（遗传学专业论文）cbcbf、cbice53等抗冻相关基因的克隆及功能验证.pdf

c 6 c 矗最西j c 8 铝等抗冻相关基因的克隆及功能验证 论文摘要 寒害是植物生长过程中面临的巨大危害之，全球每年因此危害而造成的农作物、 花卉等植物的损失高达数千亿美元。许多植物对低温有一定的适应性和抵抗能力，这与 基因型有很大的关系。通过分子生物学手段在十字花科植物荠菜( c a p s e l a b u r s a - p a s t o r i s ) 中克隆得到了新的抗冻基因转录激活因子c b c b f 2 5 , c b c b f 发第e 游 转录因子c b i c e 5 3 ，和抗冻相关基因c b c a x s l 与c b r c i 3 5 , 并发现在荠菜中存在抗冻相 关基因的表达调控途径，在此途径中i c e l 激活c b f , 进而促进抗冻基因表达，从而提 高荠菜的抗冻性能。在p c a m b i a l 3 0 4 基础上构建了c a m v 3 5 s 组成型表达启动子驱动基因 表达的单价植物表达载体1 ( 即p c a m v 3 5 s ：c b c o r l 5 b ) ( c b c o r l s b 为受c b f 基因激活的 抗冻基因；d a t a b a s ea c c e s s i o nn o ：a y 3 9 1 1 2 1 ) ，载体2 ( 即p c a m v 3 5 s ：c b c b o ，载 体3 ( 即p c a m v 3 5 s ：c b c a x s l ) ，载体4 ( 即p c a y v 3 5 s ：c b r c i 3 5 ) ，同时构建冷诱导启 动子驱动基因表达的植物表达载体5 ( 即p c i p ：c b c o r l 5 b , c i p ：c o l d - i n d u c e d p r o m o t e r ) 。将载体1 、载体2 、载体3 、载体4 、载体5 分别转化烟草，同时将载体2 和载体5 、3 载体和载体5 、载体4 和载体5 、载体3 和载体4 分别共转化烟草，以揭示 这些基因的表达特点及作用机理，同时研究冷敏植物烟草中是否存在低温胁迫的应激反 应途径。 本文中基因克隆均采用r a c e p c r 技术。从荠菜中克隆得到了两个新的抗冻基因转录 激活因子c b f 2 5 ( d a t a b a s ea c c e s s i o nn o ：a y 4 9 1 4 9 8 ) 和c b c b f ( d a t a b a s ea c c e s s i o n n o ：a y 3 9 1 1 2 1 ) 。c b c b f 2 5 全长c d n a 为8 9 8 b p ，含有个6 6 9 b p 的开放阅读框( o r f ) ，编码 一个有2 2 3 个氨基酸的d r e c r t 的结合蛋白质；c b c b f 全长c d n a 为1 0 3 4 b p ，含有一个6 5 7 b p 的开放阅读框( o r f ) ，预测编码一个2 1 9 个氨基酸的d r e c r t 的结合蛋白质。同源比较表 明c b c b f 2 5 ，c b c b f 和许多其它c b f 蛋白有很高的同源性。预测c b c b f 2 5 ，c b c b f 蛋白都包 括一个潜在的核定位序列( n l s ) 在n 端，紧跟着一个a p 2d n a 结合基元和一个酸性的c 端可 能充当激活结构域。生物信息学分析显示c b c b f 2 e , c b c b f - 与其它的c 6 瑾因十分相似。冷 适应分析表明的卿功c 6 哟表达是受冷诱导的。所有的分析结果表明c b c b f 2 b w 能 同其它的壤因具有相同的功能例如通过激活下游抗冻基因的表达提高植物的抗冻 性。 c b c b ac b i c e 5 3 渊关基因的克隆及功能验证 本研究在荠菜还克隆到了一个新的i c e l 基因( d a t a b a s ea c c e s s i o nn o ，： a y 5 0 6 8 0 4 ) ，该基因( c b l c e 砌全长c d n a 为1 8 1 l b p ，含有一个1 4 7 6 b p 的开放阅读框 ( o r f ) ，预测编码一个4 9 2 个氨基酸的蛋白。预测的c b i c e 5 3 蛋白包括一个潜在的螺旋一 环一螺旋结构，个核定位序列( n l s ) 和几个其它的结构域。生物信息学分析显示 c b i c e 5 3 与拟南芥的i c e l 基因十分相似。非生物胁迫分析及冷适应分析表明c b i c e 5 3 的表达与冷诱导和盐诱导相关，并且受a b a 的诱导，与干旱诱导不相关。 此外，本研究在荠菜中克隆了两个新的抗冻相关基因c b c a x 5 1 ( d a t a b a s ea c c e s s i o n n o ：a y 6 6 0 8 7 0 ) 和c b r c i 3 5 ( d a t a b a s ea c c e s s i o nn o ：a y 5 6 6 5 7 3 ) 。c b c a x 5 1 全长c d n a 为1 7 5 4 b p ，含有个1 3 9 8 b p 的开放阅读框( o r f ) ，编码一个有4 6 6 个氨基酸的蛋白质： c b r c i 3 5 全长c d n a 为1 3 0 0 b p ，含有一个9 7 8 b p 的开放阅读框( o r f ) ，编码一个有3 2 6 个氨基酸的蛋白质。 分析结果表明荠菜中存在c b c b f 2 5 , c b c b f ,c b i c e 5 3 等与抗冻相关的基因，发现 c b i c e 5 3 是组成性表达，同时其表达受盐及a b a 的诱导，推测在荠菜中存在c b i c e 5 3 激 活c b c b f 2 5 和c b c b f 的转录，进而激活下游抗冻基因的转录的基因表达调控途径，即存 在与拟南芥相类似的c b f 基因表达调控途径。在成功地构建植物表达载体之后，采用冻 融法成功地将重组质粒转化到了根癌农杆菌菌株e h a l 0 5 中，采用农杆菌介导的烟草叶 盘转化法，将目的基因转入烟草中，在诱导生根后对转基因植株进行p c r 检测，鉴定出 阳性植株，为进一步的功能验证提供了基础。 关键词：c b c b f 2 5 , c b c b ，c b i c e 5 3 , c b c a z s i ，c b r c i 3 嚣荠菜c a p s e l l a b u r s a - p a s t o r i 岛r a c e ，基因转化 援重大擎硪竺竺竺竺查垡! 竖丝堕：型型塑里塑塑墨婴堂墼一 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - - _ - _ 一一一 s u m m a r y g u s t yc o l dh a r mo rf r e e z i n gh a r mi so n eo ft h em o s ts e r i o u sa d v e r s ef a c t o r so ng r o w t h a n dd e v e l o p m e n to fp l a n t s ，w h i c hc o s t sb i l l i o n so fd o l l a r se v e r yy e a r m a n yp l a n t sh a v ea n i n b u i l ta b i l i t yt oa d a p tt h el o wt e m p e r a t u r ea n dd r o u g h t ，a n dt h i sa b i l i t yi sc o n t r o l l e db y h e r e d i t a r yg e n o t y p eo fp l a n te v o l u t i o n i nt h i ss t u d y , t w on o v e lc o l d r e g u l a t eg e n eu p 。s t r e a m t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r sc b c b f 2 5 ，c b c b fa n di t su p - s t r e a mt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rc b i c e 5 3 ， a n dt w oo t h e rc o l d r e s p o n s i v eg e n ec b c a x 5 1a n dc b r c i 3 5h a v eb e e nc l o n e d a l lo ft h e s e a r e s t e dt h a tt h e r ei sc b fg e n ee x p r e s s i o n - r e g u l a t e dp a t h w a ya n dt r a n s c r i p t i o n a lc a s c a d e l e a d i n g t ot h e e x p r e s s i o n o fc o l d r e s p o n s i v eg e n e su n d e rc o l ds t r e s si nc a p s e l l a b u r s a - p a s t o r i s ，w h i c hi c e la c t i v a t et h ee x p r e s s i o no fc b fb yb i n d i n gi t sp r o m o t o ra n dc b f b i n dt h ed r e c r te l e m e n ti nt h ep r o m o t e ro ft h ec o l d - r e g u l a t e dg e n e sa n da c t i v a t e t r a n s c r i p t i o no f t h e m t h e r e b yi n c r e a s ep l a n t s f r e e z i n gt o l e r a n c e w ea l s oc o n s t r u c tu n i v a l e n t v e c t o ro fg e n ee x p r e s s i o nb a s e do np c a m b i a1 3 0 4 ，w i t hc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o nc a m v 3 5 s p r o m o t e ra c t i v a t i n gt h eg e n e ss u c ha sv e c t o r1 ：p c a m v 3 5 s ：c b c o r l s b ( c b c o r l 5 bi sa k i n d o f c o l d - r e g u l a t e dg e n ea c t i v a t e d b yc b f g e n e s ；d a t a b a s e a c c e s s i o n n o ：a y 3 9 1 1 2 1 ) ；v e c t o r 2 p c a m v 3 5 s ：c b c b f ；v e c t o r3 ：p c a m v 3 5 s ：c b c a x 5 1 ；v e c t o r4 ：p c a m v 3 5 s ：c b r c i 3 5 a tt h e s a m e t i m e ，c o n s t r u c t i n gc o l d - r e g n l a t e d v e c t o r 5 ：p c i p ：c b c o r l s b ( c i p ：c o l d i n d u c e d p r o m o t e r a n dt r a n f e rv e c t o r1 ，v e c t o r2 ，v e c t o r3 ，v e c t o r4 ，v e c t o r5a n dc o t r a n f c rv e c t o r2 a n dv e c t o r5 ：v e c t o r3a n d5 ：v e c t o r4a n dv e c t o r5 ：v e c t o r3a n dv e c t o r4t ot h et o b a c c o i n t h ef u t u r ew ec o u l df i n do u tt h eo f f s p r i n gh o l d i n gt h ei n c r e a s i n gf r e e z i n gt o l e r a n c ea n dh a v ea m u c hb e r e tm e t h o dt ou n d e r s t a n dt h ef r e e z i n gt o l e r a n c em e c h a n i s mi np l a n t s t w on o v e lc b fg e n ew a sc l o n e df r o mc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s ( d e s i g n a t e dc b c b f 2 5 ， d a t a b a s ea c c e s s i o nn o ：a y 4 3 7 8 8 8 ；c b c b f , d a t a b a s ea c c e s s i o nn o ：a y 3 9 1 1 2 1 ) b y r a c e p c r t h ef u l l - l e n g t hc d n ao fc b c b f 2 5w a s8 9 8b pl o n ga n dc o n t a i n e da6 6 9b po p e n r e a d i n gf r a m e ( o r f ) e n c o d i n gap u t a t i v ed r e c r t ( l t r e ) b i n d i n gp r o t e i no f 2 2 2 3a m i n o a c i d s ；t h ef u l l l e n g t he d n ao fc b c 够w a s1 0 3 4b pl o n ga n dc o n t a i n e da6 5 7b po p e nr e a d i n g f r a m e ( o m r ) e n c o d i n g ap u t a t i v ed r e c r t ( l t r e ) - b i n d i n gp r o t e i no f2 1 9a m i n oa c i d s t h e 6 腹旦史肇硪士i 啊啪震 c b c b & 伍泐毋虢垮湘关基因的克隆及功能验证 _-_-_-_-_-_一一 p r e d i c t e dc b c b f 2 5o rc b e b fp r o t e i n sw a sf o u n dt o h a v eap o t e n t i a ln u c l e a rl o c a l i z a t i o n s e q u e n c e ( n l s ) i ni t sn t e r m i n a lr e g i o nf o l l o w e db ya na p 2d n a - b i n d i n gm o t i f a n da n a c i d i cc t e r m i n a lh a l ft h a tm i g h ta c tb sa na c t i v a t o rd o m a i n b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i sr e v e a l e d t h a tc b c b f 2 5a n dc b c b fs t r o n g l yr e s e m b l e do t h e rc b fg e n e sf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a ( c b f l ，c b f 2 ，c b f 3 ) a n db r a s s i c an a p u s ( b n c b f 5 ，b n c b f 7 ，b n c b f l 6a n db n c b f l 7 ) s u b s e q u e n tc o l d a c c l i m a t ea s s a ys h o w e dt h a tc b c b f 2 5o rc b c b fw a sr e l e v a n tt oc o l d a c c l i m a t e a l lr e s u l t si m p l i e dt h a tc b c b f 2 5o rc b c b f m i g h th a v es i m i l a rf u n c t i o n sp o s s e s s e d b yo t h e rc b fg e n e ss u c ha si n d u c i n gt h ee x p r e s s i o no fs o m ec o l d - r e g u l a t e dg e n e sa n d i n c r e a s i n gp l a n t s f r e e z i n gt o l e r a n c e w eh a v ec l o n e dan e wi c e l ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o ：a y 5 0 6 8 0 4 ) g e n ef r o mc a p s e l l a b u r s a - p a s t o r i sb yr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( p a c e ) t h ef u l l l e n g t he d n ao f c a p s e t l ab u r s a - p a s t o r i si c e lg e n e ( c b i c e 5 3 ) i n c l u d i n gc o m p l e t e5 - u t ra n d3 - u t rw a s 1 8 1 1b pl o n g ，c o n t a i n i n ga1 4 7 6b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) w h i c he n c o d e sa4 9 2a m i n o a c i d sp r o t e i n t h ep r e d i c t e dc b i c e 5 3p r o t e i ni n c l u d e sap o t e n t i a lb a s i ch e l i x l o o p - h e l i x ，a p o t e n t i a ln u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ( n l s ) a n ds e v e r a lo t h e r sd o m a i n s 。b i o i n f o r m a t i c a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tc b i c e 5 3h a dv e r yh i g hl e v e lo fs i m i l a r i t yw i t ht h ei c e lg e n ef r o m a r a b i d o p s i st h a l i a n a s u b s e q u e n ta b i o t i cs t r e s s e sa s s a ya n dc o l da c c l i m a t ea s s a yr e v e a l e d t h a tc b l c e 5 3i n v o l v e di nc o l da c c l i m a t ea n ds a l tt o l e r a n c e ，a n dw a si n d u c e db ya b a t r e a t m e n ta n db ef o r e i g nt od e h y d r a t i o n b e s i d e s ，t w on e wc o l dr e l a t e dg e n e sc b c a x 5 1 ( d a t a b a s ea c c e s s i o n n o ：a y 6 6 0 8 7 0 ) a n dc b r c i 3 5 ( d a t a b a s ea c c e s s i o nn o ：a y 5 6 6 5 7 3 ) g e n ew a sc l o n e df r o m c a p s e l l a b u r s a - p a s t o r i sb yr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( r a c e ) t h ef u l l l e n g t he d n ao fc b u r s a - p a s t o r i se a xg e n e ( d e s i g n a t e da sc b c a x s l ) w a s1 7 5 4b pc o n t a i n i n ga1 3 9 8 一b po p e n r e a d i n gf r a m e ( o r f ) e n c o d i n ga4 6 6 一a m i n oa c i dp r o t e i n ；t h ef u l l - l e n g t he d n ao fc b u r s a - p a s t o r i sr c ig e n ef d e s i g n a t e da sc b r c i 3 5 ) w a s13 0 0b pc o n t a i n i n ga9 7 8 - b po p e n r e a d i n gf r a r n e ( o r f ) e n c o d i n ga3 2 6 - a m i n oa c i dp r o t e i n t h r o u g ha b o v em o l e c u l a rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no ff o u rn o v e lc o l d r e s p o n s i v e g e n e sa n dc o r r e l a t i v er e g u l a t o r sf r o mc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s ，w ev a l i d a t e dt h a tt h e r ea r e c o l d - r e s p o n s i v eg e n e sc b e b f 2 5 、c b c b y c b i c e 5 3i nc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s a n dt h e e x p r e s s i o no ft h e mi si n d u c e db yc o l d t h ec b i c e 5 3w a se x p r e s s e dc o n s t i t u t i v e l ya n d ， 橇星史擎_ 睦淳咖黻 c b c b f 西f c 8 劈等抗冻相关基因的克隆及功能验证 u p r e g u l a t e dw i t ht i m eo fc o l di n d u c e d c b i c e 5 3a l s o i n v o l v e di ns a l tt o l e r a n c e ，a n dw a s i n d u e e db ya b at r e a t m e n ta n db ef o r e i g nt od e h y d r a t i o n a n dp r o v e dt h a tt h e r ei sc b fg e n e e x p r e s s i o n r e g u l a t e dp a t h w a ya n dt r a n s c r i p t i o n a lc a s c a d el e a d i n gt o t h ee x p r e s s i o no f c o l d - r e s p o n s i v eg e n e su n d e rc o l ds t r e s si nc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s ，w h i c hc b i c e 5 3a c t i v a t e s t h ee x p r e s s i o no fc b c b f 2 5o rc b c b fa n dc b c b f 2 5o rc b c b fa c t i v a t e st r a n s c r i t ) f i o no f c b c o r l 5 b f i v ek i n d so fp l a n t e x p r e s s i n g v e c t o rf o rt r a n s f o r m i n g d i c o t y l e d o np l a n t s w a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l yb ys u b s t i t u t i n gt h er e p o r tg e n e ( c u s ) o fp c l 3 0 4w i t ht h ec o d i n g s e q u e n c eo f o u r d e s t i n a t i o ng e n e t h er e c o m b i n a n tv e c t o rw 船i n t r o d u c e di n t oa g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n sw i t h 肌e z e - t h a wm e t h o d t h el e a f d i s c so ft o b a c c op l a n t si n f e c t e db ya t u m e f a c i e n sw e r es e l e c t e dw i t l lh y g r o m y c i n t h er e g e n e r a t e dp l a n t sw i l l b et e s t e db yp c r t h es e a r c hf o rm e c h a n i s mo f a g a i n s tc o l ds t r e s sw i l lg i v eab a s i ct h e o r ya n dp r a c t i c et of u t u r e f u n c t i o nv a l i d a t i o n k e y w o r d s ：c b c b f 2 5 ，c b c b f ，c b i c e 5 3 ，c b c a x 5 1 ，c b r c i 3 5 , c a p s e i l ab u r s a - p a s t o r i s 。 r a c e ，t r a n s f m a t i o n 8 o c 6 正出柳等抗冻相关基因的克隆及功能验证 引言 工业化的发展和城市化进程的加速带来了大气的温室效应、空气及水土的污染、部 分土壤的盐碱化和一些耕地的荒漠化等负作用。进而对农作物、经济植物和植被植物的 生长发育产生逆境的胁迫作用。在全球气候变暖的大背景下，当前气候的一个显著特点 是四季的节律失调气候的不规则性增强。其中突发的低温冷害和冻害严重妨碍许多经 济植物尤其是热带型植物的生长突发的低温冷害和冻害严重妨碍许多经济植物尤其是 热带型植物的生长，全球每年因低温冷害和冻害造成农作物和园艺植物的经济损失高达 数千亿美元。以有性杂交为主的植物品种常规改良途径存在周期长、育种资源的遗传背 景狭窄、难以克服性状的负相关连锁等缺点。因此，深入研究植物抗寒机理，尤其是从 分子水平上阐明冷胁迫下基因表达调控机制，克隆相关抗冻基因，并进一步利用现代生 物技术培育抗寒作物新品种，具有重要的理论意义及实践价值。本研究对从荠菜中克隆 到的抗冻相关基因及其转录因子类似基因作进一步的表达和功能分析，为高等植物对冷 害和干旱胁迫应答的分子机理提供更多的认识。在应用上获得具有自主知识产权的对植 物抗冻耐旱基因工程具有实用价值的基因资源。 西c b f , 血棚等抗冻相关基因的克隆及功能验证 第一章植物抗冻的研究进展 1 1 植物抗冻的机理 植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进化 的遗传基因型所控制，又受个体发育中的生理生态因素所制约。温度作为重要的环境因 子之一，限制植物的分布及生长和产量( v i s w a n a t h a nc 2 0 0 2 ) ，对植物生长发育起着 决定性作用。一些植物在长期的系统进化中产生了独特的耐冷耐冻机制，如大量温带植 物在冰点以上的低温环境中能够获得对低温的适应性，变的更加抗冻。即发生了所谓的 冷适应( l e v i t t ，1 9 8 0 ) 。 长期以来，已有多种学科，如植物生理学、形态学、遗传育种学、生物化学、生物 物理学、细胞生物学及分子生物学等，从多方面对植物抗寒机理进行了广泛的研究。植 物的抗寒过程是一个复杂的生物化学和生理学的变化过程，它包括植物体糖含量的改变 ( w e l i ne ta 。，1 9 9 5 ) ，膜脂台成物的改变( h a j e l ae ta j ，1 9 9 0 ) ，可溶性蛋白( 脯 氨酸) 和可混溶渗透物质( 稚菜碱，多羟基化合物) 的聚集( v i s w a n a t h a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ， a b a 的瞬时增加或减少或者植物生长的停滞( l e v i t t ，j 1 9 8 0 ) ，荷尔蒙水平和基因表 达的改变。( g u y ，1 9 9 0 ：l i na n d t h o m a s h o w ，1 9 9 2 ：p a l v a e t ，1 9 9 4 ；s a k a ia n dl a r c h e r ， 1 9 8 7 ：h u g h e s ，1 9 9 6 ：i b a ，2 0 0 2 ) 。简令成和吴素萱( 1 9 6 5 ) 报道，细胞器膜结构的破坏 是植物在低温逆境中造成伤害和死亡的重要原因。h e b e r ( 1 9 6 8 ) 通过菠菜分离叶绿体的 冰冻实验，精确地证实冻害首先是破坏叶绿体的膜结构，然后才导致光合磷酸化( a t p 酶) 的失活。此后，大量研究结果进一步揭示和证实，低温对细胞膜体系的损伤是造成 植物寒害的根本机制，其主要原因是由于冰冻引起的细胞脱水而导致膜的脂双层向六角 形i i 相的转变以及膜的破裂( 简令成，1 9 8 3 ；s t e p o n k u se ta ，1 9 9 3 a ) ( 邓江明，简 令成2 0 0 1 ) 。 1 2 抗冻蛋白a f p 的研究进展 1 9 6 9 年，ald e v r i e s 首先在南极m c m u r d o 海峡的一种n o - t o t h e n e n i i d 鱼的血液 中首次发现抗冻蛋白( a n t i f r e e z ep r o t e i n 简称a f p ) ( 达来等1 9 9 2 ) 。人们从极区鱼的 c b c b f , ( 扰c 栅等抗冻相关基因的克隆及功能验证 血清中发现的这种奇妙的物质能阻止体液内冰核的形成与生长，维持体液的非冰冻状 态。这一发现引起了许多科学家的研究兴趣，研究对象从极区鱼扩展到昆虫、( 费云标 等，2 0 0 0 ：费云标，1 9 9 2 ) 无脊椎动物、脊椎动物、最后又扩展到非维管植物和维管植 物( b a r r e t tj 2 0 0 1 ) 甚至细菌、真菌、微生物。科学家发现，原来a f p 在生物界广 泛存在，是生物适应低温、抵御冻害的一种机制。( 尹明安等，2 0 0 1 ) 尤其是生活在寒 带和寒温带海洋中、陆地上的许多鱼类和昆虫，为适应寒冷的环境，都能产生大分子抗 冻物质。它可以提高鱼类在低温环境中的生存能力。a f p 除了有与冰晶结合降低血清冰 点的功能外( 可使鱼血清冰点降到一1 4 ) ( 达来等1 9 9 2 ) ，还能通过与细胞表面和离 子通道的相互作用，从而保护细胞膜免受低温的破坏，阻止离子渗漏。a f p 的这些性质 可被应用于改良动植物品种和冷冻保存等，有着广阔的应用前景( 刘万勃等，2 0 0 0 ) 。 植物中的a f p 发现较晚，1 9 9 2 年，加拿大g r i f f i t h 等才第一次明确提出获得植物 内生a f p 。他们从经低温锻炼的能够忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了内源产生的a f p ， 并从冬黑麦叶片的外质体中提取并部分纯化了该蛋白。由于它能改变冰晶的正常生长模 式以及非依数性地降低水的冰点，他们认为该蛋白就是植物中类似鱼类a f p 的抗冻蛋 白。( g r i f f i t hmp ra 1 ，1 9 9 2 ) 同年，在g r i f f i t h 等的发现稍后，美国圣母大学的 d u m a n 实验室在多种植物中发现了有热滞效应的蛋白质( u r r u t i amee ta 1 。1 9 9 2 ) 。 两年之后，中国学者费云标等从常绿抗冻植物沙冬青( a 嬲o p i p t a n t h u s m o n g l i c u s ) 叶片 分离到了抗冻蛋白( f e iy u n b i a oe ta 1 ，1 9 9 4 ) 。从1 9 9 4 年始，卢存福在高山植物唐 古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得具有抗冻活性的蛋白质( a f p ) ( 卢存福，博士学 位论文，1 9 9 6 ；卢存福等，1 9 9 8 ) 。 抗冻蛋白是一类抑制冰晶生长的蛋白质，包括不含糖基的a f p s 和含糖基的a f g p s ( a n t i f r e e z eg l y c o p r o t e i n s ) ，具有三个基本特征：( 尹明安等，2 0 0 1 ) 热滞效应 ( t h e r m a lh y s t e r e s i sa c t i v i t y ，t h a ) 、冰晶形态效应、重结晶抑制效应 ( r e c r y s t a l l i z a t i o ni n h i b i t i o n ，r i ) 。对3 类生物的a f p s 分析表明，其化学结构、 理化性质、空间构型均不相同；同类生物之间的a f p s 同源性也不高，几乎不存在相似 性序列或结构模式，说明它们可能是在不同的有机体中独立进化而来，没有共同的演化 规律( 卢存福等，1 9 9 8 ； b a r r e t tj ， 2 0 0 1 ；孙淑贞等，2 0 0 2 ) 。 基于抗冻蛋白以上的种种特性，可以通过基因工程的手段，将抗冻蛋白基因转入原 来没有抗冻蛋白的动植物体内，使其产生抗冻蛋白，从而提高其抗冻耐寒能力，可使原 攒旦| t 擎_ 莹攀啦艟交c 6 c 坛血柳等抗冻相关基因的克隆及功能验证 来不能在寒带生长的作物移植到寒冷地区栽培。植物内源a f p 基因更适合在植物体内表 达，由此产生的转基因植物在抗寒性改变上将会更明显。抗冻蛋白也可以应用于食品中， 在食品冷冻时，抗冻蛋白可抑制重晶化保持食品柔软的质地。在冷冻储藏食品中，抗冻 蛋白在食品的冰冻、储藏、运输和解冻过程抑制重晶化，减少细胞损伤以保持食品质地， 还可减少滴液以降低营养成分的损失( f e e n e yree ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 1 3 植物冷诱导相关基因的研究进展 过去的二十年里，抗冷胁迫的研究者们对植物在低温适应中基因表达的改变做了大 量的研究工作，取得了实质性的进展。他们发现低温锻炼能诱发不少新蛋白质的合成， 并进一步分离出这些冷诱导表达的基因。尤其是近几年来，通过对这些新多肽的分析与 鉴定，揭示这些新多肽大多具有高度亲水性的特性( t h o m a s h o wm ，1 9 9 9 ) 。这表明，它 们对膜可能起着保护与稳定作用，从而防止冰冻损伤，提高植物的抗冻性。还有一些研 究进一步探索了这种抗冻基因表达的启动和调节因子。( y a m a g u c h i s h i n o z a k ika n d s h i n o z a k ik1 9 9 4 ：j a g g l o o t t o s e n ，k re ta ，1 9 9 8 ) 这些研究，不仅为阐明植物的 抗冻机理提供了新的证据，而且为农作物的抗寒育种提供了新的启示。w e i s e r ( 1 9 7 0 ) 最先提出低温锻炼可能会引起基因表达改变的设想。g u y 等( 1 9 8 5 ) 首次揭示菠菜在低温 锻炼中基因表达确实发生了改变。过去的二十年中大量的研究已经证实，低温锻炼可以 诱发许多抗冻基因表达( 邓江明，简令成，2 0 0 1 ) ，并且在多种植物中克隆得到了大量 与抗冻相关的基因及抗冻基因上游的转录因子( t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ) 包括：拟南芥 d r a b i d o p s i st h a l d a n a 中的k i n l ( k u r k e l asa n df r a n e km 1 9 9 0 ) ， c o t 6 6 t k i n 2 ) ( g i i m o u rsja n da r t u snn1 9 9 2 ：k u r k e l asa n db o r g - f r a n c km 1 9 9 2 ) c o t 5 a ，c o t 5 b ( l i nca n dt h o m a s h o wmf 。1 9 9 2 ) ，r d 2 9 n ，c o r 7 8 ( h o r v a t hdpe t a 1 ，1 9 9 3 ) ，c o r 4 7 ( g i l m o u rsja n da r t u snn ，1 9 9 2 ) ，r d 2 9 b ( n o r d i nk ，e ta 1 ， 1 9 9 3 ) 和r a b l 8 ( l a n gv a n dp a l v aet ，1 9 9 2 ) ；油菜b r a s s i c a n a p u s 中的肋牙甄肋，五 砌鹏b n 2 8 ( o r re ta 1 ，1 9 9 2 a ，1 9 9 2 b ：s a e z v a s q u e ze ta l ，1 9 9 3 ：w e r e t ii n y ke t a 1 ，1 9 9 3 ：t h e r e s ac e ta 1 ，1 9 9 4 ) ；曹蓿a l f a l f a 中的c a s l 8c a s l 五 m s a c m g e n ef a m i l y ( l a b e r g ep a i 1 9 9 3 ：w o l f r a i me t 占1 1 9 9 3 ) ；大麦b a r l e y 中的p 锣和 p a 0 8 6 ( c a t t i v e l l i ，1a n db a r r e l s d 1 9 9 0 ) ：菠菜s p i n a c h 中的c a p ( n e v e ne t a - ，1 9 9 3 ) ：小麦w h e a tt r i t i c u ma e s t i v u m 中的w e s l g , t t g d l ( c h a u v i ne ta 1 1 9 9 3 ： 握旦史擎疆静射妣吱 c b c b f ( h 加8 舒等抗冻相关基因的克隆及功自峨f 正 h o u d eo ta l ；1 9 9 2 ) 0 0 1 3 9 ( g u oe ta 7 ，1 9 9 2 ) ；番茄t o m a t o ( s o l a r i u mc o m m e r s o n i i ) 中的删1 3 。( z h ue ta 1 ，1 9 9 3 。 与此同时，许多c b f d r e b l 基因家族也被成功的分离了，该家族基因能够与抗冻基 因启动子部分的顺势作用元件d r e c r t ( d e h y d r a t