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微生物学实验目录,实验一：光学显微镜的构造和使用方法实验二:细菌的革兰氏染色实验三：酵母水浸片的制备细胞数及死亡率的测定实验四：显微镜测微技术实验五：霉菌形态观察实验六：培养基的制备与灭菌实验七：微生物的分离与筛选实验八：淀粉酶产生菌的检出实验九：大肠杆菌的主要生化特性实验十：理化因素对微生物的影响-紫外线的杀菌作用实验十一：食品中杂菌总数及大肠菌群的检验,光学显微镜的构造和使用方法,实验一,熟悉光学显微镜基本结构和用途；掌握低倍镜、高倍镜使用方法;掌握使用显微镜观察微生物的形态；,一、实验目的,显微镜玻片标本酵母菌载玻片、盖玻片、擦镜纸香柏油、二甲苯、,二、实验器材,机械系统部分光学系统部分照明系统部分,1.光学显微镜的构造,三、实验内容,机械部分,光学系统部分,“5”，“10”的含义。目镜指针,如何计算显微镜的放大倍数？,照明系统部分,光源,反光镜,聚光镜,光圈,：内光源与外光源,：凹面镜与平面镜,：升高与降低聚光镜,：放开与关闭光圈,如何调节观察视野的明暗度？,2.光学显微镜的使用,取镜放镜对光放片调焦(粗调焦和细调焦),低倍镜的使用,高倍镜的使用,问题思考：对颜色深的标本与颜色浅的标本在观察过程中有何不同？,3.显微镜使用注意事项,显微镜持取正确姿势使用前后的镜头维护注意标本的放置方向观察时注意双目齐睁高倍镜不得使用粗调严禁拆卸任何部件使用后恢复机器原貌,四、思考题,如何根据观察对象使用镜头？为什么先用低倍镜观察,细菌的革兰氏染色,实验二,一目的和要求：,1、掌握革兰氏染色的原理及方法2、初步掌握无菌操作技术,二、实验用品,菌种：大肠杆菌斜面菌种；八叠球菌斜面菌种试剂：结晶紫染液；蕃红染液；碘液；95乙醇其它：显微镜；载玻片；接种环；香柏油；酒精灯；擦镜纸,三、基本原理：,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGran创立的。细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低。革兰氏阴性菌其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高。,四、实验步骤,1、涂片：将大肠杆菌和八叠球菌分别涂片、干燥、固定2、染色：（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗（3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇（4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。,经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。,大肠杆菌（G-）,八叠球菌（G+）,五、实验报告,1、结果：画出2株细菌的染色观察结果（颜色、革兰氏染色反应）。2、思考题：1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键步骤是什么？2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？,酵母水浸片的制备酵母细胞数及死亡率的测定,实验三,一、实验目的,学习用血球计数板计酵母细胞数。学习测定酵母细胞死亡率。,二、实验器材酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管，吸水纸,三、基本原理,利用血球计数板在显微镜下直接计数，直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的，可根据观察到的数目换算成单位体积的总数目，此法计得的是菌的总数，故称总菌计数法。,血球计数板刻有两方格网，每网分九大方格，中间为计数室。计数室为2516（1625）小方格。计数时常数五个中格的总数，换算出1ml中的总菌数。,死亡率测定的原理为：美兰溶液是对细胞无毒性的、弱氧化性的染液，其氧化态无色，还原态兰紫色。活细胞具有还原能力，能将美兰溶液还原为无色，而死细胞不具还原能力。,四、操作步骤,.细胞数测定稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必稀释。镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则进行清洗。加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。,4显微镜计数：先低倍镜找计数室，后高倍镜计数。一般以每小格510个菌体为宜。常选四角和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。5清洗血球计数板：自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，自行凉干。镜检，洗净为止。记录,.死亡率测定制片记录总数及死亡数计算死亡率死亡率（）,死亡数,总数,1.实验结果：2思考题：（）用血球计数板的误差主要来自哪些方面？如何减少误差？（）为什么活细胞能使美兰脱色?,五实验报告,显微镜测微技术,实验四,一、实验目的,1）学习用测微尺测量微生物细胞大小。2）掌握台镜测微尺和目镜测微尺的使用方法。,二、材料与仪器,1、啤酒酵母2、显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺,微生物细胞大小，是其形态特征重要标志之一。每一种微生物在一定条件下，有其相对固有的大小形态。它是分类鉴定的依据之一。其大小测定可用测微尺测量。测微尺分为目镜测微尺和物镜测微尺两部分。,三、基本原理,目镜测微尺：是一块可以放入接目镜内的特定圆形玻璃片。玻片中央是一个细长带刻度的尺，等分成50或100小格，每个等分线间距为0.1mm。由于不同显微镜的放大倍数不同，故目镜测微尺每格实际代表长度随显微镜的不同而不同。因此在使用前必须用物镜测微尺校正，以求得在一定接物镜及目镜等光学系统下，目镜测微尺每格所代表的实际长度。,物镜测微尺是一块中央部分刻有精确等分线的载玻片。每一刻度间距为10um即把1mm等分为100格，是专门为校正目镜测微尺实际数值用的。,四、方法与步骤,1、目镜测微尺的校正1）将目镜测微尺装入目境内，刻度朝下，并将物镜测微尺朝上置载物台上。2）用低倍镜核对，至能清晰看到物镜测微尺。3）改用高倍镜或油镜对焦后，转动目镜，使目镜测微的刻度和物镜测微尺刻度平行。4)两尺吻合后，先使两尺的一端某一刻度完全重合，然后再寻找另一端第二条重叠的刻度。,5)计下两吻合刻度间，目镜测微尺与物镜测微尺的格数。按下列公式算出目镜测微尺每小格所代表长度。目镜测微尺每格长度（微米）两吻合刻度间物镜测微尺格数10m=两吻和刻度间目镜测微尺格数例如：目镜测微尺的5格等于物镜测微尺的2格，则目镜测微尺1格=（210）/5=4微米,目镜测微尺安装方法,目镜测微尺,目镜测微尺,一,镜台测微尺及其中央部分的放大,镜台测微尺校准目镜测微尺时的情况,2、酵母细胞大小测定：,1）制作酵母水浸片2)取下镜台测微尺，将“水浸片”标本置于载物台上。3）先用低倍镜观察到目标后，转换高倍镜测量酵母的大小，测量1020个菌体，求出其平均值。,四、测量结果记录：,在高倍镜下：目镜测微尺格=物镜测微尺格目镜测微尺1格=微米酵母细胞长度=目镜测微尺平均格=微米宽度=目镜测微尺平均格=微米注：要求测量10个酵母细胞的平均值,五、思考题,1、为何更换不同倍数目镜和物镜时，必须要重新标定？2、根据测量结果，同种酵母菌大小不同？,霉菌形态观察,实验五,一、实验目的,1）学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；2）了解四类常见霉菌的基本形态特征。,二、实验材料,菌种：曲霉（Aspergikkussp.）根霉（Rhizopussp.）其它：显微镜、载玻片、三棱针、乳酸石碳酸,三、基本原理,霉菌菌丝较大，细胞易收缩变形，而且孢子容易飞散，所以制标本使常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片其特点是：（a）细胞不变形；（2）具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；（c）溶液本身是蓝色的，有一定染色的效果。,四、实验步骤,1）菌落特征观察：菌落大小、菌丝高矮、生长密度、同心环、孢子颜色2）制片：载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸液，三棱针挑取霉菌展开于液滴中。3）低倍镜观察,根霉,)：,孢囊孢子（sporangiospore）,根霉、毛霉,分生孢子(Canidinm),曲霉、青霉,五、实验结果,1.记录,2.绘图,五、思考题,1你主要根据哪些形态特征来区分两种霉菌？2你认为在显微镜下，两种霉菌的主要区别是什么？,培养基的制备与灭菌,实验六,一、目的与要求,1、了解培养基的配制原理，掌握制备培养基的过程。2、学习高压蒸汽灭菌操作技术。3、了解干热灭菌操作要点。,二、实验原理:,培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。一般来说，培养基包括有水份、碳源、氮源、无机盐类以及生长因素等五大类营养成份。此外还得有适宜的PH值，一定的渗透压（即浓度）以及氧化还原电位等。,灭菌：即通过不同的加热方法，使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的,蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水量较多者，其凝固所需要的温度低，反之，含水份较少者需要高温才能使蛋白质凝固。因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需的温度高。,三、实验方法,1.玻璃器皿的灭菌：干热灭菌：适用于玻璃仪器，将物品放入烘箱，160170oC，12小时。2.培养基的配制察氏培养基、牛肉膏蛋白胨培养基3.培养基的灭菌高压蒸汽灭菌,四、注意事项,称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。,四、实验报告,记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。,五、思考题,l配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?3.高压灭菌锅灭菌时，为何先放冷空气？4.,微生物的分离与筛选,实验七,一、实验目的,学习从自然界中分离、培养微生物的方法。学习制备平板及接种等无菌操作技术。,二、实验原理,利用目的菌的生理特征，将菌从微生物群体中筛选出来，并进行分离培养，获得纯种。,1.稀释平板分离法(1)取样(2)稀释水样(3)平板制作,10-110-210-310-410-510-6,三、实验方法,2.平板划线分离法,(1)倒平板:(2)划线：,3菌落形态特征的观察,观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、透明度、气味及粘滞性等。4微生物个体形态观察在观察了已培养好的各种微生物菌落形态以后，用结晶紫单染色，进行显微镜的观察。并绘制形态图。5.斜面接种技术,描述所分离出的菌落的特征，类型。为什么培养时要倒置培养？什么情况下适宜用划线分离法？什么情况下适宜用稀释分离法？,四、实验结果及思考题,淀粉酶产生菌的检出,实验八,一、实验目的,1）设计淀粉酶产生菌检出方案。2）学习淀粉酶产生菌的筛选方法。,二、实验用品,菌种：黑曲霉（Pr3）；枯草杆菌(7658)；卡尔丝酵母(2604)其它：察氏培养基；无菌培养皿；碘液,三、实验原理,淀粉酶产生菌向胞外产生淀粉酶，使淀粉分解成麦芽糖。利用淀粉遇碘变蓝的特性进行检测,四、实验方法,1）配制察氏培养基2）制作平板3）在三个不同区域接入三种菌，进行培养4）菌长好后，加入碘液，进行观察,五、实验结果,六、思考题,1.说明透明圈产生的原因。2.如何判断产淀粉能力的强弱？,大肠杆菌的主要生化特性,实验九,一、实验目的,学会大肠杆菌的检出方法，并掌握其理论依据。,二、实验材料,菌种：大肠杆菌；产气杆菌试剂：甲基红试剂；40氢氧化钾；1.5萘酚酒精溶液；吲哚试剂；1%溴麝香草酚蓝,三、实验原理,V-P反应：某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。甲基红反应：当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2)柠檬酸盐反应：有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色变为深蓝色。吲哚反应：有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。,四、实验方法,1）配制培养基葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基柠檬酸盐培养基2）接菌培养3）加入药品，进行反应，观察,五、实验结果,将实验结果填入下表。“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。,五、思考题,1)解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸活性的指示剂，而不用丙酮酸？2)为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？,理化因素对微生物的影响-紫外线的杀菌作用,实验十,一、实验目的,证明紫外线的杀菌作用,二、试验材料,1299液体培养物；牛肉膏培养基；灭菌的十字形黑纸；灭菌吸管；三角耙等,三、实验原理,紫外线中波长为200300nm者具有杀菌能力。其中265266nm的杀菌作用最强，紫外线除日光中含有一部分外，医学上使用的常以人工紫外线灯产生；其杀菌机制是干扰细菌DNA的合成。特点是穿透力较