要组成部分。好 的搜索算法应该能够遍历所有构象空 间，合理的评分函数能够有效地模拟配 图1 1 基于分子对接药物设计方法 体受体问相互作用的亲和力。 1 4 绿豆胰蛋白酶抑制剂与f u r i n 在自然界的许多植物中都发现了酶抑制剂的存在l l ”，如胰蛋白酶抑制剂 ( t r y p s i ni n h i b i t o r ) ，胰凝乳蛋白酶抑制剂( c h r y m o t r y p s i ni n h i b i t 0 0 、和a 一淀粉酶抑 制剂( a - a m y l a s ei n h i b i t o r ) 等。根据氨基酸序列同源性，蛋白酶抑制剂可分为 k u n i t z 和b o w m a n - b i r k 类【”1 。植物蛋白酶抑制剂的分子量在4 6 0 k d 范围内变 动【城，但主要分布在8 - 2 0 k d 之间。1 9 6 3 年戚正武等人【l 刀从绿豆中提取了一种 胰蛋白酶抑制剂( m u n gb e a nt r y p s i n si n h i b i t o r , m b t i ) ，并深入而系统的研究了 它的物理化学及生物化学性质，测定了它的一级结构。这是一个由7 2 个氨基酸 残基组成的多肽分子抑制剂，含7 对二硫键，分子量为7 9 8 4 。绿豆胰蛋白酶抑 制剂( m b t i ) 属于b o w m a n - b i r k 类型抑制剂( 简称b b i ) 。m b t i 的两个活性位 点l y s 2 0 和a r 9 4 7 能以l ：2 的摩尔分子比抑制胰蛋白酶，被认为是自然界里胰 蛋白酶最有效的抑制剂之一。并且，这两个活性位点符合前体加工酶对底物以 及抑制剂活性位点的基本要求：它们都是碱性残基，因此可以推测m b t i 可能 9 第1 章前言 在一定程度上抑制前体加工酶的活性。 f u r i n 是最早被发现的前体加工酶，这类酶参与了很多生理过程，如激素的 加工、成熟，胚胎的生成，神经因子的加工和神经生长。特别是f u r i n 在哺乳动 物体内分布广泛，而且这些酶在某些环境下可能导致疾病的发生，而病菌感染 机体时，前体加工酶是必需的，它们扮演了重要的角色。结合在细胞表面的f u r i n 加工病菌的外壳蛋白，引起病毒的入侵，动物体被感染。本文尝试将绿豆胰蛋 白酶改造成为f u r i n 的短肽类和具有双活性位点的蛋白质类抑制剂。 1 5 主要研究内容 本文对目前对接方法进行了研究，并将其应用于具体的b o w m a n - b i r k 绿豆 胰蛋白酶抑制剂特殊的双头【l8 】结构与蛋白酶相互作用的三体体系中，从三体对 接策略和f u r i n 抑制剂改造应用两个方面开展了工作。 在方法研究上，本文介绍了分子对接方法如a u t o d o c k t 9 , 2 0 1 、d o c k r ”、 c h e m s c o r e 、z d o e k p ”，从而对多种的算法进行综合的理解和掌握，并且根据实际 情况对一些方法进行一定改进，从而能够使得蛋白质、多肽对接计算能表达出 客观上蛋白质与多肽相互作用规律，从一定程度上促进了分子对接方法的发展， 并且扩大其应用范围。本文主要采用的算法为a u t o d o e k 方法，并将其改进用于 蛋白质与蛋白质的对接中，一定程度上解决了现有蛋白质蛋白质对接方法的模 型比较简单的问题，提高了对接计算的精确度。a u t o d o c k 相比目前的蛋白质 蛋白质对接方法，具有更精确的半经验评价函数，而且还能够处理部分柔性。 在搜索算法上，本文采用了g a 和t p s o 两种优化搜索算法在蛋白质与多肽对接 问题上的优化能力，增加了计算结果的可信程度。 本文第一部分工作主要考查了蛋自质多肽蛋白质三体体系的特点，以 b o w m a n b i r k 绿豆胰蛋白酶抑制剂独特双活性位点特殊结构与登革热病毒蛋白 酶n s 3 组成的三体体系为应用体系。基于普通的两体对接方法采取了特殊的策 略，实现了该体系的成功重新构造。本文对三体体系的研究工作的主体思想是“分 而治之”( d i v i d e a n d - c o n q u e r ) ，也就是将三体体系分成几个两两间有相互作用的 二体体系，之后采用“屏蔽”和“分割”两种策略。 屏蔽策略就是针对绿豆胰蛋白酶抑制剂的双活性位点的特殊结构，将它一 端的一个活性位点先用一个受体蛋白通过对接与之相互作用，即先将一个活性 l o 第1 章前言 位点屏蔽掉，之后再将另一个受体蛋白对接到m b t i 第二个活性位点形成了三 体体系的雏形，最后，将第一个受体蛋白从体系中去掉之后，再以分子对接方 法重新将其加到体系中来，这样就准确地完成了对已知三体体系的重造。 分割策略就是依据已解析出来的绿豆胰蛋白酶抑制剂的两个活性片断长链 晶体结构，将两条多肽长链( 2 1 肽l y s 活性片断和2 5 肽a 唱片断) 分别与两个 受体蛋白进行对接。然后，再依据两个片断与受体对接正确相对位置，通过旋 转位移方法将体系中其他的残基、原子重新接合到体系当中，得出比较准确和 可信的对接三体复合物构象。这种策略中，最终三体体系构象是否准确的关键 在于：将两个多肽长链与受体蛋白对接结果的合理和准确性。而我们课题组所 发展出来的t p s o 和改进a u t o d o c k 的两种对接方法，对于这种多肽蛋白质体系 对接已经验证是具有非常高的准确率的。这样就保证了对于三体体系对接结果 的正确性。 本文的第二部分主要基于对于前体蛋白加工酶f i n - i n 特性和生物功能的研 究，致力于将绿豆胰蛋白酶抑制剂( m b l r i ) 设计和改造为f u r i n 抑制剂。从多肽 和蛋白质这两类f i m n 抑制剂的方面来进行： 首先，本文以p d b 数据库己发表的m b t i 的l y s 活性多肽长链晶体结构为 基础，采用定点突变的方法得到一系列多肽序列，并通过同源建模得到了这一 系列f u r i n 短肽类抑制的三维结构。将这些短肽抑制剂与f u r i n 蛋白进行对接之后， 通过对对接结果的分析，发现在抑制剂与f u r i n 发生作用时，带正电的碱性残基 侧链能否深入到f u r i n 的三个活性残基所组成的凹穴，是决定抑制剂能否发挥抑 制作用的关键因素。之后对各条抑制剂对f u r i n 的抑制常数硒的生物学实验结果 的分析有力地支持了本文所发现的这条规律。 其次，本文将第一部分获得的分子对接方法应用于三体体系对接的策略， 应用于到将m b t i 设计成为能同时抑制两个f u r i n 蛋白的双效蛋白质类抑制剂， 基于f u r i n 蛋白自身的特点，利用m b t i 活性多肽l y s 片断对f u r i n 抑制作用，采 取分割策略，成功地通过d o e k i n g 方法得到了m b t i 和f u r i n 三体的复合物，为 将双活性位点的m b t i 发展成为高效、专一的f u r i n 抑制剂打下了坚实的基础。 第2 章分予对接的原理和发展方向 2 1 引言 第2 章分子对接的原理和发展方向 天然蛋白质在生物进化的过程中学会了有选择地与细胞组分相互作用，形 成确定的、紧密的结构，如给体受体、酶底物、酶抑止剂、抗体抗原的结合 等，这种专一性的结合是蛋白质的特性，它决定了蛋白质的生物功能。因此， 生物体系分子间的相互作用模式或结合模式一直是生物学家最为关心的课题之 一，是一个具有重大理论和实际意义的基础性问题。它的研究对于了解生物分 子间的识别机理、蛋白质结构和功能之间的关系和进行新药的设计都是非常重 要的。 蛋白质和配体的对接模拟计算是二十世纪7 0 年代末发展起来的方法，现在 已经吸引了越来越多的生物学研究人员和化学计量学工作者的加入。近二十年 来，随着计算机运算能力的大幅度提高、越来越多蛋白质序列和结构数据的获 得、人们对生物分子的加深了解以及更加精确的原子相互作用模型的建立，分 子对接的研究有了重大的发展。 2 2 分子对接算法的基本原理 分子对接法就是将小分子配体放置于受体的活性位点处，并寻找其合理的取 向和构象，使得配体与受体的形状和相互作用的匹配最佳。在药物设计中，分 子对接法主要是用来从小分子数据库里搜寻与受体生物大分子有较好亲和力的 d ：药均 融受体 6 o 謦龟相互伟用 o 氲键稽互作用 一一麓承橱互作瑶 图2 1 药物一受体互补匹配示意图 第2 章分子对接的原理和发展方向 小分子，进行药理测试，从中发现新的先导化合物。药物分子与受体结合时， 必须遵循以下互补匹配规则：i ) 几何形状互补匹配；2 ) 静电相互作用互补匹 配( 正电荷对应负电荷) ；3 ) 氢键相互作用互补匹配( 氢键供体对应氢键受体) ； 4 ) 疏水相互作用互补匹配( 疏水区对应疏水区) 。 配体与受体的结合过程是一个很复杂的过程，涉及到配体和受体的去溶剂 化、配体和受体( 主要是活性位点处的残基) 的构象变化以及配体与受体之间 的相互作用。由方程( 2 1 ) 知，配体与受体的结合强弱取决于结合过程的自由 能变化： a g 6 咖= 一r ti n k ， ( 2 - i ) 其中磁是药物与受体的结合常数。而结合自由能又可以表示成： a g 女h g = hb i i 畦h g t 厶s 啪吨( 2 - 2 ) 大部分的分子对接算法忽略了全部的熵效应，而在焓效应中也只考虑配体 与受体的相互作用能。配体与受体的相互作用包括静电作用( e e l 。6 。) 、范德 华作用( b d w ) 和氢键相互作用( e hb o n d ) ，即 e m m c d m = e m p + e m m + e hbond(2-3) 根据所采用的力场的差异，( 2 3 ) 式中的氢键作用可以显示地表达，也可以 通过调整相应原子的范德华半径来处理，或者将其包含在静电作用能中。 根据分子对接程序寻找配体与受体的结合构象的方法的差异，可以将分子 对接程序分为： 1 ) 局部优化法不对配体和受体进行构象搜寻，只是对初始构象进行优化，得 到配体与受体结合的一个局部最优结合构象； 2 ) 树搜寻法采用树搜索中的深度优先或广度优先搜索方法，通过有限的步骤， 得到一个相对较好的局部最优结合构象； 3 ) 全局优化法在进行构象搜索时，利用模拟退火法或遗传算法，寻找配体与 受体的全局最优结合构象( 受问题规模以及计算资源的影响) 。 不同的程序用不同的方法处理配体与受体结合时的柔性问题，有的方法将受 体与配体都当成刚性的，有的只考虑配体的柔性，而有的程序则同时考虑受体 与配体的柔性。 第2 章分子对接的原理和发展方向 2 3 分子对接的发展方向 下面对未来分子对接的发展方向做以下概述： 2 3 1 柔性对接 配体与受体相互作用的过程中，由于它们之间的诱导契合，受体的构象，特 别是活性部位构象也会发生一些变化。因此在分予对接的过程中将受体柔性考 虑进去田州，其结果可能更接近于真实的结合过程脚1 。 较早同时考虑了配体和受体柔性的分子对接程序是f l e x i d o c k t ”j ，它通过改变 受体活性部位可旋转键来考虑受体柔性的，在分子对接过程中，受体的位置是 固定的，但其中的一些键是可以旋转的，而配体除了键的旋转外，整体还可以 在空间平动或转动。这种方法较好地模拟了分子对接的过程中受体和配体之间 的诱导契合，但也随之带来一个计算量的问题，其计算所耗费资源是与受体的 柔性键的数目成指数关系上升的，往往计算一个典型的药物分子需要几个小时 的时间，因此f l e x i d o c k 很难应用于大规模的虚拟筛选。 为了解决这个问题，人们开始采用另外一种策略，即不从可旋转键的角度来 考虑分子的柔性而直接选取多个可能的受体构象作为靶点结构，因此对接速度 大大提高，计算一个分子平均只需要5 - 6 分钟，而且对接结果的正确率比刚性对 接有所提高。另一种简化受体柔性的算法是采用软对接方法【2 7 1 使用从基于分子力 场的评分函数式衍生出来的一种“软”评分函数来衡量大分子和小分子之间相互 作用的好坏，这个过程中蛋白质结构保持刚性，但这种“软”评分函数可以容许配 体和受体之间有某种程度的重合，从而来模拟受体可能的柔性结构。虽然这种 方法限制了可容许结合的配体大小和构象变化，但由于很容易整合到已有的程 序中，并且不增加额外的计算时间，所以仍然是一种有效的方法。 2 3 2 溶剂化效应 溶剂化效应在配体受体结合过程中具有重要作用，配体受体结合作用的强 弱决定于二者相互作用以及去溶剂化效应对结合自由能的贡献： g 。d = a g i m 。，w f a g 。f a g , , t ( 2 4 ) 其中， g n 代表复合物相互作用自由能，g 劬，和g 叫。分别代表配体 1 4 第2 章分子对接的原理和发展方向 和受体的去溶剂化自由能。在数据库筛选过程中，忽略配体溶剂化作用，筛选 得到的候选分子往往带有比较高的电荷或体积偏大。k u n t z 等【2 8 】在d o c k 基础 上，发展了一种利用配体溶剂化能来平衡配体一受体相互作用能的方法。将该方 法应用于a c d ( a v a i l a b l ec h e m i c a l sd i r e c t o r y ) 库筛选，结果显示，配体溶剂化能 的校正明显改善了已知配体的相对排列位置。 配体和受体的结合过程是在水溶液中进行的，溶剂对分子的构象、电子结构 和化学反应有着重要的影响。同时，溶剂对生物大分子的结构与功能也有重要 影响。如溶剂能影响酶的催化活性、蛋白质的折叠和展开、生物大分子在溶液 中的构象等；药物在体内的传输、与受体的作用和代谢也离不开体液对其的影响。 所以水分子对于两者的结合是非常重要的，一般认为，水分子的作用表现在以 下三个方面： 首先，在水溶液中，受体蛋白质非极性的残基将远离水分子指向蛋白内部而 极性的残基更加接近水分子，于是形成亲水和疏水的区域，这使得受体中的某 些特定的二级或三级结构能够稳定存在，同时配体受体之间的疏水作用也是两 者结合的主要作用力之一。 其次，在水溶液中，配体和受体相结合之前都有一个去溶剂化的过程，即将 结合部位的水分子排除出去，这个过程直接影响配体和受体的结合能力。 第三，一些水分子直接参与配体和受体的结合，形成氢键、水桥等相互作用。 如果这种相互作用足够大，部分水分子将会被“固定”在配体受体复合物中形成 结晶水。 在以前的大多数的分子对接研究中都没有考虑水分子的影响，因此对于某些 体系的研究结果出现了较大的偏差。近年来越来越多的研究小组在使用的评分 函数中添加了去溶剂化效应，这也从另外一个方面提高了分子对接程序预测溶 液中配体受体结合强度的准确性。 2 3 3 并行计算 分子对接方法用于药物设计的效用日趋显著，而且己经广泛用于药物的先导 化合物的搜寻，但另一方面，分子对接具有非常高的计算复杂性，由于处理的 化合物的数量极其巨大，例如m d l 公司的a c d s c 数据库中的分子已有2 2 0 万之多，在单处理器的工作站上筛选动辄需要几个月甚至几年的时间，另外随 着受体柔性以及更多评分函数的引进，分子对接的计算量则会成倍提高，显然 第2 章分子对接的原理和发展方向 传统的工作站越来越难以承受这种高负荷的计算，必须求助于高性能的超级计 算机。世界上许多制药公司己经陆续购置超级计算机用于药物设计。目前已有 多个应用理论方法设计开发而成功上市的药物。 将分子对接工作从微机上转移到超级计算机上还必须解决软件改造和移植 的问题。即需要将原来串行的分子对接方法改造成适于超级计算技术的并行方 法和程序。分子对接的并行化程序大致可以分成两种类型，种是基于对接算 法的并行，它更适合于提高单个分子对接的效率；另一种是基于分子对接任务 的并行，即在超级计算机或并行集群的多个节点上并行运行分子对接的串行程 序，该种方法通常用于超级计算机上的虚拟筛选问题。当前第二种分子对接的 并行化应用比较常见。比如，位于美国马萨诸塞州的v e r t e x 制药公司装备了1 1 2 个c p u 的超级计算机集群( c l u s t e r ) 并将在近期内扩展到9 0 0 个c p u 。 2 3 4 反向对接 近年来，一些科学家提出了反向分子对接( i n v e r s e d o c k i n g ) t 2 9 1 1 笋j 概念，反向分 子对接是利用小分子去筛选一系列靶标蛋白，其目的也不再是筛药，而更多的 是去探索药物作用机理或毒副作用机制。反向对接方法对于某些临床药物有较 好的预测结果。反向对接及蛋自质数据库搜寻在药物研究中具有诸多潜在应用。 一方面，对于已知生物活性但作用机制不明确的