（遗传学专业论文）黑腹果蝇neurexin精确定位研究.pdf

中文摘要 黑腹果蝇n e u r e x i n 精确定位研究 研究生：罗凤宝 导师：谢维教授 中文摘要 神经递质受体，粘附分子及其它支架分子和信号分子在突触的正确组装对整个脑的完整 性和连接性及正确的神经递质释放起着至关重要的作用。近年来研究发现n e u r e x i n 及 n e u r o l i g i n 这对分子在突触形成及突触行使功能中起着重要作用。 n e u r e x i n 当初是因为它能够与黑蜘蛛毒素a 1 a t r o t o x i n 相互作用而被发现的。哺乳动物里 共有三个n e u r e x i n 基因，分别是n e u r e x i ni ，n e u r e x i ni i 及n e u r c x i ni i i ，这三个基因各有两个不 同的启动子。我们通过生物信息学分析及实验证明果蝇基冈组中只有一个n e u r e x i n 基因 ( n e u r e x i n 1 ) ，且只有一种转录形式( c g 7 0 5 0 ) ，在预测的结构上与高等动物里的c t - n e u r e x i n 有 着很人的同源性。本实验室先前的研究表明n e u r e x i n 1 表达在果蝇胚胎的神经系统，而且在 胚胎早期就开始表达。免疫荧光染色证明它在胚胎、幼虫及成虫里都集中予脑及腹神经管的 突触密集区分布，并和一些突触标记分子共定位。但是n e u r e x i n 的突触精细定位目前还朱知 晓。 免疫电镜技术是可以在超微结构水平对目的分子进行精确定位的一种方法，其中包埋 前免疫电镜技术具有操作相对简单，背景少等优点而被。泛麻川于一些人们感兴趣分子的定 位研究。冈此本文以果蝇为模式生物，利用包螂前免疫电镜技术对n e u r e x i n 进行精确定位。 通过在果蝇神经系统( n m j 和v n c ) 建立包埋前免疫电镜技术，发现在果蝇三龄幼虫 内源性的n e u r e x i n 主要定位在突触位点，突触前后都有分布，但在突触后的分布较多。而利 用n r x - g a i a 希i u a s i l r x 信号放人系统过表达n e u r e x i n ，突触前和突触后均可观测到胶体金颗 粒。冈此我们认为n e u r e x i n 主要是在神经系统表达，在突触前后都有表达，且在突触后表达 量较多。 关键词：突触，n e u r e x i n ，包埋前免疫电镜，定位 英文摘要 u l t r a s t r u c t u r a ll o c a l i z a t i o no f s y n a p t i c m o l e c u l en e u r e x i ni nd r o s o p hi l a m e l a n o g a s t e r g r a d u a t es t u d e n t ：l u of e n g b a o s u p e r v i s o r ：x i ew e i k e yl a b o r a t o r yo f d e v e l o p m e n t a lg e n e sa n dh u m a nd i s e a s e s , m i n i s t r yo f e d u c a t i o n , s o u t h e a s tu n i v e r s i t ym e d i c a ls c h o o l a b s t r a c t n ea c c u r a t ea s s e m b l yo f n e u r o t r a n s m i t t e rr e c e p t o r s ，e e l la d h e s i o nm o l e c u l e s ，s c a f f o l d i n g p r o t e i n sa n ds i g n a lm o l e c u l e si si m p o r t a n tf o rt h ei n t e g r i t ya n dc o n n e c t i v i t yo f t h ew h o l eb r i a n a n dn e u r o t r a n s m i r t e rr e l e a s e r e c e n te v i d e n c eh i g h l i g h t st h ei m p o r t a n c eo fat r a n s - s y n a p t i c i n t e r a c t i o nb e t w e e np o s t s y n a p t i cn e u r o l i g i n sa n dp r e s y n a p t i cn e u r e x i n si ns y n a p t o g e n e s i sa n d s y n a p t i cf u n c t i o n n e u r e x i n sw e r ed i s c o v e r e da sar e s u l to f t h d ra b i l i t yt ob i n da - l a t r o t o x i n ，ac o m p o n e n to f b l a c kw i d o ws p i d e rv e n o m ，w h i c ht r i g g e r sm a s s i v en e u r o t r a n s m i t t e rr e l e a s e t h e r ea r et h r e eg e n e s t h a te n c o d ea - n e u r e x i n sa n dt h r e eg e n e st h a te n c o d e1 3 - n e u r e x i n s ，a l lo fw h i c ha r ee x p r e s s e d p r e d o m i n a n t l yi nn e u r o n s d r o s o p h i l ag e n o m ee i l c o d e s as o l ef u n c t i o n a ln e u r e x i n ( c g 7 0 5 0 ；n e u r e x i n - i ，n r x - 1 ) ， w h i c hi sah o m o l o go fv e r t e b r a t ea - n e u r e x i n se x p r e s s e di nc e n t r a ln e r v o o ss y s t e m ，h i g h l y e n r i c h e di ns y n a p t i cr e g i o n so ft h ev e n t r a lg a n g l i o na n db r a i n n e n r e x i n 1t r a n s c r i p ti ne m b r y o s a n dt h ef i r s ti n s t a rl a r v an e r v es y s t e mw a sr e v e a l e db yr n ai ns i t uh y b r i d i s a t i o n n es y n a p t i c l o c a l i z a t i o no fn e u r e x i ni nv i v or e m a i n su n k n o w l l i r n m u n o e mi sat e c h n i q u em a tc a ne x a m i n et h es u b c e l h l a rl o c a l i z a t i o no fap r o t e i nw h i c h i sv e r yl o wl e v e lb u ti n t e r e s t i n g p r e - e m b e di m m u n o e mi se a s yt oh a n d l ea n dt h eb a c k g r o u n di s c l e a n h e r ew ee s t a b l i s h e dp r e - e m b e di m m u n o - e mt e c h n i q u ei n t h i s l a b o r a t o r ya n d u s e d d r o s o p h i l a 懿m o d e lt oa n a l y s et h ed i s t r i b u t i o no f n e u r e x i n t h er e s u l ts h o w e dn a n o g o l d so ft h e e n d o g e n o u sn e u r e x i ni nd r o s o p h i l ab y p r e - e m b e di m m u n o - e ma n dn a n o g o l d sa r el o c a t e da tt h e s y n a p t i cm e m b r a n er e g i o ni nn a n d v n ci nd r o s o p h i l a n e u r e x i ni sl o c a t e da tt h es y n a p t i c m e m b r a n er e g i o ni nn m jw h e na m p l i f y i n gi t se x p r e s s i o nu s i n gn r x - g a i aa n du a s - n r x l s y s t e m n er e s u l t si n d i c a t et h a tn e n r e x i ni sl o c a t e dt ob o t hp r ea n dp o s t s y n a p t i cr e g i o n k e yw o r d s ：s y n a p s e ，n e u r e x i n ，p r e - e m b e di m m u n o - e m ，l o c a l i z a t i o n 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人住导帅指导卜进行的研究_ l 作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研謇生签名：跏幺日期：砷矗2 - 东南大学学位论文使用授权声明 东南人学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：孥狐 导师签名： 口 绪言 绪言 突触是一种高度特异化的、非对称性的粘附性连接。通过许许多多的突触将单独的神经 元连接在一起，组成功能性神经网络，从而进行信息的整理、储存及提取。位于突触间隙附 近的突触粘附分子除了在突触形成过程中起到识别靶点的作用，还有可能起到启动和维持突 触改变的作用。近年来研究发现n e u r o l i g i n 及n e u r e x i n 这对分子在突触形成及突触行使功能 中起着重要作用。 n e u r o l i g i n s 是作为a - n e u r e x i n 的配体而被发现的，它们能介导细胞与细胞之间的粘附。 哺乳动物里共有三个n e u r e x i n 基因，分别是n e u r e x i ni ，n e u r e x i ni i 及n e u r e x i ni i i ，这三个基因 各有两个不同的启动子，分别可以转录出长的a n a 嬲i n ( ( x - n e u r e x i nl ，a - n e u r e x i n1 1 及 a - n e u r e x i ni i i ) 及短的b n e u r e x i n ( p - n e u r e x i ni ，i 昏- n e u r e x i ni i 及p - n e u r e x i ni i i ) 。大量生物信 息学分析及实验证明果蝇体内只有一个n c u r e x i n 基冈( n e u r e x i n 1 ) ，且只有一种转录形式， 基因编号为c g 7 0 5 0 ，全长为5 5 1 4 b p ，共编码1 8 3 7 个氨基酸，在预测的结构上与高等动物里的 a - n e u r e x i n 有着很人的同源性。 n e u r e x i n 家族蛋a n e u r e x i n s 可与黑寡妇蜘蛛毒素0 【1 a t r o t o x i n ，n e u r o l i g i n s n e u r e x o p h i l i n s 和突触结合蛋f ：l ( s y n a p t o t a g m i n s ) 等相互作用，在神经递质释放、突触囊泡入坞及靶向作用、 功能性突触形成等过程中发挥重要作用。 原位杂交表明n e u r e x i n 1 表达在果蝇胚胎的神经系统，而且在胚胎早期就开始表达。免 疫荧光染色证明它在胚胎、幼虫及成虫里都集中于脑及腹神经管的突触密集区表达，并和一 些突触标记分子共定位。但是n e u r e x i n 在整体动物水平的突触精细定位及具体分布目前还朱 知晓。 东南 学砸十学位论i 第一章文献综述 突触粘附分子n e u r e x i n 功能及定位的研究进展 突触与突触分子 神经元与神经元之间或神经元与非神经细胞( 肌细胞、腺细胞等) 之间的一种特化的 细胞连接，称为突触( s ”a p * ) 。神经元细胞问通过突触前后信息的传递来完成中枢神经 系统中复杂的功能例如学习和记忆等。它是神经元2 问的联系和进行生理活动的关键性结 构，也是网络中神经细胞间相互连接的基本丁作单位。突触是介导神经元及其靶标之间信号 传递而在细胞连接处所形成的特化结构，精确的突触连接阿络介导功能的行使”i 。 据神经冲动通过突触的方式的不同，突触可分为电突触和化学突触两种类型。在电突触， 轴突末端( 突触前膜) 和另一神经元膜( 突触后膜) 之间以突触间隙相隔。腔肠动物神经网 的突触土要是电突触。蚯蚓、虾、软体动物等无脊椎动物土要也是电突触。脊椎动物也有电 突触t 但更多的是化学突触。化学突触的形志特点灶两个神经元之间有卟宽约为2 0 砌 3 0 n m 的缝隙。缝隙的前_ | 亓分别为突触前艘和突触j 亓膜缝隙的存在使神经冲动不能直接通 过，只有往某种化学物质，即神经递质的参与r ，在神经递质与突触后膜上的受体结合后， 突触后神经才能击极化f m 发生兴奋。在这哩我们生妥介目 化学突触。 突触的结构- 口分为突触时成分、突触间隙和突触后成分= 部分。究触前、后成分彼此相 对的细胞膜分别称为突触时艘用l 究触 j 膜( p l c s y n a p f i ca n d p o s t s y n a p t i m b ) 两者2 闸在宽约i5 3 0 a m 狄窄川隙为突触间隙，内禽糖蚩自和世细丝。突触前成分通常姓神 经兀的轴突终束节球状膨 突触前术端是由簇突触囊泡甬绕l u 子致密的膜所形茂的特化 结构，而究触j 亓位 包含有密集的离子通道用j 信号转导分子。亿 突触前末端膨人的究触囊 泡音有许多神经递质，把突触前斤分隔开米的是突触间隙，即为一个扩展的胞外审搿c 。如图 1 所示。不同的生物体和神经元类型决定突触前后的特化结构展现山不同的形态结构”i 。不 同物种z 问神经递质祥放的分子机制是高度保守的”。 目l 突触m 杏结构示意圉( j u l i e nr m2 0 0 5 a x o f i t e r m i n a s y n a p t i c c l e f t d e n dr i t i c 第一章文献综述 突触的形成包括如下几个步骤：连接起始、募集突触前和突触后的分子、突触的稳定和 成熟、然后是突触的消除【4 】首先，轴突与靶点形成接触点，这个接触点是特异的，而突触 的特异性被认为是由突触前后的p a n 锄晦通过突触间隙的连接来介导形成p j ，这对整个神经 系统行使正确功能很关键。第二，在新形成的突触，突触前及突触后一些分子的募集。在这 一步，一些跨突触的粘附分子能够调控突触前一些递质释放元件分子及突触后的一些递质受 体分子正确募集和定位。起调控作用的分子包括n e t t r o l i g i n 及i l e u r e x i i l 粘附复合体以及能诱导 突触前几种分子聚集的s y n c l a m 【删。最近的研究表明突触前后基本元素的快速募集和稳定 参与了从最初的一个接触位点到最后突触的形成的整个过程。突触囊泡和突触活跃区的主要 成分在突触形成时与突触前蛋白，如钙离子通道等是一起成团被快速运输招募到接触位点的 p 川。在接触后几分钟到几个小时内一些受体的亚单位和支架分子成分在不同的时间点被分 别招募到突触后位点【l 卜1 3 】。在募集完突触前和突触后的分子正确定位后，一个新生的突触就 形成了。 有研究证明突触分子在分子和细胞水平参与突触的形成。一些突触分子，包括i n t e g r i n s ， n c a m ，a p c a m ，f a s c i c l i ni i ，c a d h e r i n s ，d s c a m ，n o t i n ，s y n c a m ，n e u r e x i n sa n dn e u r o l i g i n s ， s i d e k i c l 【s 和s ”d e c 姐s 等1 1 4 1 ，所有的分子都是跨膜蛋白，表达在突触前膜或突触后膜上，其 胞外区相互作j j 或与细胞外基质相作用。大部分分子在它们的胞外端含有免疫球蛋白类似结 构域，并且一些胞内端还含有与p d z 结构域 p o s t s y n a p t i ed e n s i t y9 5 ( p s d 9 5 ) d i s c sl a r g e ( d l g ) z o n ao c l u d e n s 1 ( z o 1 ) 】相互作用模序【l 引。这些突触分子在突触靶标的识别、突触前和 突触后的特化、突触的组装和去组装以及突触的维持过程中发挥重要作用。 近年米研究发现n e u r o l i g i n 及n e u r e x i n 这对相互作用分子在突触形成和发育以及突触功 能的行使过程中起着重要作刚。n e u r o l i g i n s 是作为a - n e u r e x i n 的配体而被发现的，它们能介 导细胞与细胞之间的枯附。n e u r o l i g i n 住体外能诱导突触前的分化而形成新的功能性的突触 p j 。研究还发现n e u r o l i g i n 及其受体n e u r e x i n 能调控兴奋性及抑制性突触之间的比例。 突触粘附分子稳定新生的连接并诱导突触的形成 细胞与细胞之间的粘附是多细胞生物最基本的特征。在发育过程中，各种类型细胞之间 特异性的枯附对于特定细胞形成止确的各种组织利器官是必须的。在成体，细胞之间的粘附 不仅仅是维持这些组织和器官的结构和功能的完整性，还必须可以帮助完成新生连接的形成 和一些老的接触的重塑( r e m o d e l i n g ) 1 1 6 。 突触枯附分子介导的胞内识别对于轴突与树突之间形成合适的组合十分重要。许多的粘 附分子可能都参与了突触的形成，神经递质的传递以及突触的可塑性的过程。他们参与突触 形成的不同阶段：首先，它们向导轴突到达正确的靶细胞；第二，它们在突触前后位点形成 初始接触：第三，诱导突触前后的募集分子形成有功能的突触。第四。粘附分子可能参与调 节突触结构和功能【4 j 。如图2 ，a 显示的是粘附分子把突触( s y n a p t o s o m e s ) 相互隔开从而反 映出突触前后膜的紧密联系；b 形成突触过程中粘附分子帮助轴突选择合适的目标细胞和目 标细胞的正确区域；c 突触粘附分子募集各类分子到本无特定功能的区域形成具有特定功能 的突触前和突触后；d 突触粘附分子通过调节粘连的强度和信号来影响突触连接处的大小和 形状，从而改变突触的功效。 3 g 南 学碗l 学位论立 圈2 粘附分子子在究中的重要功能( y a 砌p t l m n i l 2 0 0 3 ) 细胞间形成止确的突触需要粘附分子介导的细胞与细胞的识别。最新的模型就是细胞枯 附分子在轴突和突触后细胞问形成同源或异源的相互作川米支持新生接触处的膜结构。位下 膜两侧异源性结台的粘附分子募集膜两侧不同的胞质信号从而产生突触在结构和功能的不 对称性。蒯i 5 ；f 性结合的枯附分子招算相同的胞质信号传给另一侧的膜从而产生相同的突触， 但是祖两侧细胞中丧逃不同枯附分于结合的蛋白会导致形成不同的究触。参与突触形成的细 胞桔肘分子属丁儿个不同的家旅包括 j c a d l l 印n 剌i g 超家族m 】，当然也乜括e p h r i n s ， n e u r o l i g i n s , n n s 剥h a l e 虮1 4j i “w 。 对r n e u r o l i g i n s 的研究使僻特异的细胞粘附分于在突触形成过科有重要作川返十概念 被j 泛的接受，在| | _ 神经元细胞r - 袁选n e u r o l i g i n s ，f _ 且与神经元细胞e 培彝能够诱导神 经元细胞突触l m 结构的形成”。n e u r o l i g i n s 姓t 翌位r 突触后的至少i 以山四个基编心的 跨膜蛋白“。利“ r n a i 的方法在培养神经元内降低n e u m l i g i n s 的表达导致兴奋性和抑制性 突触的数繁都减少而特异降低n 锄r o 】i 画n 2 的量主要会影响抑制性突触。n e u r o l i g i n s 的 突触活动依赖与它相互作川的n e u 咄i n s n c u r e x i a s 由a e u r e x i a 1 黼i n2 一r e x i3 这 二个基田编码，可以形成上千种不同的剪切形式”“。n e u r e x i n s 的细胞质尾端带有一个p d z 结构域。地过与突触脯的支架分子丰i i 互作儿j ，n e u r 既i n s 可咀诱发突触前活跃k 的虮驶。例如 - n e u r e x i n s 可与c a s k ；f i i 带41 蛋白( 肌动蛋白结合蛋白) 结台，而它w j 义能。j 肌动蛋白细胞 骨架结合“”。这种相可的n 。可以稳定发育过烈中的突触前末端希l 突触囊泡】。 第一乖土献综述 5 s i ；高 图j 通过n e u r o 嘲n 母e x i n 柳作用的分子( d n c h _ l2 0 0 6 ) n e u 坤目n s 年b - n e a r e x i n s 的胞质尾的c - 求端禽打个能与支浆蛋白p d z 结台f j 四个钮韭 酸基序通过这个基s f i b - n e u r e x i n s 与直辈蛋n c a s k 与冲经递质释放相关的m i l l i 生一相互作 刚“。o 州其他廿知的可以促进突触前末端彤j 垃的货一是蚓潍性的枯附分f s y n c a m s y n c a m 可以与 n x i n s 以及c a s k 、m i n 湘互作坩”。c a s km i n t 及v e i l 形成_ 三聚体， 这个_ 二聚体复合物形成个盘架，这个支架对突触小泡的组装起着支掉f l ；t h i ：s i 。另外，c a s k 及m i n 岫过其它一些分子相互作川米帮助n e u r e x i n 凋h 胞吞作h ，比如，m u n c 1 8s y m a x i n l i p r i n 戍r a b p h i l i n3 n 。n e u m x i n 能够直接o ，渊小泡胞备的s y a a p t o t a g m i n 相可f l d l j “。 n e u r e x i n 妇t 过c a s k 与能形成a c t i n s p e c t f i n 馓丝的堂向41 相瓦”使n e u r e x i n 肌蚩向细胞昔 架相连叫。j 习此tc a s k 可能是作为一种接头调“分r 术募集一些突触小泡胞奋相关的分千 米形成一个人分子艇台体然后使这些人分子复合体与n e 哦x i n _ b 关联。 表达种纤维原细胞树尖的n e u , e x i n s 一1 b 在兴奋性自抑制性突触- p 都扮演一个募集谷氦酰 胺能；r i g a b a 能受体的突触后蛋白的个基奉的炎触信妒1 。相似地，n e u r o l i g i n 能f 敛地州 募n c u 托廊s 聚集，从而诱导突触前的分化和突触囊泡的聚集p 0 j 。这些麓现部订教地证明了 n e u r o l i l 曲s 和l n e u r e x i n s 在突触的形成过程起着非常m 婴的作川。然而n e u r o l i g i a i ，- 2 ，一3 的 单敲除或般敲除小鼠都可以存活并且可育，甚至是二个n e m o l i g l n 都敲除的小鼠拄脑部细胞 结构一突触密度和突触的形态上都表现正常，这些小鼠在出生时就因呼吸问题死1 i = 。而它们 在谷氰酰胺能乖i g a b a 能突触比例的平衡发生改变，导致了这些小鼠表现出增强的刺激和呼 吸韵律的政变川。 很明显地在体缺失n 删r o l i g i m 宪触仍然可以形成，所以说n e u r o l l 由s 是采触形成的充 分而1 f 必要条件a 已有实验证明在体实验发现n e m o 目僻可能调节突触成熟和辨奇性和抑制 性突触的平衡。而在d 删i m 二敲除小鼠表型也验证了上述观点，这些小鼠出生后不久即 死亡且g a b a 能突触密度减少7 5 0 * * 。但是谷氨酰瞎能突触没有受到影响i 删。其它分子在突 触形成的体外实验中显示可能参与其中，特异地在h e k 2 9 3 细胞中表达s l c a m 可以使培养 的海马神经元进行宪触前分化。在此系统中的形成的完触前末端具有自发性年诱发性的囊泡 释放n e u r o l i g i n s 和n o n e x k a s 的相互作用可以增加究触的数量， 面s y a c a m 可以提高突触的 功能因此，几个细胞粘附分子之间相互协作的过程应该是在体形成完整而有功能突触所必 须的i “ 东南大学顽i 学位论文 n e u r e x i n s 的功能及其研究进展 突触粘附分于是突触的重要组成部份，在脑发育过程中突触桔附分子在突触的建立和结 构维持方面起着重要作坩。同时，越来越多的证据说明突触粘附分子在兜触可塑性及学习记 忆中也起着多种重要作用。 n e u n e x i n 当初是因_ = i 它能够与黑蜘蛛毒素* l a a v t o x i n 相互作川而被发现的”。哺乳动物 里共有三个n e u r e x i n 基田分别是n c m e x i n1 ，n e a r e x i n1 1 及d j nl l i 。这三个基困备有两个 不同的启动子，分别可以转录山k 的a - n 即r e x i n ( a - n c u r c x i n1 ，a - n e 哦x i ni 吸a n e m e x i nl i d 及短邮- n c u r e x i n ( p n e u r e x i ni ，b 一吼hl i ) l l - a e u r e x i a1 1 1 ) 1 3 4 ，哺乳动物长的n - n c u t e x l n 及短的p n e u r e x l n 部是单跨腆的分子，具有典型的受体型胞外结构，其q ，l n s 结构域对传递 跨膜信号起着至关重要的作用。l n s 结构域的命名是因为这些重复序列出现在l a m i n i na ， n e u t e x i n 及性撒素结台蚩门( s e x h o r m o n e - b i n d i n g p r o t e i n ) ，故命名这种保守的结构域n q l n s 。 每个l n s 刍 构域都是独立的折叠结构和配体结台单元。f ，- n e u m x i n 上唯一的l n s 结构域就能 与n e u r o l i g i n 上的乙酰h 日碱酯酶相似结构域相且结台。在a n e 眦x l n 发b _ n c u r c x m 巾，是后一 个l n s 结构域后血，往往有些能够高度糖基化的竹点，及单的跨麒段较短的胞内端结 构，h 这个胞内端的术端都具有一个保守的i i 型p d z 站含基序( p d z b i n d i n g m o t i f ) ，如蚓4 。 n 匝臣互厦迁蠹曩歪瑟毒页墨耍夏妾盘互i 团吣。 a - n e u r e x l n 叵口= 二刍e j e ，d b - n e u r e x i n 圈4m n e u r e x i n 段 n e u r e x 蝴较示意酗( l i a n de l h m l2 0 0 6 ) 最切的关r n e u m x m 女l n e u r o l i g i n 功能的研究主要米白体外实验，在培养的1 f 神经兀细胞 中表达n e u r o b g i n i 以诱导业培葬帕种经兀细胞进 ，定触前的分化”】。柯研究左明n e u r e x i n s 是n l i g i n s 诱导突触前蛋白募集利突触禾梢形成的受体。加入i u 溶性重组n e u r e x i n sl b 阻断 内源性n 叫m x i n s 与n e u m l i g i n s 相互作川可以减少究触前术梢的数目。麻h n e u r o l i g i n s 涂铺培 养的神经元：挺面可以募集n i n s _ f 其他突触前蚩自而细胞外抗体介导的人i 成蔟 n e u r e x i n s 也足以募集突触前蛋白，任袭达n e i n s l 0 的细胞中诱导突触前末梢的形成必须 依赖n e u r o l i g i n s 寡累体的存在。这些结果表i i ) n c u r o l i g i n s 通过缩# b - n e u r e x i n s 而诱导突触前 末端的形成。 深入研究发现，转染成纤维细胞、神经内分泌细胞使l n c u r e x i n s 先山现在树突时也可 队募粜n e u r o l i g 蛔s 和突触后蛋白、受体。胞外抗体诱导的人r 成j 麓n e u r o l i g i a s 也能产生这一 效麻。冈此，这两种分r 在究触发生过程中实际上表现为相互作丰烈向信号诱导。进一步 实验证实在 神经元细胞中表逃n e u r e x i n w 以诱导共培养的神经元细胞突触后特化结构的 形成， 在成熟的突触中，通过n m d a 受体s y n g a p - p s d 9 5 n c u r o l i g i n b - n c u m x i n - c a s k - m i n t - m 岫c 1 8 s y a t o x i n 的相互作州的瀑布效应，功能性地将究触后的信号装置和突触前的递 质释放机制藕联起来了。这样一个跨突触信号传导瀑布能传递逆向信号。从突触后向突触前 结构，稠节突触的司毽性。该模型预测p - n n 定1 ：_ ) ：在突触前肢。由r n r e x i 自身分布 第一章文献综述 状况及比较复杂的i s o f o r m s 结构并且缺少亲和力高的抗体，对于n a 1 l e x i n s 的研究相对比较困 难，我们对于n e u r e x i n 定位可以肯定的是确定其在神经系统特异性表达。但是迄今为止还不 能确定n e u r e x i n s 是否特异地在突触前表达，是否还有部分在突触后也有表达。应用当前可 以得到的免疫试剂，还不能得到9 - n 锄i e x h 在前突触定位的直接证据i ；q 3 5 1 。而且在已有的文 献报道，在- n e u i 瓴i i l 敲除的小鼠中诱发性突触反应减少了5 0 ，同时与突触自发性反应相 关的n m d a 依赖性组分也减少了5 0 ，因此认为a - n e u r e x i n 对于突触后n m d a 受体功能的行 使是必须的t 3 6 j 。 n e u r e x i n s 定位的研究进展 生物体细胞是一个高度有序的结构，胞内根据空间分布和功能不同，可以分成不同细胞 器或细胞区域。新生蛋白质要定位特定的细胞部位( 亚细胞器) 才能发挥其生物学功能，细 胞内的区域化分布能够影响到蛋白质折叠、聚合以及转录后修饰的过程，对细胞功能产生深 远的影响。了解蛋白质的弧细胞定位信息，可以为我们推断蛋白质的生物学功能提供必要的 帮助，同时对蛋白质的其他研究如相互作用、进化等也能提供必要的信息。对于突触而言， 突触囊泡转运的突触前膜是与专门进行信号转导突触后膜相联系的。突触前后膜是由突触粘 附分子介导的突触连接进行突触功能的行使。n e u r o l i g i n s 和n e u r e x i n s 就是表达在神经细胞表 面的相互作用来形成突触连接的突触粘附分子。在体外实验证实这诬个分子在突触的形成、 分化等过程中起着非常重要的作用，但是具体它们在体的功能是什么样的目前还不是很清 楚。因此研究n e u r o l i g i n s $ l l n e u r e x i n s 的亚细胞定位对于这两个分子在体功能的研究有着起着 非常重要的作用。 1 9 9 9 年s o n g 等人第一次利用免疫电镜技术对n e u r o l i g i n 在超微结构水平定侥进行分析， 结果显示在人鼠脑组织中n e u r o l i g i n l 主要聚集在突触间隙和突触后致密区，且主要存在与谷 氨酸盐能而j - g a b a 能的突触中p 丌。两之后的一些培养的神经元细胞实验也证实了 n e u r o l i g i n l 确实在突触后表达p 圳。这就提示与n e u r o l i g i n l 形成异源性复合体的n e u r e x i n si p 可能是在突触前表达。在一些体外培养细胞中有间接性证据i 正d b n e u r e x i n s 1 b 主要是住突触 前发挥作用的。儿个间接的证据如下：1 、一种识_ 5 1 j j i m $ l l p - n e u r e x i n 的抗体显示n e u r e x i n 的异 构体存在于突触和轴突的生长锥。2 、通过包被在颗粒载体上的n e u r o l i g i n 聚集的内源性的 n e u r e x i n s 在缺乏后突触成分的情况一卜也可以引起前突触的分化。3 、轴突中抗原决定族标记 的经过抗体聚集的1 3 - n e u r e x i n 会引起突触小泡的募集。不同类型的n e u r c ) 【i l l 很有可能在前、 后突触的细胞膜区域有差异性分布。n e u r e x i n 的结构特点决定了它们是作为一种受体而行使 功能的，其上千种的不同形式的分子可能与不同的配体分子结合【6 】1 3 0 l 。 2 0 0 4 年p e n g 等人利用l c - m s m s 的方法在分离的大鼠突触后成分中发现了n e u r e x i n s 的 存在删。2 0 0 7 年h i r o k it a n i g u c h i 等人在1 kj o u r n a lo f n e u r o s c i e n c e 的文章利用免疫电镜技术 对犬鼠的n 删l r e x i l l s 进行在体精确定位1 4 ，统计了被标记的2 0 5 个突触中，结果显示有2 7 n e u r e x i n s 只位于突触前，3 4 位于突触后，而有3 9 的显示在突触前后都有分布。这些在体 结果显示内源性的n e u r e x i n s 蛋白主要分布在突触位置，不仅在突触前有表达，在突触后的 表达相对比较多。 7 东南人学哦l 学位论文 c， 隧熊 瞳鱼望爨露：露盈翮 k i t 蜒：盛薹差美 圈5 免疵电镜显示n i i m 在小鼠脑中突前后的分布( h i r o k i t i g u e h le ta l2 0 0 7 作者认为与n e u r o l 蟛t 卜1 顺式存在的n c u r 嘣i n l p 抑制了n e u r c x i n s 的反式结台，阻断了 n e m o l i g l n - i 的突触活性，在培养的神经元细胞中能减少突触前来端的密度。提示在突触前 后的n i a s 与n c u r o l i 垂n 的结合方式不同，且0 ：突触形成和发育过样中的作州也不尽相 同作者提出的一个观点是，突触后的n c u r c x i n s 可以与同样存在j 。突触肝的n e u r o l i g i n 分 子顺式结台。部分阻断r 突触前后n e u r e x i n s 和n e u r o l i g i n 的结台，从而抑制了n e u r o l i g i n 在突触形成过棵中行使功能。干1 者提山的一个关r 假设突触前后的n e u r e x i n s 自n e u r o l i g i n 的站台方式山f h 显不但是其巾冗体的机制足什幺不消她，争令也没打寅j | 垒数槲 正岍。 幽“ m 一道、塑9 辫_ k 朋孵弋 未爵乏 周q 。b g h 埘n 等人通过超进离心和免疫电镜等技术得山了与前青儿乎完仑相反的 结论1 ，超述离心过后的人鼠脑组织炎触的再个纽升可咀报据白身不同性质发生分离然 后对分离龋分进行、狍t e m b l o t t i n g 检测结果显示n e u r e x i n s i b 十要是存在r 离心后突触前组 分，同时对离心过后样晶进行免疫电镜标记也验证n e u r e x i n s 土监表丛批突触前( 9 6 ) ， h 有相当少的一部分( 4 左右) 是位r 突触后的，如图7 。与该蚩自分布相一致的是n e u r e x i n i 埔l n e u r o l i g i n 灶跨膜相互佧川的，这，s o n 始人们实验结果是吻合的”“。 * 一章史m 镕连 f a lp m s mp o s l s m n e u r o l ”j i n 嘲_ - 畔孽一1 1 2 繁攀“。 琶3 0 0 8 ； ；2 u ” 苗 重1 0 0 蛊 霉矿 圈7 超逮离心后w # k m m “6 “g 显示n x i n 的分布( b 啪m g h a da ，2 0 0 7 e t 前的研究数据支持n 酬 目n 是突触斤分子，因此作者的观点是n e m , 既i n i 吐要位于 突触前的，通过与突触后的n 栅m l i 西n 跨膜相互作埘在突触形成咀及稳定过稗中起作用。而 在宪触后少量存在的l n e u r c x i ni b 主要娃在突触发生过程中抑制n r o l i g l 的功能。 到目前为l 关 - n c u m x i n 及n e u r o l i g i n l i 0 功能九部分米自体外实验，但n e u r e x i n 及 n e u m l i g i n 在整体动物水平的人脑中的功能j = i = 小灶 h 清楚。丽n c u r c x i a s 在体的定位和分砧也 q ：挂很清楚，衅管目前研究结果显示n m s 庄突触发生和突触传递中发抨晴要作j i j ，但 仍来确定其精确的作川机制。 黑腔聚蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 娃运州1 | ：常j - 泛的模式生物，特别是果蝇的神经 肌肉接头( n m j ) ，它是研究突触的形成和功能一个f l ：常好的模型土要是由r 其具钉脊椎 动物中枢 p 经系统突触的特征：足谷氩酸盐类蹙体自i 包含离f n 的谷氨酸盐类受体1 ”1 。我 们己经证实在果蝇中“有- - 1 a - n e u r e x i n 基田且与哺乳动物的a _ n e u r c x i n 具有搬高的同源 性。目前为i t - 关j ：n e u r e x i n 定位的研究土要是在人鼠中进行的，其爿i 论小一敦甚生完全相 反，没有非常统一的现点。鉴r 果蝇中有且h 有一个n e u r e x i n 基冈，那么梁蝇中的n i 分子的定 i 】：是什么样的昵，h 前还没有文献报道，田此利用果蝇作为模式生物进行n 删r e x i n 定似分析可咀进步对丁研3 = i ：n e u r e x i n 在体的功能提供帮助。 * ，e - b m m 尬 h & 一自翻mm垃 曷 ：i_l，日o_瓢，a目目目m日目目w龃_ _ 东南大学硕上学位论文 第二章实验材料与方法 第一节实验材料 一所用果蝇品系 n r x - g a l 4