（发酵工程专业论文）白腐菌木素过氧化物酶的研究.pdf

天津科技大学硕士论文 摘要 担子纲白腐菌( w h i t e - r o tf u n g i ) 分泌的胞外木素过氧化物酶( 1 i g n i n p e r o x i d a s e ，l i p ) 在木素降解过程中起主导作用。本论文主要是对白腐菌产l i p 发酵条件及其酶液对稻草中木素降解的研究。 在静置培养条件下，产酶培养基的最优组成为( l j 】) ：葡萄糖0 2 9 糊精 1 8 9 ，酒石酸铵2 4 m m ，藜芦醇( v e r a t r y la l c o h o l ，v a ) 3 m m ，吐温8 01 9 ，醋酸 缓冲液1 0 m m ( p h 4 5 ) ，k h 2 p o4 4 9 ，m g s 0 4 7 h 0 2o 2 9 ，c a c l 2 2 h 0 2o 4 9 ，v b l l m g ，微量元素混合液( m n s 0 。h 2 0 含量改为0 0 6 9 l ) 7 0 m l ，产酶温度为3 7 ，白腐菌此条件下产生的l i p 最高酶活达7 5 6 0 u l ( 8 d ) ；在振荡培养条件下， 产酶培养基的最优组成为( l - 1 ) ：葡萄糖1 0 9 , 酒石酸铵2 r a m ，藜芦醇3 m m ，吐 温8 01 9 ，醋酸缓冲液1 0 m m ( p h 4 5 ) ，k h 2 p o43 9 ，m g s 0 4 7 h 0 2 l g ， c a c l 2 2 h 2 00 0 5 9 ，v b ll m g ，微量元素混合液( m n s 0 4 h 。o 含量改为0 0 6 9 l ) 7 0 m l ，培养条件为3 7 c ，1 6 0 r m i n ，此条件下白腐菌产生的l i p 最高酶活达 6 5 0 0 u l ( s d ) 。 通过s d s p a g e 简单分析了不同培养条件下粗酶液中l i p 的合成情况， 凝胶中蛋白带的多少与l i p 活力的高低相对应。这说明，在培养条件改变时， 由于菌体分泌的l i p 同工酶在数量上有所增加，使得整体的l i p 酶活力相应 提高。 经过对l i p 发酵条件的研究，使其过量生产，并利用l i p 粗酶液直接降 解稻草，木素的降解率为8 7 ，经红外光谱分析其降解产物，推断l i p 在体 外降解稻草的反应主要是氧化反应。 关键词白腐菌 木素过氧化物酶 黄孢原毛平革菌 木素生物降解 摘要 a b a t r a c t b a s i d i o m y c e t e s w h i t e - r o t f u n g i w h i c hc a ns e c r e t es e v e r a le x t r a c e l l u l a r e n z y m e s ，i nw h i c hl i pp l a y sad o m i n a n tr o l ei nl i g n i nd e g r a d a t i o n r e s e a r c h i n g a n do p t i m i z i n gf e r m e n t a t i v ec o n d i t i o n so fl i pa n d d e g r a d i n gr i c es t r a wb y “p i s t h em a i n p u r p o s e o f t h i sd i s s e r t a t i o n u n d e rs t a t i cc u l t u r ec o n d i t i o n ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc u l t u r e c o n d i t i o n sc o n t a i n e dt h ef o l l o w i n g ( l 。) ：g l u c o s e2 9 ，a m m o n i u mt a r t r a t e2 4 r e t o o l ， v e r a t r y la l c o h o l3 m m o l ，t w e e n8 0l g , a c e t a t eb u f f e r ( p h 4 5 ) l o m m o l ，k h 2 p 0 4 4 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 ，c a c l 2 _ 2 h 0 2 0 4 9 ，v b l l m g a n d t r a c ee l e m e n t s7 0 m 1 t h e h i 曲e s tl i g n i np e r o x i d a s ea c t i v i t ya p p e a r si nt h es i x t hd a y a f t e ri n c u b a t i o ni nt h e a b o v ec u l t u r ea t3 7 0 c u n d e rt h ee o n d i t i o no fs h a k i n gc u l t u r e ，t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n sc o n t a i n e dt h ef o l l o w i n g ( l 1 ) ：g l u c o s e1 0 ， a r m n o n i h r nt a r t r a t e2 r e t o o l ，v e r a t r y la l c o h o l3 m m o l ，t w e e n8 0lg ，a c e t a t eb u f f e r ( p h 4 5 ) 1 0 m m o l ，k h 2 p o4 3 9 ，m g s 0 4 7 h 0 2l g ，o 0 5 9c a c l 2 2 h 2 0 ，v b il m g a n dt r a c ee l e m e n t s7 0 m 1 t h eh i g h e s tl i g n i np e r o x i d a s ea c t i v i t ya p p e a r si nt h e e i g h t hd a y a f t e ri n c u b a t i o ni nt h ea b o v ec u l t u r ea t3 7 1 6 0 r m i n w ea n a l y s i z e ds y n t h e s i so fl i pu n d e rd i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n st h r o u g h s d s - p a g e t h eq u a n t i t yo fp r o t e i ni ng e li sc o r r e s p o n d i n gt ol i pa c t i v i t y 1 1 1 i s s h o w e dt h ei n c r e a s ei n q u a n t i t y o fl i pi s o e n z y m em a d et o t a ll i pa c t i v i t y c o r r e s p o n d i n g l yi m p r o v e d w h e nt h ec u l t u r ec o n d i t i o nw a sc h a n g e d h a v i n gc r u d ee n z y m eo fl i pf r o ms t a t i c c u l t u r et o d e g r a d er i c es t r a w , t h e d e g r a d i n gr a t eo fl i g n i ni s8 7 a tt h e4 t hd a y t h r o u g hi rs p e c t r u ma n a l y s i so f e x t r a c t i v ep r o d u c t so f d e g r a d e d a n du n d e g r a d e dr i c es t r a w b y c r u d e e n z y m eo f l i p f r o ms t a t i cc u l t u r e ，i ti sf o u n dm a i nr e a c t i o nw a so x i d a t i v er e a c t i o ni nl i g n i n b i o d e g r a d i n gp r o c e s s k e y w o r d s ：w h i t e r o t f u n g i l i g n i np e r o x i d a s e p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m l i g n i nb i o d e g r a d a t i o n 2 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 木素生物降解理论的研究 1 1 1 木素在自然界中的存在和组成 木素( 或称木质素，l i g n i n ) 是自然界中含量最丰富，并可回收利用的有 机资源，它广泛存在于种子植物中。木素据来源可分为针叶木木素、阔叶木 木素和禾草木素三大类，不同植物木素含量有较大差异。植物细胞壁的主要 组分有纤维素( 4 0 6 0 ) 、半纤维素( 2 0 3 0 ) 和木质素( 1 5 3 0 ) ， 木素在木质纤维中除存在于初生和次生细胞壁外，尚有大量存在于纤维与纤 维之间，主要功能是给植物组织以强度和硬度，起着粘合纤维和使纤维刚挺 的作用，它能与细胞壁多糖结合，构成一体，防止过多水分和有害酶类渗进 细胞壁，起到了很好的防腐和防微生物侵害的作用【l j 。 木素属天然芳香族高分子聚合物，他由苯基丙烷单元通过醚键和碳一碳键 连接聚合而成。木素中一般含有对位香豆醇、松柏醇和芥子醇三种不同类型 的苯基丙烷单体。木素的结构单元随植物品种、植物年龄、甚至细胞壁形态 部位的不同而存在着不同比例的愈创木基( 3 - 甲氧基- 4 羟基苯基) 、丁香基( 3 ， 5 二甲氧基4 羟苯基) 和对羟丙烷等，这些醇的共聚化作用产生了不均匀、 无旋光性、交叉键合和高度分散性的聚合物，对木素的反应性能起重要作用 的官能团主要有酚式羟基、苄式羟基和羰基。 1 1 2 木素的化学降解与化学制浆 木索的降解是木质纤维原料利用的重要处理环节，由于木素以不溶性三 维网格形式存在，难于溶解析出( 据报道术素只能被吡啶和二恶烷等少数溶 剂溶出) ；又因木素为无定形热塑性高聚物，高温下往往发生软化，软化后的 木素更容易被化学药物作用而溶解析出。在化学制浆过程中，往往给以高温、 高压和强碱条件，使化学试剂与木素之间通过亲核反应、亲电取代反应或氧 化反应，使木素解聚溶出，除去木素，并尽可能地控制碳水化合物的降解， 以提高纤维得率。故生产纸浆的同时，也带来了能耗高、污染重等一系列严 重的问题。针对上述情况，各国都采取措施，加大科研投入，以寻求最佳制 浆工艺，减轻制浆废水污染环境带来的巨大压力。 1 1 3 木素生物降解的研究现状 木素的降解机理是制浆和漂白研究的主要内容，近年来，环境保护和资 源利用问题受到前所未有的关注，传统的利用化学药剂脱除植物纤维原料木 素的制浆或漂白方法所带来的环境污染问题日益严重。因此，利用生物技术 脱除木素的研究已成为国内外开发利用植物纤维原料的热点课题。 木素降解机理的研究主要包括两个方面：( 1 ) 比较降解反应前后原料木 素或木素模型物结构变化，推断降解过程可能发生的化学变化；( 2 ) 根据木 1 前言 素降解反应产物，判断木素降解过程与降解途径。关于木素生物降解研究， 又可分为利用微生物直接处理原料木素和利用微生物分泌的木素降解酶处理 原料木素或木素模型物。 木素降解在自然界碳氧循环中具有极其重要的作用，过去仅知少数真菌 能降解木素，自从应用了1 4 c 标记的木素和松柏醇的去氢聚合物( d h p s ) 做 底物后，新发现了不少具有木素分解能力的微生物。另外人们借助现代仪器 ( 如电子光谱、喇曼光谱、核磁共振谱等) 对木素生物降解产物进行了鉴定， 使生物降解途径逐渐明确，为低污染造纸业( 生物带嵘) 的发展奠定了基础。 为了在降低能耗、控制环境污染的前提下持续地发展制浆造纸工业，人们不 断地进行着探索和努力。生物制浆由于具有所需设备简单、工业原料和能耗 廉省、纸浆品质好、废液污染小等优点引起了人们的广泛兴趣和高度重视， 有关研究日趋活跃。近十几年来，国际上围绕木素生物降解进行了大量基础 研究工作。主要集中在如下几个方面：( i ) 微生物( 主要是自腐菌) 对模型 化合物、合成木素和天然木素的降解机理，生理条件对生物降解作用的影响 【4 lj ；( 2 ) 木素降解酶的分离、提纯、特性分析和作用机理研究【1 3 】；( 3 ) 木素 降解过程中植物内部组织及纤维细胞的微观结构变化【4 】。这些研究成果，给 生物制浆、生物漂白、制浆漂自废液的生物处理等提供了重要依据和潜在途 径。 1 1 4 木素生物降解研究的目的及意义 随着国家可持续发展战略的实施，环境保护越来越受到人们的重视。制 浆造纸、农药、印染等国民经济发展必不可少的行业，每年都会向自然界排 放大量有剧毒、致癌的工业废弃物i i j 。木素是制浆造纸工业的主要剩余物， 同时也是地球上碳循环的重要组成部分，人们对其进行深入的研究，会使其 代谢机理更明朗，应用前景更广阔。通过生物降解有可能使木素转化为重要 的化工产品、微生物蛋白饲料或有机肥料，使其变废为宝。但木素生物降解 应用前景最好的还是生物制浆，因为其最好最直接的利用方式是制各高得率 的纸浆。从自然资源合理利用和可持续发展战略的角度考虑，对木素的生物 降解理论进行充分研究具有重要的现实意义。 木素生物降解的研究工作范围十分广泛【5 】，除了早期发现的能够自然降 解纤维原料木素的白腐菌类( w h i t e r o tf u n g i ) 担子菌纲( b a s i d i o m m y e e t e s ) 的黄胞原毛平革菌( p h a n e r o c h a e 耙c h r y s o s p o r i u m ) 和杂色云芝( c o r i o l u s v e r s i c o l o r ) 外，具有降解木素能力的极少部分细菌和一些放线菌正在不断被 筛选和研究，但对于以黄胞原毛平革菌和杂色云芝为代表的木素降解机理的 认识在目前的菌种筛选、生物制浆、生物漂白研究工作中依然具有重要的理 论意义。 1 1 5 木素降解菌体系 天津科技大学硕士学位论文 木素中单元结构间连接键的生物降解主要是非专一性氧化反应，其初始 降解为胞外过程。具有降解木素能力的微生物包括真菌、细菌和放线菌。目 前研究和应用较为广泛的菌种大多为真菌门担子菌纲的白腐菌。 微生物对纤维原料的降解反应的实质是多种酶协同作用下发生的酶促反 应，据报道微生物分泌的与木素降解直接有关的胞外酶有木素过氧化物酶 ( 1 i g n i np e r o x i d a s e ，l i p ) 、锰过氧化物酶( m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ，m n p ) 和漆 酶( 1 a c c a s e ，l a c ) 忙j 。1 9 8 6 年，又有人发现葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶， 可以彻底氧化底物产生h 2 0 2 ，与l i p 和m i l p 共同构成木素降解体系。以黄 胞原毛平革菌为例，能够分泌胞外酶l i p 和m 1 1 p ，具有h 2 0 2 发生系统的微生 物降解木素的过程所示如图1 1 。 二氧化碳+ 水 、 卜一i，一菌丝( 晰p n a ) 川_ j _ 一一二一二二= ：一 i 一、 j 7 、口 眦 乙= 醛氧化酶 g i y 酬删d 鹊e ，1 。氧气一、 过氧化氢 、 o 木素过氧化物酶 “ 锰过氧化物酶+ j 鲻目化氢 阳离子根 图1 1 铡噬糌木素降解体系示意图 分解反应 异声鬲、多种降礴l 产物 如图1 - 1 所示，不能被真菌直接吸收的木素大分子在胞外酶m n p 、l i p 和 乙二醛氧化酶【1 6 1 催化反应得到的h 2 0 2 共同作用下形成阳离子根，随后在产烷 菌作用下分解为可被菌丝直接吸收利用的小分子物质，最终在菌体内氧化为 c 0 2 和h 2 0 ，完成木素的代谢过程。在实际反应中，l i p 需要藜芦醇构成降解 体系；m n p 需要m n 2 + 形成木素降解体系。在这一过程中，木素并非菌体生长 所需的直接碳源，菌体降解木素需要首先代谢碳水化合物获得所需的h 2 0 2 ， 然后木素降解成为可能，因此，木素降解是菌体次生代谢的结果。 一 ，v 一 一叫 。 嘶 一 0t予。 m _ 1 前言 与其它微生物种类相比，白腐菌能更快、更彻底地降解木素。以稻草生 物降解为例，余惠生【4 】进行电镜分析的结果显示，白腐菌通过原料表面的气 孔或端部侵入稻草内部，并在薄壁细胞和细胞腔内部繁殖，通过纹孔或在细 胞壁造孔向四周蔓延。在稻草组织内部，薄壁细胞最先被菌破坏分解，然后 胞问层物质逐渐分解，导致纤维解离。在上述过程中，白腐菌首先选择性攻 击稻草纤维细胞壁中木素浓度最高的胞间层部位，然后逐渐分解纤维次生壁 木素，但未见白腐菌降解木材纤维时，发生纤维细胞壁变薄直至破坏的现象。 上述降解稻草的微观过程与一般报道的白腐菌降解木材的微观过程差别较 大，有关研究认为，在木材原料生物降解过程中，木素降解首先发生在细胞 腔部位，然后向胞间层蔓延【4 】。另外，稻草纤维次生壁木素在生物作用下逐 渐被除去，使微细纤维裸露于纤维表面，有利于纸浆打浆后分丝帚化，提高 成纸强度l 。 关于木素降解菌的应用研究，国内外围绕菌种选育、降解机理、影响因 素等内容进行了大量的工作。e r i k s s o n 和k i r k 5 等人在生物学方面开展广泛研 究：白腐菌p l e u r o t u s o s t r e a t u s ( j a e q u ) f r i p b n o 5 3 被用来分别处理日本柏树磨 木木素、松木硫酸盐木素和商品木素磺酸盐。实验考察了纤维素使用与否对 木素降解量和降解菌酶活力的影响，证实了纤维素的存在对各种木素的生物 降解都产生明显的促进作用。 一些研究结果显示f 7 1 ，p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 不能分泌一种重要的 酚氧化物酶( 漆酶) ，而另一些真菌( 主要是杂色云芝) 并不产生l i p 但可以 分泌m n p 和l a e ，虽然它们能在不同程度上降解木素大分子，但其降解机理 显然是有所区别的。从目前的情况看，对于微生物的木素降解作用研究还不 很透彻。由于真菌处理原料周期长，因此近期内完全依靠微生物完成生产规 模的生物制浆是相当困难的。 最近的研究发现漆酶可以在分子氧和a b t s ( 2 ，2 一a z o b i s - ( 3 一e t h y l b e n z t h i a z o l i n e - 6 s u l f o n i ca c i d ) ) 等氧化还原介质的作用下催化木素大分子降解，这一 发现对于推进漆酶制剂工业化应用进程具有重要意义。 1 2 白腐茵的研究进展 1 2 1 白腐菌的生物学背景 自腐菌是生物界中一类奇特的丝状真菌，属于担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) ， 腐生在树木或木材上，因引起木质白色腐烂而得名。这里所说的“白腐菌” 并非生物学上的分类概念，而是对具有木素降解能力的一类真菌的总称。 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mb u r d s a l l 是典型种，学名黄孢原毛平革菌，普遍 分布于北美。其菌丝体为多核，少有隔膜，无锁状联合。多核的分生孢子大 多为异核，而白腐菌的担孢子却是同核体。存在同宗配合和异宗配合两类交 配系统。 4 天津科技大学硕士学位论文 自腐菌靠降解木质素一纤维素材料的能力穿入木质，侵入木质细胞腔内， 释放降解酶，导致木质腐烂成为淡色的海绵状团块一白腐。 1 2 2 白腐菌研究和利用现状 7 0 年代确定了白腐菌在实验室条件下降解木素的营养需求【6 】：8 0 年代发 现了白腐茵的两种重要酶系，木素过氧化物酶系( l i p ) 和锰过氧化物酶系 ( m n p ) 【7 j ：9 0 年代展开了对以上酶系催化特征、分子生物学的研究 8 1 ，其研 究利用现状有两个明显特点：( 1 ) 白腐菌生物制品生产与生物补救技术正走 向市场、趋于商业化并密切与工业界发生联系，白腐菌分泌的木素降解酶在 造纸工业上对木材制浆及漂白纸浆的再利用和处理有不可低估的作用。美国 宾州州立大学的t i e n z y m e 公司，商业化生产供应白腐菌酶制品。许多大学和 公司的实验室正在探索酶制剂工业化生产的最优化工程规划，涉及到反应器 的设计、培养参数的改良、突变品系的筛选、固定化酶载体的选择等。( 2 ) 研究已经深入分子水平。现已对一些重要酶的e d n a 进行克隆与测序，并详 细描述了白腐菌的基因组及基因结构。开始采用重组技术研究l i p 、m l l p 的 同源、异源表达及调控机制。目的是更好地对白腐菌实施遗传操作。按人类 的愿望与工业、环保实际的需要改造菌种。 白腐菌降解木素有三个特点【1 4 】：( 1 ) 能彻底降解木素生成c 0 2 和水，而 细菌至多将2 0 木素碳转化为c 0 2 ；( 2 ) 木素降解主要是氧化反应，产物中 不出现木素单体；( 3 ) 术素降解本身不提供菌体生长所需的碳源和能源，需 要提供另外的碳源和能源供菌降解木素。白腐菌降解木素产物所含碳、甲氧 基和氢比相应原木素少，而含较多氧和羰基，芳香性组成降低，n 、b 不饱 和链烃增加，但分子量近似于原木素。 1 3 白腐菌木素降解酶的基本特性与作用机理 1 3 1 木素过氧化物酶( l i p ) l i p 是一系列含有血红素辅基的同功酶，分子量在3 8 - 4 3 k d ，其中约1 5 为糖基组分；魁r k 【5 j 等人从p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 培养液中分离出1 0 个含血红索的蛋白，其中6 个为l i p ，主组分为h 8 。l i p 同功酶在分子量、 表观k m 和v m a x 等方面都很相近，且这些同功酶可能是由同一基因编码， 经转录后修饰( 包括糖基化或磷酸化的数量和类型) 造成结构上的差异。 l i p 在以h 2 0 2 为辅助底物时，可氧化酚型木素模型化合物为苯氧自由基， 氧化非酚型木素模型化合物为芳香正离子自由基，在经过一系列非酶催化的 自由基反应后使木素侧链上的c 。c 。键断裂，产生c 。一c 。片断和c l c 。片断， 其作用机制【l5 】推测如图1 2 。 前言 l t p l l li p p l i p i 图卜2l i p 的降解机制 图1 2 中，自然状态下的l i p 含有自旋f e 3 + ，被h 2 0 2 氧化失去两个电子 后形成l i pi ( 0 = f e a + ) ，l i pi 含有一个o = f e 4 + q b 心和一个有机阳离子自 由基( a + ) ，该自由基依酶的种类和来源不同或定位于血红素或定位于蛋白 质多肽链中；随后，l i pi 氧化一分子外源底物( r h ) ，得到一氢原子和一电 子，产生底物自由基( r ) 和l i pi i ，而有机阳离子自由基( a 十) 则被还原 为初始态，接着l i pi i 被另一分子外源底物还原为初始态形式f e ”，但又形 成一个r ；最后，两个r 或结合成r 2 或歧化为r 2 h 4 。上述过程中如果l i p i i 与过量的h 2 0 2 反应则生成低活性形式l i pi i i f e 3 + - o p 或f e 2 + - 0 2 p ，使反应 速度降低直至失活。 1 3 2 锰过氧化物酶( m n p ) m n p 与l i p 在免疫学和氨基酸序列方面很相似，但l i p 的抗体不与m n p 反应，二者甘氨酸、亮氨酸和异亮氨酸含量不同1 7 j 。m n p 可以在m n 2 + 存在时 氧化酚型底物，同时氧化m n 2 + 为m n 3 + ，g o l d 等人利用乳酸盐或类似化合物 的缓冲溶液与m n 2 + 形成螯合物，提高氧化能力3 2 0 倍。m n p 的作用机制见 图1 3 。 l 皴；鹬 1 图1 - 3m n p 的降解木素机制 裁 化纛术囊 天津科技大学硕士学位论文 在m n p 的作用过程中，m n 2 + 作为电子载体与h 2 0 2 对酚型化合物或酚 型木素的降解具有重要作用【8 1 9 】。如图1 3 ，m n p 在h 2 0 2 存在时失去一个电 子形成m n p + 。m 1 1 p + 将m n 2 + 氧化为m n 3 + ，自身被还原为自然状态m n p ，m n ” 与丙二酸盐形成螫合物氧化木素大分子并使之降解，m n 3 十则还原为 m n 抖 2 4 - 2 6 ，如此完成氧化还原催化周期。一些研究结果认为m n p 的作用主要 是脱除木素甲氧基，形成易于进一步被氧化的醌式结构导致芳香环断裂。 1 3 3 漆酶( l a c ) 漆酶( e c l 1 0 3 2 ) 是一类含铜的多酚氧化酶，可以催化酚型化合物形成 苯氧游离基。它对酚型化合物底物的作用效果与辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ，h r p ) 相似1 4 “。l a c 与h r p 对多种酚型模型化合物的作用结果显 示确有氧化降解反应发生。漆酶催化单电子氧化反应，对于木素模型化合物， 反应的主要部位有：c 。氧化、脱除甲氧基和芳香环开裂1 4 “。漆酶最早是从漆 树的分泌物中发现，随后发现很多植物和微生物都可产生这种酶。反应的最 适p h 值为3 5 - 6 0 。其对木素的催化过程1 如图卜4 。 图卜4l a e 的降解机制 奉豢 飙化忿拳豢 图卜4 中，l a c 还原分子氧为水，在电子转移介体a b t s 的作用下，实现木 素的氧化降解，被l a c 氧化的a b t s 以a b t s 自由基的形式在l a c 分子与纤维 细胞壁木素分子之间传递电子，构成完整氧化还原周期。“3 。近期的研究结果 认为，在0 ：存在时，漆酶催化酚型化合物脱去羟基上的电子或质子形成自由 基，从而导致酚型木素侧链脱羧、脱氧，造成c - c 键断裂。与前两种酶的最 大区别是不需要h 2 0 。存在即可完成催化氧化反应。 1 4 木素降解酶活力的测定方法 1 4 1 木素过氧化物酶的测定 1 4 1 1 以藜芦醇为底物测l i p 活力的方法i l 2 j 多种含苯丙烷的化合物和含苯甘油0 苯醚键的木素模型化合物都曾用 作测试l i p 活力的底物，其中应用最广的是藜芦醇( v e r a t r y la l c o h o l ，v a ) ， 它是白腐菌的一种次生代谢产物，被认为可诱导l i p 的合成，在3 1 0 n m 处无 光吸收，而当h 2 0 2 存在时，v a 可被l i p 氧化为藜芦醛( v e r a t r a l d e h y d e ) ，此 1 前言 时在3 1 0 n m 处则有强烈光吸收( e = 9 3 1 0 3 m 0 1 c m 。1 ) ，因此一般用其光密 度增加速率a o d m i n 来表示l i p 活力。在同类化合物中l i p 对v a 有较小的 k 。和较高的v 。a x ，反应条件通常为2 m m o l v a ( k i n = 6 0 1 t m 0 1 ) ，0 4 m m o lh 2 0 2 ( k = 8 0 um 0 1 ) 矛l ：l5 0 m m o lp h 2 5 的酒石酸钠缓冲溶液，3 0 ，以每分钟形成l um o l 藜芦醛为1 个酶活力单位( 3 】。 应当注意的是l i p 的最适p h i 2 ，但o h 2 5 时酶容易失活，所以采用 p h 2 5 的缓冲液，此时反应速率的线性区约在2 分钟内。酶的加入量应足够使 o d 值每分钟增加0 2 左右，反应温度亦应稳定。为确保反应正常进行，v a 还应经真空蒸馏以除去可使反应发生延迟的还原性杂质。 这个测试方法作为l i p 活力测定的标准方法被广泛应用，但也有如下缺 点【1 3 , 1 4 1 ：( 1 ) v a 在氧化过程中，舍二甲氧苯基的中间产物和终产物藜芦醛会 被很多真菌和基质成分所还原；( 2 ) 真菌代谢中形成的很多酚类、芳香类化 合物在3 1 0 n m 也有光吸收，完全排除此项干扰比较难；( 3 ) 3 1 0 n m 时光散射 作用很强，因此，反应液的浊度对结果影响较大，在可见光区域测试则可减 少此干扰；( 4 ) 某些白腐菌可产生不属于过氧化物酶的v a 氧化酶 ( f l a v i n c o f a c t o r e d v a o x i d a s e s ，v a o ) ，v a o 也可氧化v a 为藜芦醛。 1 4 1 2 以天青( a z u r e ) 染料为底物测l i p 活力的方法p 6 j 1 9 9 2 年a r c h i b a l d 提出以l i p 在h 2 0 2 存在下氧化a z u r e 类染料来表示l i p 活力的方法【1 5 1 。a z l a r e 是纺织工业中常用染料，有a 、b 、c 等不同型号， 其 。略有差别。l i p 活力测定中选用的是a z u r e b ，反应条件为3 2u m o l l a z l l r e b ，1 0 0 u m o l l - 2 0 2 ，5 0 m m o l l p h 4 5 的酒石酸钠缓冲液，在6 5 l n m 处 测o d 值减小速率。1 个酶活力盟位用每分钟每毫升培养基滤液降低o 1 个 o d 值来表示。其线性反应时间可延长至2 0 分钟。 此法较v a 氧化法有下述优点：( 1 ) 由于不是在紫外区测试，可避开芳 香化合物的干扰，灵敏度提高，可以测出更低量的l i p ：( 2 ) 比u r eb 性质稳定， 在生物反应条件下不易被脱色；( 3 ) a z u r e b 不容易被v a 氧化反应的干扰酶 类如v a o 所氧化，与漆酶( l a c c a s e ) 和锰过氧化物酶( m n p ) 也不发生反应， 选择性强。 1 4 1 3 由羟基自由基的生成反映l i p 活力的方法 当l i p 、v a 及电子受体( 如e d t a 、草酸盐) 存在时可使f e ”还原为f e ” 并产生o h ，而v a 和草酸盐都是p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 等白腐菌的次 生代谢产物，因此推断l i p 可由此逢径产生o h 以用于降解木素。检测o h 产 生量的方法有多种，测定它与k m t b a ( d k e t o y m e t h y l t h i o l b u t y r i ca c i d ) 形成乙烯是一种常用方法。由于i c f 2 0 2 在l i p 催化下能发生反应生成o h ，因 此将上述方法用于检测l i p 活力，灵敏度较高。测试条件一般为在一密闭容 器内加入待测样品，1 0 也m m o lk q - b a ，2 0 m m o l p h 4 5 醋酸缓冲液，3 8 u c ，反 天津科技大学硕士学位论文 应4 h 后，出容器顶部取2 0 , 1 0 0 1 t l 气体，用气相色谱检测乙烯的生成。 在培养物中，由于o h 的生成有多种途径，不仅仅与木素降解有关，因 此它不能特异性地反映l i p 活力。 1 4 2b l n p 活力的测定1 1 s l 很多有机化合物特别是氧化还原型染料常被用作测定m n p 活力的底物， 但这些方法比较间接，产生误差的因素较多，而m n 3 + 是m n p 作用的直接产 物，在2 3 8 n m 处测m n ”的光吸收值是测定m n p 活力的一个较为灵敏简便的 方法，此法还可用于连续测定。反应条件为5 0 m m 的乳酸钠缓冲液( p h 4 5 ) 3 4 m l ，1 6 m m o l l 的m n s 0 4 溶液0 1 m l ，培养基滤出液0 4 m l ，预热至3 7 0 c 后，加入1 6 m m o l l 的h 2 0 2 溶液0 1 m l 启动反应，测反应最初3 分钟内九 = 2 4 0 n m 处吸光度的变化，1 个酶活力单位用每分钟每毫升培养基滤液增加0 1 个o d 值来表示。 1 4 3l a e 活力的测定 l a c 的催化作用与l i p 和m i l p 不同，它不需要h 2 0 2 ，因此活力测定比较 容易，对苯二胺( 。，4 9 5 ) 、愈创木酚( x 。，4 8 5 ) 、邻苯二酚( 。4 0 0 ) 和漆 酚( 九。4 2 0 ) 都曾用作漆酶活力测定的底物。 反应条件为o 5 m m o l l a b t s 的0 1 m o l l 醋酸钠缓冲液( p h 5 0 ) 2 m l ， 加入l m l 酶液后启动反应，测九= 4 2 0 n m 处吸光度变化，a b t s 氧化产物在 4 2 0 n m 处的e = 3 6 0 0 0 d m 3 m c m ，1 个酶活力单位用每分钟1um o l 的a b t s 被转化所需的酶量。 1 5 木素大分子生物降解反应途径 迄今为止，对白腐菌降解木素所造成的化学变化已经进行了很多研究【4 0 1 ， 通过模型物和同位素示踪研究，认为微生物对木素大分子的作用以氧化反应 为主。在一般化学反应条件下，有机物大分子在高温下裂化产生自由基，而 在酶的催化1 乍用下，只需要在常温和中性条件即可使木素大分子结构单元氧 化脱氢产生进一步裂解或聚合反应所需的自由基，使自由基反应得以顺利进 行。 对比生物降解前后木素分子结构的变化，可以发现经过生物处理后的木 素a 羰基含量增加，同时产生芳香羧酸结构。形成这种结构与侧链氧化以及 c 。c 。裂解直接相关。k i r k 和张厚明 13 j 进一步推测在侧链氧化时，苯环也被 氧化裂解，并提出四点证据：( 1 ) 甲氧基含量减少2 5 ，但并没有发现甲氧 基脱落的苯环；( 2 ) 仅靠侧链氧化不可能导致氧和羰基含量明显升高；( 3 ) 红外光谱分祈表明苯环含量降低；( 4 ) 存在没有苯环联接的a 、8 不饱和羰 基。e l l w a r d ze ta l 使用1 3 cn m r 对木素生物处理时发生苯环开裂的推断提出 了更为直接【j 勺证据。根据他们的研究结果【4 引，木素经过生物处理后产生如图 1 5 所示的几种化合物： 9 1 前言 c 。h 、呲 、眦 o c h 2 c h2 0 h c h = 0 h = = ：、。j 影j 、。m 。 0 、 b 、 c 一 o m e 0 c h 2 c 0 0 h c ic l c0 c h rc 0 0 h 图1 5 木素生物处理降解产物 o m e 图1 5 a 中q 一芳香羧酸为c 。c 。氧化裂解产物。 图1 5 b 中香草醇可能为n 一芳香羧酸还原产物或包括c 。c 。氧化裂解产物 在内的其他反应途径产物。 圈1 5 c 、d 中芳香乙酸或芳香乙醇结构可能来自b 芳基醚结构的c 。一ce 氧化裂解。e n o k ie ta 1 1 4 2 l 利用p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 处理带有e 芳基醚 键的模型化合物4 乙氧基3 甲氧基酚丙三醇1 3 愈创木基醚得到降解产物2 ( 邻甲氧基酚) 乙醇也证实了6 芳基醚键的断裂。另外通过芳香乙酸还原或 其他途径也可以得到芳香乙醇结构。 图l 一5 ( a d ) 结构显示，在木素降解过程中c 。c 。裂解是一个关键步骤。 其中c 和d 结构还可能与c ，c ，、c 1 c 。裂解有关，其他的研究证明，酚过氧 化物酶的催化作用导致对羟苯甲醇和对羟苯甲醛结构单元的c l c 。键氧化裂 解 4 4 】。 图1 5 e 中的烷基乙酸结构体现了b 芳基醚结构苯环的断裂。通过“c n m r 分析，在1 7 0 p p m 和1 7 5 p p m 之间以及1 6 2 p p m 和1 6 3 p p m 之间发现新的 信号，其中1 7 0 p p m 和1 7 5 p p m 间信号代表饱和的与非饱和羧酸，1 6 2 p p m 和 1 6 3 p p m 间信号表示乙烯基醚键( c c o r ) 的c 。或、1 3 不饱和丙酮 ( c = c c o r ) 的c 。，这些试验结果说明生物处理后，木素模型物苯环裂解。 除了图1 - 5 0 e ) 所列化合物，在木素生物降解产物中还检测到部分脂肪族 化合物中的甲基、亚甲基基团，这部分产物可能与还原过程或酯类化合物的 存在有关。 1 0 天津科技大学硕士学位论文 1 6l i p 的研究现状 1 6 1l i p 发酵条件的研究 胞外木素降解酶系的发现是利用p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解木素 研究的重大进展垆j 。木素过氧化物酶系一般产生于限氮或限碳培养的次级代 谢阶段，在整个合成阶段l i p 的合成量要比m n p 大得多，而且l i p 能降解木 素的模型物，因此l i p 在木素的降解中起着主导的作用，成为后来的主要研 究酶。 由于l i p 最初被发现时的合成量很低( 约2 0 u l ) ，为了提高酶的产量， 人们从培养方式、木素模型物的诱导、氧浓度的影响、细胞固定化培养、痕 量元素浓度的作用等方面进行了大量的研究【1 2 1 。研究表明利用p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m 进行限氮培养时，必须通纯氧才能合成l i p ，通氧强度大、游 离菌丝球尺寸小，有利于产酶。而限碳培养，在空气环境下就能合成l i p 。采 用细施固定化培养时，用聚氨酯泡沫固定细胞可增加菌丝的比表面积，降低 剪切力，能够促进l i p 的合成。由于采用木素模型物进行白腐菌降解特性研 究，很难反映出降解过程，为此，中科院化工冶金所陈洪章1 5 0 1 等人以汽爆处 理的麦草为原料进行了固态发酵l i p 的初步研究，结果表明固态发酵产生的 l i p 活力远远高于液态发酵。 山东大学高培基【2 7 1 等人用h p l c 分析不同培养条件下l i p 的同功酶组分， 结果表明不同培养基成分对l i p 同功酶组分的影响方式不同。改变培养条件 时，l i p 同功酶的数量及酶组分的合成量均发生显著变化，进而影响l i p 的总 合成量，这说明了l i p 合成调控的复杂性。 1 6 2l i p 同功酶的物理及酶学特性 l i p 的活力与其一系列的同功酶密切相关。l e i s o l a 等人【3 5 j 收集 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mb k m 一1 7 6 7 在不同培养时间和不同培养条件下的 发酵液，利用等电点聚焦的方法分析出了1 5 种l i p 同功酶。通过离子交换高 效液相色谱( h p l c ) 分析该菌株在最优发酵条件下的发酵浓缩液，于2 8 0 r i m 处检测出1 2 个吸收峰，在4 0 9 n m 处至少有1 0 个强吸收峰。这1 0 个血红蛋 白被定义为h 1 h 1 0 ，其中有6 个( h i ，h 2 ，h 6 ，h 7 ，h 8 和h i o ) 属于l i p ，在 h 2 0 2 存在时能够氧化藜芦醇，而h 2 和h 8 是影响l i p 活力的两个主要同功酶。 其它4 个具有m n p 活力。通过s d s - p a g e 可知这些l i p 同功酶有不同的等电 点( p 1 4 7 3 3 ) 和分子量( 3 8 4 3 k d a ) 。通过免疫印迹分析和部分蛋白质水解 消化模式表明，l i p 同功酶具有高度的同源性。 t i e n 和k i r k 3 0 等人利用藜芦醇、木素模型物等底物来检测同功酶的动力 学特性发现，底物不同，k m 值变化比较显著，对于藜芦醇同功酶的k m 值范 围为8 6 4 8 01 1m o l ，l 。这些同功酶的活力范围随底物的变化而发生变化，其原 因可能是由于底物的亲和力或与活性中心的结合力不同所致。 1 前言 1 6 3l i p 的基因工程进展 1 6 3 1l i p 的基因结构 l i p 基因编码一条由3 4 3 3 4 5 个氨基酸残基组成的成熟多肽，对信号肽断 裂位点分析表明l i p 最初是作为一种前体酶合成的，前体酶含有一个2 7 2 8 氨基酸残基的先导序列，先导序列中则含有一个2l 氨基酸的信号肽，由前体 酶先导序列a l a 一2 1 位点断裂产生，该信号肽含有一个带正电的n 端区域、一 个中央疏水区域和一个极性的c 端区域，由此决定了l i p 是典型的分泌型蛋 白。 p h a n e r o c h a e t ec h r y s