（环境工程专业论文）脱氮细菌的分离及脱氮特性研究.pdf

u p iirlijji r l l i jj i l i p i i j l l l i j l l l l liifli i y 2 2 7 0 0 2 4 邈氢缉萱煎佥蛊区盛氢鳖性盈窒 论文作者签名：塑造竖 指导教师签名 论文评阅人1 ： 评阅人2 ： 评阅人3 ： 评阅人4 ： 评阅人5 ： 答辩委员会主席： 委员1 ： 委员2 ： 委员3 ： 委员4 ： 委员5 ： 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名匆牺汔晦 签字日期：垆b 年；月。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：玮匀：戋哞 签字日期：们f j | 年了月p 日 浙江大学硕士学位论文致谢 致谢 值此论文完成之际，谨向我尊敬的导师杨岳平先生表达我最诚挚的感谢。承 蒙您的指导，本论文得以顺利完成。过去两年半的学习生涯，不但拓宽了我的专 业理论知识，也使我积累了相当的水处理工程经验；更重要的是您勤勉务实的治 学态度和谦虚谨慎的处世之风深深影响了我，您的敦敦教诲当铭记于心，则必成 为我今后人生的巨大财富。 非常感谢胡安辉师姐、唐佳玛师姐和谢柳师兄对我的帮助。同时也要感谢陪 伴我成长的其他师兄师姐、师弟师妹：李清峰、赖水秀、郑豪、包子健、唐勇、 骆金、陈然、林雅逢、陈莎莎、高冲、周俊利。我们风雨同舟，共同成长。 感谢我的家人和朋友，你们的支持是我不断进步的不竭动力。 最后，要感谢浙江大学，以及在这里度过的7 年流金岁月。任岁月更迭，已 带不走留在母校的欢歌笑语，但必会秉持对“求是创新”高雅之风的不懈追求， 继续前行，深怀对求是学府的眷恋! 杨浩锋 2 0 1 3 0 1 于浙大紫金港 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 从城镇生活污水处理装置中分离获得一株氨氧化细菌( c m n r 0 1 4 ) 和一株 反硝化细菌( c m ，n r d 3 ) ，并进一步研究菌株的系统发育地位及反应特性，通过 小试试验探索菌株脱除废水中氮素的能力。采用1 6 sr d n a 序列分析对菌株进行 初步鉴定，探讨了基质浓度、p h 和温度对菌株反应活性的影响。发酵罐连续培 养达到了分离菌株扩大培养的目的，采用两级a o 工艺进行了菌株去除废水中 氮素的小试试验。 根据形态学特征、生理生化特性及1 6 sr d n a 序列测定分析，初步鉴定 c m n r 0 1 4 菌株属于亚硝酸单胞杆菌，c m n r d 3 菌株属于反硝化寡养单胞菌。 c m n r 0 1 4 菌株的最大氨氧化速率2 4 5 4m g ( l d ) ，利用氨的k m 值4 5 6 6 m g l ，氨自身的抑制常数2 4 0 1m gl ，最大氨氧化速率的氨浓度3 3 1 2m gl 。 亚硝酸盐对氨氧化的抑制常数1 5 2 4m g l 一。氨氧化的最适p h7 7 9 。氨氧化的 最适温度3 4 。c 。菌株在初始氨氮浓度为1 8 0m g l ，最佳氨氧化p h 、温度条件下， 4 天内氨氮降解率达到9 1 6 ，菌株倍增时间2 9 4 天。c m n r d 3 菌株能利用硝 酸钠或亚硝酸钠进行反硝化作用，最佳电子受体是硝酸盐氮，反硝化速率最大为 1 9 8 6m g l - 1 - h - 1 ，最适生长p h 为7 3 6 ，最适生长温度为3 3 5 。c 。菌株在初始硝 态氮浓度为1 4 0 m g l ，以乙酸钠为唯一碳源，p h 为7 3 6 ，温度3 3 5 。c 的最优生 长条件下，培养1 0 h 进入对数生长期，倍增时间为9 9 h ，4 8 h 内硝酸盐还原率达 9 5 。 利用发酵罐对菌株进行扩大培养具有高质量和高效性，很好地解决了脱氮功 能菌在工程应用上菌液量不足的难题。采用两级a o 工艺，c m - n r 0 1 4 和 c m - n r d 3 联合处理含氮化粪池废水，氨氮去除率在9 9 以上，总氮去除率在8 0 以上，c o d 去除率大于9 0 。采用脱氮功能菌去除氨氮和总氮的容积负荷最大 分别为0 0 8 4k g ( m 3 d ) 和0 0 4 7k g ( m 3 d ) 。本研究脱氮功能菌实现了短程硝化 反硝化，对氨氮和总氮的去除率高，产生的污泥量少，相对于一般活性污泥法 可节省能源。脱氮功能菌在去除废水中氮素方面有很高的应用价值，可用于城镇 污水处理厂提标改造等。 关键词：生物脱氮；亚硝酸单胞杆菌；反硝化寡养单胞菌；短程硝化反硝化 i i 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t a a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i an a m e dc m - n r o 14a n dad e n i t r i f y i n gb a c t e r i a n a m e dc m - n r d 3w e r ei s o l a t e df r o mu r b a nd o m e s t i cw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n t s 16 sr d n as e q u e n c e sw e r ea n a l y z e dt o i d e n t i f yt h es t r a i n s e f f e c t so fs u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ，p ha n dt e m p e r a t u r eo nt h er e a c t i o na c t i v i t yo ft h es t r a i n sw e r es t u d i e d i nt h eb a t c hc u l t u r e p r o c e s so ft w o - s t a g ea ow a sc o n d u c t e dt os t u d yt h ev a l u eo f s t r a i n si nr e m o v i n gn i t r o g e n as u f f i c i e n ta m o u n to fb a c t e r i aw e r eo b t a i n e db y c o n t i n u o u sc u l t u r ei nf e r m e n t a t i o nt a n k s s t r a i nc m n r 014a n ds t r a i nc m n r d 3w e r ei d e n t i f i e da sn i t r o s o m o n a s e u t r o p h aa n ds t e n o t r o p h o m o n a ss p r e s p e c t i v e l yt h r o u g hm o r p h o l o g i c a lf e a t u r e ， b i o c h e m i c a l b i o p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr d n as e q u e n c e a n a l y s i s t h e m a x i m a la m m o n i ao x i d a t i o nr a t eo fc m n r 0 1 4w a s2 4 5 4m g ( l d ) 。1u n d e rt h e o p t i m a la m m o n i ac o n c e n t r a t i o n3 31 2m g l - 1 i oa n dk if o ra m m o n i aw e r e4 5 6 6 m g l a n d2 4 0 1m g l - 1 , r e s p e c t i v e l y k if o rn i t r i t ew a s15 2 4m g - l - 1 t h eo p t i m a lp h f o ra m m o n i ao x i d a t i o nw a s7 7 9 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 4 w h e nc u l t u r e d i nt h e c o n d i t i o n so fa m m o n i an i t r o g e n18 0m l ，p h7 7 9a n d3 4 ，s t r a i n c m - n r 0 1 4r e m o v e d9 1 6 o fa m m o n i ai n4d a y s d o u b l i n gt i m eo ft h es t r a i nw a s 2 9 4 d s t r a i nc m - n r d 3w a sa b l et ou s ee i t h e rs o d i u mn i t r a t eo rs o d i u mn i t r i t ea s e l e c t r o na c c e p t o rt oo x i d i z eo r g a n i cm a t t e r t h em a x i m u md e n i t r i f i c a t i o nr a t eb y u s i n gn i t r a t ea se l e c t r o na c c e p t o rw a s19 8 6m g l - 1 h 1 ，w h i c hi sm u c hh i g h e rt h a nt h a t o fn i t r i t e ( 4 0 5m g l 1 h 1 ) t h e r e f o r e ，t h eo p t i m a le l e c t r o na c c e p t o rw a sn i t r a t e g r o w t hd y n a m i c st e s tr e v e a l e dt h a tt h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ef o rc m - n r d 3 w e r e7 3 6a n d3 3 5 c ，r e s p e c t i v e l y u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf n 0 3 。- n1 4 0 m g l ， a c e t a t es e r v e da ss o l eo r g a n i cc a r b o ns o u r c e ，p h7 3 6a n d3 3 5o c ) ，s t r a i nc m - n r d 3 i nt h ee x p o n e n t i a lp h a s ew a so b t a i n e da f t e r10h ，a n dt h ed o u b l i n gt i m ew a s9 9h t h en i t r a t er e m o v a le f f i c i e n c yw a su pt o9 5 i n4 8h o u r s a m o u n to fb a c t e r i aw e r eo b t a i n e db yc o n t i n u o u sc u l t u r et h a tw a so f h i g hq u a l i t y a n de f f i c i e n c y , w h i c hc a ns u p p l ys u f f i c i e n tb a c t e r i af o rp r o j e c ta p p l i c a t i o n b yt h e p r o c e s so ft w o - s t a g ea o ，t h es t r a i n ss u c c e s s f u l l ya c h i e v e ds h o r t c u tn i t r i f i c a t i o na n d i i i d e n i t r i f i c a t i o ni nw h i c hm o r et h a n9 9 o fn h 4 + - n ，8 0 o ft na n d9 0 o fc o d w e r er e i i l o v e dt o t a l l y v o l u m el o a df o rn h 4 + - na n dt nw e r e0 0 8 4 蚓( m 3 d ) a n d 0 0 4 7k g ( m 3 d ) ，r e s p e c t i v e l y t h ep r o c e s sp r o d u c e dl e s ss l u d g ei nw h i c hm u c h e n e r g yw a ss a v e dc o m p a r e dt ot h eg e n e r a la c t i v a t e ds l u d g ep r o c e s s t h es t r a i n sh a v e h i 曲v a l u ei nr e m o v a lo fn i t r o g e n i nw a s t e w a t e r , a n di tc a l lb eu s e dt or e f o r m m u n i c i p a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n t b i o l o g i c a ln i t r o g e nr e m o v a l ；n i t r o s o m o n a se u t r o p h a ；s t e n o t r o p h o m o n a s s p ；s h o r t c u tn i t r i f i c a t i o na n d d e n i t r i f i c a t i o n i v 浙江大学硕士学位论文 目录 目录 致谢i 摘要。i i a b s t r a c t i i i 目 录v 1 弓i 言1 1 1 生物脱氮工艺研究进展1 1 1 1 传统生物脱氮工艺1 1 1 2 新型生物脱氮工艺2 1 2 氨氧化细菌研究进展4 1 2 1 氨氧化细菌和氨氧化过程4 1 2 2 氨氧化细菌的分离5 1 2 3 氨氧化细菌生长的环境因素6 1 3 反硝化细菌研究进展7 1 3 1 反硝化细菌的分离7 1 3 2 反硝化影响因素8 1 4 本课题的研究意义与内容9 2 氨氧化细菌的分离鉴定及氨氧化特性研究11 2 1 材料与方法11 2 1 1 菌源和培养基1l 2 1 2 富集培养方法11 2 1 3 分离培养方法1 1 2 1 4 菌株鉴定11 2 1 5 氨氧化菌株的生长特性1 2 2 1 6 主要检测指标的分析方法1 3 2 2 1 富集及分离培养结果1 3 2 2 结果与讨论1 3 2 2 2 菌株的鉴定1 4 2 2 3 氨氧化反应动力学16 2 2 4 最适p h 1 9 2 2 5 最适温度一2 0 2 2 6 最优条件下菌株的生长曲线及氨氧化能力2 1 2 3 本章小结2 3 3 反硝化细菌的分离鉴定及反硝化特性研究2 4 3 1 材料与方法2 4 3 1 1 菌源和培养基2 4 3 1 2 分离培养方法2 4 3 1 3 菌株鉴定2 4 3 1 4 反硝化菌株的生长特性2 5 3 1 5 主要检测指标的分析方法2 5 3 2 结果与讨论2 5 3 2 1 反硝化菌的分离和筛选2 5 3 2 2 菌株的鉴定2 6 v 浙江大学硕士学位论文 目录 3 2 3 反硝化反应动力学2 8 3 2 4 最适p h 3 0 3 2 5 最适温度3 1 3 2 6 最优条件下菌株的生长曲线及反硝化效果3 2 3 3 本章小结3 2 4 脱氮功能菌处理化粪池废水小试研究3 4 4 1 材料与方法3 4 4 1 1 试验材料。3 4 4 1 2c m - n r o1 4 连续培养方法3 4 4 i 3c m - n r d 3 连续培养方法3 4 4 1 4 小试试验3 5 4 1 5 分析测试方法3 5 4 2 结果与讨论3 6 4 2 1 连续培养结果3 6 4 2 2 小试试验结果3 8 4 3 本章小结4 3 5 结论与展望4 4 5 1 主要结论4 4 5 2 创新点4 5 5 3 不足与展望4 5 参考文献4 7 个人简历51 v i 浙江大学硕士学位论文 脱氮细菌的分离及脱氮特性研究 1 引言 1 1 生物脱氮工艺研究进展 1 1 1 传统生物脱氮工艺 生物脱氮是去除废水中氮素污染的有效方法，其过程是通过硝化作用和反硝 化作用两个步骤共同完成的。 硝化作用分两步完成：在好氧条件下，首先由氨氧化细菌( 又称亚硝酸细菌， a m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i u m ，a o b ) 将n h 4 + - n 氧化成n o z - - n ( 式1 1 ) ，再由 亚硝酸氧化细菌( 又称硝酸细菌，n i t r i t e o x i d i z i n gb a c t e r i u m ，n o b ) 将n 0 2 。n 氧化成n 0 3 - n ( 式1 2 ) 。硝化反应的总反应式可表示为式1 3 。 n h + + 1 5 0 ，jn 0 2 + 2 h + + h 2 0 a g “= - 2 6 0 2 k j m o l ( 1 1 ) n 0 2 一+ 0 5 0 2 一n 0 3 一 n h 4 + + 2 0 2 一n 0 3 一+ o + 2 h + a g 口：一7 5 8 k j m o l a g 口：一3 3 6 o k j m o l ( 1 - 2 ) ( 1 - 3 ) 反硝化作用是指在厌氧条件下，反硝化细菌将硝酸盐氮或亚硝酸盐氮还原成 氮气的过程，其反应可分别表示为式1 4 和式1 5 。 n 0 3 一+ 5 日+ + 5 ej0 5 2 + 2 乙d + o h a g 9 = 一2 7 0 o k j m o l( 1 4 ) n 0 2 一+ 3 日+ + 3 e 一0 5 n 2 + 卫0 + 0 1 1 一 a g 口= - 2 1 2 o k j m o l( 1 5 ) 传统的生物脱氮工艺主要包括氧化沟( o x i d a t i o nd i t c h ) 工艺、a 2 o ( a n a e r o b i c a n o x i co x i c ) 工艺和s b r ( s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o r ) z 等。 ( 1 ) 氧化沟( o x i d a t i o nd i t c h ) 工艺 氧化沟是活性污泥法的一种改良，外形呈封闭环状沟，采用表面机械曝气， 含氮废水在沟内不断地循环流动，形成厌氧、缺氧和好氧段。其特点是操作简便， 处理效果稳定。1 9 5 4 年荷兰建成了世界上第一座氧化沟污水处理厂，用序批式 方式处理废水。之后氧化沟改进为连续进水方式，目前在我国的城市污水处理厂 中广泛应用【1 1 。 ( 2 ) a 2 o ( a n a e r o b i c a n o x i co x i c ) 工艺 a 2 o 工艺包括厌氧段、缺氧段和好氧段三段2 1 ，污水中的部分易降解有机物 浙江大学硕士学位论文脱氮细菌的分离及脱氮特性研究 在厌氧段中被转化为v f a s ( 挥发性脂肪酸) 。污水进入缺氧区后，反硝化细菌利 用有机物作为碳源，通过反硝化作用脱氮。在好氧区，有机物浓度相当低，有利 于硝化细菌繁殖，发挥硝化作用。该工艺的特点是水力停留时间短，运行费用低 且可以有效防止污泥膨胀。缺点是脱氮效率不高。 ( 3 ) s b r ( s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o r ) s - 艺 s b r 即序批式活性污泥法，是一种按间歇曝气方式来运行的活性污泥污水处 理技术。s b r 工艺按照一定时间顺序进行间歇操作，全部过程包括五个阶段： 进水期、反应期、沉淀期、排水排泥期、闲置期。为了达到理想的反硝化效果， 进水后先进行一定时间的缺氧搅拌，好氧茵将利用进水中的有机物进行好氧分 解，此时水中的溶解氧将迅速降低，反硝化菌进行脱氮。然后停止搅拌一段时间， 使污泥处于厌氧状态，接着再进行曝气，使硝化菌进行硝化作用 3 1 。该工艺的显 著特点是处理效率高，耐冲击负荷，操作和维护方便。 1 1 2 新型生物脱氮工艺 传统生物脱氮工艺普遍存在处理效率低、基建费用高、运行过程复杂等缺点。 近二十年来，废水生物脱氮技术取得了快速发展，一些新型生物脱氮工艺相继出 现【4 1 ，如短程硝化反硝化( s h a r o n ) 工艺、厌氧氨氧化( a n a m m o x ) 工艺、全 自养型氮去除( c a n o n ) 工艺、短程硝化一厌氧氨氧化( s h a r o n a n a m m o x ) 工艺、 氧限制自养型硝化反硝化( o l a n d ) 工艺等。 ( 1 ) s h a r o n 工艺 s h a r o n ( s i n g l er e a c t o rh i g ha c t i v i t ya m m o n i ar e m o v a lo v e rn i t r i t e ) 工艺 又叫短程硝化反硝化工艺，1 9 9 7 年由荷兰d e l f t 工业大学提出并成功开发。其 原理是：通过控制反应器内温度( 3 0 3 5 。c ) 和p h ( 7 4 8 3 ) 5 1 使亚硝酸细菌的 生长速率明显大于硝酸细菌，并且不进行污泥回流，使污泥停留时间( s r t ) 等 于水力停留时间( h r t ) 。利用硝酸细菌比亚硝酸细菌世代时间长的特点，通过 控制适当的h r t ，实现短程硝化【6 1 ，然后进行反硝化脱氮。s h a r o n 工艺的反 应见式1 - 6 和式1 7 。 n h 4 + + 1 5 d 2 寸n 0 2 一+ h 2 d + 2 h + ( 1 - 6 ) 6 n 0 2 一+ 3 c h 3 0 h + 3 c 0 2 争3 人乞+ 6 h c 0 3 一+ 3 厶乙o ( 1 7 ) 浙江大学硕士学位论文脱氮细菌的分离及脱氮特性研究 s h a r o n 工艺在一个简单的连续流反应器中进行，在处理高浓度氨氮废水 ( o 5g n l 。) 方面有显著效果。该工艺首先应用于荷兰d o k h a v e n 污水处理 厂，用于处理厌氧消化污泥分离液，处理水量1 8 0 0m 3 。后来推广应用于荷兰 u t r e c h t 污水处理厂。该工艺的特点包括7 1 ：1 ) 由于亚硝酸细菌对氧的亲和力比 硝酸细菌强，通过减少曝气可以节省能耗约2 5 ( 以氧计) ；2 ) 亚硝酸型反硝化 可以节省碳源约4 0 ( 以甲醇计) ；3 ) h r t 缩短，大幅度降低产生的污泥量；4 ) 硝化反应产生的酸度可部分由反硝化产生的碱度中和，减少了化学试剂用量。 短程硝化反硝化的实现- 9 温度、p h 、d o 、污泥停留时间等因素有关，目前 工程上多是在间歇运行的条件下来实现短程硝化反硝化，在连续流条件下很难实 现【8 1 。对于如何在更普遍的条件下将短程硝化反硝化应用于城市废水的治理，仍 是学者普遍关注的课题。 ( 2 ) a n a m m o x 工艺 a n a m m o x ( a n a e r o b i ca m m o n i u mo x i d a t i o n ) 工艺也叫厌氧氨氧化工艺， 于1 9 9 0 年荷兰d e l f t 工业大学k l u y e r 生物技术实验室开发。其原理是在厌氧条 件下，厌氧氨氧化细菌直接以n h 4 + 为电子供体，以n 0 3 - 或n 0 2 - 为电子受体，生 成n 2 【9 1 。b r o d a 【1 0 1 在1 9 7 7 年描述了一种化能自养型细菌，能以n 0 2 - 为电子受体， 将氨直接氧化为n 2 。j e t t e n 1 1 1 对a n a m m o x 的进一步研究表明：在缺氧或厌氧 条件下，氨氧化可以利用n h 4 + 或n h 2 0 h 作为电子供体，将n 0 3 - 或n 0 2 还原。 以n 0 3 - 和n 0 2 - 为电子受体的厌氧氨氧化反应可分别表示为式1 - 8 和式1 - 9 。 3 n 0 3 一+ 5 n h 4 + j 4 n 2 + 9 日2 d + 2 h + ( 1 8 ) n 0 2 一+ n h 4 + j 2 + 嘎0 ( 1 - 9 ) a n a m m o x 工艺已成功应用于荷兰d o k h a v e n 污水处理厂( 9 8m 3 ) ，2 0 0 2 年投入使用。该工艺的特点是：1 ) 不需要投加外源碳源，明显区别于传统硝化 反硝化过程，大大缩短了氮素循环过程，并可节约能源6 0 t 以上；2 ) 无需供氧， 无需投加酸碱试剂，故降低了能耗，节省了运行费用；3 ) 产生的污泥少；4 ) 对 低c n 比，高浓度n h 4 + - n 废水具有广阔的应用前景。a n a m m o x 工艺的难度 在于：厌氧氨氧化细菌的世代时间长( 1 0 d 左右) ，反应器启动时间长；废水中 的氨要部分氧化成亚硝酸盐，但又不能过度氧化，必须保持n 0 2 和n h 4 + 的适当 比例。 气 浙江大学硕士学位论文 脱氮细菌的分离及脱氮特性研究 ( 3 ) c a n o n 工艺 c a n o n ( c o m p l e t e l ya u t o t r o p h i cn i t r o g e n - r e m o v a lo v e rn i t r i t e ) 工即全自养 型氮去除工艺，是t h i r d l 2 等于1 9 9 9 年提出的。其基本原理是在同一个反应器中， 通过控制溶解氧等条件同时进行硝化反应和厌氧氨氧化反应。首先氨氧化细菌 ( a o b ) 将氨氧化为亚硝酸氮，然后由a n a m m o x 菌以n h 4 + - n 为电子供体，还 原n 0 2 - - n 生成n 2 。c a n o n 工艺的整体反应方程可表示为式1 1 0 ”】。 n h 3 + 0 8 5 0 2j o 11 n 0 3 一+ 0 4 4 n 2 + 0 1 4 h + + 1 4 3 h 2 0 ( 1 - 1 0 ) c a n o n 工艺以微生物载体区分可分为活性污泥法和生物膜法。利用a o b 和n o b 对氧的亲和力不同，通过控制d o 即可在生物膜或者污泥絮体表层实现 亚硝酸盐的积累。当氧向生物膜或者污泥絮体内层扩散并被消耗后，出现厌氧层， a n a m m o x 菌便可生长。日本f u r u k a w a 等 1 4 在控制p h 7 5 7 7 ，温度3 5 。c ，d 0 2 3 m g l 。1 条件下，以无纺布为填料，成功启动了c a n o n 反应器。反应器负荷达 到0 4 8k g n ( m 3 d ) ，其中a n a m m o x 菌和a o b 分别占细菌总数的1 5 - 98 7 。 c a n o n 的显著特点是：1 ) a o b 和a n a m m o x 菌都是自养型细菌，产生的 污泥量大大减少；2 ) 与传统的脱氮工艺相比，节省了曝气能耗；3 ) 无需外加碳 源，运行成本降低；4 ) 适用于处理高氨氮低c o d 废水，反应器容积负荷大。 1 2 氨氧化细菌研究进展 1 2 1 氨氧化细菌和氨氧化过程 1 2 1 1 氨氧化细菌 氨氧化细菌有自养型与异养型之分，一般认为自养型氨氧化细菌是硝化作用 的主要菌群。自养型氨氧化细菌是革兰氏阴性细菌，以氨为能源，c 0 2 为碳源； 混合营养生长时，可以丙酮酸、果糖等有机物为碳源。自养型氨氧化细菌倍增时 间为8 小时至数天，生长极为缓慢；喜欢在微碱性环境( 7 5 8 0 ) 下生长，温度 2 5 3 0 。 根据细胞形态特征，在伯杰氏系统细菌学手册第一版中，氨氧化细菌被 划分为n i t r o s o m o n a s 、n i t r o s o c o c c u s 、n i t r o s o v i b r i o 、n i t r o s o s p i r a 和n i t r o s o l o b u s 五个属。根据氨氧化细菌的系统发育，在伯杰氏系统细菌学手册第二版中， 它们被合并为3 个属：亚硝化螺菌群( n i t r o s o s p i r a ) 、亚硝化单胞菌群 4 浙江大学硕士学位论文 脱氮细菌的分离及脱氮特性研究 ( n i t r o s o m o n a s ) 和亚硝化球菌属( n i 仃o s o c o c c u s ) 1 5 1 。其中前两个属归类于变 形菌纲( p r o t e o b a c t e r i a ) p 亚纲，一般存在于淡水、土壤或砂石中；亚硝化球菌 属归类于变形菌纲y 亚纲，一般存在于海洋环境中。这三个属各自包含不同的种， n i t r o s o m o n a s 包含n i t r o s o m o n a se u r o p a e a 和n i t r o s o m o n a sm o b i l i s 等1 1 个种； n i t r o s o s p i r a 包含原命名为n i t r o s o v i b r i o 、n i t r o s o l o b u s 和n i t r o s o s p i r a 三个种； n i 仃o s o c o c c u s 包含n i 仃o s o c o c c u so c e a n u s 和n i t r o s o c o c c u sh a l o p h i l u s 两个种。 1 2 1 2 氨氧化过程 氨氧化细菌是化能自养型细菌，将氨氧化成亚硝酸盐主要分两步完成：1 ) 在氨单加氧酶( a m o ) 的作用下将氨转化为羟胺；2 ) 在羟胺氧还酶( h a o ) 的 作用下将羟胺转化为亚硝酸盐。反应式可表示为式1 1 1 和式1 1 2 1 6 】。 n h 3 + d 2 + 2 日】型坐l 专n h 2 0 h + i - 2 0 a g 8 = 一1 2 0 k j m o l ( 1 - 1 1 ) n h 2 0 h + 0 5 d 2 坐乌嗍+ 2 h + + 2 e a g 8 = - 1 1 4 k j m o l( 1 - 1 2 ) a m o 能催化多种基质，除氨以外，还有一些碳氢化合物和醇类物质。金属 螯合剂、乙炔等物质会抑制a m o 的活性m 】。对于化能自养型氨氧化细菌，氨氧 化成亚硝酸盐的中间产物羟胺才是真正的能源物质。有实验证明，同时以羟胺和 氨为能源物质时，羟胺的摩尔细胞产率是氨的两倍【1 8 】。但羟胺不能单独作为能 源物质，氨氧化细菌e u t r o p h a 能够以羟胺为惟一能源物质生长，但前提是添 加乙炔抑制a m o 活性。若不添加乙炔，e u t r o p h a 在三天内解体，可能是因为 在没有氨的条件下，还原态a m o 催化氧气产生氧自由基，而氧自由基对细胞结 构具有毁损作用5 1 。 h a o 不仅能够催化羟胺氧化为亚硝酸盐，还能将羟胺氧化成n o 和n 2 0 1 9 。 h 2 0 2 处理会导致h a o 丧失羟胺氧化活性。 1 2 2 氨氧化细菌的分离 早在1 9 世纪末，w i n o g r a d s k y 2 0 1 在他的研究中就已经证实自然界中存在不同 种类的氨氧化细菌。化能自养型的氨氧化细菌，生长极为缓慢，在液体培养基中 主要附着在固体颗粒或容器壁上。这些因素加大了氨氧化细菌分离工作的难度， 使接下来的很长一段时期内这方面的进展缓慢。随着科学技术的发展，从1 9 6 0 年开始，各种氨氧化细菌被相继分离，并在实验室获得培养。 浙江大学硕士学位论文脱氮细菌的分离及脱氮特性研究 o h 一2 1 1 等人从城市污水处理厂好氧生物膜上分离得到一株氨氧化细菌并将 其归入n i t r o s o m o n a s 属。该菌株d n a 中的g + c 含量为4 8 5 ，与n e u t r o p h a 的d n a 相似性仅为3 0 。将该菌株用聚丙烯酰胺固定化后，投加到实验室模拟 废水处理装置中，发现出水氨氮可降到2m g l - 1 以下，总氮去除率超过7 0 。 m i z o g u c h i 2 2 】等人从海水样品中成功分离出一株氨氧化细菌，与n e u t r o p h a 的1 6 s r d n a 相似性高达9 4 2 6 。菌株严格好氧，属于革兰氏阴性菌，最佳生长温度为 2 7 2 9 。c ，硫酸铵浓度2 6 m m 。k o o p s 2 3 】等从湖泊中分离筛选出5 株嗜碱氨氧化 细菌，最适生长p h 为8 5 9 5 ，最高耐受p h 达1 1 3 。通过1 6 sr d n a 和a m o a 基因序列分析，将它们归入n i t r o s o m o n a sh a l o p h i l a 。t o k u y a m a 2 4 1 等从土壤样品 中分离得到一株嗜冷氨氧化细菌，最适合生长温度为2 0 。c ，并且在5 c 低温条件 下仍可生长。通过鉴定，将其归入n i t r o s o v i b r i o 。 在进行氨氧化细菌的分离培养之前，样品中必须含有充足的a o b ，通过富 集培养可以达到这一要求，并使a o b 成为优势细菌。分离培养时对a o b 生长 影响较大的是氨浓度和盐度，另外p h 对a o b 生长的影响显著。a o b 在生长过 程中将氨氧化为亚硝酸，会使培养体系的p h 下降，为了减少p h 变化给a o b 生 长带来的不利影响，在培养基中加入缓冲物质可以起到很好的效果。这类缓冲物 质包括：n a 2 h p 0 413 5g l t 2 1 1 ；n a h c 0 3 n a z c 0 3 ( o 5mn a + ) 缓冲液2 3 1 ；c a c 0 35 l ；h e p e s4 7 7g l 。 1 2 3 氨氧化细菌生长的环境因素 温度影响细菌细胞内的生化反应速率，温度从低温逐渐升高后，反应速率加 快，细菌生长加快。当温度超过细菌生长的上限后，由于蛋白质和核酸发生变性， 细菌难以生长。大多数氨氧化细菌的生长温度为5 3 5 。c ，最适生长温度为2 5 3 0 ，属于中温细菌。少数从海洋中分离的氨氧化细菌可耐受5 以下的低温，而 少数从热泉中分离的氨氧化细菌可耐受6 0 。c 以上的高温。 p h 对细菌细胞内酶活性有很大影响，一般氨氧化细菌的生长p h 范围为 5 8 8 5 ，最适生长p h 范围7 5 8 0 。氨氧化细菌适合在较高p h 环境中生长，是 因为氨氧化细菌能够真正利用的基质是n h 3 ，提高p h 有利于增大n h 3 的比例。 另一方面，氨氧化过程产酸，提高p h 可以缓冲酸性。 氨氧化细菌是好氧性细菌，它的生长离不开氧的有效供给。氨氧化细菌对氧 6 浙江大学硕士学位论文脱氮细菌的分离及脱氮特性研究 的亲和力和好氧速率均高于硝酸细菌，在短程硝化反硝化工艺中，可通过控制 d o 来达到亚硝酸的积累。 在高浓度下，氨可从基质转变为抑制剂，抑制氨氧化细菌的生长。a n t h o n i s e n 等人发现，n h 3 对n i t r o s o m o n a s 菌株的抑制浓度为o 7 1 1 0 7 1m m o l l ，对 n i t r o b a c t e r 菌株的抑制浓度为7 1 4 7 0 4 3 “m o l l t 2 5 1 。亚硝酸是氨氧化细菌的代谢 产物，同时也是氨氧化细菌生长的抑制剂。当h n 0 2 浓度为1 5 7 1 1 8 5 7 1p m o l l 时，n i t r o s o m o n a s 和n i t r o b a c t e r 菌株的氨氧化活性均受到抑制【5 1 。 1 3 反硝化细菌研究进展 1 3 1 反硝化细菌的分离 反硝化细菌( d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ) 是指能将硝酸盐或亚硝酸盐还原成氮气的 细菌。硝酸盐是反硝化细菌厌氧呼吸过程的电子受体，氮气是代谢产物，而当环 境中存在氧气时，氧是优先电子受体。要完成反硝化过程，反硝化细菌要不断地 从外界获得电子供体，一般是有机物，反硝化细菌能够利用的有机物种