（植物学专业论文）蒜鳞茎休眠前后胞间连丝变化及类外连丝显现与功能的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得煎盐l l ! 巫茔i或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：球、迸塑鍪宇日期：m 吗年月妒日 一学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑逝i 至苎丞至有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权煎l 塑丝盔：! 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：弓长迦迎导师签名：力矿多 签字日期：勘归f 月j 一。日签字日期：j 舯垮g 月魂 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址i 电话： 邮编： 河北农业大学硕士学位论文 摘 要 胞间连丝作为植物体内连接两个相邻细胞的细胞器，为胞问物质交流和通 讯联络提供了直接与便捷的共质途径。本研究以蒜似i l i u ms a t i v u ml ) 为材料， 利_ f = i 电子显微镜技术，系统观察了蒜鳞片休眠进程中鳞片薄壁细胞及胞间连丝 的特征与变化，同时进行了a t p 酶的细胞化学定位，并借助激光共聚焦荧光 显微技术和不同分子量的荧光指示剂，对类外连丝的功能进行了探讨。 胞闻连丝作为植物体的一种细胞嚣，在植物的生长发育和衰老进程中，同 其它细胞器一样，其形态、结构和功能都发生着明显的变化。从成熟期到萌芽 期，胞间连丝直径由常态的4 0 n m 扩大到1 0 0 n m ，并由体眠期大多处于断裂状 态衍变成萌芽期的类外连丝状态，表明在蒜鳞茎发育的不同时期胞间连丝所呈 现的不同结构形态是一种生理顺麻。借助激光共聚焦荧光显微镜并结合荧光标 记物示踪，发现不透膜荧光物质分子量为4 5 7 d a 的l u c i f e ry e l l o w ( l y c h ) ， 可以经类外连丝进入存活细胞内，由此确证了类外连丝的共质传输功能。 通过对蒜鳞片薄壁细胞的观察发现，鳞片在休眠、休眠解除初期和萌芽的 进程中，其各种细胞器处于动态变化之中。核染色质变化最明显，从正常的均 匀态剑凝聚态，然后义趋丁：边缘化：细胞核发生变形继而解体：质体逐渐消 火：细胞内囊泡化程度增加：线粒体是最后降解的细胞器。结合a t p 酶的细 胞化学定位，发现在薄壁细胞中和胞间连丝处，a t p 酶的活性呈现出明显的时 空分布的动态变化特征。从而证明了当蒜鳞茎薄壁细胞衰败时内含物的撤空是 一个主动、有序的需能过程，并由此推断蒜鳞片薄壁细胞的衰败过程属于植物 程序性死亡( p c d ) 的范畴。 关键诩：蒜、胞间连丝、类外连丝、共质传输、a t p 酶、程序性死亡 塑! ! 璺些查鲎堡圭兰堡丝奎 英文缳霉 a e r a f s c c c l s m c m v e d e r f - a e t i n f l 下c g a c t i n g f p l y c h m f m p m t p 陀 怼d p d p m p i p e s r l t c s e s e l t m v 英文缩写表 a b b r e v i a t i o 聪 2 英文名称 a p p r e s s e de n d o p l a s m i cr e t i c u l u m a c t i nf i l a m e n t s c o m p a n i o ne e l l c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y c u c u m b e rm o s a i cv i r u s e c t o d e s m a t a e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m f i l a m e n t o u sa c t i n f l u o r e s c e n ti s o t h i o e y a n a t e g l o b u l a ra c t i n g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n l u c i f e ry e l l o w m i c r o f i l a m e n t s m o v e m e n tp r o t e i n m i t o c h o n d r i a p l a s t i d p a r e n c h y m ac e l l p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p l a s m o d e s m a t a p l a s m am e m b r a n e p i p e r a z i n e - n ，n b i s - 2 - e t h a n e s u t f o n i ca c i d r h o d a m i n ebl s o t h i o c y a n a t e s i e v ee l e m e n t s i z ee x c l u s i o nl i m i t t o b a c c om o s a i cv i r u s 河北农业大学硕士学位论文 试剂名称 f i t c - d e x t r a n l u c i f e ry e l l o w p i p e s n m a d d s a d m p 3 0 s p i - p o n 8 1 2 u r a n y lm a g n e s i u m o s m i u mt e l r o x i d e ( 锇酸) 戊二醛 其他试剂均为国产分析纯 化学试剂 3 来源 s i g m a s i g m a s i g m a s p i s p i s p i s p i s p i s p i s p i 河北农业大学硕士学位论文 文献综述：胞问连丝：共质体运输的动态通道 1 前言 胞间连丝( p l a s m o d e s m a t a , p d ) 是细胞间的细胞器，是细胞间信息交流和物质运 输的直接途径( “i 。胞问连丝最早是由t a n g l e 于1 8 7 9 年在马钱子胚乳细胞中发现 的”1 ，1 9 0 1 年由德国植物学家、细胞学家s t r a s b u r g c r 命名【8 】，1 9 3 0 年m u n c h 提出 植物细胞间胞间连丝是相邻细胞间原生质桥的概念。随后，许多学者致力于这一结 构的研究，但早期由于技术条件的限制，胞间连丝的精细结构与生理功能均未有充 分揭示，直到二十世纪五十年代，对于胞间连丝能否转运有机溶质仍有意见分歧。 随着电子显微镜、标记物体内示踪等新技术的广泛应用，胞间连丝的内部结构与功 能才逐渐被揭示出米【9 _ ”j 。 2 胞间连丝：共质体运输的动态通道 胞间连丝是植物细胞的重要结掬特征之一，是共质体运输的有效途径。它联结 两个相邻细胞的原生质体，致使两相邻细胞的细胞质互相沟通，相关的刺激得到传 导，某些代谢物质得到转运，构成了原生质的连续性，使多细胞植物体形成完整统 一的整体。 2 1 胞间连丝的超微结构 胞间连丝十分纤细，但在电镜下观察到的胞间连丝并非是单纯实心的丝状物， 它有着非常复杂的内部结构 2 , 3 , 9 , 15 】。早期通过电子显微技术研究胞间连丝形成了一 种通行的模式，即胞间连丝镶嵌在细胞壁上，与质膜相连，无分支的管状结构。相 邻原生质体借助质膜通过连丝孔道而连接，质膜进入孔道后，构成了胞间连丝的外 围，直径约4 0 6 0 h m ，内质网通过孔道时受约束而紧束成连丝微管( d e s m o m b u l e ) 或称压缩内质网( a p p r e s s e de n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，a e r ) ，其直径约2 0 n m ，由 蛋白质亚单位构成。而且，连丝微管被认为是起源于相邻细胞的内质网，并与该内 质网是相连接的。最近研究表明，胞间连丝的内质网组分起源于皮层的内质网”1 。 在连丝微管的中央与细胞壁平面垂直方向有一条电子密度深的线，称为中心柱 ( c e n t r a l r o d ) ，质膜与连丝微管间充满细胞质，横断面呈环状，称为孔环 4 河北农业大学硕士学位论文 ( a n n u l u s ) 。大部分模式都认为孔环是运输物质的通道。在胞间连丝的两端，由于 连丝微管与质膜间的间距缩小，孔环随之收缩形成颈区( n e c kr e g i o n ) 【1 6 1 ，但该结 构并不是所有胞间连丝都具有的一般特征。 随着高等植物中胞间连丝亚显微结构的广泛与深入的研究，不同的学者根据自 己的实验观察，提出了多个模型1 9 l0 ，他们的模型很形象地描绘出了胞间连丝可 能具备的结构特点。其中，o v e r a l la n db l a c k m a n 1 提出的胞问连丝的立体模型很具 有代表型。他们在胞间连丝基本模式的基础上，提出肌动蛋白和肌球蛋白围绕着连 丝微管排列，并起到连接质膜和连丝微管的作用，在胞间连丝的颈区，收缩蛋白 ( c o n t r a c t i l ep r o t e i n ) 借助于锚定蛋白( a n c h o r i n gp r o t e i n ) 将质膜与内质网相连 接，并且通过质壁分离实验已经证明了锚定蛋白的存在1 1 3 l 这些胞外结构可能为 胞间连丝组分在细胞壁上提供了锚定位点。存在于胞间连丝颈区的胞外括约肌 ( e x t m e e l l u l a rs p h i n c t e r s ) 和胞外螺旋( e x l r a e e l l u l a rs p i r a d 可能也具有调节胞问连丝通 透能力的作用，此外，推测，大分子物质的胞间转运可能依赖于肌动蛋白一肌球蛋 白的相互作用，同时，胞间连丝的s e l 依赖于连丝微管与质膜之间的孔环结构。 图1胞问连丝的模式结构1 f i g 1m o d e ls t r b c t u r co fp d 河北农业大学硕士学位论文 2 2 胞间连丝的形成 植物胞间连丝的形成主要有两种方式，即胞间连丝的初生形成和胞间连丝的次 生形成 1 7 - 2 0 l 。 2 2 1 胞闻连丝的初生形成： 细胞分裂末期，当胞质分裂与细胞板形成时，胞间连丝亦随之发生，这种随细 胞分裂而出现胞闯连丝的过程，称之为胞间连丝的初生形成口。具体过程是，在 植物细胞的胞质分裂后期，纺锤丝在靠近两极处消失，中间的纺锤丝保留下来，此 处徽管的数量增加，并向四周扩散，形成一个筒状结构，称为成膜体 ( p h r a g m o p l a s t ) ，同时，内质网由两极通过纺锤体的细丝向赤道区移动，内质网在细 胞板孔道中的存在，可阻j 臼l 泡内成壁物在此淀积，从而始终保持这两团胞质之间 的联系，在细胞板或膜的约束下，这段内质网进一步转变为连丝微管，即为压缩内 质网，随着质膜的连接，组成了外围界限，胞间连丝即告形成【l j 。 2 2 2 胞间连丝的次生形成： 胞间连丝是否只有在细胞分裂形成新壁时形成，还是在不分裂的细胞壁上也有 形成? 长期以来许多学者进行了研究并取得了很人进展，现已查明，在已经长成的 非分裂细胞间，也同样可以形成胞间连丝，即胞间连丝的次生形成。”l 。胞间连丝 的次生形成可能是在某些酶的作下完成的“，如纤维素酶( c e l l u l a s e ) 、半纤维素 酶( h e m i c e l l u l a s e ) 、果胶酶( p e c t i n a s e ) 、胼胝质酶( c a l l o s a s e ) 等。己证实在质膜、 内质网、类溶酶体和胞间迮丝形成部位都有酸性磷酸酶活性反应，大量水解酶可能 由内质网通过类溶酶体小泡分泌到质膜附近，溶解细胞蹙物质，内质网随之跟进， 最后，在不分裂的细胞壁上形成胞间连丝，即次生胞间连丝。例如，在亲缘关系远 近不同的接穗与砧木细胞之间口”“，在寄生物和寄主植物细胞之间，在花粉母细胞 之间以及植物体内各种正常生长的细胞之间，甚至于在愈伤组织培养中，都有胞间 连丝的次生形成并伴随有细胞壁的局部解体现象1 2 7 。9 】。郭晓才1 3 0 在对进行了一段 时间离体培养的各自具有独特细胞结构标志的胡萝h 细胞系和烟草细胞系观察时发 现，两类细胞之间的隔离层消失，异种胞间次生胞间连丝形成，将两个原本独立的 原生质体连成了统一的共质体。另外，晟新研究发现j ，菟丝子菌丝侵染宿主 时，宿主细胞产生新的细胞壁，该细胞壁既不同于宿主细胞原有的细胞壁，又不同 6 河北农业大学硕士学位论文 于菟丝子细胞壁，这种新生的细胞壁上的胞间连丝起到连接植物宿主细胞与菟丝子 细胞的共质联络的作用。 2 2 3 胞间连丝的次生变化 随着生物体的生长发育过程，胞间连丝还发生许多次生变化1 。如保卫细胞形 成时，与周围表皮细胞相连接的胞间连丝会消失；有的胞间连丝在后期可以出现分 枝，如伴胞与筛分子之间分叉型的胞间连丝的变化”1 ”1 ；次生胞间连丝还表现在衰 老组织中胞间连丝内压缩内质网的消失，使胞间连丝直径扩大，最终形成开放型的 胞间通道( i n t e r c e l l u l a rc h a n n e l ) ”3 。”1 。郑国铝、简令成“”发现百合花粉母细 胞内的染色质在穿壁前，胞间连丝发生次生变化。李明义”“先后观察到紫竹梅 雄蕊毛细胞的胞间连丝随着细胞的生长、发育、衰老呈现动态变化过程，胞间连丝 的直径由5 0 n m 扩大到1 0 0 n m ，内部的压缩内质网逐步降解、撤离，胞问连丝衍变 成开放性通道。王幼群等1 观察到衰老的洋葱鳞片表皮细胞的胞间连丝的孔径可达 8 0 h m 。因此有人提出了胞问连丝和胞间通道两个不同的概念，但实质上，胞闯奎 丝和胞间通道在细胞发育的不同时期。行使着相同的功能：物质运输和信息传递。 胞间通道是由胞间连丝次生变化形成的是一种不可逆的过程。压缩内质网消失后 的胞问连丝，即胞间通道，结构简单，但运输能力增大。胞间连丝向胞闻通道转 化，与细胞发育有关，并有降解酶的参与，是某些器官进行人量的物质运输所必需 的，在细胞衰老过程中产生的人餐降解产物有可能迅速地经此转运到生长中心和贮 藏器管。 3 胞间连丝与细胞骨架 3 1 胞间连丝与细胞骨架组分构成上的相似性 目前，有关胞问连丝结构、功能及其与细胞骨架，尤其是与微丝的关系越米越 受到人们的关注，因为细胞骨架不仅在维持细胞形态，保持细胞内部结构的有序性 中起重要作用。而且与细胞运动、物质运输、能量转化、细胞分裂等生命活动密切 相关，而胞间连丝正是细胞骨架在相邻细胞之间进行交流的桥梁所在p 。众所周 知，细胞骨架是由微丝( m i c r o f i l a m e n t ，m f ) 、微管( m i c r o t u b u l e ，m t ) 和中间 纤维( i n t e r m e d i a t ef i l a m e n t ) 组成的。经大量实验证明，胞间连丝组分，与细胞骨 7 河北农韭大学颈士学位论文 架肖摄大戆楣 娃性。免疫金标实验显示胞阕连丝上鸯魏球蛋鑫帮瓤动蛋自的存在 。o v e r a l l 靼b l a c k m a n f 提掇了腿球摄囊秘股动蛋自在躯闻连丝处隧绕中央懿连 丝微管存在，辫且起到稳定连丝徽管靼胞间适丝的作用，他们用细臌松弛素处理棱物 组织的实验证明丁他们的观点。b l a c k m a n 4 0 的研究表明，胞阅连熊中有胍动蛋白 ( a c t i nf i l a m e n t s , a f s ) 存在，胞间连丝上的肌动摄白有可能与肌球蛋白筵同作用， 成为相邻的共质体间大分子转移的驱动力。在蕨类植物中的胞间逢丝上发现了类肌 动蛋白( a c t i n 1 i k e ) 的存在 i ”，而且类肌球爱自( m y o s i n 1 i k e ) 也相继在洋葱和玉 米根的胞问琏丝上发现p “。同时，m y o s i n 硼也被定位在了胞问连丝上1 4 “。另外， 其能缅脆骨架蛋爵也被定位在施简连丝上，如，中心蛋自( c e n 扫i n ，叫、依赖与e r 懿锈翻缀岛，依赖予钙调素靛鬻鑫激酶泌, 4 2 , 4 4 , 4 ”。张伟裁等l 椒7 弱掰d g d ( d i e t h y l e n eg l y c o ld i s t e a r a t e ) 包蠼、去包嫒荆铡片术显示，l 、麦珠被帮艇巍镪脆骨檠结 掏时，发现微丝壁分数状跨胞分布教凝态，攘测徽丝霹能与正常聪润连丝存在着菜 种结构上的联系。杨霉等【4 s j 剥用洋葱兹粉母细胞观察刘胞闻连丝和胞虞通遵蠹有擞 丝的分布，且微熊集结成束，穿越胞间连丝。王冬梅等 4 y - s t l 借助与肌幼蛋白纤维 ( a c t i nf i l a m e n t s ，a f s ) 节特异结合的荧光标记物t r i t c p h 在激光共聚焦荧光显微 镜( c l s m ) 直接检测到了胞问共质通道中a f s 的存在。并用焦疫金标实验证明了 肌动蛋白在胞间避丝上的存在，为验证a f s 参与胞间连丝结构组成的可靠性提供了 一个新的依据。然而由于目前所埔技术的局限性，如用来驻示肌动摄自纤丝的荧光 显徽术无法辨认胞问迄丝及其内部绦椅，而免疫电镜难以隧分胞闻连丝中的舰动疆 岛楚g 一臻逶是f - - 聚等，所蔽在阐明微丝与正常胞问连丝的关系上迄今仍缺乏足 够躲实验涯撂。 3 2 胞闻连丝与细胞骨架功能上的摈关性 裹等植物中细胞闻腿咸滚动与纲腿骨架熬关系是纲脆运动领域撵静霆要议题。 严文梅等”“利用遗体鼹察发现凤暇莲挺头乳突细鼹中瀵跃的胞壤滚动与细胞骨架密 切相关，微丝和微管的相互配合与共存对胞威的集漉涌动是必不可少的。另外，原 生质穿壁运动与微丝活动密切相关。近期的研究袭明，小麦胚乳细胞中作活跃伸缩 运动的胞质纤索是由肌动蛋白集柬纽成的，肌动蛋白纤丝可跨胞分布而存在于常态 胞间连丝中，从而使棚邻细胞的胞质骨架得以实现胞间避续性。以细胞松弛素o ( c d ) 和p r o f i l i n 进行的药理学试验诚明，微丝参与胞间连丝通透性的调节。在 对小麦珠心与胚乳的研究中发现，原生质胞闻运动受徽丝活动的锎约，微丝集合成 8 河北农业大学硕士学位论文 的纤索可穿越胞间通道，并成为胞质颗粒物胞间迁移的动力与桥梁”1 。d i n g 等“” 以烟草为材料，利用显微注射技术证明肌动蛋白纤丝在胞间连丝通透性的调节中可 能起到的作用。m c l e a n ”“利用烟草花叶病毒( t o b a c c om o s a i cv i r u s ，t m v ) 的运 动蛋白( m o v e m e n tp r o t e i n ，m p ) p 3 0 研究发现，p 3 0 与细胞骨架微管、微丝的相互 作用在病毒r n a 经胞间连丝共质运输的调节中起到关键作用。另外，b o y k o “利 用t m v 的m p 突变体研究发现，微管在病毒r n a 的胞间转运中起关键性作用。另 外，利用免疫金标定位和透射电镜观察发现，微管和微丝与初生纹孔场处胞间连丝 的肌动蛋白、肌球蛋白相联系，对细胞间物质运输具重要的功能”。同时有学者认 为跨越植物细胞的细胞骨架间的信息交流由胞间连丝来协调进行的”。 4 胞问连丝与大分子的胞间转移 过去一直认为胞间连丝是一种静态结构，一般情况下，胞间连丝仅能通过一些 较小的分子，其允许通过物质的分子量上限( s i z ee x c l u s i o nl i m i t ，s e l ) 仅为 8 0 01 0 0 0d a ，并在这个范围以下随植物发育以及生理状态等的变化而呈动态变化 ”“6 ”。近年来许多研究的证据表明，胞间连丝的s e l 随组织种类及其生理状况而异 ”“。在一些情况下，火分子物质如病毒的核酸、蛋白质或植物内源核酸、蛋白质可 以经胞间连丝进行胞问转移”3 “。人分子通过胞间连丝的胞间转移是协同发育和 生理过程的一个重要手段。 4 1 胞间连丝通透性的研究方法 胞间连丝作为一种特殊的细胞器是植物体内胞问物质与信息交流的通道。 研究胞间连丝通透性的方法大体有两种：一是显微注射技术；二是转基因技术。 显微注射技术是直接向活体细胞内引入物质的方法。利用它开展物质在植物细 胞胞间转移的研究。j ：作始于上个世纪7 0 年代。主要利用不同分子量的荧光分子探 针对胞间连丝孔道的大小”“、胞间连丝通透性的调节”、共质体分区”、以及胞间 通道物质转移的动力学特征”等进行研究。显微注射技术很重要的一点就是为胞间 连丝作为大分子物质进行胞间转运的通道提供了直接的证据。显微注射研究表明， 成熟组织的胞间连丝通透性般是在8 0 0 - 1 0 0 0 d a ”“。李明义等”“采用不同分子量 的探针对紫竹梅雄蕊毛进行显微注射研究，结果表明。胞间连丝的通透性能随发育 9 河北农业大学硕士学位论文 过程和细胞生理状况而变化。k e m p e r s 等利用显微注射技术在南瓜茎的束外韧皮部 中发现荧光标记的分子量为3k d a 的分子探针可以在伴胞和筛管之间转移”“。这一 结果为胞间连丝是伴胞向筛管供应大分子蛋白等物质的通路的观点提供了直观的实 验证据。 现在，通常用转基因技术将病毒运动蛋白( m o v e m e n tp r o t e i n ，肝) 与绿色荧光 蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 的融合基因导入植株中，用以观察融合 蛋白在植物细胞胞间的转运情况”。或者同时利用m p 突变体研究胞间连丝与运动 蛋白的相互作用，以探讨p 对生物大分子胞间转移的影响。例如，在转基因烟草 中，对导入外源马铃薯卷叶病毒( p o t a t ol e a f f r o l lv i r u s ，p l r v - m p l 7 ) 的 m p l 7 - 6 f p 融合蛋白的表达进行观察，发现在不同表达水平的m p l 7 下，胞间连丝的 通透性明显不同。在源叶中的维管束和非维管束组织中m p l 7 与胞问连丝的功能密 切相关”。 4 2 胞问连丝与大分子物质的胞问转移 4 2 1 原生质胞间运动和核穿壁与大分子物质通过胞闻连垒的藉括 首先把胞间连丝可能参与人分子物质胞间转移联系起来的是原生质的胞间运动 现象利核穿肇，如葱蒜的表皮在衰退时出现的“核穿壁”1 7 37 6 1 , 花粉母细胞在发育 初期的“细胞融合”“。 4 2 2 植物内源大分子的胞闻转移 研究表明，植物内源大分子也可以通过胞间连丝进行胞间转移。其中植物体为 防止外界伤害，自身合成的一些防御性的化学物质或蛋白质，亦称为病原相关蛋白 ( p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n ，p r ) 可以在细胞间进行转移。当番茄丛矮病毒 ( t o m a t ob u s h ys t u n tv i r u s ) 侵染烟草后，利用酵母双杂交系统，以番茄丛矮 病毒的运动蛋白p 2 2 为探针，检测到一种新的亮氨酸拉链型植物内源蛋白m r n a 的 富积依赖于番茄丛矮病毒的侵染，该蛋白与病毒运动蛋白专一性互作，并影响病毒 分子在植物体内的胞间运输”。 o 河北农业大学硕士学位论文 植物内源大分子同样可以通过胞间连丝转移而对植物的发育进行调控。高 等植物的顶端分生组织分为三层：l i 、l 2 、l 3 ，层间具有信息交流，蛋白质可能是 这种层间交流的信息物8 ”。其中最具代表性的便是k n l 蛋白。k n l 是玉米 k n l ( k n o t t e d1 ) 基因编码的一个含有同源异型盒的d n a 结合蛋白，序列分析表明它 是一个转录因子。研究表明，植物内层细胞k n l 的表达可以引起表皮细胞生长模式 的改变”“。l u c a s 等”“以显微注射的方式直接证明了f i t c k n l 可以通过玉米和烟 草叶肉细胞的胞间连丝进行胞间转移。k n i 使胞间连丝通透性能从般水平上升至 超过2 0k d a ，并可使标记的2 0k d a 的大豆胰蛋白酶抑制剂胞间转移。k n l 还促进 核酸( k n l 有义r n a ) 的胞间转移”“。i ( i m ”利用显微注射方法，借助于k n i 的绿色荧 光蛋白融合体观察发现，k n i 可以从叶的内部组织运输到表皮组织，为证明k n i 可 以在叶的不同组织层间转移运动提供了直接的实验证据。另外，在玉米根尖切片中 运用一种新的双标记定位法，对k n i 的m r m a 和蛋白进行定位观察，也证明了在根 尖部位的k n l 蛋白可以进行胞间转运。这说明，k n l 的确是层间交流的信息物， 它可以经由胞间连丝从一层细胞转移剑另层细胞，引起细胞的增殖。 金鱼草的f l o ( f l o r i c a u l a 基冈的产物) 也有与上述k n l 相似的作h j 方式。在 玉米和其它植物中具有多种k n l 类似物”。此外，调1 i 植物发育的许多基因都是同 源异型基因，为d n a 结合蛋向，具有通过胞间迮丝层间交流的可能性。例如，通过 基因缺失和基冈获得方法进行实验研究分析，结果发现，在高等植物胚珠发育过程 中，由t n j s c f i e l ( w u s ) 同源异型基冈编码的w u s 蛋白在胚珠相邻细胞间起到重要 信号调节作h j “。某些转录冈子也可以通过胞间连丝进行胞间转移”“。已经发现 的转录闵子s h r 在根尖分生组织中通过胞间连丝进行胞间转运1 。此外，细胞非自 主蛋白( n o n c e l 卜a u t o n o m o u sp r o t e i n s ，n c a p s ) 在胞间连丝的转运中是具有选 择性和调节性的，其在植物州和花的发育中起到调控作用1 ”| 。对k n l 、f l o 及其它 同源异型基田产物的研究表明，在某个特定细胞中合成的蛋白质可以转运到同一组 织中相邻的或更远的细胞。这些可能在层间转移的蛋白都是在植物的发育中具有重 要作用的蛋白，它提醒人们注意人分子物质通过胞问连丝转移在植物发育调控中的 可能作用。 4 2 3 病毒大分子通过胞间连丝的转移 河北农业大学硕士学位论文 继原生质胞间运动和核穿壁之后，病毒通过胞间连丝实现系统感染是胞问连丝 参与大分子物质胞问转移的又个例证, 9 5 j 。病毒粒子的体积( 1 0 8 0 n m ) 较大， 既便是自由折叠的病毒核酸( 1 0 r i m ) 也远远超过胞间连丝允许通过物质的最大极 限( s e l ) ，一般情况下胞间连丝的通透极限仅为8 0 0 1 0 0 0 d a ，而病毒的分子量 远远超出此范围。因此，病毒不可能依赖简单的扩散而通过胞间连丝进行胞间转移 的，必须采取一定措旌克服胞间连丝障碍以实现胞间转移而最终到达韧皮部进行长 距离运输p “。随着人们对植物病毒基因组结构和功能研究的不断深入，发现植物病 毒在寄主细胞间的运动是由病毒的一个或几个基因产物( 运动蛋白) 与寄主成分相 互作用的一种主动运输过程1 ”j 。病毒通过胞间连丝的转移主要有两种方式： 4 2 3 1 病毒颗粒的胞间转移 完整的病毒颗粒通过在胞间连丝处形成的管状结构由一个细胞转移到另一个细 胞。在这种情况下胞间连丝缺乏连丝微管，由病毒蛋白诱导在胞间连丝内部形成特 定的管状结构。 4 2 3 2 病毒运动蛋白与大分子物质通过胞间连丝的转移 病毒核酸借助病毒编码的运动蛋向能够进行胞间转运”“。运动蛋白为病毒核 酸编码的1 f 结构蛋白，其主要功能是在病毒感染时促进病毒的胞间转移。运动蛋白 的突变对病毒的复制没有影响，但却使病毒的胞间转移受阻。病毒运动蛋白一方面 和胞间连丝相互作刚使得胞间连丝的通透性增加，另一方面又和病毒的核酸相互作 用，从而促进分子量远远高于8 0 0 - - 1 0 0 0 d a 的病毒核酸的胞问转移“。这方面， 最早的证据来自对烟草花叶病毒( t m v ) 突变体的研究，烟草花叶病毒( t m v ) 编码 的3 0 k d a 的运动蛋白是单链核酸结合蛋白，它可能类似于分子伴侣( m o l e c u l a r c h a p e r o n e ) 的作用，使折叠的单链核酸与之结合后形成线状结构的蛋白一核酸复合 体，易于通过胞间连丝。 由于胞问连丝允许通过物质的最人极限( s e l ) 远远小于植物病毒的最小侵染 单位( 病毒粒子和病毒核酸) 所以植物病毒的运动蛋白可能直接或间接地与胞间 连丝发生相互作用。应用胶体金免疫电镜发现，无论是在转基因植物中，还是在受 侵染的植株中，t m vm p 均分布在胞间连丝处。在转基因植物中，t m vm p 仅能进入 2 河北农业大学硕士学位论文 并改变叶肉细胞间和维管束鞘细胞间的次生胞间连丝，并且与内源胞间连丝的蛋 白相互作用，扩大胞间连丝的微通道。将病毒运动蛋白注入植物细胞，它立即 改变胞间连丝的通透性，使大分子物质可以发生胞间转移“，“。有学者推测，m p 本身可能是蛋白激酶，作用于胞间连丝使其蛋白质磷酸化，引起构象改变，而使胞 间连丝孔径增大“。 病毒进行胞间运输时，其通过胞间连丝的类型是有选择性的“。i t a y a 等“”1 将黄瓜花叶病毒( c u c u m b e rm o s a i cv i r u s ，c m v ) 的m p 与g f p 融合基因通过转基因 技术导入烟草中，发现在不同发育时期的叶片中，该融合蛋白的表达和运输不同， 成熟叶片的次生胞间连丝处有该融合蛋白存在，并且能够进行胞间转运，而幼嫩叶 片表皮细胞的初生胞间连丝处没有融合蛋白的存在。利用烟草花叶病毒( t m v ) 的 3 0 k d a 运动蛋白来研究初生胞间连丝和次生胞间连丝的功能，结果发现，在t m vm p 转基因植株中，m p 定位在成熟叶片的韧皮部和维管束的次生胞间连丝处，但在成 熟或幼嫩叶片的初生胞间连丝处却没有m p 蛋白的存在“。 人们根据对多种病毒胞间转移机制的研究，提出了运动蛋白m p 基冈策略：植 物病毒的成功侵染依赖于病毒在寄主体内的移动，病毒只存从侵染点细胞通过胞间 连丝移动到周围健康细胞，才能完成系统侵染。病毒在植物细胞间的移动需要病毒 基冈编码的运动蛋白( m p ) 的参与，m p 可以与胞间连丝相互作用，并引起胞间连 丝s e l 的改变，从而协助病毒完成细胞间运动。 4 2 4 筛管伴胞间( s i e v ee l e m e n t - c o m p a n i o nc e l l ，s e c c ) 的胞间连丝与大分子物 质的胞间转移 胞间连丝不但可以转运象病毒r n a 和蛋白质这种外源大分子物质，而且可能参 与内源蛋白质的运输。筛管一伴胞之间的胞间连丝便可能是伴胞向成熟的筛管供应 蛋白质的通路“i l l l 。存在于韧皮部的筛管一伴胞复合体在物质运输、信息传递、病 毒运动、以及防御作用中发挥着重要作_ 【 “。 在高等植物中，成熟筛管通常是没有细胞核、核糖体以及其它许多重要的细胞 器，不具有合成蛋白质的能力。但在许多情况下，筛管富含多种蛋白质并可以长期 维持活力，这表明它得到了必需蛋白质的供应，相邻细胞的蛋白质可经胞间连丝运 输到这些细胞中1 。而且伴胞与筛管之间进行的物质运输具有选择性的“”“。 分子识别可能是蛋白在c c - s e 中进行选择运输的一种机制。利用黄瓜花叶病毒运动 河北表泣大学硕士学位论文 蛋自与绿色荧光蛋自融合体实验显示，蛋自经脆闻连丝豹运输依赖予棱物的发育阶 段帮器絮类型“”。冀铃蔫绫锤块莲痰炎病毒( p o t a t os p i n d l et u b e rv i r o i d ， p s t v d ) 是一鼬不编码蛋白翘甍体他的类病毒烈a ，该类殡毒驰基因维盛矮与缨腿 因子相互作刚才能行使其自主复制和侵染功能，该r n a 在韧皮酆的运输不是籀单的 伴随其它有机物通过韧皮部从源器官( s o u r c eo r g a n s ) 进入到库器官( s i n k o r g a n s ) ，而是其有选择性进入到库器官，利用p s t v d 突变体研究发现，p s t v d 可 以进入韧皮部并进行系统的扩散，但却不能在烟草叶片的韧皮部内存在。该豢病毒 可能具有类似于械物内源r n a 的结构基序( s t r u c t u r a lm o t i f s ) ，使它能够被胞 内因子谈剐而在植物韧皮部进行选择性转运”。 。又如，南瓜的韧皮部伤流液包 含两种基本的筛管卜摄自：p p i 和p p 2 。在正在发育和成熟的筛分子及其伴胞中， 这两种蛋自被特是的袭这“。对南噩筛管蛋白及其m r n a 的定经研究显示，俘胞可 能囱分化成熟静舞譬提供虽鑫鹱“2 “。骧经杂交实验表裙，在发芽1 2 天豹南瓜下疆 毒l l l 韧皮邦中p p 2 m r n a 只定位于俅胞，不提在于簿綮中，囊p p 2 蛋白矮存在于拌憨葶珏 筛管。这表明该蛩自威在不需要它的伴腿中活跃她合成，随后被运歪筛管中执雩亍功 能。 4 3 大分子胞问转移的分子机制及生物学意义 一般情溅卜，脆瀚连丝麓通透极限仅为8 0 01 0 0 0 d a ，嚣螽筛管一俸胞之间、菜 些分生缎缓中戆臌闯逡丝、以及受到瘸毒运动蛋是影镌的脆闫连丝躲可酸允许天分 子麓搓自震霸l 核酸遥过。 通常的情况f ，臌间逾丝内部的蛋向质颗粒、两瑞韵颈区将其通透极限限制在 穰，j 、的蕊酮潮l 。胬茈，入 f ：i 最襁认为，如采犬分子物质可馘经脆间连丝在细胞问转 移，氍臆阕迄丝巍然发生明显静结构上鹣变仡，鲡连照徽篱消失脆震通道扩大形 成舞披态f = 1 4 1 ，如援穿鹫和癌毒邋过诱导艨闻逡丝形残篱状结擒褥透过胞阀连丝。援 在人们则更趋彝予认为，更多的情况f 犬分子物鹱透过腹阙连丝转移是避过其与脆 阐述丝的相互作崩，使碍胞阐述丝发生结构上尚捻测不到的蛋照质构象铸的变化。 这类似丁病毒运动蛋自对胞间连丝的作h i 象k n l 及其类似物这样的内源蛋白质 也可能是通过与病毒运动蛋白相似的方式作用于胞间连丝使其发生构象变化，从而 通过胞间连丝。 4 河北农业大学硕士学位论文 多种实验证明大分子物质可以经胞间连丝实现细胞间转移，并且在分生组织和 植物整体发育的调控中发挥重要作用。除此之外，大分子物质胞间转移在营养物质 和能量的供应中也可能具有重要的意义。大分子蛋白质从伴胞向筛管运输可以满足 成熟的筛管对蛋白质的需要。小麦籽粒在灌浆过程中其朝向胚乳腹沟的珠心突起组 织( c r e a s e t i s s u e ) 胞间连丝的通透性能很高，远远超出一般的水平l l “。可以满足灌浆 过程中大量的物质需求。某些条件下胞间连丝通透性能的变化还可以满足对能量的 需求。 从以上所述可以看出。胞间连丝的通透性能在很多情况下是很高的，并可能在 植物的生长发育和物质能量的供应中发挥重要作用。大分子物质通过胞问连丝实现 细胞间的共享很可能是植物体内普遍存在的，并受到开关的调节( t l l 】植物体的各个 部位胞间连丝都有转运大分子物质的潜能，在一些内外因子的影响下这种潜能或开 或闭) 。分生组织受到内源表达的k n l 及其类似物的作用，这种潜能开放；成熟组 织k n i 及其类似物表达量下降或不表达这种潜能关闭。在一些情况下，比如物 质和能量供应量比较人，胞间连丝受到另外一些因子的影响发生构象改变，这种潜 能重新开放。病毒感染时，病毒运动蛋白通过与胞间连丝蛋白的作用，启动了植物 体内源的这种机制。但到目前为止，这方面的研究仅是得到了一些初步的结果。对 胞间连丝较高通透性能存在的条件以及其作用机制和意义都还有待进一步的研究。 5 植物细胞的外连丝与类外连丝的结构与功能 t a n g l e i t l 发现胞间连丝以来的1 0 0 多年里，人们对细胞间的原生质联络从结 构、功能上作了大量的研究并取得了显著进展与成就【i ”1 2 4 。然而对于在表皮细胞 外侧壁上是否存在着类似的结构研究很少，只有距胞间连丝发现6 0 年之后才于 1 9 3 9 检察到了表皮细胞上外连丝的存在i l ”j 。至于在一个完整植物中因形态发生而 出现的各种质外体空间或因细胞组织的盛衰变化而呈现的局部空隙与它们相邻的 细胞分界壁上是否亦存在着类似外连丝的结构或者是原有胞间连丝的存留物，则 更是少有人顾及，但显然，这是在植物个体发育过程中频繁发生着的。我们在开展 有关胞间连丝的修饰与衍变现象时结合查阅文献资料感到，上述两方面问题对深入 探讨植物与外界环境问的物质交流以及植物体内细胞内含物的再分配、再利用可能 有着重要作用：尽管迄今所收集文献数量有限，但从中以可见到若干有价值的线 索，值得作一个简要的回顾与归纳，希冀能引起学术界的关注与兴趣。 河北农业大学硕士学位论文 5 1 外连丝的形态结构特征： 在发现胞间连丝的六十年后，s c h u m a c h e r 和h a l b s g u t h l l 2 5 经特殊的显微技术处 理于1 9 3 9 年在植物表皮细胞外壁上发现有大量的孔道的存在，在多种植物的外表 皮细胞上证实了他们的观察，认为这些表皮细胞外壁的通道结构具有真实的原生质 性质【。1 “i ，为表皮细胞原生质与胞外空间的直接联系。根据r u h l a n d 的建议，外 侧壁上的这些通道被命名为外连缝_ ( e c t o d e s m a t a ) ，以与胞间连丝相区别”7 1 。与胞 间连丝相比，外连丝仅在一侧与表皮细胞的原生质体相连，然而它们并不外裸，通 常为角质层所覆盖。如l 卜图所示： 圈2 光镜下的外连丝i ( 箭头所示) f i g21 6 ep h o t o so f e c t o d e s m a t a ( a r r o w h e a d ) l a m b e r t z 和s c h n e p t 利_ i jg i l s o n 溶液，借助氯化汞沉淀在光学显微镜卜观察 到了叶、辈、花瓣、叶柄和蔓中的表皮细胞外壁上的外连丝【”“”8 1 。随后，利_ j 电 子显微镜技术、h g l 法和偏振显微镜法分别证明了外连丝的存在【”8 ，”o i 。在显示外 连丝存在、形态、分布上，汞沉淀法j 泛与普遍地为各国学者所应用，是检察外 连丝的主要依据。 起初研究者认为外连丝的形态是多种多样的，观察到它们呈圆锥形的、楔形 的、或带状的各种状态。人多数情况f ，植物叶子上所见的外连丝多呈完整的线 状，甚至还有呈伞型的蘑菇状，伞部接触着原生质，。而梗部附着在角质膜上1 1 “ ”2 i 。但是，随后的研究证明，外连丝的形态并不是那么多样化的，只是由于研究方 法上汞沉淀的多样性引起的景象】。 6 河北农业大学硕士学位论文 一般而言，外连丝具有分布不均匀，密度差异性大的特点在叶表面一些区 域内外连丝的分布很有规律性，且数量很多，而其他区域只有少量或几乎没有。外 连丝特别丰富的区域是大叶脉的两侧、保卫细胞处、圆锥形腺毛( c o n i c a lh a i r ) 以 及围绕头状腺毛的表皮细胞。外连丝呈线状或链状排列，碾整齐而且不受细胞限 制，而另一些情况是，外连丝都挤在垂周壁上，或外连丝可能环绕着圆锥形毛细 胞，并且在这些腺毛周围的表皮上呈现环状排列，好像是腺毛基部细胞周围的连续 螺旋形链，另外，气孔保卫细胞上的外连丝部分集中在凸壁上，部分在孔边缘的凹 壁上，有时则只集中在气孔的极端，相对于圆锥形腺毛，头状腺毛没有夕 连丝，但 在他们附近环绕他们基部细胞的表皮细胞上经常发现大量的外连丝存在”j 。这些 观察似乎支持了下面要讨论的外连丝与叶吸收和叶分泌相关的观点。 大多数外连丝并不是贯穿整个细胞壁，而是在细胞壁中间就中断。这种中断不 是实验中人为因素造成的，而是外连丝的自身中断，这是因为在靠近细胞内腔处的 细胞壁上缺乏某种还原物质，该物质是由表皮细胞原生质体分泌出来的。f r a n k e l i ”1 利_ 【 j 抗坏血酸处理叶片，发现原本中断着的外连丝在抗坏血酸的诱导下多数可延伸 并贯穿整个细胞肇到达细胞内腔。其他的诱导因子还有半胱氨酸，谷氨酸和苯丙氨 酸等。叶片表皮层分泌抗坏血酸的事实随后被t u k e y ”7 1 证明，说明植物叶片自身 分泌抗坏血酸米诱导外连丝的延伸。冈此，有人提出了这样的观点：外连丝并不是 a 身存在结构多样性，而是依赖于诱导冈子导致其结构发生变化。 最初，研究者们认为处在叶片上的外连丝的数量是处于动态变化中，在夜间数 量多。而在白天数量相对的就变少i l ”j ，这一点似表明外连丝可以象阿米巴伪足那 样从原生质体上向外伸出或缩同。但s c h u m a c h e r 认为。外连丝始终如一的存在于 细胞壁上f ”。1 9 5 9 年，s i e v e r s 证明外连丝随昼夜的交替有一个明显的变化规律， 在高温和光下外连丝相对变少，而黑暗和低温会促进外连丝的增加，因此推测外连 丝有一个生理变化过程，它可能影响到氯化汞检测法的效果i l 。萎蔫的叶子比正 常的叶子的吸收能力弱，萎蔫的叶子中贯穿型外连丝的数量也相对的少，同时， 中断型的外连丝数量增加3 ”。p a n i c i ”9 1 随后也证明t # b 连丝的数目随着物种和品种 以及环境因子的变化而发生动态的变化。 由光学显微镜图像显示外连丝通道孔径在o 8 - 1 0 1 t m 或更大。与一般胞壁上常 见的纹孔场的大小相近似，但是表皮细胞外侧胞壁上汞沉淀物所显示的通道亦具有 与纹孔类似的结构，尚待进一步的细致分析。f r a n k e ! ”4 】在存放数月的切片中观察 1 7 河北农业大学硕士学位论文 到外连丝断面上原先的点状汞沉淀因局部退色而显露出大量纤细点状物；与 s c h n e p f 【1 在超微结构观察中所揭示的外连丝通道的纤丝网络相结合来考虑，显示 出光镜下所见外连丝实际上是由大量纤细丝状空隙集束形成的可能性